ViroSeq CELERA. CDx. HIV-1 Genotyping System v2.0. Instrucciones de uso DRAFT

Transcripción

1 CELERA ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 Para utilizar con los ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100/3100-Avant) y el ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 Instrucciones de uso J94-36 CDx Rev. A DRAFT Celera 1401 Harbor Bay Parkway August 21, :56 pm, _cover_es.fm Alameda, CA *+H3764J94360X* USA ABBOTT Max-Planck-Ring Wiesbaden Germany

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3 Contenido Introducción Indicaciones de uso Campo de aplicación Resumen y explicación Principios del procedimiento Para realizar pedidos Leyenda de los símbolos Preparación y procesamiento de las muestras Reactivos del Pack 1 (paquete 1) Advertencias y precauciones Requisitos de conservación y manipulación Muestra extraída Material necesario Preparación de la zona de trabajo Prevención de la degradación del ARN Flujo de trabajo Tamaño del análisis Controles Protocolo Control de calidad Limitaciones Secuenciación de series analíticas en los ABI PRISM 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100 y 3100-Avant) Introducción Material necesario Protocolo ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 i

4 Análisis con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v Introducción Material necesario Requisitos del sistema para ejecutar el programa ViroSeq Software v Instalación, desinstalación y uso del software Ejemplos Edición de los datos Informe sobre resistencia a antirretrovirales Tablas de mutaciones Mensajes de error del software Software ViroSeq y resultados Eficacia diagnóstica Eficacia Mantenimiento y calibración de los analizadores ABI PRISM 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100 y 3100-Avant) Material necesario Cuidado de los analizadores 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos 3100 y 3100-Avant) Matriz de capilares Jeringas Bloques de polímero Inyector automático Unidades de placa Mantenimiento del ordenador Calibración espacial y espectral Bibliografía Referencias citadas ii ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

5 Sección 1: Introducción Contenido Indicaciones de uso Campo de aplicación Resumen y explicación Principios del procedimiento Para realizar pedidos Leyenda de los símbolos Indicaciones de uso El ViroSeq HIV-1 Genotyping System está indicado para utilizarse en la detección de mutaciones genómicas del VIH que confieren resistencia a tipos específicos de fármacos antirretrovirales y como ayuda durante la vigilancia y el tratamiento de las infecciones por el VIH. En particular, el ViroSeq HIV-1 Genotyping System puede utilizarse para: Detectar la resistencia viral del subtipo B del VIH-1 en muestras de plasma recogidas en EDTA con una carga viral entre y copias/ml. Genotipar el gen completo (desde el codón 1 hasta el 99) de la proteasa del VIH-1 y dos terceras partes del gen de la transcriptasa inversa (TI), desde el codón 1 hasta el 335. Para utilizar el ViroSeq HIV-1 Genotyping System: El usuario o el técnico deben haber recibido formación sobre su uso. Un médico cualificado debe interpretar y aplicar los resultados. El kit no debe utilizarse como prueba de cribado para el VIH ni como prueba diagnóstica para confirmar la presencia de infección por el VIH. Campo de aplicación Incluye las siguientes poblaciones: Personas infectadas con el VIH-1 con fracaso terapéutico (aumento de la carga viral) antes del cambio de tratamiento Personas infectadas con el VIH-1 en la presentación inicial, antes del tratamiento farmacológico inicial Resumen y explicación El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es el agente etiológico responsable de la pandemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). 1,2 El tratamiento de las infecciones por VIH-1 con un tratamiento antirretroviral potente puede suprimir la replicación del VIH-1. 3,4 Sin embargo, es complicado erradicar el VIH-1, ya que las infecciones latentes constituyen un mecanismo que permite al virus reaparecer y perdurar durante toda la vida del paciente. 5,6 Con frecuencia, el fracaso terapéutico se debe a un cumplimiento inadecuado de los regímenes de tratamiento y/o a la aparición de cepas del virus resistentes a los fármacos. 7 Estas cepas mutantes del VIH-1 pueden ser resistentes a uno o más fármacos de cada una de las seis clases de antirretrovirales: los inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa, los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa, los inhibidores de la proteasa, los inhibidores de la fusión, los inhibidores de la entrada y los inhibidores de la transferencia de la cadena de integrasa del VIH. 8,9,10 Además, la resistencia a un determinado fármaco puede generar resistencia cruzada a otros fármacos de la misma clase. 7,11 Sin embargo, el fracaso terapéutico no siempre produce resistencia a todos los fármacos de un régimen. 12 Por este motivo, la determinación del mejor tratamiento de rescate para pacientes en los que han fracasado varios regímenes terapéuticos puede ser un reto considerable. Uno de los factores clave para identificar nuevas estrategias de tratamiento es conocer el genotipo de resistencia viral indicado por las mutaciones presentes en el conjunto de virus existente en el plasma del paciente. 13 Los resultados obtenidos en estudios de intervención retrospectivos y prospectivos apoyan la utilidad clínica de las pruebas de resistencia Estos estudios indican que la presencia de resistencia farmacológica es un factor de riesgo independiente de fracaso terapéutico. En la actualidad, se recomienda realizar pruebas de resistencia en las personas infectadas con el VIH que solicitan atención médica, independientemente de si el tratamiento va a iniciarse de inmediato. Se debe considerar la conveniencia de repetir estas pruebas al inicio del tratamiento antirretroviral. Las pruebas de resistencia farmacológica del VIH deben realizarse siempre que cambie de régimen antirretroviral debido a un fracaso terapéutico. También se recomienda realizar pruebas de resistencia a las mujeres embarazadas antes de iniciar el tratamiento antirretroviral y a las mujeres que se queden embarazadas durante el tratamiento. 17,18 El ViroSeq HIV-1 Genotyping System detecta mutaciones en las regiones de la TI y de la proteasa del gen pol, y proporciona un informe en el que se señalan los indicios genéticos de resistencia viral. Es un sistema completo que incluye reactivos para el aislamiento del ARN viral del plasma, la TI-PCR y la secuenciación. 19,20 El gen de la proteasa completo y dos terceras partes del gen de la TI se amplifican para generar un amplicón de 1,8 kb. El amplicón se utiliza como patrón de secuenciación para siete cebadores que generan una secuencia consensuada de 1,3 kb aproximadamente. El programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software ensambla, modifica e identifica las mutaciones en esta secuencia de 1,3 kb. El software compara la secuencia consensuada con una referencia conocida, la secuencia HXB-2, para determinar las mutaciones presentes en la muestra. Por último, el software ViroSeq utiliza un algoritmo patentado para analizar las mutaciones y generar un informe sobre resistencia farmacológica. Principios del procedimiento La formación del usuario es esencial para realizar el ensayo ViroSeq HIV-1 Genotyping y para lograr resultados precisos. El ViroSeq HIV-1 Genotyping System se basa en seis procesos principales: Preparación de muestras Transcripción inversa (TI) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Secuenciación cíclica Detección de secuencias automatizada Análisis del software Para realizar pedidos 4J94-36 ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 Para utilizar con los ABI PRISM 3100/3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100/3100-Avant) y el ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 Instrucciones de uso Leyenda de los símbolos CDx ABI Σ Σ 48 = 48 = = Número de catálogo de Celera Número de catálogo de Applied Biosystems = Contiene 48 ensayos = = Peligro de descarga eléctrica/incendio = Nocivo = = Riesgos biológicos = = Limitación de la temperatura Consultar las instrucciones de uso = Tóxico = Fabricante Representante autorizado en la Comunidad Europea Producto sanitario para diagnóstico in vitro = Peligro de láser = Riesgo de infección = Sensible a la luz ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 1 de 66

6 Sección 2: Preparación y procesamiento de las muestras Contenido: Reactivos del Pack 1 (paquete 1) Advertencias y precauciones Requisitos de conservación y manipulación Muestra extraída Material necesario Preparación de la zona de trabajo Prevención de la degradación del ARN Flujo de trabajo Tamaño del análisis Controles Protocolo Control de calidad Limitaciones Reactivos del Pack 1 (paquete 1) Σ Σ 48 = 48 ViroSeq HIV-1 Sample Preparation Module HIV Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral del VIH), tubo 43% de tiocianato de guanidina < 2% de ditiotreitol < 1% de N-lauroilsarcosina Color del tapón Transparente Cantidad 2 x 14,4 ml ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module HIV RT Mix (mezcla de TI del VIH), tubo < 0,1% datp, dctp, dgtp, dttp < 0,1% de cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa), tubo 20 U/μL de RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa) MuLV Reverse Transcriptase (transcriptasa inversa del MuLV), tubo 50 U/μL de transcriptasa inversa recombinante del virus de la leucemia murina HIV PCR Mix (mezcla para PCR del VIH), tubo < 0,1% datp, dctp, dgtp, dttp, dutp < 0,1% de cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 AmpliTaq Gold DNA Polymerase (ADN polimerasa AmpliTaq Gold ), tubo 5 U/μL de AmpliTaq Gold DNA Polymerase (ADN polimerasa AmpliTaq Gold ) AmpErase UNG, tubo 1 U/μL de uracil-n-glicosilasa DTT (100 mm), tubo 1,4% de ditiotreitol DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN), tubo < 0,1% de marcador de peso de ADN Color del tapón Azul Blanco Morado Azul Dorado Verde Amarillo Transparente Cantidad 1 x 384 μl 1 x 48 μl 1 x 48 μl 1 x 1,42 ml 1 x 24 μl 1 x 48 μl 1 x 20 μl 1 x 36 μl Agarose Gel Loading Buffer (solución Transparente 1 x 240 μl tampón de carga de gel de agarosa), tubo RNA Diluent (diluyente de ARN), tubo Transparente 1 x 1,6 ml Contiene tiocianato de guanidina. Libera gases tóxicos en contacto con ácidos o lejía. R 20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. R 32 Libera gases muy tóxicos en contacto con ácidos. R 36/38 Irrita los ojos y la piel. S 26 En caso de contacto con los ojos, aclarar de inmediato con abundante agua y solicitar ayuda médica. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los ojos/la cara. S 46 En caso de ingestión, solicitar ayuda médica de inmediato y mostrar el envase o la etiqueta. RNA Diluent (diluyente de ARN), tubo Transparente 3 x 1,6 ml Página 2 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

7 ViroSeq HIV-1 Sequencing Module Color del tapón Cantidad ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module Color del tapón Cantidad POSIBLE PELIGRO BIOLÓGICO. Material de origen humano. Utilice las precauciones universales. HIV SEQ Mix A (mezcla A para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio HIV SEQ Mix B (mezcla B para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio HIV SEQ Mix C (mezcla C para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio HIV SEQ Mix D (mezcla D para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio HIV SEQ Mix F (mezcla F para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio HIV SEQ Mix G (mezcla G para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio HIV SEQ Mix H (mezcla H para secuenciación del VIH), tubo BigDye Terminator Ready Reaction Mix < 0,1% de nucleótidos y cebadores oligonucléotidos sintéticos no infecciosos del VIH-1 < 0,1% de AmpliTaq DNA Polymerase, FS < 0,1% de cloruro de magnesio Blanco Blanco Blanco Blanco Rojo Rojo Rojo 1 x 576 μl 1 x 576 μl 1 x 576 μl 1 x 576 μl 1 x 576 μl 1 x 576 μl 1 x 576 μl HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo del VIH-1 de 8E5), tubo El control positivo se preparó diluyendo VIH-1 tipo B (8E5) cultivado en plasma humano negativo para el ARN del VIH y no reactivo en las pruebas de anticuerpos anti VIH-1/2, anti VHC, anti VTLH-I y HbsAg autorizadas por la FDA de EE.UU. El virus de las células 8E5 contiene un genoma viral intacto pero defectuoso, con una inserción de una sola base en el codón 219 del gen de la TI. 21 La carga viral es de a copias/ml. HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo del VIH-1 de 8E5), tubo El control negativo contiene plasma humano normal analizado para demostrar que carece de ARN del VIH, y no es reactivo en las pruebas de anticuerpos anti VIH-1/2, anti VHC, anti VTLH-I y HbsAg autorizadas por la FDA de EE.UU. Rojo Transparente 5 x 500 μl 5 x 950 μl ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 3 de 66

8 Advertencias y precauciones 1. Esta prueba debe utilizarse con plasma humano recogido únicamente con EDTA como anticoagulante. No utilice plasma recogido en heparina con este procedimiento, ya que se ha demostrado que inhibe la PCR. 2. No pipetee con la boca. 3. No beba, coma ni fume en las zonas de trabajo del laboratorio. Utilice equipo de protección personal apropiado al manipular las muestras extraídas y los reactivos del kit (p. ej., gafas de seguridad, guantes y ropa protectora). Lávese las manos exhaustivamente después de manipular las muestras extraídas y los reactivos del kit. 4. Evite la contaminación microbiana y con ribonucleasa de los reactivos cuando extraiga cantidades iguales (alícuotas) de los frascos de reactivo. Se recomienda utilizar pipetas y puntas de pipeta desechables y estériles. 5. No combine reactivos de lotes diferentes ni de distintos frascos del mismo lote. 6. No utilice este kit después de la fecha de caducidad. 7. Minimice la exposición a productos químicos. La exposición incluye el contacto, la ingestión o la inhalación de los productos químicos. No deje los envases de los productos químicos abiertos. Utilícelos solamente con una ventilación adecuada. 8. Deseche los reactivos no utilizados y los residuos de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio y las normativas medioambientales y de salud nacionales, estatales o provinciales, y locales. Requisitos de conservación y manipulación Nota. Si se siguen las recomendaciones de conservación de los reactivos, los tubos de reactivo (tanto abiertos como sin abrir) son estables hasta la fecha de caducidad. No utilice este kit ni ninguno de sus componentes reactivos después de la fecha de caducidad. Pack 1 (paquete 1) Módulo Condiciones de conservación Comentarios ViroSeq HIV-1 Sample Preparation Module ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module Conservar entre 15 C y 25 C En un congelador de descongelación manual designado como «sin amplicones» Una vez abiertos, los componentes siguientes deben transferirse y conservarse en el área de ADN amplificado a una temperatura de 2 C a8 C: DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN) Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel de agarosa) Nota. Todos los demás componentes deben conservarse a una temperatura entre 15 C y 25 C en la zona «sin amplicones». 9. PELIGRO DE LÁSER. La exposición a luz láser directa o reflejada a 40 mw durante 0,1 segundos puede quemar la retina y dejar escotomas permanentes. No mire nunca directamente al haz del láser ni permita que el reflejo del haz entre en los ojos. Siga las recomendaciones del fabricante sobre el uso de ropa y protección ocular apropiada cuando utilice el ABI PRISM 3100 o el ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100/3100-Avant). ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module Conservar entre 15 C y 25 C En un congelador de descongelación manual designado como «sin amplicones» Cinco viales de cada control de plasma (positivo y negativo). Descongele un vial de control de plasma positivo y otro de control de plasma negativo. Utilícelos en cada análisis de muestras. No los vuelva a congelar. 10. RIESGOS BIOLÓGICOS. Las muestras biológicas, como los tejidos y la sangre, pueden transmitir enfermedades infecciosas. Manipule todas las muestras extraídas como si fueran infecciosas. Utilice procedimientos de laboratorio seguros, como los que se describen en el documento Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 22 (Seguridad biológica en laboratorios biomédicos y microbiológicos) y en el documento M29-T del NCCLS. 23 ViroSeq HIV-1 Sequencing Module Pack 2 (paquete 2) Conservar en la zona de posamplificación entre: entre 15 C y 25 C En un congelador de descongelación manual designado para ADN amplificado únicamente Estos materiales son sensibles a la luz. Evite la exposición prolongada a la luz. Reactivo Condiciones de conservación Comentarios 11. PRECAUCIÓN: Los controles contienen componentes de origen humano y/o potencialmente infecciosos. Los componentes derivados de sangre humana se han analizado con pruebas autorizadas por la FDA para demostrar que no son reactivos para HBsAg, anti-vhc, anti-vih-1/vih-2 ni anti-vtlh-i. Ningún método de prueba conocido puede ofrecer una garantía total de que los productos derivados de tejidos humanos no transmitan infecciones. Por lo tanto, todos los materiales de procedencia humana deben considerarse potencialmente infecciosos. Las partículas de VIH-1 que contiene el control positivo son defectuosas; no obstante, hay estudios que demuestran una capacidad limitada para revertir a una forma infecciosa. Esto debe tenerse en consideración en caso de una exposición accidental importante. 12. Los componentes que contengan azida sódica pueden reaccionar con el plomo y el cobre de las tuberías formando azidas metálicas muy explosivas. Cuando vaya a verter soluciones que contengan azida sódica por el fregadero del laboratorio, deje correr gran cantidad de agua por las cañerías para impedir la acumulación de azidas. 13. Limpie y desinfecte a fondo todas las superficies de trabajo con una solución recién preparada de hipoclorito sódico al 0,5% en agua desionizada. NO utilice lejía (hipoclorito sódico al 0,5%) en el material de vidrio ni en las superficies expuestas al HIV Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral del VIH). 14. Información para los usuarios de Europa: para los productos no clasificados como peligrosos según la Directiva Europea 1999/45/CE existe una Ficha de datos de seguridad disponible para los usuarios profesionales que la soliciten. En el caso de los materiales no suministrados por Celera, consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. ViroSeq HIV-1 KCl Conservar en la zona de posamplificación entre: 15 C y 30 C Muestra extraída A. Recogida de muestras No lo congele. El ViroSeq HIV-1 Genotyping System está indicado para utilizarse únicamente con muestras de plasma. Recoja 5 ml de sangre entera en un tubo estéril con EDTA como anticoagulante (tubos Vacutainer PPT de Becton-Dickinson, REF , o equivalentes) e invierta de inmediato el tubo de 8 a 10 veces para mezclarla. IMPORTANTE! Este ensayo solo está validado para utilizarse con muestras de pacientes recogidas en EDTA. Las muestras recogidas con heparina no son adecuadas para este ensayo. Se ha demostrado que los siguientes componentes en las muestras de plasma no interfieren con los resultados de la prueba: Lípidos hasta 30 mg/ml Bilirrubina hasta 0,6 mg/ml Hemoglobina hasta 5 mg/ml Página 4 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

