Sistema Integrado de Gestión GUÍA PRÁCTICA N 11

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1 Sistema Integrado de Gestión GUÍA PRÁCTICA N 11 PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y TÉCNICAS DE TINCIÓN PROGRAMA DE Versión 3 Código: IV Proceso: Investigación IV Febrero de 2016

2 Página 2 de 9 1. OBJETIVO Adquirir destreza en la preparación de placas de extendidos de cultivos bacterianos. Observar mediante el uso de diferentes coloraciones: la forma, el tamaño, y composición de las bacterias. 2. ALCANCE Esta guía prácticadeberá leerse y comprender su contenido para posteriormente poder desarrollar a cabalidad el objetivo propuesto. 3. DEFINICION La determinación de la morfología en la identificación de los microorganismos, juega un papel fundamental como ayuda para su clasificación. A través de las determinaciones morfológicas y una adecuada consulta bibliográfica científica, se puede efectuar una aproximación a la identificación de los microorganismos. El estudio microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorante, debido a que en condiciones naturales son difíciles de observar. Los colorantes son compuestos orgánicos que contienen radicales cromóforos (que producen color) pueden ser ácidos, básicos o neutros. Los colorantes ácidos, tiñen las partes básicas y los colorantes básicos tiñen las partes ácidas. La coloración de las células parece deberse a una combinación de fenómenos químicos y físicos como la capilaridad, absorción, osmosis, intercambio de iones entre colorantes y sitios activos en la superficie o en el interior de la célula. La coloración simple es el método que consiste en teñir, utilizando un solo colorante ácido o básico, como por ejemplo: azul de metileno, cristal violeta, fucsina o safranina. Estos colorantes se emplean para apreciar la forma y el tamaño, pero no muestran detalles de la estructura interna. La morfología de las bacterias se puede confirmar de dos maneras: 1) observándolas sin teñir se puede evidenciar su movilidad u 2) observándolas muertas teñidas con colorantes. Algunos colorantes diferenciales sirven para observar la estructura interna de las células. Estos colorantes se utilizan en tinciones como: Coloración de Gram Coloración de cápsula Coloración de espora

3 Página 3 de 9 Prueba de KOH Prueba de motilidad La coloración de Gram fue elaborada, por el danés Hans Gram en Esta técnica permite distinguir entre diferentes bacterias que pueden mostrar una morfología similar. Con este procedimiento no solo se hace visible la forma, tamaño y otros detalles estructurales, sino que pueden agruparse en tipos Grampositivos y Gram-negativos por sus reacciones frente a los colorantes. La diferencia en la reacción de coloración entre las positivas y negativas, se atribuye a la diferencia en la composición química de su pared celular. Las paredes de las células Gram negativas tienen un contenido lipídico más elevado que las positivas, y aunque en ambas se forma un complejo cristal violetayodo, el alcohol extrae el lípido de las células Gram-negativas y aumenta la permeabilidad celular. Esto da como resultado la pérdida del complejo cristal violeta-yodo, y los microorganismos se colorean posteriormente de rojo con safranina o fucsina. El colorante es retenido por las células Gram-positivas, en las cuales la deshidratación por el alcohol ocasiona una disminución de la permeabilidad, reteniendo el complejo cristal violeta-yodo tras la decoloración. Al examen microscópico de un extendido coloreado por el método de Gram que contenga una flora bacteriana mixta, se puede observar las características diferenciales del método. Muchas bacterias conservan la combinación violeta-yodo y se teñirá de purpura (Gram-positivas), otras se colorean de rojo por la safranina o el colorante que se emplee en la contra-coloración (Gram-negativas). Las características de la coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes o muy viejos. Las bacterias que poseen capsula no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros componentes de las células por eso exigen el empleo de coloraciones especiales. En la coloración de cápsula se colorea la célula y el interior, pero no la capsula, de manera que la envoltura se aprecia por contraste, aplicando por ejemplo el método de Anthony. Otros procedimientos producen un efecto colorante diferencial, cuando la capsula admite un contra-colorante, o se utiliza el principio de coloración negativa como el método de la tinta china. La prueba de motilidad se presenta en algunas bacterias que presentan movilidad debido a la presencia de flagelos. Este hecho puede ser fácilmente demostrable en condiciones de laboratorio. 4.CONDICIONES GENERALES

