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1 QUANTA Lite aps/pt IgG ELISA (anti-fosfatidilserina/antiprotrombina) QUANTA Lite aps/pt IgM ELISA (anti-fosfatidilserina/antiprotrombina) Para uso diagnóstico in vitro Complejidad CLIA: Alta Código de Producto: , Uso previsto Los kits QUANTA Lite aps/pt IgG y QUANTA Lite aps/pt IgM son análisis inmunoenzimáticos por adsorción (ELISA) semicuantitativos y cualitativos para la detección de anticuerpos de clase IgG e IgM frente al complejo fosfatidilserina/protrombina (PS/PT) en suero o plasma. Sirven de ayuda en el diagnóstico de ciertas enfermedades trombóticas autoinmunes, como el síndrome antifosfolipídico (SAF) y enfermedades secundarias a lupus eritematoso sistémico u otras afecciones similares, en conjunción con otros datos clínicos y de laboratorio. Resumen y explicación de la prueba Los anticuerpos antifosfolipídicos (apl) representan un amplio grupo de inmunoglobulinas con una considerable relevancia clínica debido a su relación con la trombosis arterial o venosa, la pérdida recurrente del embarazo, los trastornos neurológicos, la hipertensión pulmonar y la trombocitopenia. 1 Los ensayos de detección de anticuerpos anticardiolipina (ACA) por ELISA y de anticoagulante lúpico (AL) mediante pruebas de coagulación han constituido el estándar más utilizado en el diagnóstico del síndrome antifosfolipídico (SAF). La familia de los apl se ha ampliado recientemente con la inclusión de un grupo heterogéneo de autoanticuerpos con especificidad para las proteínas ligadoras de fosfolípidos o para su complejo fosfolipídico. 2-5 Entre dichas proteínas, la más estudiada es la β 2 -glicoproteína I (β 2 GPI). La β 2 GPI posee el epítopo o los epítopos crípticos para la unión de ACA que quedan expuestos cuando la β 2 GPI se une a fosfolípidos cargados negativamente, como la cardiolipina, o que son inmovilizados en las placas de plástico irradiadas de un ELISA. 6 Varios estudios han puesto de manifiesto la relevancia del ELISA de anticuerpos anti-β 2 GPI como prueba alternativa a los ELISA de ACA convencionales que presenta una mayor especificidad 7-11, y dicho método ha sido adoptado por la comunidad sanitaria. La protrombina (factor II) es también una proteína ligadora de fosfolípidos. Su peso molecular es , y está presente en el plasma normal en una concentración aproximada de 2,5 μmol/l. La protrombina ejerce acción procoagulante mediante un complejo de protrombinasa que desencadena la conversión del fibrinógeno en fibrina. 12 Sabemos que el AL se une a varias proteínas plasmáticas, como la β 2 GPI y la protrombina. 13,15 En 1995, Arvieux y cols. 16 detectaron apt (anticuerpos antiprotrombina) mediante ELISA en muestras positivas para el anticoagulante lúpico (AL) utilizando placas irradiadas, de modo similar a la prueba de anti-β 2 GPI. Su hipótesis establece una analogía con los anti-β 2 GPI: los apt pueden reconocer epítopos crípticos o neoepítopos formados cuando la protrombina interactúa con la superficie aniónica. Existen varios estudios sobre la prevalencia de los apt en pacientes con anticuerpos antifosfolipídicos (apl). Arvieux y cols. 16 encontraron una prevalencia del 55,4 % en pacientes con un resultado positivo para el AL. Galli y cols. 17 hallaron apt en el 58 % de los pacientes con SAF. Petri y cols. informaron de modo preliminar que los apt tuvieron un posible valor predictivo de eventos trombóticos en 100 pacientes con LES. 18 Horbach y cols. 19 investigaron la importancia clínica de los apt en 175 pacientes con LES y descubrieron que tanto la IgG apt como la IgM apt son más frecuentes en pacientes con una historia de trombosis y están relacionados con la trombosis venosa, no con la trombosis arterial. Los títulos de IgM apt fueron ligeramente más altos en los pacientes con trombosis que en los que no estaban afectados de trombosis, mientras que los títulos de IgG apt no mostraron diferencias entre los dos grupos. Vaarala y cols. 20 determinaron un valor predictivo 2,5 veces mayor con respecto al riesgo de infarto de miocardio o muerte cardiaca en varones de mediana edad con niveles elevados de apt. La relación entre el apt y el AL ha sido estudiada extensamente. En 1988, Fleck y cols. 21 descubrieron que el apt tenía actividad de AL. Asimismo, se ha demostrado que los anticuerpos resposables de la actividad del AL se unen a la protrombina en determinadas condiciones experimentales. 