PCR. Componentes del PCR. PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

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1 PCR PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis. (Nobel de química en 1993) Necesidad de pruebas de diagnóstico rápido. El objetivo es obtener un gran número de copias a partir de un segmento determinado de DNA. Componentes del PCR REACTIVOS Y ENZIMAS - Taq polimerasa. - Primers u oligonucleotidos. - Buffer de amplificación (KCl, Tris y MgCl 2 ). - Deoxinucleotidos trifosfato dntps. - Muestra de DNA ó cdna. FUNDAMENTO La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar mas de un millón de veces un DNA obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, utilizando para ello las propiedades de la Taq Polimerasa, siempre y cuando se conozca una parte de la secuencia de nucleótidos. MATERIALES Y EQUIPOS - Micropipetas de 2, 100 y 1000 µl. - Puntas para micropipetas. - Termociclador - Tubos Eppendorf Se debe disponer de un primer en sentido 5 a 3, este será el F ó Forward. Y un primer en sentido inverso, este será el R ó Reverso que en realidad es un Inverso complementario a la hebra que va en sentido 3-5 y debe sintetizarse en sentido 5-3!!! El diseño de cebadores no debe basarse en una sola secuencia conocida, pues debemos tener la seguridad de que estos se incorporaran a regiones que no sean variables entre individuos de la misma especie, genero o familia. ACTINALVANN_F: ACCCCATCGAGCACGGCATCG ACTINALVANN_R: TGGTCTCGTGGATGCCGCAGG Inv compl CCTGCGGCATCCACGAGACCA Primer F Primer R Así se sintetiza GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATTTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGCTTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATCTTTGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATAATCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGT CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGAACATATTCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATCATATTCAGC 1

2 0 Cebador especie 1: GATGCACATATCTGACT GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATTTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGCTTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTAGTATCTTTGCTACCCACATGCTAGATTATATTCAGC GATGCACATATCTGACTACTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATAATCAGC Cebador especie 2: CATGCATATATCTGAC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGT CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATTATATTCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTATGCTAGCCACATGCTAGAACATATTCAGC CATGCATATATCTGAC-AGTATCTTTGCTAGCCACATGCTAGATCATATTCAGC Reglas Generales para el diseño de cebadores para PCR Secuencia única de nucleótidos Extremo 3 con presencia de GC Complementariedad interna Complementariedad con el otro cebador Composición y distribución de nucleótidos Longitud del cebador Parámetro Temperatura de Incorporación Composición de la secuencia flanqueada Longitud de la secuencia flanqueada Sitio único de hibridación en el templete 1-2 G-C nucleótidos < 3 bases contiguas < 3 bases contiguas %GC 45-60, TM C, < 4 G s ó C s Continuas nucleótidos 1-2 C de diferencia entre cebadores Parecida en proporción de bases al cebador nucleótidos Óptimos Evitar formación de palindromes o dimeros. Un perfil de PCR es la secuencia de pasos que se programan en el termociclador para indicar las condiciones de la reacción: DESNATURALIZACION Desnaturalización Inicial 95 C 5 min Fase Cíclica (X) 3 Desnaturalización 95 C 1 min Extensión Final Extensión 72 C 72 C Incorporación 2 min 5 min Enfriamiento Desnaturalización por calor aplicando temperaturas de 90 a 95 C C 1.5 min C Indefinido 2

3 HIBRIDACION ENLONGACION Annealing o de emparejamiento. 40 hasta 65 C. Temperatura optima de apareamiento entre los primers y la cadena de ADN a amplificar. La taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3 del primer. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser 72 +/- 5 C. Depende de la enzima utilizada Cada enzima tiene diferentes requerimientos y varía en especificidad, eficiencia y velocidad Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo permite obtener, amplificación, millones de copias del fragmento de interés. Los modelos también evolucionan. Todo esto, se realiza de forma automatizada, en un termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de DNA se emplean técnicas de electroforesis. Agarosa polisacarido extraído de algas marinas. Se usa a concentraciones de 0.5-2%. Facil de preparar y no tóxico. Separa fragmentos de ,000 pb. Bajo poder de resolución. RT- PCR TIPOS DE PCR Donde el molde inicial es RNA (mrna) y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversión del RNA a un tipo de DNA llamado DNAc (DNA complementario). Polyacrilamida- son polimeros de acrilamida. Se usa a concentraciones de %. Dificil de preparar y acrilamida neurotóxica. Rango bastante reducido de separación, pero de gran poder de resolución. Separa fragmentos de 500 pb. Mas usual para proteínas. 3

4 PCR anidada Técnica muy sensible, el producto de la amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con primers que se encuentran en la primer secuencia amplificada. PCR IN SITU Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. Se realiza una primera amplificación de DNA blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de DNA/RNA. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. PCR Multiplex Se amplifica mas de una secuencia en una misma reacción, se emplean dos o mas pares de primers con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de DNA PCR TIEMPO REAL La principal característica es que permite cuantificar la cantidad de DNA o RNA presentes en la muestra original. Se utiliza comúnmente para determinar la expresión del mrna de un gen. Se utiliza una sustancia marcada con un fluorocromo que, en un termociclador con sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorocromo a la longitud de onda apropiada, permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. SYBR Green Taqman Aplicaciones La técnica tiene una multitud de aplicaciones: Medicina Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso Se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006). Agronomía y diversidad Permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés agronómico. Paleontología, antropología biológica, y ciencias forenses. permite recuperar las escasas cantidades de ADN que aún no se han degradado. 4

5 TSV en America 1992 DNA WSSV en America 1998 ssrna RT-PCR como técnica poderosa para detectar portadores asintomaticos Materiales y Métodos: Primers para WSSV (Lo et al., 1996) Primers para TSV (Nunan et al., 1998) -Pl a Juveniles de 3.5 g libres de WSSV y TSV por PCR. -90 camarones por acuario de 90L. Objetivo: Realizar la detección simultanea de WSSV y TSV en un solo tubo por 1-step multiplex RT-PCR -Inoculos de P. monodon y L. vannamei infectados. -Pleopodos colectados de organismos moribundos (20 ng). Extracción de RNA Fragmentos: TSV 231 pb WSSV 530 pb ITS 892 pb RT-PCR multiplex Gel de agarosa al 2% Resultado: 5

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