Uso del Nucleocounter en los centros de inseminación artificial

Transcripción

1 Uso del Nucleocounter en los centros de inseminación artificial Jornada de CIAs (ANPS) Control de calidad seminal Rocío Hernández-Gil 19 de Octubre de 2016

2 EVOLUCIÓN DE LOS CIAS Instalaciones - Bioseguridad Automatización de procesos Especialización del personal Actualización de sistemas de evaluación seminal Integración de Sistemas de gestión de Calidad Mejor eficiencia y rentabilidad productiva Calidad seminal garantizada

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4 Centro de inseminación Mejorar la eficiencia Incrementar la productividad Determinación de la CALIDAD Y CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA

5 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

6 DIRECTOS CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Cámaras de recuento celular Citómetría de flujo FACS Count Sistemas CASA Nucleocounter SP-100

7 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA INDIRECTOS Visual Colorímetría Coulter counter

8 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Cámaras de recuento Colorimetría Sistemas CASA Nucleocounter La estimación precisa de la concentración espermática de los eyaculados es esencial para uso eficiente de los verracos en los Cias

9 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA CÁMARAS DE RECUENTO Requiere seguir un procedimiento laborioso: tiempo y entrenamiento Al ser necesarios varios pasos en el procedimiento, las fuentes de error van aumentando durante el proceso: - Falta de homogeneidad en la toma de muestra del eyaculado - Falta de exactitud en volumen muestra: sin calibración o pipeteo inadecuado - Error en llenado de cámaras - Datos insuficientes Gran variabilidad en réplicas: resultados inconsistentes Altos coeficientes de variación (hasta un 20%)

10 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA COLORÍMETRÍA IMPORTANTE o Rango de concentración: escoger una dilución adecuada que permita obtener datos de absorbancia dentro del rango óptimo de lectura del equipo o Curva patrón validada (datos actualizados periódicamente) Medida indirecta de la concentración espermática pero también otros tipos de células, bacterias, proteínas, aglutinación sobreestimación (hasta 30%). El coeficiente de variación es bajo <5%, pero hay factores a tener en cuenta: grado de dilución empleado y concentración de la muestra, errores en la técnica de preparación de la muestra, presencia de otras partículas La exactitud de la medida de concentración dependerá de la fiabilidad curva obtenida de la ecuación de regresión

11 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA SISTEMAS CASA o Varios factores pueden afectar a los resultados, concentración del eyaculado, problemas durante el procedimiento (dilución, llenado ), tipo y calidad de cámara de recuento empleada, captura de imágenes inadecuada. o Puede haber cierto grado de subjetividad al seleccionar los campos a evaluar. o Es necesario entrenamiento previo del protocolo establecido. o En caso de muestras muy concentradas: sobreestimación de la concentración, debido a que el sistema puede contabilizar el mismo espermatozoide dos veces por las colisiones espermáticas. o Aglutinaciones espermáticas

12 NUCLEOCOUNTER

13 NUCLEOCOUNTER El fundamento del Nucleocounter es un sistema integrado por un microscopio de fluorescencia, una fuente de luz (LED), sistema óptico que incluye lentes, y filtros de excitación y emisión y un sistema de captura y análisis de imágenes. Está diseñado para detectar señales procedente de los nucleos de los espermatozoides

14 NUCLEOCOUNTER 1. Rotura de membranas espermáticas mediante solución de lisis 2. Tinción con yoduro de propidio incluido en los cassetes de los núcleos de los espermatozoides 3. Captura de imagen de núcleos teñidos tras iluminar con luz fluorescente. 4. Análisis de imagen y recuento de núcleos espermáticos

15 NUCLEOCOUNTER Qué VENTAJAS aporta este equipo a la estimación de la concentración? Método directo, rápido y sencillo. Sin calibración, ni mantenimiento. No hay interferencias con partículas de gel, restos celulares, o contaminación