14,22 Además, Bevers y cols. 14 demostraron que la protrombina era necesaria para la expresión de la actividad del AL en 11 de 16 muestras de plasma positivas para el AL y carentes de AAC, lo que implica que al menos el 69 % de la actividad del AL depende de los anticuerpos que ligan la protrombina. El mecanismo de acción de dichos anticuerpos no se conoce con exactitud. Se ha especulado que los apt pueden inhibir la liberación de prostaciclinas mediada por trombina en las células endoteliales, y que los apt inhiben la activación de la proteína C. 2 Recientemente se ha hipotetizado que la protrombina se une a los fosfolípidos aniónicos expuestos de las células endoteliales y que los apt activan dichas células e inducen la formación de sustancias procoagulantes a través de la protrombina. 23 Bertolaccini y cols. 24 examinaron la presencia de IgG e IgM apt mediante ELISA en pacientes con LES. Estos anticuerpos se hallaron en el 28 % de los pacientes con LES: un 18 % presentaron un resultado positivo para la IgG y un 14 % fueron positivos para la IgM, mientras que en un 4 % de los casos se obtuvieron resultados positivos tanto para la IgG como para la IgM. En este grupo se registró una relación entre la presencia de apt y la existencia de eventos vasculares, ya que un 53 % de los pacientes con LES que presentaban apt tenían una historia de eventos trombóticos. Asimismo, este estudio 24 halló relación entre los apt y la presencia de AAC y de anti-β 2 GPI, aunque los autores afirman que el ELISA de apt no puede considerarse un sustituto de los análisis de AL, ACA o β 2 GPI convencionales. A lo largo de los últimos años se ha desarrollado una comprensión más profunda sobre la importancia clínica de los anticuerpos apt. Ahora sabemos que los anticuerpos más estrechamente relacionados con el síndrome antifosfolipídico y el AL apuntan a un complejo de fosfolípidos aniónicos, como el complejo fosfatidilserina/protrombina (PS/PT), en lugar de hacerlo a la PT sola. Estos datos se describen con detalle en una revisión reciente. 25 Varios estudios han demostrado que las pruebas de anti-ps/pt presentan relevancia clínica significativa, y que se correlacionan muy estrechamente con las características clínicas del síndrome antifosfolipídico y del anticoagulante lúpico Principios del procedimiento Los kits QUANTA Lite aps/pt IgG (anti-fosfatidilserina/protrombina) IgG e QUANTA Lite aps/pt IgM son inmunoensayos enzimáticos (ELISA) para la detección de anticuerpos IgG e IgM en suero o plasma humano que estan dirigidos al complejo fosfatidilserina/protrombina y emplean la técnica de ELISA en sándwich. Los pocillos de las placas de plástico microperforadas se revisten con complejo PS/PT y luego se estabilizan. Durante la incubación, el suero que contiene anticuerpos IgG o IgM anti-ps/pt se une al PS/PT. La proteína no ligada se elimina mediante lavado y, a continuación, se añade a los pocillos conjugado marcado con peroxidasa de rábano (HRP) anti-igg o IgM humanas. Tras la incubación, el conjugado no unido se elimina mediante lavado. Entonces se añade un sustrato específico para la peroxidasa, que sufre un cambio de color en presencia del enzima conjugado. 1

2 Tras detener la producción enzimática de sustancia coloreada, la presencia o la ausencia de anticuerpos antiprotrombina se determina por métodos espectrofotométricos midiendo la intensidad del color que aparece en los pocillos de las muestras de pacientes y comparándola con la de una curva de calibración de cinco puntos. Reactivos Placa microperforada de poliestireno para ELISA recubierta de antígeno purificado PS/PT (12 tiras de 1 x 8 pocillos), con soporte, suministrada en un envase de aluminio que contiene desecantes 2. Control negativo para el ELISA; 1 vial de tampón que contiene conservante y suero humano sin anticuerpos IgG humanos anti-ps/pt; prediluido; 1,2 ml 3. Control para el ELISA aps/pt IgG; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano IgG anti-ps/pt; prediluido; 1,2 ml 4. Calibrador A para el ELISA aps/pt IgG; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano 5. Calibrador B para el ELISA aps/pt IgG; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano 6. Calibrador C para el ELISA aps/pt IgG; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano 7. Calibrador D para el ELISA aps/pt IgG; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano 8. Calibrador E para el ELISA aps/pt IgG; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano 9. Conjugado aps/pt IgG HRP con anti-igg humanas (de cabra); 1 vial de color azul que contiene tampón, estabilizantes de proteínas y conservante; 10 ml 10. Diluyente de muestras HRP Plus; 1 vial de color rosa que contiene solución salina tamponada con Tris, Tween 20, estabilizadores calcio-proteína y conservante; 50 ml 11. Tampón de lavado HRP Plus; 1 vial de concentrado 40x, de color rojo, que contiene solución salina tamponada con Tris, Tween 20 y calcio; 25 ml; consulte las instrucciones de dilución en el apartado Métodos. 