PROCEDIMIENTO DETECCION NOROVIRUS RT-qPCR EN EXTRACTO VIRAL PROVENIENTE DE MOLUSCOS BIVALVOS. PRT Página 1 de 7

Transcripción

1 PRT Página 1 de 7 1. OBJETIVO Realizar la detección molecular de genes de Norovirus en muestras de moluscos bivalvos. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a concentrados virales obtenidos de muestras de moluscos bivalvos. 3. FUNDAMENTO El método descrito fue diseñado por FDA, Gulf Coast Seafood Laboratory Dauphin Island, Consiste en realizar primero un RT PCR (Transcriptasa Reversa), para lograr la conversión de RNA viral en cdna y luego realizar un PCR múltiplex en tiempo real utilizando sondas. Este ensayo utiliza un Control Interno de Amplificación (CIA) el cual es amplificado paralelamente con la secuencia de interés, asegurando la integridad del PCR y previniendo el reporte de falsos positivos. 4. REFERENCIAS 4.1 William Burkhardt III, Jackie W. Woods, Jessica Nordstrom, and G. Hartman 2006, A Real-Time RT-PCR Protocol for the Simultaneous Detection of Norovirus and Enteroviruses, Laboratory Information Bulletin # Gary Hartman, Henry Lau, and Andrew Lin 2005, A Rapid One-Step Method for the Detection and Screening of Hepatitis A Virus. Laboratory Information Bulletin.# Qiagen OneStep RT-PCR Handbook, February TERMINOLOGÍA 5.1 RT qpcr = Transcriptasa Reversa PCR tiempo real. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Materiales Tubos Eppendorf de 1,5 ml, siliconizados y libres de RNA/DNA Tubos Eppendorf negros Set de micro pipetas libres de DNA/RNA Puntas con filtro para micropipetas libres de DNA/RNA Rack de enfriamiento para microtubos o hielo.

2 PRT Página 2 de RNase Away, Nucleoclean, RNaseZap, or similar product Guantes de latex o nitrilo libres de RNase 6.2 Reactivos Kit Qiagen OneStep RT-PCR Kit; Cat No (25 reaction) or (100 reactions) Componentes del kit. OneStep RT-PCR Mix de enzima OneStep RT-PCR Buffer (5X) Mix dntp (10mM cada nucleótido) Agua libre RNaser MgCl 2 25 mm Inhibidor de RNasa Ambion Superase In (5 Units/µL) Cat No. 2694(2,500 U) o 2696 (10,000 U) Agua desionizada, certificada libre de RNasa and DNasa Partidores y sondas- Hidratados en agua libre de DNA/RNA a una concentración de 100 µm y almacenados a -20ºC. Tabla Nº Control Interno, se encuentra en proceso de patente y debe ser solicitado a W. Burkhardt. 6.3 Equipos Vortex Microcentrífuga refrigerada Gabinete de bioseguridad Micro-centrifuga refrigerada Termociclador PCR tiempo Real. 7. DESARROLLO 7.1 Limpiar el área de trabajo con RNase Away, Nucleoclean, RNaseZap, o un producto similar, luego irradiar con luz UV por al menos 20 minutos. Cambiar de guantes cada vez que se salga y vuelva a entrar al área. 7.2 Preparar el mix de partidores de acuerdo a la siguiente tabla:

3 PRT Página 3 de 7 NoV Mix Partidores G1F 45µL G1R 45µL G2F 45µL G2R 45µL IC46F 11.15µL IC194R 11.15µL H 2 O 997.7µL 7.3 Preparar el mix de sondas de acuerdo a la siguiente tabla: NoV Mix Sonda G1P 15µL G1Pb 15µL G2P 15µL ICP 22.5µL H 2 O µl 7.4 Preparar el mix de buffer de acuerdo a la siguiente tabla: NoV Buffer Mix Agua libre de RNasa 1760µL OneStep RT-PCR Buffer, 5x 1000µL 25 mm MgCl 300µL dntps 200µL