9 Se recomienda separar el plasma de la sangre en los 30 minutos siguientes a la recogida y, como máximo, 120 minutos después de la recogida si se utilizan tubos PPT o equivalentes. Centrifugue los tubos a a x g a temperatura ambiente (entre 15 C y25 C) durante 15minutos. Tan pronto como sea posible, transfiera el plasma de los tubos PPT (o equivalentes) a tubos de polipropileno estériles de 1,5 ml y consérvelos a una temperatura de entre 65 C y 80 C hasta el momento de su utilización. B. Transporte de las muestras extraídas El transporte de productos derivados de sangre humana, como el plasma, debe cumplir las normativas locales y nacionales referentes al transporte de agentes etiológicos. Los tubos con plasma pueden enviarse a una temperatura entre 2 C y 8 C por mensajería urgente (entrega antes de 24 horas) o bien, congelados a 70 C o menos en hielo seco. C. Conservación de las muestras extraídas Conserve las muestras de plasma a una temperatura entre 65 C y 80 C. No las congele durante más de 6 meses. No congele y descongele el plasma más de dos veces. Material necesario Artículo Artículo ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100-Avant) con: Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de datos v.1.0) Versión del firmware ó PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 6 o 6a Procesador Intel Pentium IV a 2 GHz 1 GB de RAM 2 x discos duros de 36 GB Kit de limpieza del bloque de polímero ABI PRISM Sequencing Analysis Software v.3.7 para un ordenador con Windows NT GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (Termociclador 9600 del sistema de PCR GeneAmp ) o GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler (Termociclador 9700 del sistema de PCR GeneAmp ) MicroAmp 96-Well Tray (Bandeja de 96 pocillos MicroAmp ) para los tubos de reacción con tapón incorporado MicroAmp 96-Well Support Base (Base de soporte de 96 pocillos MicroAmp ) ABI 3100-AVANT IMPORTANTE! No debe descargarse software de Internet para este uso específico Si necesita licencias adicionales, utilice y especifique la v.3.7 IMPORTANTE! No descargue software de Internet para este uso específico. N ó N N N Separadores de depósitos ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 1 con: ViroSeq HIV-1 Sample Preparation Module ViroSeq HIV-1 RT-PCR Module ViroSeq HIV-1 Sequencing Module ViroSeq HIV-1 8E5 Control Module ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 2 con: YM-100 Microconcentrators (microconcentradores YM-100) MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plates with Covers (placas ópticas de 96 pocillos para reacción MicroAmp con tapa) MicroAmp Reaction Tubes with Caps (tubos de reacción MicroAmp con tapón) KCl (200 mm) 4J J94-21 Base de placa de 96 pocillos Retenedor de placa de 96 pocillos Separadores de placa de 96 pocillos MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ) N Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μl Jeringa de vidrio con polímero de reserva, 5,0 ml Artículo ABI PRISM 3100 Capillary Array (matriz de capilares ABI PRISM 3100), 50 cm ABI Juntas tóricas de jeringa Performance Optimized Polymer 6 (POP-6 ) Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético ABI PRISM 3100-Avant Capillary Array (matriz de capilares ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm Formamida Hi-Di, 25 ml ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v (software de recogida de datos v.1.0.1) Versión del firmware PC con: Microsoft Windows NT v.4.0 Procesador Intel Pentium III a 550 MHz 256 MB de RAM Disco duro de 18 GB Kit de limpieza del bloque de polímero ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v.1.1 (software de recogida de datos v.1.1) Versión del firmware PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 5 o 6a Procesador Intel Pentium IV a 2 GHz 1 GB de RAM 2 x discos duros de 36 GB Kit de limpieza del bloque de polímero IMPORTANTE! No debe descargarse software de Internet para este uso específico. Contiene formamida. R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. R 36/38 Irrita los ojos y la piel. S 53 Evítese la exposición recábense instrucciones especiales antes del uso. S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los ojos/la cara. S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). BigDye Terminator v1.1 Sequencing Standard (patrón de secuenciación BigDye Terminator v1.1) ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 5 de 66

10 . Material no suministrado El usuario deberá suministrar los siguientes materiales, reactivos y equipo. (Utilícelos según las instrucciones del fabricante a menos que se especifique otra cosa). a. Puntas resistentes a aerosoles, sin RNasa, de 10 a μl b. Gel de agarosa con bromuro de etidio c. Sistema de electroforesis en gel de agarosa (caja de gel con alimentación eléctrica capaz de suministrar 10 V/cm de gel de agarosa) d. Cinta adhesiva de aluminio e. Campana de flujo laminar (campana de bioseguridad) limpia f. Lejía (para limpiar; prepare una solución al 10% antes de utilizarla) g. Microtubos de centrífuga Quick-Spin (2.000 x g) h. Centrífuga con refrigeración ( a x g) y rotor con cierre hermético para tubos de 1,5 ml i. Centrífuga con rotor de microplacas j. Centrífuga con bomba de vacío (si se utilizan las placas de 96 pocillos CENTRI SEP 96 ); debe tener: Capacidad para crear vacío Rotor con cabezal basculante k. Placas de 96 pocillos CENTRI SEP 96 l. Etanol al 70% (para limpiar) m. Etanol al 100%, no desnaturalizado (calidad para biología molecular) n. Bromuro de etidio o. ExoSAP-IT para la limpieza de productos de la PCR p. Guantes sin talco q. Isopropanol al 100%, anhidro (calidad ACS) r. Batas de laboratorio s. Pañuelos de papel que no suelten pelusa t. Pipetas con capacidad de 0 a μl u. Tubos con tapón de rosca, 1,5 ml (estériles, sin RNasa/DNasa), deben soportar entre y x g v. Acetato sódico, 3,0 M, ph 5,2 w. Solución tampón de TBE, 10X x. Pipetas de transferencia, punta fina y. Caja de luz ultravioleta (lámpara de UV de 300 nm) z. Vórtex con plataforma en el cabezal (2.500 rpm) aa. Agua estéril desionizada, sin RNasa/Dnasa ab. Congelador de descongelación manual, capaz de alcanzar las condiciones de conservación indicadas en la documentación de los productos ac. Frigorífico capaz de alcanzar las condiciones de conservación indicadas en la documentación de los productos Preparación de la zona de trabajo Las diferentes partes del procedimiento del ViroSeq HIV-1 Genotyping System deben llevarse a cabo en distintas zonas de trabajo. Cada zona de trabajo debe tener pipetas, equipos y suministros específicos para que el ensayo resulte satisfactorio habitualmente. Se sugieren tres zonas de trabajo: Zona 1: Preparación de las muestras (preamplificación): se utiliza para preparar las muestras y trabajar con muestras de VIH-1. Zona 2: Preamplificación: se utiliza para los pasos de configuración de la transcripción inversa y la PCR. Zona 3: Posamplificación (ADN amplificado): zona dedicada a la amplificación por PCR, la secuenciación cíclica y la detección de secuencias automatizada, y a otras actividades que conlleven la manipulación de ADN amplificado. En el caso ideal, las zonas 1 y 2 deben estar separadas entre sí para evitar la posible transferencia de ADN y ARN exógeno al área de trabajo de preparación de la TI y la PCR. No obstante, si las zonas 1 y 2 están en la misma sala, deben estar claramente delimitadas. Las campanas de bioseguridad en las superficies de trabajo pueden servir para aislar las zonas de esta sala. Las pipetas y el equipo utilizado en la zona 1 están expuestos de forma rutinaria a patógenos humanos transportados por la sangre y no deben utilizarse en ningún otro lugar fuera de la zona 1. Siempre que sea posible, utilice un espacio dedicado, como una campana de bioseguridad con lámpara de UV, para la preparación de los reactivos para los pasos de la TI y la PCR. Las lámparas germicidas de UV de la mayoría de las campanas de bioseguridad dañan el ADN que se deja en las superficies expuestas, lo que lo hace inadecuado para la posterior amplificación. Mantenga un aislamiento físico estricto entre el espacio de trabajo del ADN amplificado (zona 3) y las otras dos zonas para impedir la transferencia de ADN amplificado fuera de la zona 3. Debido al tipo de equipo utilizado en el espacio de trabajo del ADN amplificado (zona 3), se necesita un espacio relativamente amplio. Este espacio suele ser mayor que el necesario para las zonas 1 y 2. Prevención de la degradación del ARN Para llevar a cabo correctamente el genotipado, es fundamental que se evite la degradación del ARN en las muestras problema. Las RNasas degradan al ARN. Estas enzimas están presentes de forma natural en las células y se liberan durante la lisis celular. Si la purificación no es completa, pueden quedar RNasas en las muestras derivadas de células. Asimismo, debido a que las RNasas se excretan a través de la piel, es posible introducirlas en las muestras a través del contacto con superficies que el usuario haya tocado. Debe utilizar guantes en todo momento cuando manipule muestras extraídas, reactivos, equipo y material desechable. Las RNasas son muy estables y no necesitan cofactores, por lo que permanecen funcionales en las superficies en condiciones medioambientales muy diversas. Tienen una alta actividad, de forma que una pequeña contaminación con RNasa basta para causar una pérdida significativa en una muestra de ARN. Entre las fuentes de contaminación por RNasa están: El material de vidrio y de plástico de uso general en el laboratorio La piel y el pelo Soluciones contaminadas Flujo de trabajo Puede terminar el procedimiento durante un periodo de dos o más días. Si lo interrumpe en los puntos especificados, deberá conservar las muestras preparadas tal y como se especifica en la tabla siguiente hasta que esté listo para continuar. IMPORTANTE! Mantenga todas las muestras, controles y reactivos en frío (entre 2 C y 8 C) antes de realizar la mezcla maestra. Una vez hecha la mezcla maestra, consérvela a temperatura ambiente, pero mantenga los reactivos originales en hielo. Al finalizar Conservar las muestras a Durante un máximo de A. Preparación de muestras Entre 65 C y 80 C 2 semanas B. Transcripción inversa Entre 15 C y 25 C 2 semanas C. PCR Entre 15 C y 25 C 2 semanas D. Secuenciación cíclica Entre 15 C y 25 C 3 días E. Secuencias purificadas Entre 15 C y 25 C 1 semana Tamaño del análisis El kit del ViroSeq HIV-1 Genotyping System contiene suficientes reactivos para 48 pruebas. Se recomienda procesar las series analíticas en lotes de 12 muestras, lo que permite procesar cuatro series por kit. El análisis de un número menor de muestras aumenta el número de ciclos de congelación-descongelación y la manipulación de los reactivos, lo que puede reducir la eficacia u ocasionar contaminación. IMPORTANTE! No congele y descongele los reactivos más de cinco (5) veces. Página 6 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

11 Controles Nota. Se debe incluir un control positivo y uno negativo en cada análisis. El control positivo (8E5) es un VIH-1 no infeccioso 24 en una concentración de a copias/ml. Para garantizar el rendimiento adecuado de los reactivos, debe utilizarse en cada análisis una dilución 1:10 del control positivo (de a copias/ml). Esto está diseñado de forma que simule las muestras de pacientes en todos los aspectos del procedimiento de prueba del ViroSeq System, desde «A. Preparación de las muestras» hasta la «Sección 4: Análisis con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8». El control negativo es plasma humano normal analizado para demostrar que carece de ARN del VIH-1. Debe utilizarse desde «A. Preparación de las muestras» hasta «D1. Purificación y cuantificación de los productos de la PCR» en la sección «D. Secuenciación cíclica» para asegurarse de que no hay contaminación. Debido a la naturaleza de la secuenciación automatizada del ADN, no se recomienda analizar un control negativo. Protocolo A. Preparación de muestras (El tiempo total para procesar 12 muestras es de 2,5 a 3,0 horas; el tiempo dedicado a los procedimientos manuales es de 1,5 horas.) IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de preamplificación 1. A1. Preparación 1. Enfríe una centrífuga con refrigeración y el rotor entre 2 C y 8 C, siguiendo las instrucciones del fabricante. 2. Descongele las muestras de plasma y un tubo de cada control (positivo y negativo) hasta que alcancen la temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C). 3. Mantenga únicamente un reactivo o tubo de muestra abierto a la vez. A2. Aislamiento del ARN viral del VIH-1 1. Agite las muestras de plasma en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclarlas. 2. Centrifúguelas durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. 3. Etiquete los tubos de acuerdo con el protocolo del laboratorio y a continuación, añada 0,5 ml del plasma a un tubo con tapón de rosca nuevo sin RNasa ni DNasa. 4. Prepare un control con un bajo contenido de ARN viral. Combine en un tubo de microcentrífuga: 50 μl de HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5) 450 μl de HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo de VIH-1 de 8E5) (plasma negativo) y etiquételo según corresponda. 5. Coloque una marca de orientación en un lateral del tubo y ciérrelo. 6. Introduzca las muestras en el rotor con las marcas de orientación dirigidas hacia el borde exterior del rotor. Nota. Utilice un rotor que cierre herméticamente con una junta tórica para evitar salpicaduras y pulverización. 7. Centrifugue de a x g durante 60 min entre 2 C y 8 C. 8. Mientras se centrifugan las muestras: Descongele el Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral) hasta que alcance la temperatura ambiente. Contiene tiocianato de guanidina. Libera gases tóxicos en contacto con ácidos o lejía. R 20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. R 32 Libera gases muy tóxicos en contacto con ácidos. R 36/38 Irrita los ojos y la piel. S 26 En caso de contacto con los ojos, aclarar de inmediato con abundante agua y solicitar ayuda médica. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los ojos/la cara. S 46 En caso de ingestión, solicitar ayuda médica de inmediato y mostrar el envase o la etiqueta. Nota. Si se observan precipitados, caliente el Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral) a 37 C para disolver el precipitado y, a continuación, déjelo enfriar a temperatura ambiente antes de utilizarlo. Descongele el RNA Diluent (diluyente de ARN) y consérvelo a una temperatura entre 2 C y 8 C. Prepare el etanol al 70% y consérvelo a una temperatura entre 2 C y 8 C para utilizarlo en el paso 20. Nota. Utilice únicamente etanol al 100% de calidad para biología molecular y agua sin RNasa/DNasa. PELIGRO QUÍMICO. El etanol líquido y sus vapores son inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado puede secar la piel. La exposición puede causar la depresión del sistema nervioso central y lesiones hepáticas. Conservar alejado del calor, chispas y llamas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. 9. Extraiga los tubos en cuanto se detenga el rotor. 10. Extraiga con cuidado el sobrenadante de los tubos, con ayuda de una pipeta de transferencia de punta fina. No desprenda el sedimento (que en algunos casos no está visible). RECOMENDACIÓN: Al aspirar, empiece con la punta de la pipeta de transferencia justo debajo de la línea del menisco y vaya bajando la punta por la pared opuesta a la marca de orientación a medida que aspira. Extraiga la mayor cantidad de sobrenadante posible sin desprender el sedimento. 11. Añada 600 μl de Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral) a cada sedimento. 12. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. 13. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. 14. Deje reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C) durante 10 minutos para garantizar el lisado completo del virus. 15. Añada 600 μl de isopropanol a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C) a cada muestra. PELIGRO QUÍMICO. El isopropanol líquido y sus vapores son inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado con la piel puede causar sequedad e irritación. La exposición puede causar efectos sobre el sistema nervioso central como somnolencia, mareos y cefaleas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 7 de 66