12. Cromógeno TMB; 1 vial que contiene estabilizantes; 10 ml 13. Solución de parada HRP (ácido sulfúrico 0,344 M); 1 vial incoloro O Placa microperforada de poliestireno para ELISA recubierta de antígeno purificado PS/PT (12 tiras de 1 x 8 pocillos), con soporte, suministrada en un envase de aluminio que contiene desecantes 2. Control negativo para el ELISA; 1 vial de tampón que contiene conservante y suero humano sin anticuerpos IgM humanos anti-ps/pt; prediluido; 1,2 ml 3. Control para el ELISA aps/pt IgM; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero humano IgM anti-ps/pt; prediluido; 1,2 ml 4. Calibrador A para el ELISA aps/pt IgM; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero IgM 5. Calibrador B para el ELISA aps/pt IgM; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero IgM 6. Calibrador C para el ELISA aps/pt IgM; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero IgM 7. Calibrador D para el ELISA aps/pt IgM; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero IgM 8. Calibrador E para el ELISA aps/pt IgM; 1 vial de tampón que contiene conservante y anticuerpos de suero IgM 9. Conjugado aps/pt IgM HRP con anti-igg humanas (de cabra); 1 vial de color verde que contiene tampón, estabilizantes de proteínas y conservante; 10 ml 10. Diluyente de muestras HRP Plus; 1 vial de color rosa que contiene solución salina tamponada con Tris, Tween 20, estabilizadores calcio-proteína y conservante; 50 ml 11. Tampón de lavado HRP Plus; 1 vial de concentrado 40x, de color rojo, que contiene solución salina tamponada con Tris, Tween 20 y calcio; 25 ml; consulte las instrucciones de dilución en el apartado Métodos. 12. Cromógeno TMB; 1 vial que contiene estabilizantes; 10 ml 13. Solución de parada HRP (ácido sulfúrico 0,344 M); 1 vial incoloro Advertencias 1. ADVERTENCIA: Este producto contiene una sustancia química (cloranfenicol al 0,02 %) en el diluyente de muestras, los controles, los calibradores y el conjugado que está clasificada como cancerígena por el Estado de California. 2. Todo el material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto ha sido analizado y ha producido un resultado negativo con respecto a la presencia de anticuerpos del VIH, el HBsAg y el VHC, según métodos aprobados por la FDA. Sin embargo, ningún método de análisis puede ofrecer plenas garantías de la ausencia del VIH, el VHB, el VHC u otros agentes infecciosos. Por tanto, el control del ELISA aps/pt, los calibradores del ELISA aps/pt y el control negativo del ELISA deben tratarse como si fueran materiales potencialmente infecciosos Se utiliza azida de sodio como conservante. La azida de sodio es una sustancia venenosa y puede resultar tóxica si se ingiere o si se absorbe a través de la piel o los ojos. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo o el cobre de las tuberías y formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si utiliza las pilas de lavado para eliminar reactivos, aclare con abundante cantidad de agua para evitar la formación de azidas metálicas. 4. El conjugado HRP contiene una sustancia química corrosiva/venenosa diluida que puede resultar tóxica si se ingiere en grandes cantidades. Para prevenir posibles quemaduras químicas, evite el contacto con la piel y los ojos. 5. El cromógeno TMB contiene un irritante que puede ser nocivo si es inhalado, ingerido o absorbido a través de la piel. Para prevenir daños, evite la inhalación, la ingestión y el contacto con la piel y los ojos. 6. La solución de parada HRP consiste en una solución de ácido sulfúrico diluida. Evite exponerla a bases, metales u otros compuestos que puedan reaccionar con los ácidos. El ácido sulfúrico es una sustancia venenosa y corrosiva que puede resultar tóxica si es ingerida. Para prevenir quemaduras químicas, evite el contacto con la piel y los ojos. 7. Utilice un equipo de protección personal adecuado cuando trabaje con los reactivos suministrados. 8. Los vertidos de reactivos deben limpiarse inmediatamente. Cumpla todas las normas estatales y locales sobre protección del medio ambiente para la eliminación de residuos. 2

3 Precauciones 1. Este producto está destinado a uso diagnóstico in vitro. 2. La sustitución de los componentes suministrados con este kit de análisis por otros diferentes puede dar lugar a resultados incoherentes. 3. Un lavado incompleto o ineficaz y una insuficiente eliminación del líquido de las tiras de pocillos del ELISA tendrán como consecuencia una baja precisión y/o valores de fondo elevados. 4. La adaptación total o parcial de este análisis para utilizarlo con procesadores automáticos de muestras y otros dispositivos de manipulación de líquidos puede producir diferencias en los resultados del análisis con respecto a los resultados obtenidos siguiendo el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio comprobar que el procedimiento automático empleado da unos resultados que se encuentran dentro de los límites aceptables. 