4 Página 4 de 9 Se debe leer esta guía previamente al día de la práctica, diseñando un mapa conceptual en el que presente las ideas más relevantes y los pasos a seguir durante el desarrollo de la práctica. Igualmente, solo se podrá ingresar al laboratorioportando la bata de laboratorio blanca, un dulceabrigo o toalla para limpiar superficies de trabajo y libreta de apuntes, junto con materiales propios de cada práctica. 5.1 PROPOSITO 5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA Adquirir la destreza necesaria en la preparación y montaje de extendidos bacterianos y observar mediante el uso de diferentes coloraciones: la forma, el tamaño y composición bacteriana. 5.2 PROCESO DE LA PRÁCTICA Antes de empezar la práctica el docente dará una explicación previa al desarrollo del laboratorio donde presentara los equipos y los reactivosque se utilizaran durante la práctica, explicando que cuidados se deben tener y las normas de seguridad para evitar cualquier accidente. 5.3 MATERIALES Y EQUIPO Proporcionado a cada equipo por la institución: Asa de inoculación Mechero Goteros Lugol de Gram Alcohol-acetona (decolorante) Safranina (contra-tinción) Cultivo bacterianos Colorantes: azul de metileno, cristal violeta, safranina o tinta china Bandeja de coloración Agua destilada estéril Aceite de inmersión Papel lente Cada grupo debe traer para su práctica: Laminas porta-objetos

5 Página 5 de 9 Cubreobjetos Guantes de Látex Bata de laboratorio (uso obligatorio) Marcador sharpie Libreta de apuntes Cronometro 5.4PRÁCTICA A. Preparación de extendidos 1. Esterilice el asa para bacterias, poniéndola verticalmente a la llama del mechero hasta que se ponga de color rojo en toda su longitud. 2. Enfrié el asa introduciéndola en el borde del medio de cultivo. 3. En una lámina porta-objetos limpia, coloque con el asa una gota de agua estéril. 4. Tome con el asa de argolla suavemente una pequeña porción de colonias bacterianas del medio de agar 5. Coloque la muestra sobre la gota de agua del porta-objetos, haga una extensión delgada, con el fin de que las bacterias queden bien esparcidas. Nota: Sí usted observa que lasuspensión no se extiende en la superficie de porta-objetos, sino que se recoge en gotas, significa que el porta objetos esta engrasado y debería repetir el proceso en uno completamente limpio. 6. Realice extendido con todos los cultivos de bacterias que se entregaron. 7. Deje que la preparación se seque al aire. 8. Fije la preparación pasándola dos veces sobre la llama del mechero, así las bacterias quedan firmemente adheridas al porta-objetos. Nota: cuando se hacen extendido a partir de medios líquidos (caldo), no es necesario colocar la gota de agua. B. Coloraciones Simples 1. Coloque las láminas porta-objeto en las que realizó los extendidos sobre una bandeja de coloración. 2. Cubra totalmente los extendidos con los colorantes. Debe tener tres extendidos de cada bacteria para aplicar a cada uno un colorante. Deje actuar los colorantes así: Cristal violeta minuto Azul de metileno minutos Safranina segundos 3. Lave las placas con agua, escurra y deje secar a temperatura ambiente.