12 16. Agite cada tubo en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. 17. Introduzca las muestras en el rotor con las marcas de orientación dirigidas hacia el borde exterior del rotor. 18. Centrifugue las muestras a a x g a temperatura ambiente durante 15 min. 19. Extraiga con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de punta fina. No desprenda el sedimento (que en algunos casos no está visible). IMPORTANTE! No deseche el sobrenadante junto con los residuos con lejía, ya que podrían formarse gases tóxicos. 20. Añada a cada tubo 1 ml del etanol al 70% preparado en el paso 8, frío (entre 2 C y 8 C). 21. Agite cada tubo en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. 22. Introduzca los tubos en el rotor con las marcas de orientación dirigidas hacia el borde exterior del rotor. 23. Centrifugue a a x g a temperatura ambiente durante 5 min. 24. Extraiga con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de punta fina. No desprenda el sedimento (que ahora debe ser visible). Elimine la mayor cantidad posible del etanol. 25. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el líquido restante en el fondo del tubo. 26. Extraiga con cuidado cualquier resto de etanol con otra pipeta de transferencia de punta fina. Seque los tubos con aire, destapados, durante 1 a 5 min, hasta que no se observen restos de etanol. IMPORTANTE! Es fundamental que se elimine todo el etanol visible. El etanol residual inhibe la reacción de TI-PCR. 27. Resuspenda cada sedimento en RNA Diluent (diluyente de ARN) frío (entre 2 C y 8 C), de acuerdo con las directrices siguientes. B. Transcripción inversa IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de preamplificación 2. B1. Preparación 1. Si es necesario, descongele las muestras de ARN. Asegúrese de descongelar también el ARN de los controles positivo y negativo. 2. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. 3. Etiquete un MicroAmp Reaction Tube (tubo de reacción MicroAmp ) de 0,2 ml para cada muestra de ARN. 4. Descongele la HIV RT Mix (mezcla de TI del VIH) y el DTT. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. 5. Extraiga el RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa) y la MuLV Reverse Transcriptase (transcriptasa inversa del MuLV) del kit. 6. Centrifugue todos los tubos de reactivo y las muestras durante 1 a 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo. 7. Conserve todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre 2 C y 8 C o en hielo hasta el momento de utilizarlos. B2. Reacciones de TI Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp 9600 ó 9700 situado en la zona de trabajo 2. Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 5). Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de funcionamiento del termociclador. 1. Prepare la mezcla maestra de TI de acuerdo con la tabla siguiente. Cuando termine, devuelva las soluciones madre a una temperatura entre 15 C y 25 C. Si la carga viral es Añada esta cantidad de RNA Diluent (diluyente de ARN) > copias/ml 100 μl a copias/ml 50 μl desconocida 50 μl Positivo sin diluir Positivo bajo Negativo Controles 100 μl 50 μl 50 μl 28. Agite enérgicamente en el vórtex durante 10 segundos para resuspender el sedimento. Puede quedar algo de material insoluble. 29. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. 30. Cuando finalice el procedimiento: Continúe con los pasos de la transcripción inversa o Detenga el procedimiento y conserve las muestras en un congelador a una temperatura entre 65 C y 80 C. IMPORTANTE! No congele y descongele el ARN más de dos (2) veces. No conserve el ARN durante más de dos semanas. Reactivo Volumen para 1 reacción (µl) HIV RT Mix (mezcla de TI del VIH) RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa) MuLV Reverse Transcriptase (transcriptasa inversa del MuLV) Volumen para 5 reacciones (µl) Volumen para 15 reacciones (µl) DTT, 100 mm 0,4 2,0 6,0 Volumen final 10,4 52,0 156,0 Nota. Prepare un volumen suficiente para 1 ó 2 reacciones más a fin de compensar las pérdidas debidas al pipeteo. 2. Agite la mezcla maestra de TI en el vórtex durante 2 a 3 segundos para mezclarla. 3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. IMPORTANTE! La mezcla maestra de TI debe estar a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C) en el momento de añadirla a los tubos de reacción. No la deje a temperatura ambiente durante más de 30 min. 4. Añada 10 μl del ARN viral a los MicroAmp Reaction Tubes (tubos de reacción MicroAmp ) de 0,2 ml y devuelva la solución madre de ARN viral al hielo. IMPORTANTE! Utilice una punta limpia para cada adición. Página 8 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

13 5. Tape inmediatamente los MicroAmp Reaction Tubes (tubos de reacción MicroAmp ), colóquelos en el termociclador preparado en las condiciones siguientes e inicie el programa. Espere a que la temperatura de las muestras y del instrumento aumente gradualmente hasta los 65 C. Mientras se calienta el ARN, deje la mezcla maestra de TI a temperatura ambiente. Nota. Detenga el proceso una vez transcurridos 5 minutos a 42 C y continúe de inmediato con el paso 6. Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen del termociclador en 20 μl. IMPORTANTE! Los instrumentos GeneAmp 9600 y 9700 solo se mantienen en pausa durante 10 minutos. El paso 6 debe llevarse a cabo antes de que transcurran 10 minutos. 6. Mientras el instrumento está en pausa, realice lo siguiente: a. Extraiga de inmediato las muestras de ARN del termociclador. b. Añada 10 μl de la mezcla maestra de TI a temperatura ambiente a cada tubo de reacción y tape los tubos. c. Agite en el vórtex la bandeja con las muestras durante 3 a 5 segundos para mezclarlas. d. Centrifugue la bandeja de muestras durante 1 a 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo. 7. Devuelva las muestras al termociclador y pulse Resume (Reanudar). 8. Al finalizar el programa de la TI, deje las muestras en el termociclador durante al menos 10 minutos a 4 C, pero no más de 18 horas. 9. Cuando finalice el programa: Continúe con los pasos de la PCR o Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre 15 C y 25 C hasta que esté listo para llevar a cabo la PCR; no conserve las muestras durante más de dos semanas. C. PCR Temperatura ( C) Tiempo Proceso segundos Relaja la estructura secundaria del ARN 42 5 minutos Se enfría a la temperatura óptima para la actividad enzimática Realizar una pausa de forma manual, realizar el paso 6 y pulsar Resume (Reanudar) minutos Transcripción inversa 99 5 minutos Inactiva la MuLV Reverse Transcriptase (transcriptasa inversa del MuLV) C1. Preparación 4 Mantener (> 10 minutos) Detiene el proceso hasta que esté listo para continuar IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de preamplificación Si las muestras están congeladas, descongélelas a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C). 2. Centrifugue la bandeja de muestras o los tubos durante 1 a 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo. 3. Descongele la HIV PCR Mix (mezcla para PCR del VIH). 4. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. C2. Reacción de PCR 1. Prepare la mezcla maestra de PCR. Combine en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml: Reactivo Volumen para 1 reacción (µl) HIV PCR Mix (mezcla para PCR del VIH) AmpliTaq Gold DNA Polymerase (ADN polimerasa AmpliTaq Gold) Nota. Prepare un volumen suficiente para 1 reacción más a fin de compensar las pérdidas debidas al pipeteo. 2. Agite la mezcla maestra de PCR en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclarla. 3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. 4. Añada 30 μl de la mezcla maestra de PCR a cada tubo de reacción de TI que contenga ADNc del VIH-1. El volumen final es ahora igual a 50 μl. 5. Lleve las muestras al termociclador en la zona 3. No vuelva a la zona 2 durante el resto del día. Volumen para 5 reacciones (µl) 6. Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp 9600 ó 9700 situado en la zona de trabajo 3. Nota. Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de funcionamiento del termociclador. Configure el programa del termociclador de la siguiente forma: Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen del termociclador en 50 μl. 7. Transfiera los tubos al termociclador e inicie el programa. Volumen para 15 reacciones (µl) 29,5 147,5 442,5 0,5 2,5 7,5 AmpErase UNG (uracil-nglicosilasa AmpErase) Volumen final Temperatura ( C) Tiempo Ciclos min min s s min min 1 4 Mantener 8. Cuando finalice el programa: Continúe con los pasos de purificación o Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre 15 C y 25 C. IMPORTANTE! No deje los tubos en el termociclador durante más de 24 horas. La actividad residual de la UNG podría destruir el ADN amplificado. 5. Extraiga la AmpliTaq Gold DNA Polymerase (ADN polimerasa AmpliTaq Gold ) y los reactivos de AmpErase UNG (uracil-n-glicosilasa) del kit. Descongele y agite en el vórtex durante 1 a 2 segundos. 6. Centrifugue todos los reactivos durante 1 a 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 9 de 66

14 D. Secuenciación cíclica IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de posamplificación 3. D1. Purificación y cuantificación de los productos de la PCR Hay dos métodos de purificación para los productos de la PCR. Opción 1: Microconcentración Para concentrar y purificar los productos de la PCR con los YM-100 Microconcentrators (microconcentradores YM-100): 1. Monte el microconcentrador. a. Para cada muestra, etiquete Un tubo de recogida de 1,5 ml Una columna de centrifugación b. Introduzca en cada tubo una columna de centrifugación etiquetada adecuadamente, con la membrana blanca hacia arriba. 2. Pipetee con cuidado 300 μl de KCl (200 mm) en el depósito de cada microconcentrador. El KCl (200 mm) se suministra en el Pack 2 (paquete 2). IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. 3. Pipetee los 50 μl completos del producto para PCR de cada muestra en el depósito del microconcentrador que contiene KCl y lleva la etiqueta correspondiente. IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. 4. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente. 5. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante 15 minutos. 6. Destape los tubos y pipetee con cuidado 300 μl de agua desionizada estéril en el depósito de cada microconcentrador. IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. 7. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente. 8. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante 15 minutos. 9. Destape los tubos y pipetee con cuidado 35 µl de agua desionizada estéril en el centro de cada microconcentrador. IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. 10. Vuelque el contenido de los microconcentradores en tubos de recogida nuevos y etiquetados. a. Retire los microconcentradores del tubo que contiene el filtrado. b. Invierta el microconcentrador de cada muestra sobre un tubo de 1,5 ml nuevo y etiquetado según corresponda. c. Deseche el tubo usado junto con el filtrado. 11. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante 5 minutos. 12. Retire y deseche los microconcentradores, conservando las muestras en los tubos. 13. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente y: Proceda a correr el gel de agarosa o bien, Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre 15 C y 25 C durante dos semanas como máximo. Para utilizar el gel de agarosa con los productos de la PCR purificados del YM-100 Microconcentrator (microconcentrador YM-100): 1. Descongele el DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN) a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C). Esto tardará al menos 30 minutos. Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para mezclarlo. 2. Descongele el Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel de agarosa) hasta que alcance la temperatura ambiente. Esto tardará al menos 30 minutos. Nota. Si se forman cristales, caliente la solución a 65 C durante 10 minutos. Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para mezclarlo. 3. Prepare el gel de agarosa al 1% con TBE y 0,5 μg/ml de bromuro de etidio (o bien, utilice un gel de agarosa al 1% comercial). PELIGRO QUÍMICO. El bromuro de etidio causa irritación en los ojos, la piel y el aparato respiratorio, y es un mutágeno conocido (es decir, puede provocar cambios en el material genético en las células vivas y puede causar cáncer). Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. 4. Prepare una solución tampón 1X de TBE en gel con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. 5. Coloque el gel preparado en la caja de gel. 6. Añada suficiente solución tampón 1X de TBE en gel para cubrir el gel. 7. Para cada muestra, mezcle: 5 μl de Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel de agarosa) 5 μl del producto de la PCR purificado 8. Cargue la solución de DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN). a. 6 μl en la calle 1 b. 3 μl en la calle 2 Obtendrá los siguientes resultados: Bandas 9. Cargue el resto de las calles con 10 μl de cada muestra. IMPORTANTE! No olvide anotar qué muestra cargó en cada calle. 10. Realice la electroforesis a 10 V/cm hasta que el azul de bromofenol haya migrado al menos 5 cm en el gel. 11. Examine el gel con luz UV. Calle de 6 μl (ng) Calle de 3 μl (ng) Posición Tamaño (kb) Superior 2, Segundo 1, Tercero 0, Fotografíe el gel utilizando un tiempo de exposición que no sature la película y permita ver las diferencias de intensidad de los fragmentos marcadores de peso. Página 10 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

