MVZ LEONARDO PÈREZ SANDOVAL. Proyecto de tesis para obtener el grado académico de: ESPECIALISTA EN REPRODUCCIÒN BOVINA

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1 EVALUACION DE LA RESPUESTA SUPEROVULATORIA UTILIZANDO LA ABLACION FOLICULAR COMO ALTERNATIVA PARA LA INDUCCION DEL CRECIMIENTO DE UNA NUEVA ONDA FOLICULAR EN DONADORAS BRAHMAN. MVZ LEONARDO PÈREZ SANDOVAL Proyecto de tesis para obtener el grado académico de: ESPECIALISTA EN REPRODUCCIÒN BOVINA INSTITUTO DE REPRODUCCIÒN ANIMAL CÒRDOBA (IRAC) Y ESCUELA PARA GRADUADOS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÒRDOBA 2011

2 GLOSARIO SPO: Superovulación I.A: Inseminación artificial T.E: Transferencia de embriones FSH: Hormona folículo estimulante LH: Hormona leuteinisante GNRH: Hormona liberadora de gonadotropinas CL: Cuerpo luteo FL: Folículo PGF: prostaglandina f2 alfa P4: Progesterona OPU: Aspiración folicular E2: Estrógenos TTO TEST: Tratamiento testigo TTO EXPER: Tratamiento experimental

3 INTRODUCCION Además de la inseminación artificial (I.A), la introducción de la superovulación (SPO) para la producción y transferencia de embriones, es una de las biotecnologías más importantes para acelerar el mejoramiento animal y producir animales de alto valor genético (1). Desafortunadamente la variabilidad de la respuesta en la SPO de las donadoras de embriones a los diferentes tratamientos con gonadotropinas, continúan siendo el mayor problema en los programas comerciales de transferencia de embriones (T.E). Esta variabilidad en la respuesta SPO puede estar relacionada por factores ligados al tratamiento o en el mayor de los casos por factores asociados a las características de la dinámica folicular ovárica, propia de cada donante, como son las denominadas ondas de desarrollo folicular. (2,3,4). El acompañamiento de los niveles plasmáticos de FSH, en ciclos de 2 o 3 ondas foliculares, demostró el surgimiento de ondas de FSH dos días antes de la emergencia de cada onda folicular, demostrando así ser responsable por este mecanismo. Se sabe que el folículo dominante suprime a sus subordinados por supresión de la FSH a través del estradiol y la inhibina, el folículo dominante produce un factor de crecimiento semejante a la insulina, una activina o factor de crecimiento tumoral ß, que lo torna mas sensible a la FSH, lo que posibilita un crecimiento continuo del mismo con bajas concentraciones de esta hormona. (2,5,6). El folículo dominante crece normalmente por cerca de 6 días, pasa por un periodo estático, hasta alcanzar su diámetro máximo, pudiendo regresar u ovular de acuerdo con la onda folicular en que se encuentre, la media de la emergencia de la onda folicular fue detectada en el día cero (día de la ovulación), el día 10 para ciclos de 2 ondas y para ciclos de 3 ondas, la emergencia fue detectada en los días 0, 9 y 16. (7,8,9,10). Esto confirma la efectividad de los protocolos convencionales de superovulación, originalmente basados en la observación de que las mejores respuestas, eran obtenidas con tratamientos iniciados entre los días 8 a 12 post estro. Este periodo de diestro (7 a 11 días post ovulación) corresponde aproximadamente al día de la emergencia de la segunda onda de crecimiento folicular en ciclos de 2 o 3 ondas, pero en animales que presentan 3 ondas foliculares por ciclo, el día de la emergencia de la segunda onda folicular puede ocurrir 1 o 2 días antes que en los animales de 2 ondas (33,34,35). Esta variación puede ser un factor importante en el comprometimiento de la respuesta superovulatoria, ya que cuando los tratamientos superovulatorios, son iniciados después del momento de la emergencia de la onda folicular, hay una reducción significativa de la respuesta superovulatoria. Otro factor importante relacionado con la reducción en el número de cuerpos luteos, estructuras recuperadas y embriones trasferibles en vacas súper estimuladas, es la presencia de un folículo dominante en el momento del inicio de la superovulación, por lo que la utilización de métodos de manipulación de la