16 NUCLEOCOUNTER Qué VENTAJAS aporta este equipo a la estimación de la concentración? Alta repetibilidad Linealidad Reproducibilidad excelente

17 NUCLEOCOUNTER Qué VENTAJAS aporta este equipo a la estimación de la concentración? Además: Evaluación de integridad de la membrana (viabilidad espermática)

18 CONCENTRACIONES (Millones de spz/ml) MACHO CAMARA DE BURKER Colorímetro 1 NUCLEOCOUNTER MEDIA CV(%) MEDIA CV(%) 1 2 MEDIA CV (%) ,5 23,4 NO NO 198,9 205,9 202,4 2, ,0 85,56 85,56 85, ,8 440,1 428,45 3, ,6 275,18 275,18 275, ,5 299,8 303,65 1, ,5 21,1 1054, ,6 1054, , ,5 13,6 780,74 801,81 791,28 1, , ,35 1, ,7 1644, ,5 1654,9 0, ,5 2, ,4 717,55 759,68 738,62 4, ,5 0, ,8 338,38 359,44 348,91 4, ,7 652,6 664,15 2, ,1 549,03 591,12 570,08 5, , ,5 13,4 591,12 591,12 591, ,5 2, ,5 16,1 464,77 422,64 443,71 6, ,8 658, , ,5 13,2 190,92 190,92 190, ,9 529,2 543,05 3, ,5 17,8 NO NO 235,5 242,2 238,85 2, ,5 38,3 NO NO 200,3 188,9 194,6 4, ,6 738,61 738,61 738, ,5 0, ,8 759,68 696,48 728,08 6, ,5 0, ,5 9,5 296,25 275,18 285,72 5, ,5 764,25 1, ,1 NO NO 213,8 193,7 203,75 7, ,5 6, ,8 790,5 800,15 1, , , ,05 2, ,5 18, ,5 7, ,6 505,3 519,95 4, , ,1 359,1 358,6 0,2 MEDIA 488,6 17,7 531,49 2, ,7 2,4

19 MACHO CAMARA DE BURKER Colorimetro 2 NUCLEOCOUNTER MEDIA CV(%) MEDIA CV(%) MEDIA CV (%) Y , ,33 3, ,6 166,6 148,5 162,2333 7,4913 R ,3 12, , ,6 474,7 452,8 460,3667 2,6977 T , ,33 4, ,9 183,4 196,9 186,0667 5,2544 Y ,3 18, ,67 0, ,6 438,7 429,3 426,2 3,3562 R , ,67 1, ,7 500,6 512,5 511,2667 1,9768 R ,7 8, ,67 1, ,7 312,5667 3,856 R , , ,4 381,6 384,5 390,5 3,3252 T , ,33 1, ,2 299,6 296,4 295,7333 1,4336 T , ,67 0, ,5 362,4 332,8 349,9 4,3803 W , ,33 1, ,5 184,9 169,2 180,8667 5,6742 E ,3 12, ,67 0, ,2 363,6 378,2 372,6667 2,124 R ,3 13, , ,3 501,2 513,1 511,8667 1,9745 MEDIA , ,97 1, ,6861 3,6287

20 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Aplicaciones prácticas del NUCLEOCOUNTER Control de concentración espermática de los eyaculados en la producción diaria Evaluación de viabilidad espermática en la conservación Control de calidad final de un % de las dosis producidas: monitorización Validación de equipos / Construcción de curvas patrón

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22 Otros sistemas CV>5% Nucleocounter CV<3%

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25 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA NUCLEOCOUNTER Sencillez y rapidez de uso Estimación más precisa y objetiva de la concentración: fiabilidad Evaluación de viabilidad espermática (semen conservado) Producción de dosis más homogénea: estandarización de producto Mejora de productividad y rentabilidad económica Sistema de referencia para validación de otros sistemas de evaluación. Monitorización externa de concentración

26 Muchas gracias