15 13. Evalúe la cantidad de productos de la PCR que hay en cada muestra, comparando la intensidad de cada banda con la intensidad de las bandas de los DNA Mass Ladder (marcadores de peso de ADN). 3. Prepare el gel de agarosa al 1% con TBE y 0,5 μg/ml de bromuro de etidio (o bien, utilice un gel de agarosa al 1% comercial). PELIGRO QUÍMICO. El bromuro de etidio causa irritación en los ojos, la piel y el aparato respiratorio, y es un mutágeno conocido (es decir, puede provocar cambios en el material genético en las células vivas y puede causar cáncer). Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. 4. Prepare una solución tampón 1X de TBE en gel con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. 5. Coloque el gel preparado en la caja de gel. 6. Añada suficiente solución tampón 1X de TBE en gel para cubrir el gel. Diluya el producto de la PCR restante de cada muestra con agua destilada desionizada (H 2 Odd), de acuerdo con la siguiente tabla. Si la intensidad de la banda es Entre 20 y 40 ng Entre 40 y 60 ng Entre 60 y 100 ng Haga lo siguiente ajuste el volumen de la muestra a 60 μl. diluya la muestra 1:2 con H 2 Odd (1 parte de muestra y 1 parte de agua). diluya la muestra 1:4 con H 2 Odd (1 parte de muestra y 3 partes de agua). > 100 ng diluya la muestra 1:10 con H 2 Odd (1 parte de muestra y 9 partes de agua). Nota. La banda del producto de la TI-PCR debe tener una intensidad igual o mayor a la de la banda del marcador de 20 ng para garantizar una secuenciación de alta calidad. 14. Tape y agite en el vórtex cada muestra sin diluir durante 3 a 5 minutos para mezclarla. 15. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. 16. Cuando finalice el procedimiento, continúe con la secuenciación cíclica. Opción 2: ExoSAP-IT para la limpieza de productos de la PCR Nota. La opción ExoSAP-IT requiere la cuantificación en gel de agarosa seguida por el tratamiento con ExoSAP-IT y posteriormente, la dilución apropiada para la secuenciación. Procesamiento del producto de PCR no purificado en el gel de agarosa para la opción ExoSAP-IT: 1. Descongele el DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN) a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C). Esto tardará al menos 30 minutos. Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para mezclarlo. 2. Descongele el Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel de agarosa) hasta que alcance la temperatura ambiente. Esto tardará al menos 30 minutos. Nota. Si se forman cristales, caliente la solución a 65 C durante 10 minutos. Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para mezclarlo. 7. Para cada muestra, mezcle: 5 μl de Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel de agarosa) 5 μl del producto de la PCR no purificado 8. Cargue la solución de DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN). a. 6 μl en la calle 1 b. 3 μl en la calle 2 Obtendrá los siguientes resultados: Bandas 9. Cargue el resto de las calles con 10 μl de cada muestra. IMPORTANTE! No olvide anotar qué muestra cargó en cada calle. 10. Realice la electroforesis a 10 V/cm hasta que el azul de bromofenol haya migrado al menos 5 cm en el gel. 11. Examine el gel con luz UV. Calle de 6 μl (ng) Calle de 3 μl (ng) Posición Tamaño (kb) Superior 2, Segundo 1, Tercero 0, Fotografíe el gel utilizando un tiempo de exposición que no sature la película y permita ver las diferencias de intensidad de los fragmentos marcadores de peso. 13. Evalúe la cantidad de productos de la PCR que hay en cada muestra, comparando la intensidad de cada banda con la intensidad de las bandas de los DNA Mass Ladder (marcadores de peso de ADN). Nota. NO diluya en este paso. 14. Continúe con la purificación de los productos de la PCR con ExoSAP-IT en las muestras que tengan una intensidad igual o mayor a la de la banda del marcador de peso de 20 ng. Nota. La banda del producto de la TI-PCR debe tener una intensidad igual o mayor a la de la banda del marcador de 20 ng para garantizar una secuenciación de alta calidad. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 11 de 66

16 Purificación de los productos de la PCR con ExoSAP-IT para la limpieza de productos de la PCR: Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 3). Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de funcionamiento del termociclador. 1. Pipetee con cuidado 3 µl de ExoSAP-IT en cada tubo con 45 µl de producto de la PCR que tenga una intensidad de banda superior o igual a la de la banda de 20 ng/5 µl. 2. a. Tape los tubos. b. Agite los tubos o la bandeja de muestras en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclarlas. c. Centrifugue los tubos o la bandeja de muestras durante 1 a 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo. El volumen final es ahora de 48 µl. 3. Programe el termociclador con el siguiente programa: Temperatura ( C) Tiempo Ciclos min min 1 4 Mantener Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen de reacción en el termociclador en 48 μl. 4. Transfiera los tubos o la bandeja de muestras al termociclador e inicie el programa. 3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a x g para acumular el contenido en el fondo del tubo. 4. Cuando finalice el procedimiento, continúe con la secuenciación cíclica. D2. Preparación de la secuenciación cíclica Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp 9600 ó 9700 situado en la zona de trabajo 3. Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 7). Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de funcionamiento del termociclador. Nota. No prepare las reacciones de secuenciación para el control negativo. IMPORTANTE! Las mezclas para secuenciación son sensibles a la luz. No las exponga a la luz durante periodos prolongados. 1. Descongele las mezclas de VIH-1 para secuenciación a temperatura ambiente (entre 15 C y 25 C). 2. Configure el formato de reacción. Puede utilizar una de las siguientes opciones. Un MicroAmp Reaction Tube (tubo de reacción MicroAmp ) para cada HIV SEQ Mix (mezcla para secuenciación del VIH) MicroAmp 8-Tube Strips (tiras de 8 tubos MicroAmp ) en una bandeja MicroAmp Una MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ), incluida con el kit IMPORTANTE! Si utiliza la MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ), deberá considerar tanto la disposición de las muestras como la plataforma del instrumento que utilice. 5. Cuando finalice el programa, continúe con los pasos de dilución. Dilución del producto purificado con ExoSAP-IT para la secuenciación cíclica: 1. Diluya el producto de la PCR purificado con ExoSAP-IT de cada muestra con agua destilada desionizada (H 2 Odd), de acuerdo con la siguiente tabla. Si la intensidad de la banda es Entre 20 y 40 ng Entre 40 y 60 ng Entre 60 y 100 ng Ilustración: Haga lo siguiente ajuste el volumen de la muestra a 60 μl. diluya la muestra 1:2 con H 2 Odd (1 parte de muestra y 1 parte de agua). diluya la muestra 1:4 con H 2 Odd (1 parte de muestra y 3 partes de agua). > 100 ng diluya la muestra 1:10 con H 2 Odd (1 parte de muestra y 9 partes de agua). Una placa de reacción de 96 pocillos cargada con la muestra 1 (S1) empezando en la columna 1 de la placa de 96 pocillos, S2 en la columna 2, etc. La fila H no se utiliza, a menos que desee procesar 13 muestras en la misma placa. Nota. Si utiliza un 3100-Avant Genetic Analyzer (analizador genético 3100-Avant) para el paso de detección automatizada de la secuencia, solo podrá analizar 7 columnas de muestras a la vez. Las columnas de muestras restantes y 10 µl de cada pocillo que contenga control positivo deberán transferirse a una segunda placa. Consulte Preparación de reacciones de secuenciación purificadas para el análisis en el 3100-Avant Genetic Analyzer (analizador genético 3100-Avant). 3. En cada tubo o pocillo, combine lo siguiente: 2. Tape y agite en el vórtex cada muestra sin diluir durante 3 a 5 segundos para mezclarla. Volumen para una Componente reacción (μl) Añada una de las siguientes mezclas HIV-1 SEQ (mezclas de VIH-1 para secuenciación) a cada tubo o pocillo de la placa: HIV SEQ Mix A (Mezcla A para secuenciación del VIH) HIV SEQ Mix B (Mezcla B para secuenciación del VIH) 12 HIV SEQ Mix C (Mezcla C para secuenciación del VIH) HIV SEQ Mix D (Mezcla D para secuenciación del VIH) HIV SEQ Mix F (Mezcla F para secuenciación del VIH) HIV SEQ Mix G (Mezcla G para secuenciación del VIH) HIV SEQ Mix H (Mezcla H para secuenciación del VIH) Producto de la PCR purificado y diluido 8 Volumen final 20 Página 12 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

17 4. Tape los tubos o coloque una tapa de MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ) sobre la placa. 5. Centrifugue a temperatura ambiente entre 5 y 10 segundos. 6. Transfiera las muestras al termociclador. 7. Configure el programa del termociclador de la siguiente forma: Temperatura ( C) Tiempo Ciclos s 50 5 s min 4 Mantener Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen de reacción en el termociclador en 20 μl. IMPORTANTE! No deje las muestras en el termociclador durante más de 24 horas. Conserve las muestras a una temperatura entre 15 C y 25 C. 8. Ponga el termociclador en marcha. 9. Cuando finalice el programa: Continúe con los pasos de purificación o Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre 15 C y 25 C. No conserve las muestras durante más de 3 días entre 15 C y 25 C. D3. Purificación de las secuencias Hay tres métodos recomendados para la purificación de las reacciones de secuenciación del BigDye Terminator. D3.a Purificación de las secuencias con isopropanol 1. Extraiga la bandeja MicroAmp del termociclador y destape los tubos o la placa. 2. Añada a cada mezcla de muestra: 20 μl de agua desionizada 60 μl de isopropanol al 100% PELIGRO QUÍMICO. El isopropanol líquido y sus vapores son inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado con la piel puede causar sequedad e irritación. La exposición puede causar efectos sobre el sistema nervioso central como somnolencia, mareos y cefaleas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. También puede preparar una nueva solución madre combinando: 1 parte de agua desionizada 3 partes de isopropanol al 100% Después, añada 80 μl a cada mezcla de muestra. 3. Tape los tubos con las tiras correspondientes o cubra la placa con cinta adhesiva de aluminio. 4. Agite en el vórtex o invierta la bandeja varias veces para mezclar el contenido. 5. Incube las mezclas de muestras: A temperatura ambiente En la oscuridad Durante 15 minutos 6. Centrifugue la bandeja o la placa entre y x g durante 45 minutos. 7. En cuanto se detenga la centrífuga, quite con cuidado los tapones o la cinta adhesiva sin desprender los sedimentos. 8. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta. 9. Coloque la bandeja o la placa invertida en la centrífuga, sobre una servilleta o pañuelo de papel que no suelte pelusa, y centrifúguela a 700 x g durante 1minuto. IMPORTANTE! Debe centrifugar la bandeja o placa invertida inmediatamente después de la centrifugación; de lo contrario, se perderá la señal. Si la bandeja o la placa Haga lo siguiente permanecen más de 1 minuto antes de centrifúguelas de nuevo en la posición normal centrifugarlas en posición invertida durante 5 minutos entre y x g antes de centrifugarlas en la posición invertida. 10. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela en la oscuridad a una temperatura entre 15 C y 25 C. Analice las muestras antes de una semana. IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz. D3.b Purificación con etanol/acetato sódico 1. Prepare la solución de acetato sódico/etanol combinando lo siguiente para cada reacción: 2 μl de acetato sódico 3,0 M, ph 5,2 50 μl de etanol al 100% PELIGRO QUÍMICO. El etanol líquido y sus vapores son inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado puede secar la piel. La exposición puede causar la depresión del sistema nervioso central y lesiones hepáticas. Conservar alejado del calor, chispas y llamas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados. Prepare una cantidad suficiente para una reacción más de las necesarias. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. IMPORTANTE! Prepare una solución nueva para cada serie de precipitaciones. 2. Añada 52 μl de la solución de acetato sódico/etanol a cada reacción de secuenciación. 3. Tape los tubos con las tiras correspondientes o cubra la placa con cinta adhesiva de aluminio. 4. Mezcle por inversión (tres veces) o agite en el vórtex. IMPORTANTE! Mezcle exhaustivamente en este paso. Esto es fundamental para una precipitación eficaz. 5. Centrifugue a x g durante 20 minutos. 6. En cuanto se detenga la centrífuga, quite los tapones o la cinta adhesiva sin desprender los sedimentos. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 13 de 66

18 7. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta. 8. Centrifugue a 150 x g durante 1 minuto. 9. Añada 150 μl de etanol al 70% a cada pocillo. 10. Centrifugue a x g durante 5 minutos. 11. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta. 12. Centrifugue a 150 x g durante 1 minuto. 13. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela en la oscuridad a una temperatura entre 15 C y 25 C. Analice las muestras antes de una semana. IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz. D3.c Purificación con placas de 96 pocillos CENTRI SEP 96 IMPORTANTE! Las placas CENTRI SEP 96 son sensibles a la temperatura. No las conserve a temperaturas inferiores a 4 C. Las placas deben estar a temperatura ambiente antes de utilizarlas. 1. Asegúrese de que las placas CENTRI SEP 96 estén a temperatura ambiente. 2. Desprenda la película adhesiva de aluminio de la parte inferior de la placa CENTRI SEP 96 y a continuación, de la parte superior. 3. Prepare la placa CENTRI SEP 96. a. Apile la placa CENTRI SEP 96 sobre una MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ) y una las dos placas y una base con cinta adhesiva. b. Centrifugue la placa a 700 x g durante 2 minutos para empacar la columna. c. Retire la cinta adhesiva y separe las placas. d. Deseche el líquido sobrante en la placa de lavado agitándola enérgicamente. e. Lave la MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ) y guárdela para utilizarla como placa de lavado. 4. Coloque una placa de recogida de 96 pocillos en una base de 96 pocillos y apile sobre ella la placa CENTRI SEP Una las placas a la base de 96 pocillos con cinta adhesiva, asegurándose de alinear los índices alfanuméricos de todas las placas. 6. Cargue las reacciones de secuenciación. Con una pipeta multicanal, transfiera los 20 μl de las reacciones de secuenciación a cada pocillo de la placa CENTRI SEP 96. Coloque con cuidado todas las muestras en el centro de los lechos de gel. No coloque las muestras en el lateral de los pocillos. No toque el lecho de gel con las puntas de la pipeta. 7. Centrifugue la placa a 700 x g durante 2 minutos. 8. Deseche únicamente la placa CENTRI SEP (debe haber cerca de 20 μl en cada pocillo de la placa de recogida). 9. Seque las muestras en una centrífuga con bomba de vacío, utilizando un rotor apropiado. No seque excesivamente las muestras. 10. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela en la oscuridad a una temperatura entre 15 C y 25 C. Analice las muestras antes de una semana. IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz. Control de calidad El ViroSeq (8E5) Control Module, que contiene controles tanto positivos como negativos, se incluye con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System. Se debe utilizar un control positivo y uno negativo en cada análisis. Para controlar tanto el éxito de la TI-PCR como el del genotipado se necesita el HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5). El HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo de VIH-1 de 8E5) solo se necesita para controlar el éxito de la TI-PCR. Éxito de la TI-PCR El éxito de la TI-PCR se determina en la sección «D1. Purificación y cuantificación de los productos de la PCR». Para garantizar una secuenciación de alta calidad, la intensidad de la banda de TI-PCR debe ser igual o superior a la del marcador de 20 ng en el gel de agarosa. Las muestras de plasma con cargas virales superiores a las copias/ml deben proporcionar al menos 20 ng de producto de la TI-PCR en este paso. A medida que la carga viral desciende por debajo de las copias/ml, las probabilidades de éxito en la PCR disminuyen. Sin embargo, cualquier muestra que tenga una cuantificación de ADN de 20 ng o más se puede secuenciar para obtener un genotipo, independientemente de la concentración inicial en el plasma. El HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5) tiene una carga viral inicial de a copias/ml; el control positivo bajo (dilución 1:10) tiene una carga viral de a copias/ml. El control negativo no tiene un nivel detectable de ARN del VIH-1. Los resultados de TI/PCR esperados para los controles ViroSeq son: Control positivo/positivo bajo Valor esperado > 40 ng/5 μl (control positivo sin diluir) > 20 ng/5 μl (control positivo bajo) Limitaciones Reactivos y bioquímica Valor esperado Control negativo Si Haga lo siguiente Si Haga lo siguiente la intensidad de la banda es: Control positivo sin diluir: < 40 ng Control positivo bajo: < 20 ng todas las demás reacciones de las muestras han fallado (menos de 20 ng/5 μl). se ha repetido el fallo el análisis no es válido. Repita la prueba. se ha producido un fallo del sistema. Repita todas las muestras y los controles póngase en contacto con el servicio técnico de Abbott Molecular hay cualquier banda presente en el gel de agarosa El ensayo ViroSeq solo pueden realizarlo usuarios capacitados. La obtención de resultados exactos y fiables depende de una recogida y conservación adecuadas de las muestras antes de realizar la prueba. La sangre recogida en tubos con heparina no es adecuada para utilizarse en PCR ni con este ensayo. 0 ng se ha producido contaminación entre las muestras. Ninguno de los resultados de las muestras es válido Repita desde «A. Preparación de las muestras» hasta «D1. Purificación y cuantificación de los productos de la PCR». Página 14 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

19 Las pruebas de resistencia a antirretrovirales solo se han validado en muestras de pacientes con cargas virales entre y copias/ml. En EE. UU., en una población típica de pacientes positivos para el VIH tratados con HAART (tratamiento antirretroviral sumamente activo), es previsible que el 25% de los pacientes muestren supresión de la carga viral. Es posible que estas muestras no siempre generen resultados interpretables con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System si la carga viral es inferior a copias/ml. Los usuarios deben analizar las muestras problema con una carga viral igual o superior a copias/ml. Independientemente de la carga viral, la intensidad de la banda del producto de la TI-PCR en el gel de agarosa debe ser igual o superior a la del marcador de 20 ng para producir una secuencia de alta calidad. La presencia de AmpErase UNG (uracil-n-glicosilasa AmpErase ) en el ViroSeq HIV-1 Genotyping System solo reduce el riesgo de contaminación con el producto previamente amplificado. La contaminación entre las muestras o a partir del control positivo podría seguir produciéndose. El seguimiento riguroso de las instrucciones sobre la preparación de la zona de trabajo y del protocolo reduce la posibilidad de contaminación. Con este ensayo, solo se pueden utilizar secuenciadores de ADN automatizados y termocicladores de Applied Biosystems. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 15 de 66

