Técnicas de Biología Molecular. Dr. Luis Salazar N Depto. de Ciencias Básicas / UFRO

Transcripción

1 Técnicas de Biología Molecular Dr. Luis Salazar N Depto. de Ciencias Básicas / UFRO 2004

2

3

4 Extracción de ácidos nucleicos o o DNA RNA

5 Tipos de Muestras Sangre total (EDTA) Saliva Líquido Amniótico Bulbo capilar Tejidos, huesos, dientes Forense Manchas de sangre, líquido seminal y otros materiales

6 Muestra de sangre en papel filtro

7 Extracción de DNA genómico lisis centrif. etanol etanol 70% elución sangre lisado sobrenadante DNA

8 Sala de Extracción de DNA

9 CABINA DE SEGURIDAD BIOLÓGICA

10 CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA

11

12 Evaluación del DNA extraído Espectrofotometría UV Concentración (A260 x factor) Pureza (relación A260/A280) Electroforesis en gel de agarosa Integridad Pureza (contaminación con RNA)

13

14 Electroforesis de DNA

17 Electroforesis de DNA NaCl 5 M Nal 6 M Gel de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etídio

18 Electroforesis de RNA 28 S 18 S Electroforesis en gel de agarosa desnaturante

19 Técnicas para análisis de DNA Southern blot PCR Clonación DNA chips

20 Southern blot Hae III Singer & Berg, 1991

21

22

23 Southern blot

24 Southern blot- Sondas unilocus

25 Caracterización molecular de resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri aisladas en niños chilenos con diarrea aguda Detección del gen cat mediante Southern en cepas de Shigella flexneri Rev. Méd. Chile 2002; 130 (3):275-

26 Southern blot Sondas multilocus Caso de criminalística Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)

27 Southern blot Desvantajas Gran cantidad de muestra Ensayo demorado Uso de sondas marcadas con radioisótopos

28 Polymerase Chain Reaction -PCR

29 Que es la reacción de polimerasa en cadena? Es un método para amplificar selectivamente un segmento de ADN. El segmento puede ser una pequeña parte o una larga y compleja parte de ADN. Es un método para copiar trozos de ADN.

30 Qué tan útil es el PCR? Mediante el PCR se pueden amplificar una cantidad de DNA visible en gel de electroforesis en ~2 horas. El templado de DNA no necesita ser demasiado puro (una colonia de bacteria hervida). El producto del PCR puede ser digerido, secuenciado o clonado. Se puede amplificar a partir de una molécula de ADN.

31 Invención del PCR El principio básico de la replicación del ADN usando partidores fue descrito por Gobind Khorana en Inventado por Kary Mullis en Ganó el premio Nóbel de Química en 1993.

32 Thomas D. Brock - Yellowstone National Park

33 Qué hay en la Reacción? Templado DNA Buffer reacción (Tris, amonio, iones magnesio, BSA) Deoxinucleotidos trifosfato (dntps) Partidores ADN polimerasa (Taq)

34 PCR - Componentes DNA Mg 2+ Taq DNA Polimerasa dctp dgtp dttp datp Partidores (primers) Mezcla de Reacción

35 Termociclador

36

37 Ciclos del PCR ciclos: denaturación (95 C), 30 sec. annealing (55 60 C), 30 sec. extensión (72 C), tiempo depende del tamaño del producto.

38 PCR - Desnaturación Target Sequence Target Sequence

39 5 5 3 PCR - Alineamiento Target Sequence 3 partidor 2 partidor 1 3 Target Sequence 5 5 3

40 Los iniciadores sirven para dos fines: a. Marcar los extremos del segmento diana, de manera que solamente este segmento será amplificado y no toda la hebra. b. iniciar el proceso de duplicación.

41 Diseño de partidores Longitud de bases. El contenido de G/C debe ser de 45 55%. Valores de T m no debe variar en mas de 5 C uno del otro. El extremo 3 -debe ser G o C. Evitar las secuencias repetidas. Para evadir la formación de dímeros y de hairpins.

42 Partidores PCR

43 5 5 3 PCR - Extensión 3 partidor 1 Target Sequence Target Sequence partidor 2 Taq DNA Polimerasa

44 Final del primer ciclo Target Sequence Target Sequence

45 Ciclos de la PCR Denaturación Hibridación Final de ciclo Extensión

46 PCR

47 Amplificación Exponencial 1 ciclo = 2 Amplicon 2 ciclo = 4 Amplicon 3 ciclo = 8 Amplicon 4 ciclo = 16 Amplicon 5 ciclo = 32 Amplicon 6 ciclo = 64 Amplicon 7 ciclo = 128 Amplicon No. No. Ciclos copias

48 Funcionó? Revisar las muestras en geles. El producto es del tamaño esperado? Hay más de una banda? Alguna banda tiene el tamaño correcto? Es necesario optimizar las condiciones de la reacción.

