Seminario de Problemas

Transcripción

1 Seminario de Problemas 1. Qué uniones relacionan: a) dos deoxirribosas entre si; b) 2 bases enfrentadas? 2. Un segmento de ADN de cadena simple tiene la siguiente composición de bases: A 31,5 % C 23,7 % T 17,1 % G 27,7 % Cuál sería la composición de bases de la cadena complementaria? Cuál sería la composición de bases de la forma de doble cadena de dicho segmento? 3. Explique por qué a mayor concentración salina en el medio, la hibridización entre dos hebras de ADN es menos rigurosa y viceversa. Qué utilidad tiene esto en las técnicas de Southern y Northern blot? Cómo influye la temperatura en el grado de hibridización? (Fundamentar) Cómo se puede lograr la hibridización entre dos cadenas con complementariedad parcial? 4. Qué es una enzima de restricción? De dónde se obtienen? Para qué se usan? Qué tipos de extremos pueden dejar en el ADN de cadena doble? Qué es una secuencia palindrómica? Completar las siguientes secuencias para que correspondan a posibles palindromes: AGT CAA CCC ATC 5. Usted esta estudiando la siguiente secuencia de ADN: 5 - TATCCCAGTGCCAATTGCTGGGTATAATACTGTCCAGTCTCTCTCGGAGCTGCTGCGAAAG-3 3 ATAGGGTCACGGTTAACGACCCATATTATGACAGGTCAGAGAGAGCCTCGACGACGCTTTC 5 Su idea es amplificar la secuencia por PCR y tiene que comprar los primers de 10 pb. Cómo escribiría la secuencia de los primers al hacer el pedido? 6. Se quiere determinar la presencia de secuencias correspondientes al virus del HIV en ADN de linfocitos T de un paciente. Los linfocitos son un tipo de células de la sangre pertenecientes al conjunto de los glóbulos blancos. En un tubo de ensayo agregaron los siguientes componentes para una reacción de amplificación de ADN por PCR: ADN molde: ADN total de linfocitos de un paciente que tiene anticuerpos anti-hiv circulantes en sangre Primer a de 20 nucleótidos cuya secuencia es complementaria de la hebra inferior en la región a (figura 1) Primer b, de 22 nucleótidos cuya secuencia es complementaria de la hebra superior en la región b (figura 1) dntps y Buffer con Mg+2 Taq polimerasa: ADN polimerasa de una bacteria termofila 1

2 Región a Región b nt 3 5 Se realizaron 30 ciclos de amplificación en un termociclador automático computarizado. Cada ciclo consiste en: Etapa 1: 30 seg a 94ºC. Etapa 2: 60 seg a 42ºC. Etapa 3: 30 seg a 72ºC. a. Indicar lo que está ocurriendo en cada una de las siguientes etapas de un mismo ciclo b. Cuál es la longitud (en pares de bases) del producto de la PCR? c. Cuál es el peso molecular del producto de la PCR? DATO:1 par de bases = 650 Da d. Cuál sería el producto de PCR si se omitiera: i- uno de los primers ii- los 2 primers iii- el ADN molde e. Dado que la PCR es extremadamente sensible, que controles realizaría para descartar una eventual contaminación. 7. Existe un solo gen para la pirulasa en cada célula de mamífero (en realidad dos copias dado que hay dos alelos, porque en humanos los cromosomas se encuentran de a pares). El gen tiene 70 kb de longitud. Sin embargo, se han encontrado en el citoplasma de diferentes tipos de células de un mismo organismo dos mrna de 7,7 y 8 kb de longitud. El de 7,7 es idéntico en secuencia al de 8 kb, excepto por el hecho de que carece de un segmento interno de 0,3 kb. a. Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kb) y sus mensajeros? b. Cómo explica la existencia de dos tipos de mrna diferentes de pirulasa? Ud. Supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que otros solo expresan el de 8 kb. Para demostrarlo decide analizar los extractos de mrna total de los diferentes tejidos mediante la técnica de northern-blot, utilizando la hibridación de sondas específicas de cdna radioactivas. c. Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern blot con cada una de las siguientes tres sondas y por qué?: un cdna del mrna de pirulasa de 7,7 kb un cdna del mrna de pirulasa de 8 kb un cdna del mrna del segmento diferencial de 0,3 kb 8. Usted está estudiando una proteína en su estado nativo tiene un peso molecular aparente de Daltons (115 kda). a. Deduzca su estructura cuaternaria (número de subunidades, PM de cada una de ellas, uniones que las estabilizan, y glicosilación de subunidades) a partir de los resultados de los siguientes geles de PAGE en los que se sembró la proteína pura, la cual fue previamente sometida a 3 tratamientos por peparado que se indican abajo. Al final de la corrida electroforética, los geles fueron teñidos con Coomassie Blue, que es un colorante azul que tiene afinidad por las estructuras proteicas. b. La sensibilidad del Coomasie Blue es tal que es capaz de detectar a partir de aprox. 0,2 mg de proteína/banda. Cree usted que es correcto afirmar que una proteína está pura si da una sola banda en un gel teñido con ese colorante? 2

3 9. Un cultivo de células de embrión de pollo (cultivo normal) produce grandes cantidades de la proteína X. Cuando estas células en cultivo son infectadas con el virus de sarcoma (cultivo infectado) las células no mueren, pero en ellas ya no se detecta actividad biológica de la proteína X. Por otra parte, existe un tipo de células de embrión de pollo que no presenta actividad biológica de la proteína X en ninguna condición (cultivo mutante). Se dispone de un clon de cdna de la proteína X y de anticuerpos policlonales anti proteína X (que reconocen a la proteína X tanto nativa como desnaturalizada). Estos reactivos son utilizados como "sondas" en los siguientes experimentos de Southern, Northern y Western: El Western se realizó en un gel con SDS y mercaptoetanol. Complete los lugares donde haya puntos suspensivos y responda cada pregunta: a. Sabiendo que el clon de cdna usado como sonda no posee sitios para la enzima de restricción PvuII y que existe un solo gen para la proteína (2 alelos) por genoma, qué 3