20 Sección 3: Secuenciación de series analíticas en los ABI PRISM 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100 y 3100-Avant) Contenido: Introducción Material necesario Protocolo Introducción El ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 está aprobado para uso diagnóstico in vitro con el programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 en los analizadores ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100) y ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100-Avant). Ambos instrumentos son plataformas de electroforesis capilar con fluorescencia, totalmente automatizadas, que analizan simultáneamente las muestras de un mismo análisis. Tal como se resume a continuación, las diferencias principales entre las dos plataformas son el número de placas de 96 pocillos que es posible cargar en el instrumento y el número de capilares de la matriz de capilares. Nota. El número de capilares en la matriz de capilares del instrumento determina el tamaño del análisis. Parámetro 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100) Número de placas de 96 pocillos 1 2 Número de capilares en la matriz 4 16 Número de series analíticas por placa de 96 pocillos 24 6 Juntos, estos parámetros definen el rendimiento del instrumento y permiten a cada centro determinar la configuración del sistema más adecuada para el volumen de secuenciación actual y futuro. Mapa de la placa de 96 pocillos En el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100), cada serie analítica está compuesta por las inyecciones de los 16 pocillos de dos columnas consecutivas de la placa, empezando con la columna que contiene el pocillo A1 (es decir, del pocillo A1 hasta el H2, del pocillo A3 hasta el H4, etc.). Esto significa que para una placa completa, se necesitan seis series analíticas para inyectar los 96 pocillos. En el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant), cada serie analítica está compuesta por las inyecciones de 4 pocillos consecutivos de una columna de la placa, comenzando por la columna que contiene el pocillo A1 (es decir, del pocillo A1 hasta el D1, del E1 hasta el H1, del A2 hasta el D2, etc.). Es decir, se necesitan cuatro series analíticas para inyectar 16 pocillos y 24 series para inyectar una placa completa de 96 pocillos. F RI OL WA S Asegúrese de que el instrumento esté calibrado antes de proceder con el análisis. Consulte la sección 6: Mantenimiento y calibración de los analizadores ABI PRISM 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM 3100 y 3100-Avant). Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una tarea específica en el ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100), consulte el ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM 3100), (PN ). Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una tarea específica en el ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100-Avant), consulte el ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM 3100-Avant), (PN ). Material necesario Artículo A B C D E F G H ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v (software de recogida de datos v.1.0.1) Versión del firmware PC con: Microsoft Windows NT v.4.0 Procesador Intel Pentium III a 550 MHz 256 MB de RAM Disco duro de 18 GB Kit de limpieza del bloque de polímero COLUMNAS COLUMNS : Una Single serie Run analítica on 3100-Avant en el 3100-Avant Genetic Analyzer Genetic Analyzer (4 capillary array) (Analizador genético 3100-Avant ) con matriz de 4 capilares : Una Single serie Run analítica on 3100 en Genetic el 3100 Analyzer Genetic Analyzer (16 capillary array) (Analizador genético 3100) con matriz de 16 capilares ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100) con: Data Collection Software v.1.1 (software de recogida de datos v.1.1) Versión del firmware PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 5 o 6a Procesador Intel Pentium IV a 2 GHz 1 GB de RAM 2 x discos duros de 36 GB Kit de limpieza del bloque de polímero ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético ABI PRISM 3100-Avant) con: Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de datos v.1.0) Versión del firmware ó PC con: Microsoft Windows NT v.4.0, Service Pack 6 o 6a Procesador Intel Pentium IV a 2 GHz 1 GB de RAM 2 x discos duros de 36 GB Kit de limpieza del bloque de polímero ABI PRISM Sequencing Analysis Software v.3.7 para el ordenador con Windows NT ABI IMPORTANTE! No debe descargarse software de Internet para este uso específico AVANT IMPORTANTE! No debe descargarse software de Internet para este uso específico Si necesita licencias adicionales, utilice y especifique la v.3.7 IMPORTANTE! No descargue software de Internet para este uso específico. Página 16 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

21 Artículo ABI 3. Pulse Ctrl+Alt+Delete (Ctrl+Alt+Supr) y escriba lo que corresponda en los campos user name (Nombre de usuario) y password (Contraseña). GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (Termociclador 9600 del sistema de PCR GeneAmp ) o GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler (Termociclador 9700 del sistema de PCR GeneAmp ) MicroAmp 96-Well Support Base (Base de soporte de 96 pocillos MicroAmp ) N ó N N Separadores de depósitos Base de placa de 96 pocillos Retenedor de placa de 96 pocillos Separadores de placa de 96 pocillos MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de N pocillos para reacción MicroAmp ) Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μl Jeringa de vidrio con polímero de reserva, 5,0 ml Juntas tóricas de jeringa Performance Optimized Polymer 6 (POP-6 ) Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético Formamida Hi-Di, 25 ml Si el ordenador está conectado a una red, no tendrá que iniciar sesión en la red antes de poner en marcha el instrumento. OrbixWeb Daemon se iniciará automáticamente. Si no es así, haga doble clic en el acceso directo a OrbixWeb Daemon en el escritorio o seleccione Start > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon (Inicio > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon). Nota. OrbixWeb Daemon debe estar ejecutándose para que pueda ejecutarse el programa 3100 o 3100-Avant Data Collection Software (software de recogida de datos del analizador 3100 o 3100-Avant). 4. IMPORTANTE! En el caso del 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1) y del 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), debe estar ejecutándose AE Server además de OrbixWeb Daemon para poder llevar a cabo la extracción y el análisis de los datos. Si el AE Server no se inicia automáticamente, haga doble clic en el acceso directo a AE Server o seleccione Start > Applied Biosystems > 3100 Utilities > AE Server (Inicio > Applied Biosystems > Utilidades del 3100 > Servidor AE). Encendido del instrumento Contiene formamida. R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. R 36/38 Irrita los ojos y la piel. S 53 Evítese la exposición recábense instrucciones especiales antes del uso. S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los ojos/la cara. S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). ABI PRISM 3100 Capillary Array (matriz de capilares ABI PRISM 3100), 50 cm ABI PRISM 3100-Avant Capillary Array (matriz de capilares ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm En el ordenador, compruebe que: El ordenador esté encendido. El sistema operativo Microsoft Windows NT esté cargado. Nota. El ordenador debe estar encendido y el sistema operativo Windows NT debe estar ejecutándose antes de utilizar el instrumento. 2. Asegúrese de que en el instrumento: La puerta de la estufa esté cerrada y bloqueada Las puertas del instrumento estén cerradas Nota. Si las puertas están abiertas al encender el instrumento, se encenderá una luz de advertencia. 3. Pulse el botón de encendido/apagado situado en la parte frontal del instrumento. Nota. Mientras el instrumento se inicializa y realiza autocomprobaciones, la luz amarilla de estado parpadeará. Protocolo Preparación para la detección de secuencias automatizada Inicio de la estación de trabajo Nota. Debe encender el ordenador de la estación de trabajo antes de encender el instrumento. 1. Encienda el monitor. 2. Encienda el ordenador. Cuando el ordenador arranca, se abre el cuadro de diálogo Begin Logon (Comenzar inicio de sesión). 4. Asegúrese de que la luz verde de estado esté encendida y sin parpadear antes de continuar. Nota. Si no se enciende la luz verde, inicie el software de recogida de datos y consulte el registro de sucesos. La ruta de acceso al registro de sucesos es: D:\AppliedBio\3100\Data Collection o D:\AppliedBio\3100-Avant\Data Collection Software de recogida de datos Para determinar las versiones del firmware de los analizadores 3100 o 3100-Avant ydel Data Collection software (software de recogida de datos) instalado en el sistema, haga clic en el botón About Data Collection (Acerca de la recogida de datos) en la barra de herramientas. IMPORTANTE! Utilice únicamente las siguientes versiones del software: ABI 3100 Data Collection software v (software de recogida de datos del ABI 3100 v.1.0.1) con el Firmware v o ABI 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos del ABI 3100 v.1.1) con el Firmware v o ABI 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del ABI 3100-Avant v.1.0) con el Firmware v o v ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 17 de 66

22 No cambie de lugar ni elimine archivos ni carpetas a menos que se lo indique un representante de Applied Biosystems o el ABI PRISM 3100 o ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM 3100 o ABI PRISM 3100-Avant). De lo contrario, el software podría quedar inutilizable. Inicio del software de recogida de datos 1. Compruebe que el instrumento esté encendido y que la luz de estado verde esté encendida de forma continua (que no parpadee). 2. Asegúrese de que se esté ejecutando OrbixWeb Daemon (el botón correspondiente debe aparecer en la barra de tareas de Windows NT). Si OrbixWeb Daemon no se está ejecutando, seleccione Start > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon (Inicio > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon). IMPORTANTE! Debe iniciar OrbixWeb Daemon antes de ejecutar el software de recogida de datos. 3. IMPORTANTE! En el caso del 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1) y del 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), debe estar ejecutándose AE Server además de OrbixWeb Daemon. Si AE Server no se está ejecutando, seleccione Start > Applied Biosystems > 3100 Utilities > AE Server (Inicio > Applied Biosystems > Utilidades del 3100 > Servidor AE). 4. Seleccione Start > Applied Biosystems > 3100 Data Collection o 3100-Avant Data Collection (Inicio > Applied Biosystems > recogida de datos del 3100 o recogida de datos del 3100-Avant). Preparación para el análisis Nota. Después de abrir la puerta del instrumento, y antes de ejecutar cualquier otro comando, debe esperar a que finalice la secuencia de vuelta a la posición inicial del inyector automático. 1. Prepare y tenga a mano los siguientes reactivos y consumibles: 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6 ) Una matriz de 50 cm, de 16 o de 4 capilares Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético Nota. Para preparar la solución tampón 1X con EDTA del analizador genético, diluya la solución tampón 10X con EDTA del analizador genético con agua desionizada. PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la piel y el aparato respiratorio. Utilice protección ocular, guantes y ropa protectora apropiados. 2. Asegúrese de que hay suficiente polímero POP-6 para el análisis (1,5 ml para una placa de 96 pocillos) y añada polímero si es necesario. Nota. Cambie el polímero si lleva en el instrumento más de 7 días. No utilice un polímero que haya caducado o que contenga precipitaciones. 3. Rellene o cambie los depósitos de tampón y de agua antes de cada análisis. Depósito del ánodo. Llene hasta la línea de llenado con una nueva solución tampón 1X con EDTA del analizador genético (9 ml). Depósito del cátodo. Llene hasta la línea de llenado con una nueva solución tampón 1X con EDTA del analizador genético (16 ml). Depósitos de agua. Llene hasta la línea de llenado con agua fresca desionizada (16 ml cada uno). 4. Compruebe que no haya burbujas en los canales del bloque de polímero. Si hay burbujas, presione la jeringa hasta eliminarlas. 5. Compruebe: Que el bloque de polímero esté firmemente encajado en el instrumento. Si hay polímero seco alrededor del bloque de polímero y límpielo si es necesario. Si hay fugas alrededor de la jeringa y las tuercas de los tornillos. Que las puntas de los capilares no estén aplastadas ni dañadas. 6. Si acaba de instalar una matriz de capilares nueva o usada en el instrumento, realice una calibración espacial. 7. Realice una calibración espectral si es necesario. Consulte Realización de una calibración espectral. Uso del software de recogida de datos Para el 3100 Data Collection Software v (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.0.1) 1. Seleccione View > Preferences (Ver > Preferencias). 2. En la ventana Setting Preferences (Preferencias de configuración), haga clic en la ficha Data Analysis (Análisis de datos) y seleccione las siguientes opciones: Seleccione AutoAnalysis On (Análisis automático activado) Desactive Enable BioLIMS (Activar BioLIMS) Especifique el formato en Sample File Name Prefix Format (Formato del prefijo del nombre del archivo de muestras): Sample Name (Nombre de la muestra) Well Position (Posición del pocillo) <none> (ninguno) Para el 3100 Data Collection Software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1) y el 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0) Seleccione View > Preferences (Ver > Preferencias). En la ventana Setting Preferences (Preferencias de configuración), haga clic en la ficha Data Analysis and Extraction (Extracción y análisis de datos) y seleccione las siguientes opciones: Seleccione Enable AutoAnalysis (Activar análisis automático) Desactive Extract to Sequence Collector (Extraer en el recopilador de secuencias) Seleccione By run (Por serie analítica) para los archivos de muestras agrupadas Especifique el formato en Sample File Name Format (Formato del nombre de los archivos de muestras) Sample Name (Nombre de la muestra) Well Position (Posición del pocillo) <none> (ninguno) 3. Haga clic en OK (Aceptar). Haga clic en OK (Aceptar). 4. Seleccione la ficha Plate View (Vista de la placa) y haga clic en New (Nuevo), o seleccione Tools > Plate Editor (Herramientas > Editor de placas). 5. En el cuadro de diálogo Plate Editor (Editor de placas) que se abre: Escriba el nombre de la placa Especifique la aplicación Sequencing (Secuenciación) Especifique el tipo de placa de 96-Well (96 pocillos) IMPORTANTE! Utilice únicamente letras y números, o los símbolos que se indican a continuación. No utilice espacios. - _ ( ) { } #. + Seleccione la ficha Plate View (Vista de la placa) y haga clic en New (Nuevo), o seleccione Tools > Plate Editor (Herramientas > Editor de placas). En el cuadro de diálogo Plate Editor (Editor de placas) que se abre: Escriba el nombre de la placa Especifique la aplicación Sequencing (Secuenciación) Especifique el tipo de placa 96-Well (96 pocillos) IMPORTANTE! Utilice únicamente letras y números, o los símbolos que se indican a continuación. No utilice espacios. - _ ( ) { } # Haga clic en Finish (Finalizar). Se abrirá la hoja de cálculo Plate Editor (Editor de placas). Haga clic en Finish (Finalizar). Se abrirá la hoja de cálculo Plate Editor (Editor de placas). Página 18 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

