Alérgenos Alergias Alimentarias Métodos de Detección y Cuantificación Detección cuantitativa de Gluten

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Blanca Sosa Rojo
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1 Cuantificación de Gliadina Diciembre 2012 Santiago de Chile, Chile Herramientas para la detección de Alérgenos para la Industria Alimentaria: Apoyando a la Industria a entregar Alimentos mas seguros para la Población Chilena Inst. de Salud Pública de Chile - ACHIPIA Alérgenos Alergias Alimentarias Métodos de Detección y Cuantificación Detección cuantitativa de Gluten Dra. Cristina D Aiutolo c.daiutolo@r-biopharmlat.com.ar SA V. de Obligado 2943, CABA, Argentina info@r-biopharmlat.com.ar

de Salud Pública de Chile - ACHIPIA Alérgenos Alergias Alimentarias Métodos de Detección y Cuantificación Detección

2 Alérgenos Alergias alimentarias Reglamentaciones Gestión de Alérgenos en la Industria Control de Alérgenos en Plantas Detección y Cuantificación de alérgenos Métodos de análisis LDF ELISA RT PCR Índice

Alérgenos en Plantas Detección y Cuantificación de

3 Alérgenos Sustancias inocuas, que causan reacciones alérgicas en ciertas personas Pueden ser de efecto local, sistémico, producidos por alimentos Cuando son alimentos: REACCIONES ALIMENTARIAS No mediadas por anticuerpos: INTOLERANCIAS ALIMENTARIAS Mediadas por anticuerpos: ALERGIAS ALIMENTARIAS Los alérgenos tienen efecto en bajas concentraciones (trazas) Alérgenos

ALIMENTARIAS No mediadas por anticuerpos: INTOLERANCIAS ALIMENTARIAS Mediadas por

4 Alergias alimentarias Reacciones anómalas del organismo por ingesta Desencadenadas generalmente por proteínas Se producen anticuerpos específicos (IgE) e histamina Los síntomas que van de leves (urticaria) a severos (shock anafiláctico muerte) Los alérgenos problemáticos: OCULTOS - producto de contaminación no intencional (contaminación cruzada) Alergias alimentarias

síntomas que van de leves (urticaria) a severos (shock anafiláctico muerte) Los alérgenos

5 Alergias alimentarias Dependiendo de las incidencias de alergias en cada país, los alérgenos se han clasificado en: Los grandes 8 Los grandes 14 Leche Apio 90% niños Huevo Mostaza Maní Sésamo Frutos secos 90% adultos Crustáceos Pescados Lupines Moluscos Sulfitos Soja Trigo (gluten) Alergias alimentarias

Leche Apio 90% niños Huevo Mostaza Maní Sésamo Frutos secos 90% adultos

6 Reglamentaciones Pocos países en Latinoamérica (y en el mundo) POSEEN reglamentación sobre declaración de alérgenos en la lista de ingredientes: Bolivia, Colombia, Costa Rica, Chile, Cuba, Méjico, Nicaragua, Perú y Venezuela La mayoría NO POSEEN reglamentaciones: Argentina, Brasil, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Haití, Honduras, Panamá, Paraguay, República Dominicana y Uruguay Reglamentaciones

Méjico, Nicaragua, Perú y Venezuela La mayoría NO POSEEN reglamentaciones: Argentina, Brasil,

7 Gestión de Alérgenos en la Industria Objetivos: Minimizar el riesgo de episodios de alergias en personas sensibles Maximizar las posibilidades de elección de alimentos nutritivos por parte de consumidores alérgicos Garantizar dos condiciones principales: Que los ingredientes o aditivos alergénicos que se agregan al producto se declaren en la lista de ingredientes. Que no haya alérgenos no intencionales que contaminen al producto por contacto cruzado. Aplicación de BPM Gestión de Alérgenos en la Industria

principales: Que los ingredientes o aditivos alergénicos que se agregan al producto se declaren en la lista de ingredientes.