4 dinámica folicular, pueden adecuar el momento del inicio de la superestimulación ovariana con la emergencia de la onda folicular. El adecuamiento de la dinámica folicular y la sincronización de una nueva onda folicular antes del inicio del tratamiento superovulatorio por la eliminación de los folículos de mayor diámetro (dominante) pueden ser realizados mediante el empleo de métodos hormonales o físicos (11,12,13). En los protocolos con base en la aplicación de GNRH Y LH o sus análogos, la emergencia de una nueva onda folicular ocurre en aproximadamente 1.3 días, pero la sincronización es consistente en los animales que ovulan en respuesta al tratamiento. Los protocolos que emplean la asociación de estrógeno con progesterona, determinan la emergencia de una nueva onda folicular de forma consistente dentro de un rango de 3 a 6 días, dependiendo de la sal de estradiol utilizada (11,12,13,14,15,16,17,18,19,20). Entre tanto, a pesar de permitir la sincronización de la emergencia de la onda folicular, permitiendo la realización del programa de superovulación en un momento electivo, los resultados de producción de embriones no son diferentes a los obtenidos con protocolos convencionales donde el inicio de la superovulación se realiza en el periodo de los 8 a 12 días post estro. Con el empleo de los métodos físicos, la adecuación de la dinámica folicular ocurre de forma inmediata, con un aumento en los niveles de FSH en 5 horas y la emergencia de una nueva onda de desarrollo folicular 24 a 48 horas después de la eliminación de los folículos en cualquier fase del ciclo estral, lo que permite la realización del programa de superovulación en un momento electivo, adicionalmente cuando esta remoción es realizada dentro del periodo de los 8 a 12 días post estro, la eliminación mecánica de los folículos de mayor tamaño, 24 a 48 horas antes del inicio del tratamiento superovulatorio, determinan un aumento en el numero de estructuras colectadas. (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32). Entre los métodos físicos, la eliminación de los folículos puede ser realizada por la punción guiada por ultrasonido, a través de la fosa para lumbar o por vía transvaginal, por cauterización mediante laparotomía o laparoscopia, compresión manual o a través de punción transvaginal guiada por un tubo (24,25,26,27,28,31).. Teniendo en cuenta que los resultados obtenidos por los diferentes protocolos convencionales en tratamientos superovulatorios no difieren a lo largo del tiempo en cuanto a respuesta y cantidad de embriones transferibles se refiere, y que al contrario, cada ves son mas los inconvenientes y alteraciones a los que los técnicos en transferencia de embriones se enfrentan en el campo colombiano con nuestras vacadas Brahman, como pueden ser: sobre estimulación, quistosis, folículos persistentes, entre otras, es por esto, surge la necesidad de utilizar y experimentar nuevas alternativas que puedan brindar nuevas expectativas en los trabajos de transferencia de embriones en el campo colombiano.