23 Uso del Editor de placas 1. En la columna Sample Name (Nombre de la muestra), escriba los nombres de las muestras. IMPORTANTE! Asegúrese de utilizar la convención de nombres de muestras que se indica a continuación. Para que el programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 compile correctamente los proyectos de muestras, el nombre de la muestra debe seguir esta convención de nomenclatura. El nombre de la muestra tiene un límite de 32 caracteres como máximo. Para los nombres de las muestras se pueden utilizar únicamente letras, números y los siguientes símbolos: -_(){}#.+. NO UTILICE ESPACIOS. El nombre de la muestra debe ser idéntico para las siete secuencias de cebadores de una muestra. El nombre de la muestra y la identificación del cebador deben separarse con dos subrayados consecutivos (doble subrayado). La identificación del cebador contiene el nombre del cebador y cualquier otra información específica de esa secuencia. Por ejemplo: Patient196 A Patient196 B Patient196 C 2. Seleccione la siguiente configuración para cada muestra de la hoja de cálculo. Dye Set (Conjunto de colorantes) 3100 Data Collection Software v (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.0.1) 3100 Data Collection Software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1) E E E 3100-Avant Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0) 1. Si las muestras están congeladas, espere a que se equilibren a temperatura ambiente. IMPORTANTE! Esto debe hacerse inmediatamente antes de cargar las muestras. 2. Resuspenda las muestras añadiendo 20 μl de formamida Hi-Di a cada pocillo de muestra; utilice una alícuota nueva de formamida Hi-Di para cada experimento. Contiene formamida. R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. R 36/38 Irrita los ojos y la piel. S 53 Evítese la exposición recábense instrucciones especiales antes del uso. S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los ojos/la cara. S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). Nota. Las muestras resuspendidas en formamida Hi-Di son estables a temperatura ambiente durante un máximo de 35 horas. No deje estas muestras a temperatura ambiente durante más tiempo. 3. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos. 4. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a x g para que el líquido se acumule en el fondo de la placa. Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor. 5. Prepare e instale la unidad de placa. Mobility File (Archivo de movilidad) Comments (Comentarios) BioLIMS Project (Proyecto BioLIMS) Project Name (Nombre del proyecto) Run Module 1 (Módulo de análisis 1) Analysis Mode 1 (Modo de análisis 1) Analysis Module 1 (Módulo de análisis 1) DT3100POP6 {BD}v2.mob escriba comentarios, si procede DT3100POP6 {BD}v2.mob escriba comentarios, si procede 3100-Project1 DT3100POP6{BD} v2.mob escriba comentarios, si procede 3100-Project1 3100Avant-Project1 StdSeq50_POP6 DefaultModule BC- 3100SR_SeqOff FtOff.saz StdSeq50_POP6 DefaultModule BC- 3100POP6SR_Seq OffFtOff.saz StdSeq50_POP6 DefaultModule BC- 3100APOP6SR_Seq OffFtOff.saz Preparación de reacciones de secuenciación purificadas para el análisis en el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) 1. Si las muestras están congeladas, espere a que se equilibren a temperatura ambiente. IMPORTANTE! Esto debe hacerse inmediatamente antes de cargar las muestras. 2. Resuspenda las muestras añadiendo 20 μl de formamida Hi-Di a cada pocillo de muestra; utilice una alícuota nueva de formamida Hi-Di para cada experimento. Nota. Para facilitar la introducción de texto, seleccione la configuración apropiada para la primera muestra y, a continuación, haga clic en el encabezado de la columna para seleccionar toda la columna. Después, en el menú Edit (Edición), utilice el comando Fill Down (Rellenar) o pulse Ctrl + D. 3. Compruebe que el registro de la placa sea correcto y haga clic en OK (Aceptar) para volver al menú principal. Preparación de reacciones de secuenciación purificadas para el análisis en el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100) Nota. Las instrucciones para preparar reacciones de secuenciación purificadas para el análisis en el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) se describen en la siguiente sección. Contiene formamida. R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. R 36/38 Irrita los ojos y la piel. S 53 Evítese la exposición recábense instrucciones especiales antes del uso. S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los ojos/la cara. S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). Nota. Las muestras resuspendidas en formamida Hi-Di son estables a temperatura ambiente durante un máximo de 35 horas. No deje estas muestras a temperatura ambiente durante más tiempo. 3. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 19 de 66

24 4. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a x g para que el líquido se acumule en el fondo de la placa. Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor. 5. IMPORTANTE! La señal se puede degradar si se dejan las muestras en el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) durante más de 14 series analíticas (1 serie analítica = aproximadamente 2,5 horas). Si la placa contiene 7 o menos columnas de muestras (incluido el control), prepare e instale la placa en la unidad de placa tal como se describe en «Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de la placa». O bien, Si la placa contiene más de 7 columnas de muestras, continúe con el paso 6 que se describe a continuación. 6. Transfiera las columnas de muestras sobrantes de la placa 1 a una nueva placa MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp ) (placa 2). Nota. Se pueden adquirir placas adicionales de Applied Biosystems. Consulte Material necesario en la página Transfiera 10 µl de control positivo (la mitad del volumen de la configuración de secuenciación) de la placa 1 a la placa 2. Realice este paso en los 7 pocillos que contienen el control positivo. 8. Prepare e instale la placa 1 en la unidad de placa tal como se describe en «Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de la placa». 9. Selle la placa 2 con cinta adhesiva de aluminio y consérvela en la oscuridad, a una temperatura entre 15 C y 25 C. Analice las muestras antes de una semana. Nota. Cargue la placa 2 cuando finalice la placa 1. Siga los pasos 10 a 13 que se describen a continuación. 5. Seleccione el indicador de posición de la placa que desea vincular al registro que acaba de seleccionar. El color del indicador de posición de la placa cambiará a verde. El registro de la placa se pasa de la tabla Pending Plate Records (Registros de placa pendientes) a la tabla Linked Plate Records (Registros de placa vinculados). Nota. La duración de este proceso es variable y depende del número de muestras. 6. Haga clic en la ficha Run View (Vista del análisis) para ver el plan de análisis. Seleccione cada serie analítica para comprobar que se resaltan los pocillos apropiados. IMPORTANTE! Si el pocillo no está resaltado, no se analizará. 7. Para añadir información a un registro de placa vinculado: a. Desvincule el registro de la placa y devuélvalo a la tabla Pending Plate Records (Registros de placa pendientes). b. Haga doble clic en el nombre del registro de la placa para abrirlo. c. Actualice el registro de la placa y haga clic en OK (Aceptar). d. Vincule de nuevo el registro de la placa a la placa. 8. Compruebe que la placa esté vinculada. Desvinculación del registro de una placa 1. En la tabla Linked Plate Records (Registros de placa vinculados) de la página Plate View (Vista de la placa), seleccione el registro de la placa que desee desvincular. 2. Haga clic en Unlink (Desvincular). 10. Espere a que la placa 2 se equilibre a la temperatura ambiente. IMPORTANTE! Esto debe hacerse inmediatamente antes de cargar las muestras. 11. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos. 12. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a x g para que el líquido se acumule en el fondo de la placa. Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor. Si el registro de la placa está Finalizado No finalizado El registro de la placa Pasará a la tabla Processed Plate Records (Registros de placa procesados) y el color del indicador de posición de la placa cambiará de nuevo a amarillo. Volverá a la tabla Pending Plate Records (Registros de placa pendientes) y el color del indicador de posición de la placa cambiará de nuevo a amarillo. 13. Prepare e instale la placa 2 en la unidad de placa tal como se describe a continuación en «Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de la placa». Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de la placa 1. Acople un separador de 96 pocillos a la placa, y encaje la placa en el retenedor y la base del analizador. 2. Coloque la placa con las reacciones de secuenciación en el instrumento. Coloque el pocillo A1 en la esquina superior derecha. Inicio del análisis 1. IMPORTANTE! No interrumpa un análisis. Haga clic en el botón Run Instrument (Accionar el instrumento) de color verde para iniciar el análisis. IMPORTANTE! No realice simultáneamente un análisis de datos ni ejecute ningún otro programa de software durante la secuenciación. Si la estación de trabajo está ocupada con la recogida de datos, los datos de secuenciación deben transferirse a otro ordenador para analizarlos. 2. El software comprueba automáticamente el espacio disponible en la base de datos y en la unidad D. 3. Haga clic en la ficha Plate View (Vista de la placa). Compruebe que el indicador de posición de la placa está de color amarillo. 4. En la tabla Pending Plate Records (Registros de placa pendientes), seleccione el Plate Record (Registro de la placa) correspondiente a la placa que va a cargar. Si la base de datos o la unidad D Está llena No está llena Entonces Si la unidad D está llena, copie los archivos de las muestras a un CD-RW o elimine la muestra original de la unidad. Después, haga clic en Run Instrument (Accionar el instrumento). Si la base de datos está llena, emplee la utilidad CleanUp DB (Limpiar base de datos) para limpiar la base de datos. Después, haga clic en Run Instrument (Accionar el instrumento). Se inicia el análisis. Página 20 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

25 3. Cuando finalice el preanálisis, compruebe lo siguiente: Starting Electrophoresis (Iniciando electroforesis) aparece en la esquina inferior izquierda de la pantalla EP está en On (Activado) Oven Temp (Temperatura de la estufa) está en 50,0 C Nota. Si no hay corriente eléctrica, habrá una burbuja en el bloque de polímero y deberá: a. Cancelar el análisis. b. Eliminar la burbuja del bloque de polímero. c. Reinicie el análisis. 4. Para supervisar el progreso del análisis, seleccione View > Instrument Status Monitor (Ver > Monitor de estado del instrumento). No utilice datos que estén en proceso de recopilarse si se produce un corte de corriente en medio de un análisis. Para ver los datos sin analizar IMPORTANTE! Cierre siempre las ventanas Array View (Vista de la matriz) y Capillary View (Vista de los capilares). Durante un análisis, no deje abiertas estas páginas durante períodos prolongados. Esto podría provocar problemas de actualización de la pantalla irrecuperables. Deje abierta la ventana Status View (Vista del estado). Vista de los datos sin procesar de un análisis finalizado 1. En el Data Collection Software (software de recogida de datos), seleccione la ficha Array View (Vista de la matriz). 2. Seleccione Instrument > Data Acquisition > Display Run Data (Instrumento > Adquisición de datos > Mostrar datos del análisis). 3. En la lista desplegable, seleccione el análisis que desee ver y haga clic en OK (Aceptar). Nota. Puede ver cualquier análisis finalizado que esté en la base de datos del instrumento. Pueden pasar unos instantes hasta que se recuperen los datos, sobre todo si la base de datos está bastante llena. 4. Utilice las funciones de desplazamiento de la página Array View (Vista de la matriz) para ver los datos. 5. O bien, si desea ver los datos del electroferograma de varios capilares a la vez, seleccione la ficha Capillary View (Vista de los capilares) para abrir la página Capillary View (Vista de los capilares). Si los datos se han vuelto a extraer, se encontrarán en la ubicación definida en las preferencias o en la siguiente ubicación predeterminada: D:\AppliedBio\3100\DataExtractor\Extracted Runs o D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor\Extracted Runs Uso del programa ABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 y análisis de los datos ABI PRISM Sequencing Analysis Software El programa ABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 se instalará en el disco duro de la estación de trabajo. Este programa se utiliza para: Revisar las secuencias de bases identificadas Reanalizar los datos Módulo de análisis del analizador genético para utilizar con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0 Para el programa 3100 Data Collection software v (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.0.1), utilice: BC-3100SR_SeqOffFtOff.saz o Para el programa 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1), utilice: BC-3100POP6SR_SeqOffFtOff.saz o Para el programa 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), utilice: BC-3100APOP6SR_SeqOffFtOff.saz Parámetros de procesamiento Un parámetro de procesamiento es una palabra, una frase o una casilla de verificación que indica al programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) qué hay que hacer en un determinado punto del procesamiento del archivo. Creación de Basecaller Settings (Configuración del identificador de bases) Basecaller Settings (Configuración del identificador de bases) establece las funciones del programa Basecaller (Identificador de bases) que permiten definir el número de bases de los archivos de datos que se desea analizar. Durante la identificación de las bases, Basecaller (Identificador de bases) tiene en cuenta tanto lo establecido en Basecaller Settings (Configuración del identificador de bases) como el valor de Stop Point (Punto de parada) en la ventana Sample Manager (Administrador de muestras), y se detiene en cuanto encuentra uno de los criterios de interrupción o el valor del Stop Point (Punto de parada), lo que ocurra primero. Para ver los datos analizados Cuando finaliza un análisis, los archivos de las muestras analizadas se extraen en una carpeta para el análisis, junto con un registro del análisis, en la ubicación definida en las preferencias o bien, en la siguiente ubicación predeterminada: D:\AppliedBio\3100\DataExtractor o D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor 1. En el programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación), seleccione Edit > Preferences > Basecaller Settings (Edición > Preferencias > Configuración del identificador de bases). 2. En la ventana Preferences (Preferencias), haga clic en Create a set (Crear un conjunto). 3. Seleccione la casilla de verificación Set the endpoint (Establecer el punto de interrupción) y escriba 580 en el cuadro de texto. 4. Guarde estos ajustes como configuración predefinida con el nombre HIV580. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 21 de 66

26 Establecimiento del parámetro del identificador de bases 1. Seleccione Edit > Preferences > Sample Manager Defaults (Edición > Preferencias > Configuración predeterminada del administrador de muestras). 2. Seleccione el Basecaller (Identificador de bases) apropiado en la lista desplegable Basecaller (Identificador de bases): Para el programa 3100 Data Collection software v (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.0.1), seleccione: 3100SR Para el programa 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1), seleccione: 3100POP6SR Para el programa 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), seleccione: 3100APOP6SR Nota. El analizador 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100 o 3100-Avant) está listo para iniciar el análisis de la secuencia. Uso de la ventana Sample Manager (Administrador de muestras) La ventana Sample Manager (Administrador de muestras) permite seleccionar una lista de los archivos de muestras que procesará el programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) y elegir los valores de varios parámetros del análisis. 1. Para abrir la ventana, seleccione Window > Show Sample Manager (Ventana > Mostrar administrador de muestras). 5. Borre las columnas P (Imprimir) y F (Factura). 6. Haga clic en Start (Inicio). 7. Después del análisis, compruebe si aparece un cuadro verde para cada muestra en la columna A. IMPORTANTE! Si alguna muestra tiene un cuadro rojo, revise la configuración y analice de nuevo los datos. Adición de los archivos de muestras 1. Haga clic en Add files (Añadir archivos) en la ventana Sample Manager (Administrador de muestras) o seleccione Manager > Add Files (Administrador > Añadir archivos). La parte superior del cuadro de diálogo que se abre es similar a un cuadro de diálogo de directorio típico, pero solo muestra los nombres de las carpetas y los archivos de muestras. 2. En el cuadro de lista superior, localice y abra la carpeta que contiene los archivos que desea añadir a Sample Manager (Administrador de muestras). 3. Añada los archivos que desee de Sample Manager (Administrador de muestras) a la lista Sample Files (Archivos de muestras) de la parte inferior del cuadro de diálogo. Para añadir Entonces 2. Para cerrar la ventana, seleccione Window > Hide Sample Manager (Ventana > Ocultar administrador de muestras). Uso del programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) 1. Cuando finalice el análisis, inicie el programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación). Un solo archivo a la lista Todos los archivos a la lista Algunos archivos a la lista Seleccione el archivo y haga clic en Add (Añadir), o haga doble clic en el nombre del archivo. Haga clic en Add All (Añadir todos). Añádalos individualmente o bien, haga clic en Add All (Añadir todos) y utilice después el botón Remove (Eliminar) para quitar los archivos que no desee añadir a la lista. 2. Añada todos los archivos de las carpetas Run (Análisis) a Sample Manager (Administrador de muestras). 3. Seleccione la configuración siguiente para cada muestra: Basecaller (Identificador de bases) Spacing (Separación) Basecaller Setting (Configuración del identificador de bases) Peak 1 Location (Ubicación del pico 1) Start Point (Punto de inicio) Stop Point (Punto de parada) DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/cebador) Factura settings (Configuración de factura) Para el programa 3100 Data Collection software v (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.0.1): Basecaller-3100SR Para el programa 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1): Basecaller-3100POP6SR Para el programa 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0): Basecaller-3100APOP6SR Definido por el instrumento HIV580 Establecido por el software Establecido por el software Establecido por el software DT3100POP6{BD}v2 Esta función no se utiliza con el ensayo ViroSeq 4. Cuando todos los archivos deseados estén en las listas de la parte inferior, haga clic en Finish (Finalizar) para cerrar el cuadro de diálogo y añadir los archivos a Sample Manager (Administrador de muestras). Puede eliminar un archivo de muestras de la ventana Sample Manager (Administrador de muestras) en cualquier momento, excepto cuando el programa esté procesando ese archivo. También puede cambiar el orden en el que aparecen los archivos de muestras en la ventana Sample Manager (Administrador de muestras). Eliminación de un archivo 1. Haga clic en el nombre del archivo en la columna Sample File Name (Nombre del archivo de muestras). Aparecerá resaltada la fila completa. 2. Pulse la tecla Supr o bien, haga clic en Remove (Eliminar) en la parte superior de la ventana o seleccione Manager > Remove Files (Administrador > Eliminar archivos). El programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) eliminará el archivo de la lista. 4. Seleccione la casilla de verificación A (analizar) para cada muestra. Página 22 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