6 Página 6 de 9 4. Coloque en el extremo de un porta-objetos una gota de tinta china, tome con el asa una muestra de Klebsiellapneumoniae, mézclela suavemente con la gota. Utilice un porta-objetos limpio para extender la gota y formaruna película delgada. Deje secar. 5. Una vez estén secas las láminas, observe al microscopio en 10X, 40X y 100X. Describa la forma, distribución y coloración. Realice esquemas de lo observado o tome fotos. C. Coloraciones diferenciales (Tinción de Gram) 1. Prepare un extendido fino de una colonia bacteriana y déjelo secar al aire. 2. Fije el material al porta-objetos, de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tinción, pasando el porta-objetos 3 o 4 veces sobre la llama del mechero. 3. Coloque el preparado sobre un soporte de tinción y cubra la superficie con solución de cristal-violeta durante 1 minuto. 4. Lave bien con agua destilada estéril. 5. Cubra el preparado con solución de yodo (lugol de Gram), durante 1 minuto. 6. Lave nuevamente con agua destilada estéril. 7. Sostener el porta-objetos entre el pulgar y el índice, y bañar la superficie con unas gotas del colorante (alcohol-acetona) por 10 segundos. 8. Lave nuevamente con agua corriente y coloque el porta-objetos nuevamente sobre el soporte, cubra la superficie con safranina durante un minuto; lavar con agua corriente. 9. Examine el preparado al microscopio, las bacterias Gram-positivas se observan de color violeta y las Gram-negativas rojo o rosadas. PASO Colorante básico Mordiente Decoloración Contraste COLORANTE/ TIEMPO Cristal violeta 1 minuto Lugol 1 minuto Alcohol-acetona 10 segundos Safranina 1 minuto RESULTADOS GRAM + GRAM - Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta Permanece violeta Permanece violeta Siguen violeta Se decoloran Siguen violeta Se decoloran

7 Página 7 de 9 Figura 1. Procedimiento tinción de Gram

8 Página 8 de 9 REPORTE DE PRÁCTICA PRÁCTICA 2: PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y TÉCNICAS DE TINCIÓN PRESENTADO POR: OBJETIVO: Adquirir la destreza necesaria en la preparación y montaje de extendidos bacterianos y observar mediante el uso de diferentes coloraciones: la forma, el tamaño y composición bacteriana. ACTIVIDAD: 1. Esquematice un montaje bacteriano Gram + y uno Gram-negativo, visualizado en 100X. 2. Porque antes de colorear se debe fijar la muestra? En qué consiste la fijación? 3. Para que sirven las coloraciones simples? 4. Diferencie la tinción negativa de otras? 5. Los frotis de las bacterias capsuladas no se lavan con agua ni se calientan. Por qué? 6. Como se correlaciona la presencia de capsula con la virulencia de una bacteria? Describa un método por el cual se pueda obtener muestras de pared celular para analizar su composición química? 7. Que son las formas L? 8. Clasifique las siguientes bacterias como Gram-positivas, Gram-negativas, conos: Proteusvulgaris, Clostridiumtetani, Staphilococcusaureus, Salmonella, Streptococcuspneumoniae, Bacilluscereus, Pseudomonasso, Bacillussubtilis. 9. Establezca las diferencias entre pared celular de una bacteria Gram-positiva y una Gram-negativa.

9 Página 9 de 9 6. REVISIÓN Y ACTUALIZACIÓN Esta Guía será actualizada por el Docente encargado de la práctica en el laboratorio, revisado por la Dirección Técnica de Investigaciones y la Vicerrectoría Administrativa, esta última como Representante de la Dirección para el SIG, y aprobado por el Vicerrector Académico Aprobación del Documento Nombre Responsable Firma Fecha Elaboró Javier Andrés Bustamante Docente Microbiología 19/02/2016 Reviso Olga Cecilia Suárez María Isabel Andrade Director Técnico de Investigaciones Representante de la Dirección del SIG 19/02/2016 Aprobó Roger Micolta Truque Vicerrector Académico 19/02/2016 Versió n No. Fecha de Aprobación 1 30/01/ /07/2015 Control de los Cambios Descripción de los Cambios Se actualiza la información registrada en el numeral 6 Revisión y Actualización Se cambia la versión y la fecha por actualización del slogan Justificación del cambio Reestructuración del organigrama institucional Nuevo período de la Rectoría