5 Hipótesis El uso de la aspiración folicular como inductor de la onda folicular para iniciar el tratamiento superovulatorio en donadoras de embriones de la raza Brahman, resulta en similares o mejores resultados de la respuesta superovulatoria. Objetivo general Evaluar la respuesta superovulatoria en donadoras de la raza Brahman, utilizando la aspiración folicular como alternativa en la inducción de la onda folicular, frente a un tratamiento convencional, utilizando benzoato de estradiol como inductor de la onda folicular. METODOLOGIA DEL TRABAJO El experimento fue realizado en la hacienda Oklahoma, ubicada en el municipio de san Alberto, departamento del cesar, se utilizaron 20 vacas de la raza Brahman secas y que estuvieran ciclando al momento de iniciar el tratamiento (presencia de CL ala palpación y ultrasonido), con una condición corporal de 3.5 en promedio (rango de 1 a 5) y manejadas en potrero, es de mucha importancia tener en cuenta que muchas de las donadoras Brahman presentes en el siguiente trabajo, son vacas que en su historial de chequeos reproductivos, previos y posteriores a los tratamientos superovulatorios, muestran una alta incidencia de quistes foliculares, y de folículos persistentes al momento del lavado, el experimento se diseño en base a dos tratamientos (tradicional y experimental), los dos tratamientos fueron experimentados en las mismas vacas con el fin de evitar la variabilidad, primero se realizo el tratamiento tradicional en las 20 vacas, y 45 a 60 días después fue realizado el tratamiento experimental de nuevo en las 20 vacas. Tratamiento tradicional En el día cero del tratamiento tradicional las vacas fueron ecografiadas para confirmar la presencia del CL y por ende la ciclicidad de las vacas, una ves detectada la presencia del CL, las vacas recibieron un implante intravaginal CIDR con progestágeno en combinación con una inyección de benzoato de estradiol; el cuarto día de iniciado el tratamiento, las vacas iniciaron la SPO con FSHp (folltropin, bioniche; animal heathl canada inc.) recibieron 2 dosis diarias, con intervalos de aplicación de 12 horas y realizando la aplicación en dosis decrecientes durante 4 días, hasta completar un total de 10 ml por vaca (200 mg de folltropin); a las 48 y 60 horas después de iniciada la primera aplicación de folltropin, las vacas recibieron 2 dosis de PGF ( lutalyse), al realizar la segunda dosis de PGF (60 horas después de iniciado el tratamiento SPO), es retirado el implante liberador de P4, 12 horas después de la ultima aplicación de folltropin (30 horas después de retirar el implante de P4) se aplicaron 0.025

6 mg de buseralina GNRH (2.5ml conceptal; Internet. Int), y se realizo una primera I.A, 12 horas mas tarde las vacas reciben una segunda I.A, 12 horas después las vacas recibieron una tercera y ultima I.A, 7 días después de realizada la primera I.A se realiza el lavado y colecta de los embriones. Tratamiento experimental El tratamiento experimental fue realizado en las 20 vacas, 45 a 60 días después de ser sometidas al tratamiento tradicional, las vacas en el día cero del tratamiento experimental, al igual que las vacas del grupo tradicional; fueron ecografiadas para confirmar la presencia de un CL, además de confirmar la presencia del CL, por medio de una zonda guía para ultrasonografía transvaginal, usada en la técnica de aspiración folicular, son removidos (aspirados) todos los folículos presentes en ambos ovarios (folículos 5 mm); posterior a la aspiración las vacas recibieron un implante intravaginal de progesterona CIDR, 24 horas después de realizada la aspiración de los folículos, se inicio el tratamiento SPO, siguiendo el mismo esquema de trabajo de las vacas del grupo tradicional, tanto para la aplicación de las dosis de FSH como para la remoción del dispositivo de progesterona. Ultrasonografía y OPU Los animales fueron examinados por ultrasonografía transrectal ( Falco 100, Pie Medical con traductor de 5-7,5 Mhz) para determinar la ciclicidad de las donantes al momento de iniciar el tratamiento, a las vacas del tratamiento experimental se les realizo la ablación folicular de los folículo a 5mm de diámetro mediante el uso de la sonda para OPU convex R10.

7 RESULTADOS Tabla 1. Cantidad de estructuras colectadas durante el estudio para el tratamiento testigo y experimental. Cantidad Numero de animales: 20 Tratamiento testigo Tratamiento experimental totales promedio 11,7 11,6 Tabla 2, Cantidad de estructuras colectadas durante el estudio, según su calidad, para el tratamiento testigo y experimental. Numero de animales: 20 Tratamiento testigo Tratamiento experimental totales promedio totales promedio Infértil Degenerado Calidad Calidad Calidad Transferibles * * Se consideran transferibles solo embriones de calidad 1 y 2. DISCUSIÓN El resultado obtenido con el presente trabajo, fue el desenvolvimiento de un método practico, alternativo y disponible para mejorar la respuesta superovulatoria en vacas donadoras de la raza Brahman, la sumatoria de los procedimientos ejecutados, tales como selección, nutrición de las donadora, así como la realización de los diferentes protocolos, lavaje uterino, colecta y búsqueda de los embriones, pueden ser recurrentes a altas tasas de recuperación de estructuras colectadas en el estudio, no obstante características individuales pueden interferir directamente en la respuesta. Como se puede observar en la tabla 1, los datos obtenidos durante el estudio, para la variable cantidad de estructuras colectadas para los tratamientos testigo y experimental, se puede ver que los datos para ambos tratamientos son muy similares, tanto para el total de estructuras colectadas por tratamiento, como para los promedios.