5. Existen varios factores que influyen en el rendimiento del análisis: la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la precisión y reproducibilidad de la técnica de pipeteado, la exhaustividad del lavado y de la eliminación de líquido de los pocillos de las tiras del ELISA, el fotómetro utilizado para medir los resultados, y los tiempos de incubación durante el análisis. Es necesario mantener la máxima coherencia durante el análisis para obtener resultados precisos y reproducibles. 6. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo indicado. 7. Si la bolsa de cierre hermético que contiene las tiras de pocillos y los desecantes no se vuelve a cerrar correctamente, el antígeno se deteriorará y la precisión obtenida será baja. 8 Es posible que se midan absorbancias inaceptablemente bajas después de dos o más usos de una misma botella de conjugado HRP durante un periodo de tiempo determinado. Para evitarlo, es importante seguir todos los procedimientos recomendados para la manipulación del conjugado HRP. 9. Puede producirse contaminación química del conjugado HRP como consecuencia de un lavado o aclarado inadecuados de los materiales e instrumentos. Los residuos de sustancias químicas habituales en los laboratorios, como formalina, lejía, etanol o detergente, provocan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Aclare a fondo todos los materiales e instrumentos después del uso de limpiadores o desinfectantes químicos. Condiciones de almacenamiento 1. Almacene todos los reactivos del kit a 2-8 C. No los congele. Los reactivos permanecen estables hasta la fecha de caducidad si se almacenan y manipulan como está indicado. 2. Las tiras de pocillos recubiertas de antígeno que no se utilicen deben volverse a cerrar herméticamente en la bolsa de aluminio que contiene desecantes y deben almacenarse a 2-8 C. 3. El tampón de lavado diluido permanece estable durante una semana a 2-8 C. Recogida de muestras Este procedimiento puede realizarse con una muestra de suero o plasma. La adición de azida u otros conservantes a las muestras del análisis puede afectar de manera negativa a los resultados. No deben utilizarse muestras que estén contaminadas con microorganismos, que hayan recibido un tratamiento a base de calor o que contengan partículas visibles. Tampoco deben emplearse sueros o muestras muy hemolizados o lipémicos. El documento H18-A3 del CLSI (NCCLS) recomienda las siguientes condiciones de almacenamiento de muestras: 1) No guarde las muestras a temperatura ambiente por más de 8 horas. 2) Si el análisis no se efectúa en un plazo de 8 horas, refrigere las muestras a 2-8 C. 3). Si el análisis no va a realizarse en un plazo de 48 horas o si debe preparar las muestras para enviarlas, congélelas a una temperatura de 20 C o inferior. Las muestras congeladas deben mezclarse bien después de descongelarse y antes del análisis. Procedimiento Materiales suministrados Placa microperforada para el ELISA aps/pt IgG (12 tiras de 1x8 pocillos), con soporte 1 1,2 ml de control negativo prediluido para ELISA 1 1,2 ml de control prediluido para el ELISA aps/pt IgG 1 1,2 ml de calibrador A prediluido para el ELISA aps/pt IgG 1 1,2 ml de calibrador B prediluido para el ELISA aps/pt IgG 1 1,2 ml de calibrador C prediluido para el ELISA aps/pt IgG 1 1,2 ml de calibrador D prediluido para el ELISA aps/pt IgG 1 1,2 ml de calibrador E prediluido para el ELISA aps/pt IgG 1 50 ml de diluyente de muestra HRP Plus 1 25 ml de tampón de lavado HRP Plus, con una concentración de 40x 1 10 ml de conjugado IgG aps/pt HRP con anti-igg humana (de cabra) 1 10 ml de cromógeno TMB 1 10 ml de solución de parada HRP (ácido sulfúrico 0,344 M) O Placa microperforada para el ELISA aps/pt IgM (12 tiras de 1x8 pocillos), con soporte 1 1,2 ml de control negativo prediluido para ELISA 1 1,2 ml de control prediluido para el ELISA aps/pt IgM 1 1,2 ml de calibrador A prediluido para el ELISA aps/pt IgM 1 1,2 ml de calibrador B prediluido para el ELISA aps/pt IgM 1 1,2 ml de calibrador C prediluido para el ELISA aps/pt IgM 1 1,2 ml de calibrador D prediluido para el ELISA aps/pt IgM 1 1,2 ml de calibrador E prediluido para el ELISA aps/pt IgM 1 50 ml de diluyente de muestra HRP Plus 1 25 ml de tampón de lavado HRP Plus, con una concentración de 40x 1 10 ml de conjugado IgM aps/pt HRP con anti-igm humana (de cabra) 1 10 ml de cromógeno TMB 1 10 ml de solución de parada HRP (ácido sulfúrico 0,344 M) Materiales adicionales necesarios no suministrados Micropipetas para dispensar 5, 100, y 500 µl Puntas de micropipeta desechables Tubos de análisis para diluir las muestras de los pacientes, de 4 ml de volumen Agua destilada o desionizada 3