27 Eliminación de varios archivos 1. Para eliminar todos los archivos. a. Seleccione Edit > Select All (Edición > Seleccionar todos). b. Haga clic en Remove (Eliminar) o pulse la tecla Supr. 2. Para eliminar varios archivos adyacentes. a. Haga clic en el nombre del primer archivo del grupo en Sample File Name (Nombre del archivo de muestras). b. Mientras mantiene pulsada la tecla Mayús, haga clic en el nombre del último archivo del grupo en Sample File Name (Nombre del archivo de muestras). c. Haga clic en Remove (Eliminar) o pulse la tecla Supr. 3. Para eliminar varios archivos no adyacentes. a. Mientras mantiene pulsada la tecla Ctrl, haga clic en el nombre de cada archivo que desea eliminar en Sample File Name (Nombre del archivo de muestras). b. Haga clic en Remove (Eliminar) o pulse la tecla Supr. Reordenación de archivos 1. Haga clic en el nombre del archivo en la columna Sample File Name (Nombre del archivo de muestras). Aparecerá resaltada la fila completa. 2. Mientras mantiene pulsada la tecla Alt, arrastre el nombre del archivo a una nueva ubicación en la columna Sample File Name (Nombre del archivo de muestras). Impresión de los datos de un análisis 1. Si desea cambiar temporalmente la orientación de la página, el tipo de papel, el número de paneles/página, etc., seleccione File > Print Setup (Archivo > Configuración de impresión) para abrir un cuadro de diálogo Print Setup (Configuración de impresión) especial. 2. Ajuste la configuración según sea necesario. Después, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. 3. Abra el archivo que desee imprimir. 4. Seleccione File > Print (Archivo > Imprimir) para abrir el cuadro de diálogo Printing Options (Opciones de impresión). Antes de utilizar el programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software Lista de comprobación para los datos de análisis de la secuenciación del ADN Antes de analizar los datos de Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) del ADN con el programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software, revise lo siguiente en los archivos: Artículo Revise o corrija los Start Points (Puntos de inicio) Revise o corrija los Stop Points (Puntos de parada) Nombres de las muestras Archivo DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/cebador) Intensidad suficiente de la señal Compruebe/Acción Inspeccione un subconjunto de muestras para comprobar que los Start Points (Puntos de inicio) se han establecido correctamente. Establezca Start Points (Puntos de inicio) después del blob de terminación del colorante inicial. o Determine el Start Point (Punto de inicio) medio para un subconjunto de muestras, introduzca este valor en Start Point (Punto de inicio) y Peak 1 Location (Ubicación del pico 1) de la primera muestra, y a continuación, seleccione Fill Down (Rellenar) para todas las muestras. Compruebe que los Stop Points (Puntos de parada) para un subconjunto de muestras estén en el punto de 580 bases. En caso contrario, asegúrese de seleccionar HIV580. Compruebe que los nombres de los archivos de muestras sean correctos. Utilice el mismo nombre de muestra para todas las muestras de un proyecto. El nombre de los archivos de muestras: Debe tener menos de 59 caracteres Debe incluir toda la información necesaria para identificar una muestra. Debe tener dos subrayados consecutivos para separar el nombre de la muestra y el cebador de la secuencia. El software ViroSeq necesita este doble subrayado para compilar y crear proyectos. IMPORTANTE! La información que aparece a la izquierda del doble subrayado debe ser idéntica para las seis o siete secuencias de una muestra. La información que aparece a la derecha del doble subrayado es exclusiva de cada secuencia y debe incluir la letra del cebador. El archivo DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/cebador) correcto para el análisis. Revise las cifras de intensidad de la señal para cada base. Si el valor total de intensidad de la señal del A, C, G y T es inferior a 400, inspeccione los datos sin procesar y los datos analizados, y deseche los datos con ruido. IMPORTANTE! Es necesario que se hayan secuenciado correctamente seis de los siete segmentos para poder continuar con el análisis en el software ViroSeq. Uno de los segmentos faltantes puede ser A o D. 5. Si desea dejar un margen izquierdo más ancho para realizar perforaciones, seleccione Allow for 3-hole punch (Dejar espacio para 3 perforaciones). 6. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo Printing Options (Opciones de impresión) y abrir el cuadro de diálogo Printer (Impresora) estándar de la impresora. 7. Realice los cambios necesarios en el cuadro de diálogo Printer (Impresora) y haga clic en Print (Imprimir) para empezar a imprimir. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 23 de 66

28 Sección 4: Análisis con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 Contenido: Introducción Material necesario Requisitos del sistema para ejecutar el programa ViroSeq Software v Instalación, desinstalación y uso del software Ejemplos Edición de los datos Informe sobre resistencia a antirretrovirales Tablas de mutaciones Mensajes de error del software Software ViroSeq y resultados Introducción Para generar un proyecto el software ViroSeq procesa los seis o siete archivos de secuencia de cebador correspondientes a una misma muestra de plasma. Un proyecto es un conjunto de los archivos de muestras que contienen toda la información de secuenciación necesaria para producir un genotipo. El formato del proyecto permite la revisión y la edición manual de los datos del electroferograma para generar una secuencia consensuada final para los genes de la proteasa y de la transcriptasa inversa (TI) del VIH-1. IMPORTANTE! Para obtener información acerca de las limitaciones y anomalías conocidas del ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8, consulte las Release Notes (Notas de la versión) incluidas en el ViroSeq Software v2.8 CD (CD del software ViroSeq v.2.8). Terminología empleada en esta sección Término Definición ASCII Acrónimo de American Standard Code for Information Interchange (código normalizado estadounidense para el intercambio de información). Un formato de texto simple que muchas plataformas y ordenadores reconocen. Identificación de bases La identidad del nucleótido asignado a un pico de señal de un electroferograma. Secuencia consensuada Una secuencia obtenida a partir de varias secuencias ya alineadas. Cursor de edición Un elemento gráfico que resalta un solo nucleótido de la secuencia consensuada y que se convierte en la diana de la operación de edición. Electroferograma Las señales procesadas de la fluorescencia de los colorantes de secuenciación, calculadas por el software de recogida y análisis de datos suministrado con el instrumento de secuenciación. FASTA Un archivo de texto con formato ASCII que contiene información del nombre del archivo y una secuencia. IUB International Union of Biochemists (Unión internacional de bioquímicos) Java Un lenguaje de programación diseñado para generar aplicaciones que puedan ejecutarse en sistemas operativos distintos sin necesidad de modificaciones. Barra de navegación Elemento gráfico que muestra las posiciones de interés (POI) y permite desplazarse a los datos correspondientes. POI Acrónimo de Position of Interest (posición de interés). La posición de un nucleótido que debe ser investigado por el usuario. Identificación del cebador La correspondencia de una secuencia con un cebador conocido. Proyecto La entidad de software que comprende los datos, el historial de ediciones, las posiciones de recorte, las secuencias ensambladas, etc., asociadas al procesamiento de los segmentos de secuencias de una sola muestra de VIH-1. Término Archivo de proyecto Secuencia de referencia Archivo de la muestra Secuencia Segmento de secuencia Recortado VM XML Material necesario El archivo principal que crea y que utiliza el software ViroSeq. Contiene todos los datos necesarios para producir un análisis de genotipos. La secuencia fija que se utiliza para todas las comparaciones. La secuencia de referencia del ViroSeq se basa en el HXB-2 (GenBank K03455). Un archivo que contiene todos los datos de secuencia de una muestra, generado por el programa ABI PRISM DNA Sequencing Analysis Software. Una cadena de bases nucleotídicas. Los datos de secuencia obtenidos de un cebador. Marcaje de datos para excluirlos del proceso de obtención de la secuencia consensuada. Virtual Machine. El intérprete de Windows Java que permite que el ordenador comprenda el lenguaje Java. Extensible Markup Language (Lenguaje de marcado extensible). Un formato flexible de texto que se utiliza para el intercambio de datos en Internet y en otros lugares. Descripción ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 4J94-22 Requisitos del sistema para ejecutar el programa ViroSeq Software v2.8 Para ejecutar el software ViroSeq sin conexión en un ordenador independiente se deben cumplir los siguientes requisitos. El software no puede instalarse en Windows NT.: Java Runtime Environment (JRE) Microsoft Windows JRE versión 1.4.2_10, o Microsoft Windows XP - JRE versión 1.4.2_10. Nota. JRE se incluy en el CD de instalación del software ViroSeq y se instala automáticamente junto con el software ViroSeq. Configuración 1 Configuración 2 Configuración 3 Requisitos del sistema operativo: Microsoft Windows 2000, Service Pack 4 Requisitos del sistema operativo: Microsoft Windows XP, Service Pack 2 Requisitos del sistema operativo: Plataforma: Plataforma: Plataforma: Procesador Intel Pentium IV (un solo núcleo) Procesador Intel Pentium M (un solo núcleo) Microsoft Windows XP, Service Pack 2 Procesador Intel Core 2 Duo (doble núcleo) 2,0 GHz o más 1,86 GHz o más 2,4 GHz o más 1 GB de RAM o más 512 MB de RAM o más 2 GB de RAM o más Disco duro de 40 GB o más Disco duro de 40 GB o más Disco duro de 40 GB o más Teclado, ratón Teclado, ratón Teclado, ratón Monitor que admita una resolución de pantalla de x Definición Monitor que admita una resolución de pantalla de x Monitor que admita una resolución de pantalla de x 900 Página 24 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

29 Instalación, desinstalación y uso del software Antes de instalar o desinstalar el ViroSeq software v2.8, debe iniciar una sesión en Windows utilizando una cuenta con privilegios de administrador. No intente instalar o desinstalar el software ViroSeq desde una cuenta de usuario estándar o restringido. Para instalar el software en un ordenador con Windows 2000 o XP Se necesitan privilegios de administrador para que la instalación se ejecute correctamente. 1. Cierre todas las demás aplicaciones del escritorio. 2. Introduzca el ViroSeq software v2.8 CD (CD del software ViroSeq v.2.8) en la unidad de CD. 3. El instalador debe iniciarse automáticamente. Si no lo hace, haga lo siguiente: a. Haga doble clic en My Computer (Mi PC) en el escritorio. b. Con el botón derecho del ratón, seleccione la unidad que contenga el CD. c. Seleccione Explore (Explorar). d. En Windows Explorer (Explorador de Windows), abra la carpeta del software ViroSeq. Haga doble clic en Setup.exe. 4. Acepte las condiciones del License Agreement (Contrato de licencia). Inicio del software Hay tres formas de iniciar el software: 1. Haga doble clic en el icono de ViroSeq v2.8 en el escritorio. ADVERTENCIA: No abra más de una copia de la aplicación ViroSeq software v2.8 a la vez. 2. Inicie el software ViroSeq desde el menú Start (Inicio). a. Haga clic en el menú Start (Inicio). b. Seleccione Programs > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8 (Programas > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8). 3. Inicie el software desde C:\ViroSeq v2.8. a. Haga clic en el directorio C:\ViroSeq v2.8. b. Haga doble clic en el icono de ViroSeq. Inicio de una sesión en el software Por motivos de seguridad, el programa requiere que cada usuario inicie una sesión. Al arrancar el programa aparece la ventana de diálogo User Login (Inicio de sesión de usuario). Introduzca un nombre de usuario y una contraseña válidos y a continuación haga clic en OK (Aceptar). El nombre de usuario, al igual que la fecha y la hora del sistema, se registran en la ventana History (Historial). Consulte Software Error Messages (Mensajes de error del software). Si va a iniciar una sesión por primera vez, el nombre de usuario predeterminado es Admin y la contraseña es hiv1. 5. Siga las instrucciones de la pantalla del instalador. Nota. El software se instalará en el directorio C:. Puede seleccionarse un directorio diferente si se desea. El icono de ViroSeq v2.8 se instalará automáticamente en el escritorio. Para desinstalar el software en un ordenador con Windows 2000 o XP El software se puede eliminar fácilmente del ordenador utilizando el programa Uninstall (Desinstalar). El desinstalador eliminará todos los archivos del programa y el icono del escritorio, pero dejará en el sistema los archivos modificados por el usuario. 1. En el menú Start (Inicio) de Windows, seleccione Start > Programs > ViroSeq v2.8 > Uninstall (Inicio > Programas > ViroSeq v2.8 > Desinstalar). 2. Se abrirá el cuadro de diálogo InstallShield Wizard (Asistente para la instalación). 3. Haga clic en Remove (Eliminar). 4. Haga clic en Next (Siguiente). 5. Aparecerá un cuadro de diálogo de confirmación. 6. Haga clic en Yes (Sí) para desinstalar la aplicación. 7. El proceso de desinstalación se llevará a cabo automáticamente y luego se mostrará la ventana de diálogo Maintenance Complete (Mantenimiento finalizado). ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 25 de 66

30 Cambio de la contraseña de administrador 1. Escriba el nombre del centro en el cuadro Installation Site (Centro de instalación). Nota. Se admiten abreviaturas e identificaciones numéricas. 2. En Default Password (Contraseña predeterminada), escriba hiv1. 3. Escriba su propia contraseña en el cuadro New Password (Contraseña nueva) y en el cuadro Re-Enter Password (Reintroducir contraseña). Nota. La contraseña distingue entre mayúsculas y minúsculas, y debe tener un mínimo de seis y un máximo de 14 caracteres. 4. Haga clic en OK (Aceptar). Adición de usuarios nuevos El software ViroSeq solo puede ser utilizado por usuarios capacitados. 1. En la ventana Navigation (Navegación), seleccione Edit > Change Passwords (Edición > Cambiar contraseñas). Nota. Es necesario abrir un proyecto de ViroSeq para que aparezca la ventana Navigation (Navegación). 2. En el panel User Information (Información del usuario), escriba el nuevo nombre de usuario que desee añadir en el cuadro User Name (Nombre de usuario). 3. En el cuadro Employee ID (ID del empleado), escriba el nombre o el número de identificación del empleado. 4. Escriba una contraseña en el cuadro New Password (Contraseña nueva) y en el cuadro Re-Enter Password (Reintroducir contraseña). 5. Haga clic en Add User (Añadir usuario). El nuevo usuario aparecerá en el panel Registered Users (Usuarios registrados). 6. Puede seguir añadiendo usuarios si es necesario; cuando termine, haga clic en OK (Aceptar). Eliminación de un usuario 1. En la ventana Navigation (Navegación), seleccione Edit > Change Passwords (Edición > Cambiar contraseñas). Se abrirá el cuadro de diálogo Administrator Access (Acceso de administrador). 2. En el panel Registered Users (Usuarios registrados), seleccione el nombre que desea eliminar. Se habilitará el botón Remove (Eliminar). 3. Haga clic en Remove (Eliminar) para quitar al usuario seleccionado y después, haga clic en OK (Aceptar). Cambio de las contraseñas de usuario El administrador puede cambiar las contraseñas de usuario en la ventana de diálogo Administrator Access (Acceso de administrador), después de seleccionar Edit > Change Passwords (Edición > Cambiar contraseñas). Los usuarios que no sean administradores pueden cambiar las contraseñas de usuario en el cuadro de diálogo User Access (Acceso de usuario), después de seleccionar Edit > Change Passwords (Edición > Cambiar contraseñas). Cuando aparezca el cuadro de diálogo User Access (Acceso de usuario), escriba la información adecuada en los campos Current Password (Contraseña actual), New Password (Contraseña nueva) y Re-Enter Password (Reintroducir contraseña), y después haga clic en OK (Aceptar). Las siguientes reglas se aplican a los nombres de usuario y a las contraseñas: Los nombres de usuario deben ser únicos. No distinguen entre mayúsculas y minúsculas. Se permiten espacios en el nombre de usuario y la contraseña. Las contraseñas distinguen entre mayúsculas y minúsculas. El campo de la contraseña no puede quedarse en blanco. Las contraseñas deben tener 6 caracteres como mínimo y 14 como máximo. Las contraseñas aparecen en la pantalla como asteriscos. Las contraseñas pueden contener letras, números y caracteres especiales (imprimibles). No se puede utilizar la contraseña predeterminada hiv1 al añadir un usuario nuevo. Verificación de la instalación del software Compruebe que el programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 se haya instalado correctamente, mediante el análisis de los archivos de muestras de demostración QA10 (.ab1), ubicados en el directorio C:\ViroSeq v Haga clic en New (Nuevo) en la ventana Project Status (Estado del proyecto). Se abrirá el cuadro de diálogo Open (Abrir). 2. Vaya a la carpeta C:\ViroSeq v2.8 > Projects > Demo > QA10 (C:\ViroSeq v2.8 > Proyectos > Demo > QA10). 3. Seleccione un archivo de datos de secuencia y haga clic en Open (Abrir). El software ensambla y alinea los datos para generar una secuencia consensuada a partir de los archivos.ab1 encontrados en la carpeta QA10. Se abrirán las ventanas Navigation (Navegación) y View*Edit (Ver*Edición), que muestran el proyecto compilado final para QA Seleccione File > Generate Resistance Report (Archivo > Generar informe sobre resistencia) para obtener una vista preliminar de las mutaciones de resistencia farmacológica detalladas en la página 1 del informe Antiretroviral Drug Resistance Report (Informe sobre resistencia a antirretrovirales). Compruebe que las mutaciones de resistencia farmacológica resultantes coincidan con la información de la tabla siguiente: Resistencia Mutaciones QA10 RT Proteasa Descripción general del proyecto Pasos principales de un proyecto Archivos de datos de secuenciación del ADN M41L A62V T69ins V118I M184V T215Y L10I L24I M46I F53L I54V A71V V82A Compruebe lo siguiente: Calidad correcta de la secuencia Presencia de límites definidos Nombres correctos de las muestras Archivo DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/cebador) apropiado Creación de un proyecto nuevo Busque y seleccione los archivos de secuenciación Compile el proyecto Página 26 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

