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1 APLICACIONES PCR

2 Aplicaciones de la PCR - Clonar un gen (molde ADN o ARN) - Secuencia conocida - Genes homólogos en especies próximas (primers degenerados) - Información de secuencia proteica (primers degenerados) - Rastreos de genotecas en pools - PCR inversa para clonar gen completo - Herramienta en construcciones plasmídicas - Análisis de recombinantes y eventos infrecuentes en el ADN - Mutagénesis in vitro - Corte y ligación de fragmentos de ADN in vitro - Construcción de genes sintéticos o fragmentos in vitro - Conocer la CDS de un gen, localizar los intrones, (RT-PCR) - Detectar expresión de un gen, semicuantitativo, (RT-PCR) - Real Time, PCR cuantiativa, (RT-PCR) - Clonar extremos 5 y 3 de un transcrito: RACE, (RT-PCR) - Diagnóstico e identificación - Tipado, clasificación, taxonomía (RAPDs, AFLPs, SSRs, SNPs, etc) - Aplicaciones forenses

3 RT-PCR - Esencialmente es una reacción de síntesis de cdna más una PCR con primers específicos para amplificar un fragmento a partir de un ARN mensajero - Tres tipos de primer para síntesis de cdna - Oligo dt: síntesis de cdna inespecífica, el primer antisentido puede ser el poli-t u otro específico - Primer específico: el primer antisentido puede ser el mismo que el de la reacción de síntesis de cdna u otro situado más hacia 5 del transcrito - Hexanucleótidos al azar: se obtienen diversos fragmentos de distinto tamaño en la reacción de la primera heba de cdna - Suelen obtenerse fragmentos de cdna del transcrito, quedando fuera el extremo 5 y a menudo el 3. Para amplificar el cdna hasta los extremos 5 y 3 del transcrito se utiliza la técnica RACE.

4 RT-PCR

5 5 y 3 -RACE RACE: Rapid amplification of cdna ends Nos permite conocer el sitio de inicio de la transcripción de un gen y las secuencias 5 UTR y 3 UTR

6 PCR en tiempo real - Es una RT-PCR en la cual no se detecta cuanto cdna se acumula al final, sino que se va midiendo de continuo para determinar en que ciclo de la PCR se alcanza un valor umbral. Cuanto antes se alcance (número de ciclos más bajo) mayor será la concentración inicial del ARNm. Por comparación con un control (gen de expresión constitutiva) pueden determinarse las diferencias de expresión de un gen en diferentes tejidos, condiciones, poblaciones, etc. C T : Threshold cycle. Ciclo en el cual un incremento significativo de Rn es detectado por primera vez Rn+: Intensidad emisión en reacciones Rn-: Intensidad emisión en controles sin molde Rn: Rn+ - Rn-

7 PCR en tiempo real La cantidad de DNA se detecta mediante una sonda específica que hibrida con los fragmentos de DNA que se van amplificando y que lleva incorporado un fluorocromo en su extremo 5. En cada ciclo de amplificación la sonda emite fluorescencia cuando es desprendida por la polimerasa, la cual es detectada mediante láser por el termociclador. Este sistema detecta específicamente la amplificación de un determinado gen. También puede utilizarse SYBR green, que se une inespecíficamente a cualquier DNA que se esté amplificando

8 PCR en tiempo real

9 Detección y clonación de productos de PCR El resultado de una PCR se visualiza en geles de agarosa o poliacrilamida dependiendo del tipo de experimento y el número de bandas esperado Para comprobar si se ha amplificado el fragmento correcto hay varios métodos: Digestión mediante enzimas de restricción, secuenciación, hibridación, nueva PCR con otros primers interiores. Clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR - Ligación de extremos romos cuando se usa Pfu o Pwo.

10 Clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR - La utilización de primers con una secuencia diana para una enzima de restricción en su extremo 5 se usa como sistema de clonación eficiente de productos de PCR. Tiene además otras aplicaciones en técnicas de ingeniería genética, construcción de plásmidos, etc.

11 Corte y ligación de fragmentos: PCR recombinante

12 Corte y ligación de fragmentos: PCR recombinante - En este ejemplo se eliminan mediante PCR los intrones de un gen (I-1 y I-2) - La parte 5 de los primers 1 y 6 contiene sitios de corte para enzimas de restricción para facilitar su clonación - La parte 5 de los primers 2, 3, 4 y 5 contiene secuencias pertenecientes al exón del otro lado del intrón correspondiente. - Se amplifican primero los fragmentos 1-2, 3-4 y 5-6 por separado - Se mezclan los productos 1-2 y 3-4 y amplificando con los primers 1 y 4 se obtiene el fragmento El producto final, 1-6, se obtiene mezclando 1-4 y 5-6 y amplificando con primers 1 y 6

13 - Clonación mediante PCR - Primers degenerados, diseñados a partir de: - Genes homólogos de otras especies - Secuencia aminoacídica obtenida a partir de la proteína Si con la secuencia aminoacídica se ha logrado identificar en las bases de datos de que proteína se trata, se hacen búsquedas para encontrar secuencias de genes y proteínas homólogas y se alinean para localizar regiones conservadas.

14 - Clonación mediante PCR. Primers degenerados

15 - Clonación mediante PCR. Primers degenerados CCN GCN GAR TTY GTN ATH GTN AAY CCN AAY AAR GGN CGN CTY AAR CAN TAD CAN TTR GGN TTR TTY P A E F V I V N P N K GGC CAA CTC GAC AAT TAT CAT TTG GGC TTG TTC Ara GGC CAA CTC GAC AAT TAT CAT TTG GGC TTG TTC Ara GGC CAA CTC GAC GAT TAT CAA TTG GGT GTT TTC Bra GGA CGA CTT GAA CAA CAC CAA TTA GGT TTG TAA Lat GGA CGA CTT GAA CAA CAC CAA TTA GGT TTG TAA -Pisum GGT CGA CTT GAA CAA CAC CAA TTA GGT TTG TAA -Lens_cul GGT CGA CTT GAA CAA CAC CAA TTA GGT TTG TAA -Lens GGT GCA CTT GAA CAA CAC CAA TTA GGT TTG TAA -Euph GGT CGA CTC GAA CAA CAA CAC TTA GGT TTG TTT Cic GGA CCA CTC GAA AGT CAC CAC TTA GGA TTG TTC Gly GGT ATA CTT AAG GTG TAA CAC TTG GGC TTG GCT Ara GGA CGA CTT AAA CAA TAT CAA TTA GGT TTG TTA T C G T A T G C C C C A 5 -AT AAC AAA TTC AGC AGG-3 C T C 5 -AC TAT AAC AAA TTC AGC-3 A C

16 - Clonación mediante PCR. Primers degenerados Nested PCR

17 - PCR inversa - Para clonar por PCR las regiones adyacentes a una región previamente clonada y secuenciada

18

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