49 FACTORES QUE AFECTAN LA PCR Temperatura y tiempo de desnaturación Temperatura de hibridación y diseño del iniciador Tamaño del iniciador Temperatura y tiempo de elongación Tampón Número de ciclos

50 OPTIMIZACIÓN DE LA PCR Usar iniciadores distantes entre 150 y 250 pares de bases Usar cada iniciador de aproximadamente 20 bp. Cerca de la mitad de las bases en cada iniciador debería ser citocinas y guaninas. Para el control de la técnica es importante amplificar un gen control (ej. α-glucosidasa) en cada muestra, esto demuestra la calidad de la extracción. Idealmente el iniciador control debe amplificar un gen similar en tamaño al gen objetivo.

51 Optimización de la PCR Concentración de ADN Concentración de iniciadores Concentración de cloruro de magnesio Número de ciclos

52 Concentración de ADN RLDL 258 bp ng

53 Concentración de iniciadores RLDL nm

54 Optimizar la reacción de PCR Numero de ciclos. Tiempos de denaturación, annealing y extensión. Temperatura de Annealing de los partidores. Concentración de Mg 2+.

55 Cuantos ciclos? Mas de 35 ciclos no tiene un gran efecto. Se acumulan productos inespecíficos. El plateau se produce por: Depleción de sustratos. Reanneailing de los productos. Baja la actividad de la polimerasa.

56 Número de Ciclos RLDL GAPDH Ciclos Ciclos

57 Tiempos de casa fase El tiempo de denaturación varia de acuerdo al porcentaje de GC del templado. Extensión, la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada ej.: 72 C para Taq 1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min.

58 Optimizar la temperatura de annealing Se puede calcular la T m de los partidores. La T m debe ser confirmada experimentalmente. Se utilizan temperaturas 2º sobre o bajo la T m. Uso de gradiente.

59 Efecto de la temperatura de alineamiento en la especificidad de la PCR Rev. Chil. Infectol. 2002;

60 Optimizar la Concentración de Mg 2+ La fidelidad del PCR depende de [Mg 2+ ]. Variar [Mg 2+ ] en pasos de 0.5 mm. Cantidad o especificidad?.

61 Concentración de MgCl 2 RLDL GAPDH mm mm

62 Tamaño del producto El tamaño de los productos varia generalmente entre bp. Es posible amplificar segmentos de mayor tamaño. Se requieren buffer de reacción modificados, cocktails de polimerasas, y mayores tiempos de extensión.

63 Amplificación del gen KasA de Mycobacterium tuberculosis de cepas resistentes a Isoniazida (INH) M M Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio

64 Caracterización molecular de resistencia a cloranfenicol en cepas de Shigella flexneri aisladas en niños chilenos con diarrea aguda 1003 bp Detección del gen cat mediante PCR en cepas de Shigella flexneri Rev. Méd. Chile 2002; 130 (3):

65 Amplificación por PCR del gen meca de cepas de S. Aureus resistentes a meticilina 161 bp Rev. Chil. Infectol. 2001; v.18, n.4

66 Fidelidad de la reacción La Taq polimerasa no tiene actividad nucleasa 3 5 proof-reading. Taq incorpora 1 base errónea por cada ~3000. Los errores se distribuyen al azar.

67 Importan los errores? No, para clonamiento del producto, corte con enzimas de restricción, etc. Si, en estudios de mutación, secuenciación, etc. Es recomendable utilizar enzimas con actividad proof-reading como: Pwo Pyrococcus woesei Pfu Pyrococcus furiosus.

68 Variantes de la PCR TouchdownPCR Hot startpcr Colony PCR Nested PCR Multiplex PCR PCR inverso RT-PCR PCR en tiempo real

69 Variantes de la PCR Touchdown PCR: en cada ciclo se disminuye gradualmente la temperatura de annealing. Obtener mayor cantidad de productos. Hot start PCR: la polimerasa es agregada o activada a alta temperatura. Evita la formación de productos inespecíficos.

70 Variantes de la PCR Colony PCR: como templado se utiliza una colonia o cultivo bacteriano. Método rápido de screening. Nested PCR: se utiliza como templado el producto obtenido en un PCR, con otro par de partidores. Aumentar la cantidad de un producto en particular.

71 Multiplex PCR PCR en el cual hay presentes múltiples pares de partidores, lo que da una serie de productos. Es frecuentemente usado en diagnóstico médico. Ahorra templado, tiempo y gastos.

72 PCR inverso Se utiliza para amplificar las regiones adyacentes a una secuencia de ADN. El ADN es digerido por enzimas de restricción. Usando ADN ligasa el producto de la resticcion es circularizado. Se utilizan primers dirigidos hacia afuera de la sequencia conocida.

