Validación de métodos en Microbiología Ambiental: algunos aspectos fundamentales a considerar
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- Ana Belén Ramos Quintero
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1 Buenos Aires, Argentina de septiembre, 2008 Validación de métodos en Microbiología Ambiental: algunos aspectos fundamentales a considerar Dr.C. María Isabel González González Investigador Titular/ Profesor Auxiliar Laboratorio de Microbiología de Aguas INHEM, Cuba isa@inhem.sld.cu, mariaisa@infomed.sld.cu Aspectos de importancia a considerar: Los métodos de ensayo seleccionados por el laboratorio deben ser validados y documentados de forma adecuada antes de su uso. La validación de los métodos de ensayo debe reflejar las condiciones reales del ensayo (productos contaminados de forma natural o muestras contaminadas con un inóculo conocido). El ensayo microbiológico tiene como objetivo informar sobre la calidad microbiológico de la muestra analizada según el método de ensayo realizado. 1
2 Selección de los métodos de ensayo. El laboratorio tiene la responsabilidad de emplear los métodos adecuados según el alcance requerido. Ellos pueden ser: Normalizados No normalizados Desarrollados por el laboratorio. El laboratorio, de acuerdo con el cliente puede seleccionar los métodos según su propio criterio o emplear los métodos normalizados vigentes en el país. Si se utiliza un método normalizado debe demostrar que sea de la ultima edición, a no ser que sea adecuado también el de la edición anterior. Que es la validación? La confirmación, mediante la aportación de pruebas objetivas de que se han cumplido los requisitos para el uso pretendido o una aplicación especifica. (ISO 9000). La etapa de validación consiste en el proceso de examinar el método para determinar su conformidad con el uso previsto. Guía base: ISO/TR 13843:2000 Water Quality. Guidance on Validation of Microbiological Methods 2
3 Qué se valida? Los métodos no normalizados Los métodos que diseña o desarrolla. Los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto En el caso en que utilice métodos oficiales, métodos normalizados o métodos de organismos nacionales o internacionales reconocidos, o basados en ellos, antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios deberán verificar su capacidad para cumplir de forma satisfactoria todos los requisitos establecidos en dichos métodos. Método normalizado: método de ensayo analítico desarrollado por un organismo de normalización u otro organismo reconocido cuyos métodos son generalmente aceptados por el sector técnico correspondiente. Método no normalizado: método de ensayo analítico desarrollado por un tercero o que ha sido adaptado por el laboratorio a partir de un método normalizado. Método desarrollado por el laboratorio: método de ensayo analítico que no se encuentra en normas u otras colecciones de métodos, ni en publicaciones de terceros, siendo desarrollados por el propio laboratorio. 3
4 Qué significa la validación? Un proceso que ofrece una evidencia de que un método es capaza de servir para su propósito planeado, es decir para detectar o cuantificar un grupo microbiano o microorganismo específico con adecuada precisión y exactitud. Los métodos de recuento total no tienen un grupo objeto definible y solo pueden validarse con relación a otros métodos o contra expectativas teóricas de precisión. Validación primaria. Es un proceso exploratorio con la meta de establecer los limites operacionales y características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma inadecuada. Debe originar especificaciones numéricas y descriptivas para el desempeño e incluir una descripción detallada y precisa del objeto de interés (colonia positiva, tubo o placa). Los laboratorios que desarrollan un metodo en casa o una variante de una norma existente deben realizar la validacion primaria. Es imprescindible que los tecnicos que realizan esta validacion primaria cuenten con la experiencia suficiente. 4
5 Validación secundaria (también llamada verificación). Es cuando un laboratorio procede a implementar un método desarrollado en otra parte. Se centra en la compilación de evidencia acerca de que el laboratorio esta en condiciones de cumplir las especificaciones establecidas en la validación primaria. Normalmente, esta validación emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos empleados en la validación primaria aunque extendidas por un tiempo mayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo optimo y el trabajo solo requiere tratar el procedimiento dentro de los limites operacionales establecidos por la validacion primaria. Parámetros de desempeño que se recomiendan incorporar en la validación. Exactitud. Desviación. Repetibilidad. Reproducibilidad. Especificidad. Limite de detección. Limite de cuantificación. Linealidad. Rango. Sensibilidad. Robustez. 5
6 Parámetros de desempeño que se recomiendan incorporar en la validación. Exactitud de la medición: Grado de correspondencia entre el resultado de un ensayo y el valor de referencia aceptado. Desviación negativa: Ocurre cuando el método alternativo da un resultado negativo sin confirmación y el método de referencia da un resultado positivo. Esta desviación se convierte en un resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo. Desviación positiva: Ocurre cuando el método alternativo da un resultado positivo sin confirmación y el método de referencia da un resultado negativo. Esta desviación se convierte en un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo. Repetibilidad: Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en las mismas condiciones de medición. Parámetros de desempeño que se recomiendan incorporar en la validación. Reproducibilidad: Grado de concordancia entre los resultados de mediciones del mismo mesurando realizadas en diferentes condiciones de medición. Especificidad: Fracción del número total de cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con el método utilizado. Limite de detección: Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos Número mínimo de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión. Limite de cuantificación: Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos Número mí-nimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del método evaluado. Sensibilidad: Fracción del número total de cultivos o colonias positivos que son asignados correctamente con el método utilizado. 6