4 Recipiente de 1 L para diluir el tampón de lavado HRP Plus Lector de placas microperforadas que mida la DO a 450 nm (o a 620 nm para las lecturas de doble longitud de onda) Método Antes de comenzar 1. Lleve todos los reactivos y muestras a temperatura ambiente (20-26 o C) y mézclelos bien. 2. Diluya el tampón de lavado HRP Plus a 1:40 añadiendo el contenido de la botella de tampón de lavado HRP Plus a 975 ml de agua destilada o desionizada. Si el análisis no va a emplear toda la placa, puede preparar una cantidad menor añadiendo 2,0 ml del concentrado a 78 ml de agua destilada o desionizada por cada 16 pocillos que se utilicen. El tampón diluido permanece estable durante una semana a 2-8 o C. 3. Prepare una dilución al 1:101 para cada muestra de paciente añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de diluyente de muestra HRP Plus. Las muestras diluidas deben utilizarse en un plazo de 8 horas una vez preparadas. NO DILUYA los calibradores de aps/pt IgG o aps/pt IgM, el control del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM y el control negativo del ELISA. 4. La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti-fosfatidilserina/protrombina requiere dos pocillos para cada uno de los calibradores y controles y uno o dos pocillos para cada muestra de paciente. Se recomienda analizar las muestras por duplicado. 5. Preparación de la curva estándar: Para los puntos A-E de la curva estándar de 5 puntos, utilice los respectivos calibradores A-E PREDILUIDOS para el ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM, directamente desde el vial. La curva estándar de 5 puntos presenta los valores siguientes: Punto PS/PT IgG or IgM unidades A Calibrador A prediluido para el ELISA aps/pt IgG o IgM 150,0 B Calibrador B prediluido para el ELISA aps/pt IgG o IgM 75,0 C Calibrador C prediluido para el ELISA aps/pt IgG o IgM 37,5 D Calibrador D prediluido para el ELISA aps/pt IgG o IgM 18,75 E Calibrador E prediluido para el ELISA aps/pt IgG o IgM 9,4 Procedimiento del ensayo 1. TODOS LOS REACTIVOS DEBEN LLEVARSE A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) ANTES DE PROCEDER AL ANÁLISIS. Coloque el número necesario de pocillos o tiras en el soporte. Devuelva inmediatamente las tiras no utilizadas a la bolsa con desecantes y ciérrela herméticamente para minimizar la exposición al vapor de agua. 2. Añada a los pocillos 100µL de cada uno de los cinco calibradores, las muestras de los pacientes diluidas, el control negativo del ELISA y el control del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM. NOTA: Los calibradores del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM, el control para el aps/pt IgG o aps/pt IgM y el control negativo del ELISA son prediluidos y están listos para utilizarse. Cubra los pocillos e incúbelos durante 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie horizontal. El tiempo de incubación empieza a contar a partir de la adición de la última muestra. 3. Fase de lavado: aspire completamente el contenido de todos los pocillos. Añada µl de tampón de lavado HRP Plus diluido a los pocillos y, a continuación, aspírelos. Repita esta secuencia dos veces más hasta completar tres lavados. Invierta la placa y golpéela ligeramente contra un material absorbente para eliminar cualquier resto de líquido del último lavado. Es importante que vacíe completamente todos los pocillos después de cada fase de lavado. Para realizar la aspiración, mantenga la misma secuencia que utilizó en la adición de muestras. 4. Añada 100 µl del conjugado aps/pt IgG o IgM HRP a cada pocillo. El conjugado debe extraerse de la botella aplicando condiciones de asepsia estándar y siguiendo buenas prácticas de laboratorio. Extraiga de la botella únicamente la cantidad de conjugado necesaria para el análisis. PARA EVITAR UNA POSIBLE CONTAMINACIÓN MICROBIANA O QUÍMICA, NO DEVUELVA NUNCA A LA BOTELLA EL CONJUGADO QUE NO UTILICE. Incube los pocillos durante 30 minutos, como en el paso Fase de lavado: Repita el paso Añada 100 µl de cromógeno TMB a cada pocillo e incube en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. 7. Añada 100 µl de solución de parada HRP a cada pocillo. Al añadir la solución de parada HRP, mantenga la misma secuencia y la misma temporización que utilizó para el cromógeno TMB. Golpee suavemente la placa con un dedo para mezclar completamente los pocillos. 8. Lea la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450 nm en el plazo máximo de una hora tras detener la reacción. Si desea realizar mediciones bicromáticas, puede utilizar 620 nm como longitud de onda de referencia. Control de calidad 1. Los calibradores del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM, el control del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM y el control negativo del ELISA deben analizarse con cada lote de muestras para garantizar que todos los reactivos y procedimientos actúen correctamente. 