Northern blot control

Transcripción

1 TRANSCRIPTOMA

2 - Northern blot - Aporta información sobre la presencia de un transcrito, su abundancia y su tamaño - Electroforesis: Se realiza en condiciones desnaturalizantes, Gel: agarosa 0,8-1,4% y formaldehído 6%, en buffer MOPS (3-(N-morfolino)propano-sulfónico) - Las muestras deben desnaturalizarse, buffer de carga: MOPS, formamida, formaldehído, colorante - Transferencia: por capilaridad o vacío, similar a Southern - Hibridación: similar a Southern, buffer con más formamida (50%) - Para comparar diferencias en los niveles de expresión de un gen es muy importante la utilización de un control: generalmente un gen que se exprese constitutivamente: citoesqueleto ( -actina), un gen de ARNr. Las intensidades de la señal del gen en estudio deben normalizarse con las del control

3 - RT-PCR - PCR tiempo real

4 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL - Obtener información sobre genes que se transcriben únicamente o con mayor intensidad en una determinada condición respecto a otra. Se busca analizar el transcriptoma completo. - Estos métodos se basan en la utilización de dos poblaciones de ADNc obtenidas a partir del ARN de las dos condiciones a ensayar: Métodos clásicos: - Hibridación substractiva - Differential display -cdna-aflp - ESTs Métodos basados en genómica: - Microarreglos - RNA sequencing

5 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL - Hibridación substractiva -Se basa en la eliminación de las moléculas de ADNc que están repetidas en las dos condiciones a través de un proceso de hibridación; las moléculas híbridas formadas entre ADNc de las dos condiciones son entonces eliminadas, el resto (expresadas diferencialmente) se aíslan y estudian. - p.ej. Sistema SSH (Supression Substractive hybridization), de Clontech

6 - Hibridación substractiva

7 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL - cdna-aflp - Similar al método de AFLPs pero partiendo del ADNc obtenido a partir de dos condiciones en lugar de DNA genómico. Los patrones de bandas obtenidos con ambas condiciones se comparan para detectar bandas presentes sólo en una condición, indicativo la expresión diferencial de un transcrito.

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10 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL - Differential display - Consiste en visualizar en un gel el nivel de expresión de los transcritos provenientes de dos condiciones diferentes y detectar diferencias en la misma. - Actualmente se utilizan métodos basados en PCR (DD-PCR). - Esquema: - Para cada población de RNA se ponen 3 reacciones de síntesis de ADNc, cada una con un primer oligo-dt anclado: T 12 A, T 12 C, T 12 G - Finalizada la síntesis de la hebra de ADNc, se añade el primer arbitrario (10-12 bases) y todos los componentes para una reacción de PCR, con 32 P-dCTP - Se cargan las muestras, previa desnaturalización, en un gel de acrilamida del 6% desnaturalizante (7 M urea). Autorradiografía - Cortar las bandas de interés (expresadas diferencialmente), eluir el ADN y precipitar con acetato de potasio, glicógeno y etanol. - Reamplificar por PCR usando la combinación adecuada de primer T 12 M (M= A, C o G) con arbitrario - Correr un gel de agarosa con el producto de la PCR. Extraer el fragmento del gel para subclonarlo, secuenciarlo, etc.

11 - Differential display Para cada condición se tiene un pool de RNA que se utiliza para síntesis de ADNc y amplificación con: primer oligo-dt anclado + primer arbitrario. Se obtiene así un patrón de bandas amplificadas para cada condición, las cuales se comparan en un gel de poliacrilamida para detectar transcritos expresados diferencialmente.

