PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL VIH

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1 PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL VIH Blga. Gisely Hijar Guerra Coordinación del Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular. Responsable de los Procesos de la Prueba de Genotipificación de VIH Centro Nacional de Salud Publca

2 COMO MONITOREAR RESISTENCIA? GENOTIPO CODIGO GENETICO ALTERADO DE LA PROTEINA BLANCO DE LA DROGA HIV DNA DEL PACIENTE FENOTIPO SUSCEPTIBILIDAD ALTERADA A LA DROGA PATIENT HIV

3 DEFINICIONES Genotipo : Secuencia de nucleótidos del virus de la cual se deduce la secuencia de aminoácido de una proteína (En el caso del HIV, la RT y PV) Mutaciones : cambios en la secuencia de AA deducida de la secuencia de nucleótidos con respecto a la secuencia de una cepa de referencia (sensible o salvaje) Ejemplo: Met184Val. Mutaciones específicas se identifican como causantes de resistencia genotípica Fenotipo : Deriva del genotipo. En el ejemplo, el cambio Met184Val se traduce fenotípicamente como resistencia a 3TC, ddc y Abacavir.

4 Regiones de PR y RT Evaluadas por test de Resistencia Gag Cleavage Sites p7nc p1 p6 RNase PR RT H IN 242 Genotipificación VIH-INS

5 DE LA MUESTRA A LOS RESULTADOS Pre-Analitica Analitica Post-Analitica

6 Colecta de la muestra Pre-Analítica Envío y Almacenamiento Codificación de muestra Extracción de Ac. Nucleico Amplificación de Ac. Analítica Nucleico Edición de Secuencia Ensamblaje de Secuencia Secuenciamiento Automático Post-Analítica Alineamiento de Secuencia Determinación de mutaciones Reporte de resultados

7 MUESTRA : Sangre Total

8 CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA PACIENTE : EN AYUNAS TIPO DE MUESTRA: SANGRE TIPO DE TUBO : TUBO AL VACIO CON EDTA DE 5 7 CC. TEMP. TRANSPORTE :AMBIENTE TIEMPO DESDE QUE SE TOMA LA MUESTRA HASTA QUE SE SEPARA EL PLASMA : 24 HORAS.

9 SEPARACIÓN DEL PLASMA Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENETICO (ARN ) Controles de la Prueba Controles Mutantes Controles Silvestres

10 TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT) Y REACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

11 RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RNA Ł c DNA

12 ELECTROFORESIS

13 PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

14 ÁREA SEGUNDA AMPLIFICACIÓN SEGUNDO PCR

15 SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR (Equipo : Analizador Genético)

16 SOFTWARE Sequencing Analysis ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN DEL VIH

17 SOFTWARE : SeqScape

18 La secuencia de ADN del virus obtenido es ingresado en la base de datos de la Universidad de Stanford empleando para ello el Programa HIVdb. Este programa analiza las secuencias y determina si están presentes las mutaciones del virus relacionadas a la resistencia antiretroviral.

19

20

21 INFORMES DE RESISTENCIAS

22 COLECTA /TOMA DE MUESTRA FLUJOGRAMA DE LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DE VIH SEPARACIÓN DEL PLASMA TUBO N 1 EXTRACCIÓN DE ARN RT - PCR ELECTROFORESIS

23 ELECTROFORESIS No amplifica Si amplifica SEGUNDO PCR (Primers alternativos) PURIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR No amplifica 1a vez No amplifica 2da vez Si amplifica SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR INDETERMINADO No hay secuencia 1a vez SECUENCIAMIENTO CON PRIMERS ALTERNATIVOS Hay secuencia ANÁLISIS DE SECUENCIAS No hay secuencia 2da vez Hay secuencia REPORTE DE RESULTADO

24 INFORME DE RESULTADO

25

26 Muestra / Separación de Plasma Extracción de ARN RT-PCR Electroforesis Reporte Análisis de Datos Análisis de Datos

27 Por qué son útiles y necesarios los ensayos de Resistencia Asiste al médico en la toma de decisiones terapéuticas en distintos escenarios: Clarifica los tratamientos disponibles Selecciona los regímenes mas activos Mejora el resultado clínico Clarifica la etiología de los aumentos de carga viral Reduce el uso de drogas inactivas. Provee beneficios a nivel de salud pública Clarifica la epidemiología de la resistencia al HIV reduce transmisión de virus resistentes Permite mejorar las guías de tratamiento Asiste en el desarrollo de nuevas drogas terapéuticas

28 AGRADECIMIENTOS Dr Robert Grant Robert Hance Maribel Acuña Carlos Yabar Equipo del laboratorio de VIH y del Laboratorio de Biología Molecular

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