2. Recuerde que calibradores del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM, el control del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM y los controles negativos del ELISA son prediluidos, por lo que no tienen en cuenta los métodos de procedimiento asociados con la dilución de las muestras. 3. Pueden analizarse controles adicionales de acuerdo con las pautas o condiciones establecidas por las regulaciones estatales o locales o por los organismos de homologación. Pueden prepararse sueros de control adecuados adicionales obteniendo muestras alícuotas de suero humano combinado y almacenándolas a una temperatura de 20 o C o inferior. 4. Para considerar válidos los resultados del análisis, deben cumplirse todos los criterios indicados a continuación. Si alguno de ellos no se cumple, el análisis deberá considerarse no válido y deberá repetirse. a. La absorbancia del calibrador A prediluido del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM debe ser superior a la del control prediluido del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM, que a su vez debe ser mayor que la absorbancia del control negativo prediluido del ELISA. b. El calibrador A prediluido del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM debe tener una absorbancia superior a 1,0, mientras que la absorbancia del control negativo prediluido del ELISA no puede ser mayor que 0,2. c. La absorbancia del control del ELISA aps/pt IgG o aps/pt IgM debe ser superior al doble de la del control negativo del ELISA o bien superior a 0,25. d. La concentración del control del ELISA debe estar comprendida en el rango indicado en su correspondiente etiqueta. e. Consulte el documento C24-A3 del CLSI (NCCLS) para obtener directrices adicionales sobre las prácticas de control de calidad adecuadas. 4

5 Cálculo de los resultados 1. Determine la media de todas las lecturas duplicadas. 2. Represente la absorbancia media de la curva del calibrador del análisis IgG o IgM en función del logaritmo de sus concentraciones. Utilice la recta que mejor se ajuste a la curva representada. También puede emplear un gráfico log/log. Las unidades de PS/PT asignadas a los calibradores están indicadas en el vial del calibrador. 3. Determine la concentración desconocida de IgG o IgM PS/PT en unidades de IgG o IgM PS/PT a partir del eje x leyendo la correspondiente absorbancia en el eje y. 4. Los valores negativos oscilan entre 0 y 30 unidades. Los resultados positivos tienen un valor superior a 30 unidades. Interpretación de los resultados El análisis ELISA es muy sensible a la técnica empleada y es capaz de detectar incluso pequeñas diferencias en las poblaciones de pacientes. Los valores indicados a continuación son meramente valores recomendados. Cada laboratorio debe determinar su propio rango normal basándose en las técnicas, los controles, los materiales y la población de pacientes que utilice, según los procedimientos específicos que establezca. La muestra puede entonces clasificarse como negativa o positiva según la tabla siguiente. Unidades Negativo 30 Positivo > Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos IgG o IgM PS/PT y sugiere la posibilidad de ciertas enfermedades trombóticas autoinmunes, como el SAF o enfermedades secundarias al lupus eritematoso sistémico u otras afecciones trombóticas similares a este. 2. Un resultado negativo indica que no existen anticuerpos IgG o IgM PS/PT o que sus niveles son inferiores al límite de detección del análisis. 3. Es recomendable que los resultados notificados por el labortorio incluyan esta información: Los siguientes resultados se han obtenido mediante el ELISA INOVA QUANTA Lite aps/pt IgG o QUANTA Lite aps/pt IgM. Los valores de IgG o IgM PS/PT obtenidos con métodos de análisis de fabricantes diferentes no son intercambiables. Limitaciones del procedimiento 1. La relevancia clínica de los anticuerpos IgG o IgM PS/PT para enfermedades que no sean LES ni SAF todavía se está investigando. 2. Si se obtienen títulos negativos de IgG or IgM PS/PT en presencia de síntomas clínicos, es indicado realizar las pruebas de anticoagulante lúpico, anticardiolipina y anti-β 2 u otras adicionales. 3. El diagnóstico no debe basarse solo en los resultados de IgG o IgM PS/PT. Estos deben interpretarse junto con los resultados físicos. 4. No debe iniciarse tratamiento solo por haber obtenido un título positivo de IgG o IgM PS/PT. Debe haber también síntomas clínicos de apoyo. 