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13 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL - SAGE: Serial analysis of gene expression - Se basa en tres principios - Una secuencia corta, tag (etiqueta), de nucleótidos, contiene suficiente información para identificar de forma única un transcrito. - Una vez aislados, estos tags pueden unirse para formar largas series de moléculas de ADN que pueden clonarse y secuenciarse. - La cuantificación del número de veces que un determinado tag está presente en una condición indica el nivel de expresión del gen correspondiente en esa condición

14 - SAGE - Se cortan con las enzimas NlaIII y BsmFI las secuencias tag de cada transcrito de una condición determinada - Se ligan las secuencias aisladas formando largas cadenas de ADN que se secuencian - La secuencia nos indica el número de veces que un tag particular está presente, lo que refleja la abundancia de ese transcrito en una determinada condición, permitiendo hacer comparaciones cuantitativas entre dos o más condiciones - Finalmente se identifican los genes a que corresponden los tags mediante comparación de la secuencia del tag con una base de datos que contenga todos los genes caracterizados de la especie en cuestión

15 - SAGE Obtención de los tags: Se corta con NlaIII, se añaden adaptadores (linkers) para BsmFI y se corta con esta enzima. BsmFI es del tipo IIs, corta a una distancia de unos 15 pares de bases del sitio de reconocimiento (en el linker), generando fragmentos con una secuencia de 15 pb (SAGE tag), que se ligan para formar concatémeros.

16 - ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL - ESTs: Expressed Sequence Tags - Más que un método de differential display es una técnica que permite identificar cientos de transcritos que se están expresando en una célula en un momento y condiciones determinados: transcriptoma - Consiste en la obtención de ADNc de la muestra o muestras en estudio, y en la realización de una única reacción de secuencia que permita identificar mediante búsquedas en bases de datos los genes a que corresponden cada uno de los clones secuenciados. Se obtiene así una representación del transcriptoma que puede compararse entre dos condiciones distintas.

17 - MICROARREGLOS -Un arreglo de ADN es una colección de moléculas de ADN (ADNC u oligonucleótidos) dispuestas sobre un soporte sólido como una matriz de filas y columnas - Macroarreglos: puntos sobre una membrana de nylon o nitrocelulosa, pequeño número. Las sondas (ADNc que proviene de dos condiciones) se marcan por radiactividad. Se detecta la intensidad de la señal en cada punto y se compara la misma entre las dos condiciones. - Microarreglos: Habitualmente oligonucleótidos (20-80 nucleótidos), cada uno de ellos es una secuencia identificativa de un gen. Contienen hasta puntos. El marcaje de las sondas de ADNc se realiza con fluorescencia: rojo (Cy5) para la condición problema y verde (Cy3) para la condición de referencia. El detector compara la intensidad de la fluorescencia e integra el resultado en cada punto, observándose el resultado final como un punto rojo (genes sobreexpresados en la condición problema), verde (genes con menor expresión en la condición problema) o amarillo-naranja (genes con expresión similar en las condiciones problema y de referencia)

18 Confección del microarreglo 1. Colecciones de Expressed Sequences Tags (EST) 2. Bibliotecas de ADNc 3. Secuencias genómicas Procedencia de la información de secuencia para la elaboración de los oligonucleótidos o fragmentos de ADN que se fijarán al arreglo.

19 Confección de arreglos MICROARREGLOS Siembra 0,25-1 nl/punto generando puntos de m de diámetro.

20 Confección de microarreglos

21 Hibridación en microarreglos El experimento tipo consiste en la comparación de los niveles de expresión de todos los genes de un organismo en dos estados celulares (condiciones). Proceso 1. Aislar ARNm a partir de una muestra biológica. 2. Convertir el ARNm en ADNc, utilizando una transcriptasa reversa. 3. Marcar el ADNc con nucleótidos fluorescentes (Cy5 y Cy3) 4. Hibridar el ADNc marcado en el microarreglo. 5. Detectar y cuantificar la fluorescencia utilizando un laser scanner confocal. 6. Analizar los resultados.