4 indica la presencia de 3 bandas de hibridación en los carriles a y b del experimento de Southern? b. A qué nivel está afectada la actividad de la proteína X en el cultivo infectado? c. Y en el cultivo mutante? d. Qué conclusiones le sugiere la existencia de 2 bandas de hibridación en los carriles A y B del experimento de Northern? e. El mrna más largo de la proteína X es de 6 kb. Este mrna daría una proteína de aproximadamente... aminoácidos. El peso promedio de cada residuo amínoacídíco es 110 Daltons, por lo tanto el polipéptido más grande de la proteína X debería pesar... Daltons. Cómo se explica que la banda más grande en el Western presente un PM aparente mayor ( Daltons)? 10. Un grupo de investigación se encuentra estudiando una proteína descubierta y aislada recientemente de la sangre humana y denominada PEGOTINA. Aún se desconoce el órgano donde esta proteína se produce. Mediante técnicas de ingeniería genética, los investigadores lograron obtener un plásmido con la secuencia que codifica para albúmina humana, bajo el promotor de la pegotina humana. El plásmido recombinate fue microinyectado en el núcleo de óvulos fecundados de ratón. Luego, estas células fueron implantadas en el útero de un ratón. Luego del tiempo de gestación, se obtuvieron 10 crias. Para detectar cual de las crías resultó transgénica, se extrajo ADN genómico de un trozo de oreja de la madre, y de cada una de las crías. Las 11 muestras de ADN fueron digeridas con BamH1 (enzima de restricción), se realizó una electroforesis en gel de agarosa 1% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa según la técnica de Southern Blot. Luego se hibridó con una sonda radioactiva del gen de la albúmina humana, y lavado en dos condiciones distintas. Los resultados se observan en las figuras 2a y 2b. Uno de los ratones identificado como transgénico fue sacrificado, y se extrajo ARNm de algunos tejidos. Las muestras fueron tratadas según la técnica de Northern Blot e hibridadas con la sonda de albúmina mumana, bajo dos condiciones de lavado, observándose los siguientes resultados: 4

5 ( + y - indican presencia o ausencia de señan radioactiva respectivamente) a. Cuáles de las crías son transgénicas para el gen microinyectado? Por qué? b. Qué representan las bandas que aparecen en el southern 2a, pero no, en el 2b? c. Qué resultado hubiera esperado si el Southern hubiera sido realizado con muestras de células sanguíneas de la madre y de las crías en lugar de con trozos de las colas? d. En qué tejido humano se fabricará la pegotina? Explique el resultado de los Northern Blots. e. Qué ventajas tendría el uso del gen de la luciferasa (enzima responsable de la emisión de luz de las luciérnagas) con respecto a la albúmina humana como gen indicador? 11. Usted dispone de 3 muestras de tejido de hígado de ratas, siendo 2 de ellos aparentemente tumorales. Una de las características de este tipo de tumor, entre otras cosas es que aparentemente sobreexpresan la proteína AYUDINA. No se sabe si se trata de amplificación génica (varias copias del mismo gen en distintas posiciones de un cromosoma) o simplemente un descontrol en la transcripción del mismo, existiendo una copia única (con sus dos alelos, uno en cada cromosoma homólogo). Para resolver este interrogante, usted realiza una serie de experimentos: Northern blot Se analizan tejidos de las 3 ratas. Se utiliza como sonda un fragmento de ADN doble cadena, marcado y desnaturalizado correspondiente a la secuencia del segundo exón de la ayudina. Se observa lo siguiente: Hígado 1 Riñón 1 Hígado 2 Riñón 2 Hígado 3 Riñón 3 1,5 kb 0,9 kb a. A qué moléculas corresponden las bandas observadas en la figura anterior? Qué es un Northern blot? Para qué sirve? b. Por qué no se observan bandas en las muestras de riñón? c. A qué se debe que se observen 2 bandas en un experimento de Northern blot en condiciones de baja sal con una sonda altamente específica? d. A qué se debe la diferencia de intensidad de bandas en las distintas calles? e. Qué otro cambio importante ocurrió en la rata 3? f. Cuál es la rata de expresión normal? Southern blot 5

6 Se utilizó la misma sonda que para los ensayos de Northern blot y se observó lo siguiente: Hígado 1 riñón 1 Hígado 2 riñón 2 Hígado 3 riñón 3 g. Brevemente, Cómo se hizo el Southern blot y para qué sirve? h. A qué moléculas corresponden las bandas observadas en este experimento? i. Existen sitios de restricción para la enzima utilizada en estos experimentos dentro del exón 2? Utilice esquemas para facilitar su interpretación y su respuesta. j. A qué podrían deberse las diferencias observadas en cuanto al patrón de bandas en la rata 2? (Vuelva a leer el enunciado del problema) k. Tomando en cuenta los resultados de todos los experimentos (Northern y Southern blot) responda si es possible y según su criterio Y JUSTIFIQUE: l. Qué rata sería la normal y cuales las portadoras de tumor? m. Cuál presentaría amplificación génica y cuál un descontrol de expressión? Cuál podría ser la causa de un descontrol de expresión? n. Cómo podría determinar la participación de un factor de transcripción en el control de la expresión de este gen? Para que sirven los vectores con genes reporteros? 6