5. Cabe esperar que algunas muestras sean positivas para cardiolipina y/o anti-β 2 GPI pero negativas para IgG o IgM PS/PT. La prueba de anti-β 2 GPI es un marcador específico de riesgo trombótico. La prueba de la anticardiolipina puede dar falsos positivos debido a su reactividad cruzada con el dsdna o ciertos anticuerpos de enfermedades infecciosas. De un modo similar, los pacientes con SAF pueden presentar un resultado positivo para PS/PT y negativo en las pruebas de anticoagulante lúpico, anticardiolipina o anti-β Las características de rendimiento de este análisis no se han establecido para sustratos que no sean suero o plasma. 7. Estos análisis están destinados a uso in vitro. Características de rendimiento específicas y estudios clínicos Resumen de estudios clínicos El rendimiento de los kits QUANTA Lite aps/pt aps/pt IgG e QUANTA Lite aps/pt IgM se ha evaluado en un estudio externo y en uno interno. Los resultados combinados figuran en la tabla siguiente. 5 Número de positivos (%) Grupo de pacientes Número de muestras IgG PS/PT IgM PS/PT IgG y/o IgM Normal (1,2 %) 4 (1,6 %) 7 (2,8%) Anticoagulante lúpico positivo (LAC) (87,5 %) 19 (79,2 %) 24 (100%) Síndrome antifosfolipídico (SAF) (46,5 %) 34 (47,9 %) 48 (67,6%) Artritis reumatoide Enfermedad de Crohn Colitis ulcerosa Celíacos LAC negativo (12,5 %) 1 (12,5%) Número de positivos (%) Enfermedad infecciosa (CMV, Toxo, rubéola, VHS, VHB, VHC) Sífilis Anticuerpo antiactina positivo H. pylori El uso combinado de IgG e IgM PS/PT detectó todos los 24 positivos conocidos para el anticoagulante lúpico y el 67,6 % de los pacientes con SAF. Solo 3 de los 247 pacientes normales y ninguno de otros 52 controles de la enfermedad arrojaron un resultado positivo en el kit IgG con una especificidad del 99 % (3/299). Solo 4 de los 247 pacientes normales y uno de los 52 sueros de control dieron un resultado positivo en el kit IgM con una especificidad del 98,3 % (5/299). Concordancia clínica con la β₂gpi Los kits QUANTA Lite aps/pt IgG e QUANTA Lite aps/pt IgM se compararon con análisis para la detección de IgG β 2 GPI e IgM β 2 GPI que cumplen la norma 510(k). Las muestras analizadas procedían de 71 pacientes con SAF, 24 pacientes positivos para el anticoagulante lúpico y 85 personas normales, con un total de 180 muestras. A continuación se muestra un resumen de los resultados.

6 IgG aps/pt + - IgG ** β 2 GPI - 16* 116 * Uno de los 16 fue positivo para el AL y los otros 15 eran pacientes con SAF. ** Todos procedían del grupo con SAF. IgM aps/pt + - IgM * β 2 GPI - 25** 120 * Uno fue normal y 6 procedían del grupo con SAF. ** 22 tenían SAF y 3 fueron positivos para el AL. La concordancia global de los kits IgG e IgM PS/PT con respecto a los kits β 2 GPI es del 85,6 % y del 82,2 %, respectivamente. La mayor parte de los resultados discrepantes se deben a la mayor sensibilidad de los kits PS/PT IgG e IgM para los positivos de AL y, sobre todo, para los pacientes con SAF, aunque hubo pacientes con SAF que fueron positivos para β₂gpi pero negativos para PS/PT. Los kits PS/PT IgG más IgM detectaron todas las muestras positivas para el AL y la mayoría de los pacientes con SAF. Se observó que la inmensa mayoría de pacientes con SAF fueron positivos para PS/PT y/o β 2 GPI. Comparación de métodos Los kits aps/pt IgG e IgM se compararon con los kits β₂ GPI IgG y β₂gpi IgM utilizando en total 62 muestras para la comparación IgG y 63 para la comparación IgM. Todas las muestras seleccionadas presentaron valores situados dentro del intervalo de análisis lineal. A continuación se indican los resultados, junto al positivo calculado, el negativo y las concordancias relativas. ELISA IgG aps/pt Positivo Negativo Total ELISA IgG ß 2 GPI Positivo Negativo Total Porcentaje de concordancia positiva 65 % Porcentaje de concordancia negativa 83,7 % Concordancia relativa 77,8 % ELISA IgM aps/pt Positivo Negativo Total ELISA IgG ß 2 GPI Positivo Negativo Total Porcentaje de concordancia positiva 81,3 % Porcentaje de concordancia negativa 76,6 % Concordancia relativa 77,8 % Precisión y reproducibilidad Se analizaron ocho muestras en seis réplicas en el ELISA aps/pt IgG en seis días diferentes. Total n = 36. A continuación se resumen los resultados por valor de unidad. Valor unidades IgG 1,4 139,3 79,3 36,8 22,2 8,3 53,8 1,7 DE intraensayo 0,1 6,8 4,9 2,5 1,7 0,8 3,4 0,1 % CV 8,1 4,9 6,2 6,7 7,8 9,9 6,4 7,1 DE interensayo 0,2 4,2 3,3 1,6 1,2 0,4 2,3 0,1 % CV 12,0 3,0 4,2 4,5 5,3 5,2 4,2 8,3 Se analizaron ocho muestras más en seis réplicas en el ELISA aps/pt IgM en los mismos seis días. Total n = 36. A continuación se resumen los resultados por valor de unidad. Valor unidades IgM 3,1 153,2 75,8 36,0 18,2 9,8 58,2 3,2 DE intraensayo 0,2 5,9 3,3 1,7 0,7 0,6 2,6 0,2 % CV 5,8 3,8 4,4 4,6 3,8 6,3 4,5 6,4 DE interensayo 0,3 4,3 2,4 1,1 0,5 0,4 2,1 0,2 % CV 9,9 2,8 3,2 3,0 2,6 3,8 3,6 7,4 Intervalo lineal aps/pt IgG: 5,1-150 unidades aps/pt IgM: 3,6-150 unidades En las muestras con valores superiores a 150 unidades, indique el resultado como >150 unidades o como positivo. En las muestras con valores inferiores a 5,1 unidades para IgG o 3,6 unidades para IgM, indique el resultado como <5,1 o <3,6 o como negativo. QUANTA Lite es una marca registrada de INOVA Diagnostics, Inc. Copyright 2010 Todos los derechos reservados 6