7 Parámetros de desempeño que se recomiendan incorporar en la validación. Robustez: Insensibilidad de un método analítico frente a pequeños cambios en el procedimiento. Validación primaria, validación completa: especificaciones para el desempeño de un nuevo método. Establecimiento de las Validación secundaria: Demostración mediante experimentos, de que un método establecido funciona de acuerdo a sus especificaciones, cuando lo emplea el usuario. Precisión: Grado de concordancia entre resultados de ensayo independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas. Recuperación: Fracción Termino general empleado para la cantidad de partículas calculada en una porción de ensayo o muestra, entendiendo que existe un numero verdadero (aunque desconocido) de partículas de las cuales el 100% o menos son recuperadas por el detector. Métodos de ensayo microbiológicos cualitativos. Son métodos en los que el resultado se expresa en términos de ausencia/presencia. Los procedimientos de confirmación e identificación del microorganismo, deben ser validados estimando, cuando sea apropiado, su especificidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, límite de detección, efecto matricial, repetibilidad y reproducibilidad Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse muy en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados. 7
8 Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos. Debe considerarse la especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desviación positiva, desviación negativa, repetibilidad, reproducibilidad y el límite de cuantificación dentro de una variabilidad establecida y en caso necesario, determinar cuantitativamente estos parámetros. Las diferencias debidas a las matrices deben tenerse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestras. Los resultados deben evaluarse utilizando métodos estadísticos apropiados. Los laboratorios deben conservar los datos sobre la validación de los sistemas de ensayo comerciales (kits) que utilicen. Extensión de la validación La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su aplicación. La validación es siempre un equilibrio entre costos, riesgos y posibilidades técnicas. Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe cumplir el método, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida. 8
9 Los métodos microbiológicos son intrínsecamente diferentes de otras disciplinas como la física o la química, se trabaja con seres vivos que responden a reglas biológicas diferente a las otras. Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe cumplir el método, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida. Cuando hay gran información sobre una metodología los ensayos para validar son relativamente sencillos, si la experiencia es escasa la validación será extensa. También hay que tener en cuenta las variaciones diarias debido a cambio de analistas, diferentes lotes de medio de cultivo, recalibración de instrumentos, variación de la temperatura de incubación. Toda la información referida a la validación debe ser documentada y archivada. Los procedimientos para la determinación del desempeño de un método es conveniente que incluyan: Comparación con resultados obtenidos con otros métodos. Ensayos interlaboratorios. Uso de cepas de Referencia certificadas (microorganismos conocidos, inoculados en can-tidades conocidas), tanto para los análisis cuantitativos como para los cualitativos Evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado. Evaluación de la incertidumbre basada en el conocimiento científico de los principios teóricos de método y en la experiencia práctica. 9
10 Que es la incertidumbre de medición en microbiología La incertidumbre de medición es un parámetro asociado al resultado de la medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente asignados al mesurando. Indica la calidad de una medición Los análisis microbiológicos se encuadran en la categoría de los ensayos que no permiten realizar un cálculo riguroso, metrológica y estadísticamente válido de la incertidumbre de medida. Se puede basar la estimación de la incertidumbre en datos sobre la repetibilidad y la reproducibilidad exclusivamente, aunque es mejor es incluir los sesgos (p. ej., los sesgos detectados como resultado de la participación en ensayos de aptitud). Algunos componentes (como los efectos del pipeteado, el pesado y las diluciones) pueden medirse directamente y evaluarse fácilmente para demostrar que realizan una contribución insignificante a la incertidumbre global. Otros componentes (como la estabilidad y preparación de las muestras) no pueden medirse directamente y su contribución tampoco puede evaluarse por métodos estadísticos, pero su importancia en la variabilidad de los resultados debe ser también considerada. 10
11 El concepto de incertidumbre no puede aplicarse directamente a los resultados de los ensayos cualitativos como los obtenidos en los análisis de detección o en los de determinación de atributos para fines de identificación. Deben identificarse las distintas fuentes de variabilidad, como la homogeneidad de los reactivos y la interpretación de los analistas, y demostrar que se controlan dichas fuentes. En los ensayos donde el límite de detección es un importante indicador de la validez del método, la incertidumbre asociada al inóculo empleado para determinar el límite debe ser estimada y su importancia evaluada. Los laboratorios deben conocer también la incidencia de resultados falsos positivos y falsos negativos asociada a los ensayos cualitativos que realizan. No hay que olvidar que, en la vida, lo trágico no es alcanzar las propias metas. Lo trágico es no tener metas que alcanzar. No es una calamidad morir sin haber satisfecho los sueños, pero es calamitoso no soñar. No es un desastre ser incapaz de conseguir los propios ideales, pero es desastroso no tener ningún ideal que conseguir. No es una desgracia no alcanzar las estrellas, pero sí lo es no tener estrellas que alcanzar. El pecado no está en el fracaso, sino en la falta de aspiraciones. Dr. Benjamin Mays, Morehouse College, E.U. 11
12 Gracias por su atención 12
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