8 Gestión de Alérgenos en la Industria Gestión de Alérgenos en la Industria

9 Control de Alérgenos en planta Diferentes metodologías para detección de alérgenos: Control Detección y cuantificación Confirmación Control de Alérgenos en planta

10 Detección y Cuantificación de Alérgenos Requerimientos para desarrollar un kit: Caracterizar la/las proteína/s alergénica/s Purificarla/s Obtener anticuerpos específicos con alta afinidad y avidez Detección y Cuantificación de Alérgenos

alergénica/s Purificarla/s Obtener anticuerpos específicos

11 Detección y Cuantificación de Alérgenos Características de un kit: Que se pueda estandartizar Estándares certificados (extractos de alérgenos estandartizados) Que se pueda validar/certificar por organismos internacionales AOAC / AFNOR Que tenga bajos límites de detección y cuantificación Que detecte alérgenos también en alimentos procesados Que tenga buena reproducibilidad de resultados Detección y Cuantificación de Alérgenos

internacionales AOAC / AFNOR Que tenga bajos límites de detección y cuantificación Que detecte alérgenos

12 Métodos de Análisis Ensayos inmunológicos: Inmunocromatografía (LFD) Enzimoinmunoensayo (ELISA) Reacción es cadena de la polimerasa: PCR-Gel RT-PCR Espectroscopía de masas: LC-MS-MS Métodos de Análisis

13 Métodos de Análisis - LFD Métodos cualitativos Simples de utilizar Control de limpieza: superficie como CIP Materias primas (ojo Hook) LFD

14 Métodos de Análisis - LFD Banda Control Muestra Negativa Banda Muestra Banda Control Banda Muestra Muestra Positiva Y Y Oro coloidal Alérgeno Anticuerpo Anti-Alérgeno Anticuerpo Anti-Anticuerpo (específico de especie) LFD

Muestra Positiva Y Y Oro coloidal Alérgeno Anticuerpo

15 LFD - bioavid Ensayo inmunocomatográfico No competitivo Cualitativo Los kits se almacenan a temperatura ambiente Un kit para cada alérgeno Componentes del kit: Viales de reacción (x 25) Tiras de reacción (x 25) Buffer de corrida (frasco gotero) Control positivo (liofilizado x 1) LFD

Componentes del kit: Viales de reacción (x 25) Tiras de reacción (x

16 LFD - bioavid Código Alergeno Límite de detección BL Coco 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Almendra 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Nuces de Brasil 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Mostaza 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Avellana 5 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Nuces de Macadamia 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Maní / Cacahuate 5 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Nuez (Nogal) 10 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Huevo 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Sésamo 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Castañas de Cajú 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Pistacho 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Leche 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Soja 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL Crustáceos 10 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BS Kit de Hisopado Kit para el muestreo BS Buffer de Absorción Buffer para la preparación de muestras conteniendo polifenoles LFD

matriz BL606-25 Maní / Cacahuate 5 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL607-25 Nuez (Nogal) 10 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL608-25 Huevo 1 mg/kg (ppm) dependiendo de la matriz BL609-25

17 Métodos de Análisis Ensayos inmunológicos: Inmunocromatografía (LFD) Enzimoinmunoensayo (ELISA) Reacción es cadena de la polimerasa: PCR-Gel RT-PCR Espectroscopía de masas: LC-MS-MS Métodos de Análisis

18 Métodos de Análisis - ELISA Métodos cuantitativo Simples de utilizar: requiere de un espectrofotómetro de lectura vertical Control de productos: materias primas y/ó productos terminados Personal medianamente entrenado ELISA

de lectura vertical Control de productos: materias

19 Métodos de Análisis - ELISA Medición del producto Agregado de Solución stop Agregado de sustrato/cromógeno Agregado del anticuerpo conjugado con enzima Agregado de la muestra: Antígeno contenido en la muestra Anticuerpo adsorbido a fase sólida ELISA

anticuerpo conjugado con enzima Agregado de la muestra:

20 ELISA Enzimoinmunoensayo sandwich Cuantitativo Enzimoinmunoensayo competitivo Cuantitativo (R7021 Gliadina Competitive) Los kits se almacenan a 4 8ºC Un kit para cada alérgeno Dos tipos de kits: FAST: 48 pocillos Ridascreen: 96 pocillos ELISA