31 Revisión de los datos del proyecto Creación de un proyecto nuevo Verifique que: Se haya compilado un número suficiente de archivos de secuenciación Los nombres de las muestras sean correctos Los archivos de secuenciación estén alineados en el orden y en la orientación correctos Edición de los datos Escriba la información específica del paciente, del laboratorio y de las muestras Distinga entre los picos y el ruido Recorte los extremos de los segmentos Verifique y concilie las identificaciones de bases mixtas y las bases que no se correspondan Compare con la secuencia de referencia Preparación del informe sobre resistencia Imprímalo o guárdelo en formato XML Guarde el archivo FASTA 1. Inicie el software ViroSeq y haga clic en New (Nuevo), en la ventana Project Status (Estado del proyecto). Se abrirá el cuadro de diálogo Open (Abrir). Si el software ViroSeq ya está abierto, seleccione File > New Project (Archivo > Proyecto nuevo). 2. Vaya a la carpeta que contiene los archivos del software Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) y ábrala. 3. Seleccione un archivo de datos de secuencia y haga clic en Open (Abrir). El software ensamblará y alineará los archivos de secuencia de cebador de una muestra para generar una secuencia consensuada, y creará un proyecto. Mientras el software compila el proyecto, aparecerá la ventana Progress (Progreso). Nota. El software crea proyectos independientes para cada nombre de muestra único asignado a los datos en el programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación). Existe una limitación en el número de proyectos que es posible compilar a la vez. Un límite conservador serían 14 proyectos. Al terminar, la ventana Progress (Progreso) se cierra y se abren las ventanas Navigation (Navegación) y View*Edit (Ver*Edición), que muestran uno de los proyectos compilados. Apertura de un proyecto existente 1. En la ventana Project Status (Estado del proyecto), seleccione el proyecto que desee. Si el proyecto deseado no aparece en la ventana Project Status (Estado del proyecto): a. Haga clic en Find (Buscar) para abrir el cuadro de diálogo Open (Abrir). b. Vaya a la carpeta en la que está guardado el proyecto. c. Seleccione el proyecto que desee. 2. Haga clic en Open (Abrir). Se abrirán las ventanas Navigation (Navegación) y View*Edit (Ver*Edición) del proyecto. IMPORTANTE! No abra y edite el mismo archivo de proyecto en más de una copia del software ViroSeq. Si edita los mismos segmentos de datos a la vez en varias instancias de ViroSeq, ocasionará un comportamiento inesperado del software. La ventana Navigation (Navegación) Después de compilar un proyecto, el software ViroSeq muestra gráficamente la secuencia consensuada en la ventana Navigation (Navegación). La ventana Navigation (Navegación) tiene dos partes: La barra de navegación La sección de alineación de segmentos Acerca de la barra de navegación La barra de navegación aparece en la parte superior de la ventana Navigation (Navegación). Esta barra muestra el número y la ubicación de las posiciones de interés (POI). Estas posiciones aparecen como líneas verticales en la barra de grises. El software ViroSeq muestra los proyectos compilados ya existentes en la ventana Project Status (Estado del proyecto). Para ver la ventana Project Status (Estado del proyecto), vaya a la ventana Navigation (Navegación) y seleccione File > Open Project (Archivo > Abrir proyecto). La columna Status (Estado) indica si el software encontró todos los segmentos introducidos. Si el estado es OK (Correcto) Entonces Se encontraron todos los segmentos esperados y el proyecto se compiló correctamente.? El software ViroSeq tuvo problemas al compilar el proyecto. Las causas posibles pueden ser: No fue posible identificar uno o más segmentos Se ensamblaron menos de 6 segmentos Nota. No continúe si el proyecto tiene menos de seis segmentos ensamblados. Uno de los segmentos faltantes puede ser A o D. Los números de la escala horizontal representan las posiciones de los codones de cada gen. Las POI están codificadas con colores, tal como se indica en la tabla siguiente. Codificación por color de las posiciones de interés (POI) Color Gris = color de fondo Rojo Negro Verde Azul Amarillo Blanco Significado Sin diferencias respecto a la referencia POI seleccionadas Falta de correspondencia entre segmentos Diferencia conocida o desconocida entre la secuencia de referencia y la secuencia consensuada Posición de varias bases Muestra las zonas cubiertas por un solo segmento durante el ensamblado Identificación de base confirmada por el usuario Nota. Primero es necesario guardar el proyecto. ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 27 de 66

32 Acerca de la sección de alineación de segmentos La sección de alineación de segmentos aparece en la parte inferior de la ventana Navigation (Navegación). Esta parte muestra gráficamente cómo se superponen los segmentos de secuencia. Partes y descripciones de la ventana View*Edit (Ver*Edición) Artículo Nombre Descripción 1 Botón saltar al extremo izquierdo Va a la POI situada en el extremo izquierdo. 2 Botón retroceder Pasa a la POI situada a la izquierda de la POI activa. La etiqueta de cada segmento está formada por el nombre del proyecto y el cebador utilizado. Los segmentos apuntan en la dirección de la polimerización. Compruebe que las secuencias están colocadas de la forma esperada. Hacia adelante - cebadores A, D, B, C Hacia atrás - cebadores F, G, H 3 Botón Trim (Recortar) Recorta o deshace el recortado del extremo seleccionado de un segmento en el electroferograma. 4 Botón Revert (Restablecer) Restablece la asignación de bases original de la POI actual. 5 Paleta de edición Edita la POI activa. Los botones representan los códigos de letras de las bases y las combinaciones de bases. En raras ocasiones, el segmento D puede estar alineado en una posición incorrecta. Después de compilar el proyecto, compruebe la posición del segmento D. Debe cubrir por completo el gen de la proteasa y el principio del gen de la TI. Si el segmento D no está colocado de la forma especificada, vuelva a compilar el proyecto sin el segmento D. Acerca de la ventana View*Edit (Ver*Edición) La ventana View*Edit (Ver*Edición) muestra la secuencia consensuada generada por el software. También contiene las herramientas de navegación y de edición. 6 Casilla de verificación Auto jump on edits (Saltar automáticamente después de la edición) 7 Casilla de verificación Reverse jump (Retroceder) 8 Botón Navigation Options (Opciones de navegación) Si está seleccionada, hace que se pase automáticamente a la siguiente POI después de cada edición. Se utiliza después de editar la posición actual; pasa a la siguiente POI hacia la izquierda. Esta casilla solo está activa cuando se selecciona la casilla de verificación Auto jump on edits (Saltar automáticamente después de la edición). Abre el cuadro de diálogo Navigation Options (Opciones de navegación). En este cuadro de diálogo se seleccionan las POI activas. Las POI activas son aquéllas a las que se ha llegado con los botones de navegación. 9 Botón avanzar Pasa a la POI situada a la derecha de la POI activa. 10 Botón saltar al extremo derecho Va a la POI situada en el extremo derecho. 11 Panel de etiquetas Etiqueta cada línea del panel de secuencias. También indica el nombre del cebador y la dirección de la polimerización para cada secuencia. 12 Número de codón Indica el número de codón de la secuencia de referencia. 13 Reference Translation (Traducción de referencia) Indica el código de una letra para la traducción a aminoácidos del código en la secuencia de referencia. 14 Consensus Translation Indica el código de una letra para la traducción a (Traducción consensuada) aminoácidos del código en la secuencia consensuada. 15 Reference Sequence (Secuencia de referencia) Bases de la secuencia de referencia. 16 Consensus Sequence (Secuencia consensuada) Bases de la secuencia consensuada. 17 Recuadro alrededor de la base POI actual. 18 Picos de la secuencia Electroferograma de un segmento de secuencia. El software ViroSeq muestra todos los segmentos de secuencia que se superponen en una posición. 19 Barra de desplazamiento La barra de desplazamiento horizontal del panel de secuencias. 20 Cuadro de información de posición Explica por qué se ha identificado una posición como POI. 21 Close View Edit (Cerrar Ver Edición) Cierra la ventana View Edit (Ver Edición). Página 28 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0

33 Paleta Editing (Edición) Menú File (Archivo) Códigos IUB Códigos IUB A = adenosina S = G o C (Fuerte - 3 puentes de H) C = citidina W = A o T (Débil - 2 puentes de H) G = guanosina Y = C o T (pyrimidine [pirimidina]) T = timidina B = C, G o T U = uracilo D = A, G o T K = G o T (Keto [ceto]) H = A, C o T M = A o C (amino) V = A, C o G R = A o G (purine [purina]) N = any (cualquier) base Opciones del menú File (Archivo) Elemento de menú New Project (Proyecto nuevo) Método abreviado de teclado Ctrl+N Descripción Abre el cuadro de diálogo Open (Abrir). Al hacer clic en el botón New (Nuevo) se puede seleccionar y abrir un archivo Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) de una carpeta y el software ensambla todas las secuencias de esa carpeta en proyectos nuevos. Códigos de los aminoácidos Aminoácido Código de tres letras Código de una letra Alanina Ala A Arginina Arg R Open Project (Abrir proyecto) Ctrl+O Abre la ventana Project Status (Estado del proyecto). Seleccione un proyecto de la lista o bien, haciendo clic en el botón Find (Buscar), puede seleccionar y abrir un proyecto ViroSeq ya compilado. Save (Guardar) Ctrl+S Guarda el proyecto abierto con todas las ediciones realizadas. Asparagina Asn N Save consensus (Guardar consenso) [FASTA] Ctrl+F Guarda la secuencia consensuada en un archivo de texto ASCII con la extensión.fasta. Aspartato o ácido aspártico Asp D Cisteína Cys C Generate Resistance Report (Generar informe sobre resistencia) Ctrl+G Permite ver e imprimir el informe sobre resistencia. Glutamina Gln Q Glutamato o ácido glutámico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Export Resistance Report (Exportar informe sobre resistencia) Menú Edit (Edición) Ctrl+X Permite exportar el informe sobre resistencia. Quit (Salir) Ctrl+Q Cierra el software ViroSeq. Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Opciones del menú Edit (Edición) Elemento de menú Método abreviado de teclado Descripción Serina Ser S Treonina Thr T Toggle Position Cursor (Alternar cursor de posición) Ctrl+T Activa o desactiva la línea de posición del cursor. Triptófano Trp W Tirosina Tyr Y Edit Report Information (Editar la información del informe) Ctrl+E Abre el cuadro de diálogo Edit Report Information (Editar la información del informe) donde se puede introducir la información del paciente, el laboratorio y el técnico para el encabezado del informe final. Valina Val V ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 29 de 66

34 Opciones del menú Edit (Edición) Revisión del proyecto compilado Elemento de menú Change Passwords (Cambiar contraseñas) Método abreviado de teclado Descripción Al iniciar una sesión como administrador, abre el cuadro de diálogo Administrator Access (Acceso de administrador) donde puede cambiar las contraseñas y realizar otras funciones administrativas. Al iniciar una sesión como usuario, abre el cuadro de diálogo User Access (Acceso de usuario) donde el usuario puede cambiar su contraseña. Una vez que el software ViroSeq ha compilado un proyecto, es necesario revisar y verificar las identificaciones de bases de las POI en la secuencia consensuada. Se pueden aceptar o cambiar las identificaciones de bases en los puntos en los que el software detecta diferencias entre la secuencia consensuada y la secuencia de referencia. El usuario decide si la identificación de bases propuesta está justificada, analizando los electroferogramas. Por ejemplo, los blobs de colorante al inicio de una secuencia o la repetición reiterada de la misma base pueden hacer que el software interprete incorrectamente la secuencia y sugiera una variación cuando en realidad no existe ninguna. Login As New User (Iniciar sesión como usuario nuevo) Menú Window (Ventana) Opciones del menú Window (Ventana) Abre la ventana User Login (Inicio de sesión de usuario). POI Una POI es una base de la secuencia consensuada con una o más de las siguientes características: Distinta de la cepa de VIH-1 de referencia Se encuentra en la tabla interna de posiciones de resistencia conocidas Se identifica como una base mixta en al menos un segmento en esa posición Muestra una inserción respecto a la secuencia de referencia Difiere de un segmento a otro Nota. Se pueden aplicar uno o más criterios de POI a una misma posición de consenso. Elemento de menú Método abreviado de teclado Descripción Códigos de color de las bases History (Historial) Abre el registro History (Historial). Base Color Menú Help (Ayuda) Adenina Citosina Verde Azul Guanina Negro Opciones del menú Help (Ayuda) Timina Bases mixtas Rojo Rosa Elemento de menú About ViroSeq (Acerca de ViroSeq) Método abreviado de teclado Descripción Muestra la información del producto. Establecimiento de las opciones de navegación La ventana Navigation Options (Opciones de navegación) se abre al hacer clic en el botón Navigation Options en la ventana View*Edit (Ver*Edición). Partes de un proyecto compilado Un proyecto compilado consta de: Electroferogramas de los segmentos de secuencia El software ViroSeq representa las bases como picos, con un color diferente para cada una de las cuatro bases. Secuencia consensuada de los segmentos de secuencia Con siete cebadores diferentes, los segmentos de secuencia se superponen y cubren cada sección del gen diana al menos dos veces en ambos sentidos (la excepción son los codones de la TI en las posiciones aproximadamente). Secuencia de referencia El software ViroSeq compara la secuencia consensuada con una secuencia de referencia, HXB-2. Traducción consensuada y de referencia El software ViroSeq muestra la secuencia de aminoácidos de la cepa de virus de referencia y todas las posibles traducciones de aminoácidos de la secuencia consensuada. Número de codón El software ViroSeq numera los codones basándose en la secuencia de referencia. Explicación de las opciones de navegación Opción Additional variants from reference (Variaciones adicionales respecto a la referencia) Descripción Configuración global Localiza las mutaciones que no se utilizan en el algoritmo del software ViroSeq. Página 30 de 66 ViroSeq TM HIV-1 Genotyping System v2.0