7 Referencias 1. Hughes GRV. The antiphospholipid syndrome: ten years on. Lancet 342:341-4, Roubey R. Autoantibodies to Phospholipid-Binding Plasma Proteins: A New View of Lupus Anticoagulant and Other Antiphospholipid Antibodies. Blood 84: , McNeil HP, et al. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipidbinding inhibitor of coagulation: beta 2-glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA 87:4120-4, Galli M, et al. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet 335:1544-7, Matsuura E, et al. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. 6. Matsuura E, et al. Anticardiolipin antibodies recognize β2-glycoprotein I structure altered by interacting with oxygen modified solid phase surface. J Exp. Med. 179:457-62, Roubey RA, et al. Comparison of an enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to β2 Glycoprotein I and a conventional anticardiolipin immunoassay. Arthritis Rheum 39:1606-7, McNally T, et al. Increased levels of β2 Glycoprotein I antigen and β2 Glycoprotein I binding antibodies are associated with a history of thromboembolic complications in patients with SLE and primary antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 34:1031-6, Teixido M, et al. Anti β2 Glycoprotein I antibodies: a useful marker for the antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 36:113-6, Amengual O, et al. Specificity of ELISA for antibody to β2 Glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. Br J Rheumatol 35: , Lewis S, et al. Standardized measurement of major immunoglobulin class (IgG, IgA and IgM) antibodies to β2 Glycoprotein I in patients with antiphospholipid syndrome. J Clin Lab Analysis 12:293-97, Mann KG, et al. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes. Blood 76:1-16, Galli M, et al. Kaolin clotting time and dilute Russell s viper venom time distinguish between prothrombindependent and β2 glycoprotein I-dependent antiphospholipid antibodies. Blood 86:617-23, Bevers EM, et al. Lupus anticoagulant IgG s (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipid bound human prothrombin. Thromb Haemost 66:629-32, Perpimkul P, et al. Functional and binding studies of the roles of prothrombin and β2 Glycoprotein I in the expression of lupus anticoagulant activity. Blood 83: , Arvieux J, et al. Development of an ELISA for autoantibodies to prothrombin showing their prevalence in patients with Lupus Anticoagulant. Thromb Haemost 74:1120-5, Galli M. Non β2-glycoprotein I cofactors for antiphospholipid antibodies. Lupus 5:388-92, Petri M, et al. Anti-plasma protein antibodies are predictive of thrombotic events (TE). Arthritis Rheum 37:S 281, Horbach D, et al. Lupus anticoagulant is the strongest risk factor for both venous and arterial thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Thromb Haemost 76:916-24, Vaarala O, et al. Antibodies to prothrombin imply a risk of myocardial infarction in middle-aged men. Thromb Haemost 75:456-9, Fleck RA, et al. Anti-prothrombin antibodies and the Lupus Anticoagulant. Blood 72:512-9, Oosting JD, et al. Antiphospholipid antibodies directed against a combination of phospholipids with Prothrombin, Protein C, or Protein S: an explanation for their pathogenic mechanism?. Blood 81: , Arnout J. The pathogenesis of the antiphospholipid syndrome: a hypothesis based on parallelisms with heparin-induced thrombocytopenia. Thromb Haemost 75:536-41, Bertolaccini M, et al. Autoantibodies to human prothrombin and clinical manifestations in 207 patients with systemic lupus erythematosus. J Rheumatol 25: , Amengual O, et al. Specificities, properties and clinical significance of antiprothrombin antibodies. Arthritis Rheum 48:886-95, D Agnillo P, et al. Prothrombin binds to the surface of apototic, but not viable cells and serves as a target of Lupus Anticoagulant antibodies. J of Immunol 170: , Atsumi T. et al. Association of autoantibodies against the phosphatidylserine-prothrombin complex with manifestations of the antiphospholipid syndrome and with presence of lupus anticoagulant. Arthiritis Rheum 43: , Atsumi T. Antiprothrombin antibodies are they worth assaying? Thrombosis Research 114: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition,

8 Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ESP December 2010 Revision 0 8