Competitive) Los kits se almacenan a 4 8ºC Un kit para cada

21 ELISA Código Alergeno Límite de detección R7001 Gliadina 3 ppm de gluten R6402 FAST Huevo 0,27 ppm de huevo entero ó 0,07 ppm de clara de huevo R6202 FAST Maní 1,50 ppm de maní R6802 FAST Avellana 1,50 ppm de avellana R6901 FAST Almendra 1,70 ppm de almendra R4652 FAST Leche 0,7 ppm de leche R4902 FAST β-lactoglobulina 0,19 ppm de β-lactoglobulina R4901 β-lactoglobulina 0,12 ppm de β-lactoglobulina en productos hipoalergénicos R4602 FAST Caseína 0,34 ó 1,36 ppm dependiendo de la matriz R6452 FAST Lisozima 0,02 ppm de lisozima R6152 FAST Mostaza 0,22 ppm de mostaza en polvo R6102 FAST Lupín 0,60 ppm de lupín R7302 FAST Crustáceos 0,17 ppm de proteína de crustáceo ELISA

22 Validaciones externas R7001 Ridascreen Gliadin AOAC Performance Tested Status 2006, RI Cert. No Método Oficial (Tipo 1) del Codex Alimentarius AOAC Official Method Status, OMA First Action 2012,01 ELISA: Validaciones

23 Validaciones externas R6202 Ridascreen FAST Peanut AOAC Performance Tested Status, RI Cert. No ELISA: Validaciones

24 Métodos de Análisis Ensayos inmunológicos: Inmunocromatografía (LFD) Enzimoinmunoensayo (ELISA) Reacción es cadena de la polimerasa: PCR-Gel RT-PCR Espectroscopía de masas: LC-MS-MS Métodos de Análisis

25 Métodos de Análisis Real Time PCR Métodos de detección de ADN. Cualitativo ó cuantitativo Requiere de equipamiento específico: termociclador Control de materias primas y/ó productos terminados Personal altamente entrenado RT PCR

26 REAL TIME PCR PCR Tiempo Real Para 100 reacciones controles de Inhibición interna Para diferentes termocicladores que utilicen tubos ópticos ó placas de 96 (ABI PRISM series, BIO-RAD icycler, Stratagene Mx series, Corbett RotorGene series, MJ Opticon series, Cepheid SmartCycler etc.) Traen: Reaction mix Control de inhibición Control positivo Taq Polimerasa FDE (Fluoresc. Detection Enhancer) RT PCR

27 REAL TIME PCR Código Alergeno Límite de detección S1012 SureFood PREP Allergen Preparación de ADN S3301 SureFood QUANTARD Allergen 40 Cuantificación: 14 allergenos en concentración de 40 ppm S3101/S3201 Soya < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3102/S3202 Avellana < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3103 Maní < 5 copias de ADN S3104 Almendra < 5 copias de ADN S3105/S3205 Apio < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3106/S3206 Gluten < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3107 Nuez (Walnut) < 5 copias de ADN S3108/S3208 Sésamo < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3109 Mostaza < 5 copias de ADN S3110 Pescado < 5 copias de ADN S3111/S3211 Lupín < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3112 Crustáceos < 5 copias de ADN S3113 Moluscos < 5 copias de ADN S3114/S3214 Pistacho < 5 copias de ADN; 0,4 ppm S3115 Castañas de Cajú < 5 copias de ADN RT PCR

28 Métodos de Análisis Ensayos inmunológicos: Inmunocromatografía (LFD) Enzimoinmunoensayo (ELISA) Reacción es cadena de la polimerasa: PCR-Gel RT-PCR Espectroscopía de masas: LC-MS-MS Métodos de Análisis

29 Métodos de Análisis LC MS-MS Métodos de confirmación de proteínas alergénicas Requiere de equipamiento específico y de última tecnología Muy caro y complicado Personal altamente entrenado LC-MS-MS

30 Cuantificación de Gliadina Diciembre 2012 Santiago de Chile, Chile Por su atención!!!!! SA V. de Obligado 2943, CABA, Argentina

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