4 PRT Página 4 de Preparar el mix de enzima de acuerdo a la siguiente tabla: NoV Mix Enzima OneStep RT-PCR Enzyme Mix Superasin (Ambion) 200uL 50uL 7.6 Alicuotar los reactivos de acuerdo a la siguiente tabla y almacenar a -20ºC. Volúmenes suficientes para procesar 20 muestras. NoV Buffer Mix 327 µl 1.5 ml Microcentrífuga Tubo NoV Enzima Mix 27 µl 0.5 ml Microcentrífuga Tubo NoV Partidor Mix 42 µl 0.5 ml Microcentrífuga Tubo NoV Sonda Mix 21 µl 0.5 ml Microcentrífuga Tubo 7.7 Descongelar muestras, solución de partidores, solución de sondas, control interno, buffer mix, MgCl 2 50 mm y agua para PCR y colocar en hielo. La enzima debe ser mantenida en hielo todo el tiempo no necesita ser descongelada. 7.8 Descongelar y centrifugar cada reactivo por 3 segundos y luego mantener en una gradilla de enfriamiento o sobre hielo. 7.9 No se recomienda vortear la enzima pero si mezclar suavemente por pipeteo, centrifugar por 3 segundos y regresar al frío Preparar el master Mix, de acuerdo a la tabla siguiente. Calcular el volumen necesario, considerando el número de muestra y controles de reacción. Mantener todos los reactivos descongelados en hielo.

5 PRT Página 5 de 7 Reactivo Volumen por 25 µl reacción Numero de Reacciones Master Mix NoV Buffer Mix µl NoV Partidor Mix 2 µl NoV Sonda Mix 1 µl NoV Enzima Mix 1.25 µl CIA 0.2 µl RNA 5 µl 7.11 Agregar 20 µl de Master Mix a cada pocillo Agregar las muestras y controles a los pocillos. El volumen de templado agregado a la reacción debe ser entre 2 y 5 µl Agregar el volumen de agua necesario para completar 25 µl de volumen final. El RNA viral debe ser agregado en un lugar distinto del área de preparación del Master Mix Sellar la placa, colocar en el termociclador y dar inicio al programa.

6 PRT Página 6 de El equipo debe estar programado para cumplir con las siguientes condiciones: Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Hold Hold 3 ciclos Temp Seg Optics Temp Sec Optics Repetir 50 veces Off Off Temp Seg Optics Off Off On 7.16 Para el análisis de resultados considerar que en este ensayo la sonda FAM es para enterovirus, Cy5 (FAM) es para Norovirus G1, Cy3 es para Norovirus G2 y la sonda Texas Red (TxR) es el control interno de amplificación (IAC). Por lo tanto cualquier muestra que cruce el umbral; en FAM es positiva para Enterovirus, en Cy5 es positiva para Norovirus genogrupo I, en Cy3 es positiva para Norovirus genogrupo II y en TxE es positiva para Control Interno de Amplificación (CIA) Si el CIA es negativo el ensayo debe ser considerado inválido. 8. REGISTROS 8.1 Registro resultados detección norovirus en moluscos bivalvos 9. ANEXOS Anexo N 1 Tabla Nº 1. Secuencia de partidores, sondas y control interno.

7 PRT Página 7 de 7 Tabla Nº 1. Secuencia de partidores, sondas y control interno. Identificación Secuencia de partidores GIF 5 CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA 3 G1R 5 CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C 3 G2F 5 CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 3 G2R 5 TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 3 IC46F IC194R 5 GAC ATC GAT ATG GGT GCC G-3 5 -AAT ATT CGC GAG ACG ATG CAG-3 G1P1 5 Cy5- AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA- IB FQ 3 G1Pb 5 Cy5- AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA- IB FQ 3 G2P 5 Cy3- TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT- IB RQ 3 ICP 5 TxR TCT CAT GCG TCT CCC TGG TGA ATG TG -IB RQ 3