73 Inverse PCR

74 RT-PCR Para amplificar copias de cdna a partir de RNA. Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de RNA. Primero se hace un cdna a partir del templado de ARN. Luego se usa un segundo primer ( sense ) para hacer el duplex de cdna por PCR.

75 RT-PCR mrna (sense) AAAAAAAAAA-3 : TTTTTTTTTT-5 oligo(dt) Transcripción reversa (RT) 1ra cadena cdna AAAAAAAAAA-3 TTTTTTTTTT-5 PCR P1 P2

76 PCR en tiempo real Se utiliza para determinar la concentración inicial de templado. Cuantificación de ARNm, diagnóstico de enfermedades genéticas, presencia de virus y bacterias, Requiere estandarización con muestras conocidas. Alta sensibilidad, rapidéz. Alto costo de los equipos.

77 PCR en tiempo real

78 PCR en tiempo real

79 Real Time PCR

80

81 Inhibiciones en amplificación por PCR Rev. Chil. Infectol. 2002;

82 Características de la PCR o Alta sensibilidad y especificidad o Menor cantidad de muestra o Reducción del tiempo de ensayo o Riesgos - contaminación

83 Normas Generales para reducir la contaminación Organización del laboratorio Técnicas de laboratorio adecuadas Uso de control de reactivos Número de muestras Bioseguridad

84 Aplicaciones del PCR Amplificación de segmentos de ADN. Diagnóstico o screening Enfermedades adquiridas (SIDA). Perfiles genéticos. Mutagénesis sitio-dirigida de genes. Cuantificación de RNAm.

85 Importancia de las enzimas en biología molecular

86 Importancia de las enzimas en biología molecular Replicación y Transcripción polimerasas ligasas nucleasas quinasas fosfatasas transcriptasa reversa

87 Aplicaciones de las Enzimas de Restricción Tecnología de DNA recombinante clonación de genes Estudio de polimorfismos genéticos Polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción (RFLP) Pesquisa de mutaciones Investigación de enfermedades genéticas

88 Importancia de las enzimas en biología molecular Polimerasas catalizan la síntesis de polimero de ácido nucleico Son fundamentales para clonación y amplificación de genes. Taq DNA polimerasa.

89 Importancia de las enzimas en biología molecular Nucleasas hidrolizan la ligación fosfato-diéster de los polimeros de ácidos nucleicos Exonucleasas Endonucleasas - Enzimas de restrición

90 Enzimas de Restricción Reconocen secuencia de DNA específica Degrada DNA extraño mecanismo de protección para bacterias Especie - específica Extremidades generadas asimétricas - sticky end simétricas - blunt end G*AATTC CTTAA*C GT*AC CA*TG G AATTC CTTAA C GT AC CA TG

91

92

93 Endonucleasas de Restricción Bam HI Eco RI Hinc II Hind III Kpn I Pvu II Xba I G*GATCC G*AATTC GTY*RAC (Y = C/T, R = A/T) A*AGCTT GGTAC*C CAG*CTG T*CTAGA

94 Endonucleasas de Restricción DNA ER 1 ER 2 Separación electroforética en gel de agarosa Tamaño del fragmento dirección de la eletrocforesis Tamaño del fragmento Singer & Berg, 1991

95 Representación de la acción de una enzima de restricción

96

97 Técnica de RFLP (restriction fragment length polymorphism) 5 Exon 25 Exon 26 Exon 27 3 PCR Restricción Enzimática XbaI Fragmento amplificado 710 bp 710 bp Genotipo X-X- 277 bp Genotipo X+X- 433 bp 710 bp 433 bp 277 bp Genotipo X+X+

98 Polimorfismo XbaI del gen de la apob -/- +/- +/- +/+ 710 bp 433 bp 277 bp Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etídio

99 Detección de mutaciones

100 SSCP Single Strand Conformation Polymorphisms

101 Screening de alteraciones moleculares en el gen RLDL EXONES M P A 4B 5 M A 10B 11 M (Gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio)

102 GenePhor

103 Representación de la separación electroforética

104 Perfil de SSCP de algunos exones del gen RLDL (Gel de poliacrilamida al 12.5% teñido con plata) EXON 6 EXON 9 EXON 11 EXON 8 EXON 12

105 Caracterización molecular de una mutación en el exon 4 del gen RLDL en pacientes con Hipercolesterolemia Familiar N 5... C AGG A C G A G T T T C G C T G C...3 M SSCP Exon 4 DNA Exon 4 N M CC CCC AAG ACG TGC TCC CAG GAC GAG TTT CGC pro lys thr cys ser gln asp glu phe arg códon CC CCC AAG ACG TGC TCC CAG GAC TAG TTT CGC pro lys thr cys ser gln asp stop códon 337 G > T E92X FH Paris-5