22 Síntesis de ADNc

23 Hibridación en microarreglos 1 2 Cy5 = 633 nm Cy3 = 532 nm Cy5 Cy3 Expresión de 1 > 2 Expresión de 1 = 2 Expresión de 1 < 2

24 Microarreglo de levadura

25 - RNA Sequencing - Secuenciación del transcriptoma mediante los nuevos métodos de secuenciación (Next Generation Sequencing) - Permite la obtención de millones de secuencias: gran precisión estadística - Permite la detección de ARNm con maduración alternativa o transcritos no descritos, mientras que los microarreglos sólo permiten estudiar transcritos ya conocidos (lo que se ha depositado en el microarreglo) -Puede realizarse con especies en las cuales no existe información previa de su secuencia genómica (si bien los resultados óptimos se consiguen cuando sí está secuenciado el genoma)

26 PROTEOMA

27 ESTUDIOS CON PROTEÍNAS: SDS-PAGE SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar proteínas desnaturalizadas en un gel de poliacrilmida en función de su tamaño. Se utiliza acrilamida/bis 37:1. La mezcla que se indica es para un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si este porcentaje varía debe recalcularse la cantidad de acrilamida/bis y de agua destilada a añadir. Mezcla para gel separador: Acrilamida/bis 40% 9 ml Tris-HCl 1,5 M ph 8,5 7.5 ml Agua destilada 13 ml 10% SDS 300 l 10% APS 100 l TEMED 15 l Mezcla para gel concentrante: Acrilamida/bis 40% 1 ml Tris-HCl 1M ph 6, ml Agua destilada 7.6 ml 10% SDS 100 l 10% APS 35 l TEMED 5 l

28 SDS-PAGE Buffers y soluciones Tampón de electroforesis: 25 mm Tris, 192 mm Glicina, 0.1% SDS, ph 8.3 Tampón de muestra: 0.3 M Tris HCl, ph 6.8, 5% SDS, 50% glycerol, Azul de bromofenol 0.01%, 2- mercaptoetanol 0,5% Solución de teñido: 0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% Metanol, 10% Ácido Acético Solución de desteñido: 50% Metanol, 10% Ácido Acético

29 SDS-PAGE Tinción con Coomasie Solución de teñido: 0.125% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% Metanol, 10% Ácido Acético Tinción con sales de plata 1- Etanol, ácido acético, H 2 O (30:10:60) 2- Etanol 30% 3- Nitrato de plata 0,1% 4- NaCl, CuSO 4, NH 4 OH, tiosulfato sódico 5- Ácido acético 1%

30 PAGE PAGE: Gel de poliacrilamida nativo, sin SDS - Cuando se pretende extraer una proteína del gel de forma que conserve su actividad, o bien cuando se quiere ensayar una actividad enzimática en el propio gel, las proteínas no deben desnaturalizarse. Para ello se llevan a cabo las siguientes modificaciones: - No se añade SDS al gel, buffer de muestra ni buffer de electroforesis - No se añade -mercaptoetanol al buffer de muestra para evitar la reducción de los puentes disulfuro - Las muestras no se calientan y la electroforesis se desarrolla a 4ºC - Para ver actividad en el gel: éste se incuba con el sustrato adecuado hasta que aparezcan bandas de actividad Debe tenerse muy en cuenta el ph del gel, ya que las proteína entrarán y se moverán en el gel sólo si tienen carga neta negativa, y esto depende de su punto isoeléctrico. - Si se quiere recuperar la actividad de una proteína despues de un SDS-PAGE existen protocolos para renaturalizar la proteína

31 Western Blot Detección de una proteína mediante anticuerpos tras un SDS-PAGE

32 Western Blot Actividad de la enzima fosfatasa alcalina conjugada con el anticuepo secundario

33 Western Blot Reacción cruzada con anticuerpos policlonales

34 Western Blot Cuantificación de la proteína tras un Western blot como método de determinación de la expresión del gen

35 Técnicas de Proteómica Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE Isoelectroenfoque: separación de las proteínas en función de su punto isoeléctrico: ph al cual la carga neta total de la proteína es 0 SDS-PAGE: separación de las proteínas en función de su tamaño

36 Técnicas de Proteómica Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE Pueden llegar a detectarse todas las proteínas que se están expresando en una célula Permite establecer comparaciones entre dos condiciones: sistema de análisis de expresión diferencial

37 Técnicas de Proteómica Métodos de identificación de las proteínas Las proteínas separadas en un 2D (o purificadas por cualquier otro método) pueden analizarse para conocer su masa molecular, huella peptídica y secuencias de péptidos internos en sistemas de espectrometría de masas; esto permite su identificación. - Huella peptídica: tras digestión con tripsina se obtiene la masa molecular precisa de todos los péptidos resultantes, la cual se compara con la masa virtual obtenida de la información de los genes en la base de datos. Se lleva a cabo con un MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) - Para completar la identificación puede hacerse una microsecuenciación de péptidos internos con un LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem MS). Se obtienen secuencias de longitud corta (6-14 aminoácidos) que a menudo presentan ambigüedades. - Microsecuenciación por Degradación de Edman : Método clásico de secuenciación de péptidos. Requiere al menos 0,5 g de proteína. Es un método más directo, pueden obtenerse secuencias de hasta aa, mayor fiabilidad.

38 Técnicas de Proteómica Huella peptídica

39 Técnicas de Proteómica Huella peptídica

40 Técnicas de Proteómica Huella peptídica

41 SECUENCIACIÓN DEL ADN

42 Método de Sanger o de los didesoxinucleótidos - Se basa en la utilización de terminadores: moléculas de didesoxinucleótidos que al incorporarse a la cadena de ADN detienen la reacción de polimerización.

43 - Una mezcla de los 4 desoxinucleótidos con 1 didesoxinucleótido concreto ocasionará que la reacción de polimerización se detenga al azar generando moléculas de diferente tamaño que se separan en un gel de acrilamida

44 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS ddatp ddgtp 5 -A-3 5 -AGA-3 5 -AGACCTGCA-3 5 -AGACCTGCATTTA-3 5 -AGACCTGCATTTATA-3 5 -AGACCTGCATTTATAA-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3 3 -TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5 5 -AG-3 5 -AGACCTG-3 5 -AGACCTGCATTTATAAG-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCG-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3 4 reacciones: ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp ddatp ddctp ddttp 3 -TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5 5 -A-3 5 -AGA-3 5 -AGACCTGCA-3 5 -AGACCTGCAT-3 5 -AGACCTGCATTTA-3 3 -TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5 5 -AGAC-3 5 -AGACC-3 5 -AGACCTGC-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGC-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCC-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3 3 -TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5 5 -AGACCT-3 5 -AGACCTGCATT-3 5 -AGACCTGCATTTATAA-3 5 -AGACCTGCATTT-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3 5 -AGACCTGCATTTAT-3 5 -AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3

45 - Gel de acrilamida con reacciones de secuencia, se visualiza una autorradiografía generada por la señal del isótopo 35 S-dATP

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47 - En la actualidad el proceso se hace de forma automática. Los terminadores llevan incorporados colorantes fluorescentes de diferente longitud de onda, que permiten hacer la reacción en un único tubo. Tras un proceso de electroforesis capilar un detector láser recoge la señal de cada terminador (ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp)

48 Secuenciación automática

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50 Secuenciación primer walking - Tenemos un fragmento para secuenciar clonado en un vector plasmídico. Se lleva a cabo la primera reacción de secuencia con un primer universal. A partir de la secuencia obtenida se diseña un segundo primer hacia el extremo 3 de la misma para que haga de iniciador en la siguiente reacción, y así sucesivamente hasta completar el fragmento a secuenciar Secuenciación shot-gun 5 3

51 Estrategias de secuenciación en proyectos genoma Shot-gun Clon a clon de una genoteca

52 Algunos sitios web relacionados con proyectos genoma