8 Al comparar los datos colectados en el estudio con otros trabajos similares realizados en años anteriores, (Control del desarrollo folicular y su aplicación en programas de superovulación de donantes de embriones, Bó, G. A. y R. J. Mapletoft Taurus, 1(4):14-27; Avances en tratamientos superovulatorios en cebuinos. Pietro S Baruselli ) donde se evalúo la respuesta superovulatoria con diferentes protocolos, se puede observar que los datos obtenidos por estos autores son muy similares para la variable cantidad de estructuras colectadas, a pesar de esto se pueden encontrar ventajas observadas con el uso de la ablación folicular como método de sincronización de la onda folicular, y es la posibilidad de iniciar el tratamiento superovulatorio, 24 horas después de realizada la ablación en el periodo de 8 a 12 días post estro, permitiendo una satisfactoria programación de las actividades de campo para los técnicos, así como una reducción en el total de días de tratamiento, respecto al tratamiento testigo o convencional., A pesar de que no se encontraron diferencias para la variable cantidad de estructuras totales colectadas para los dos tratamientos, se observo una gran ventaja por parte del tratamiento alternativo, al observar los datos obtenidos para la variable calidad de las estructuras colectadas (tabla 2), se puede ver un mayor numero del total de embriones transferibles para el tratamiento experimental, con respecto al tratamiento testigo, así como una mejor cantidad de embriones transferibles por vaca con respecto al tratamiento testigo, (1 embrión viable de mas por vaca donadora). Además de encontrarse una mayor cantidad de embriones transferibles, para el tratamiento experimental, se puede ver que la mayor proporción de estos embriones, son embriones de calidad 1, por lo que además de observarse una consistencia en los resultados referentes al total de estructuras viables colectadas, se observa un mejoramiento en la calidad de las mismas. Esto resulta en un método ventajoso, a nivel comercial ya que al mejorar la calidad de los embriones, se podrán mejorar los porcentajes de preñez en programas comerciales de transferencia de embriones, otra ventaja importante por parte del tratamiento experimental, seria una mejor tasa de aprovechamiento de estos embriones de mejor calidad, para realizar programas de crió preservación de embriones. ANALISIS ESTADISTICO Para saber si existe una diferencia estadísticamente significativa entre los tratamientos testigo y experimental se hizo la prueba de Kruskal Wallis, mostrada en la tabla 5, que consiste en un análisis de varianza no parámetrico sobre la variable Y que es la proporción de conteos respecto al total, y se observó que hay diferencias significativas a un nivel del 5% con un p<0,0001 entre las diferentes combinaciones de tratamientos y calidades.

9 Tabla 5, Prueba de Kruskal Wallis Variable Calidad Trat N Medias D.E. Medianas H p Y Cal 1 exp 20 0,70 0,26 0,72 86,00 <0,0001 Y Cal 1 Tes 20 0,36 0,37 0,30 Y Cal 2 exp 20 0,20 0,19 0,19 Y Cal 2 Tes 20 0,44 0,35 0,42 Y Cal 3 exp 20 0,00 0,00 0,00 Y Cal 3 Tes 20 0,01 0,04 0,00 Y Deg exp 20 0,07 0,12 0,00 Y Deg Tes 20 0,14 0,17 0,09 Y Inf exp 20 0,03 0,06 0,00 Y Inf Tes 20 0,04 0,07 0,00 Se presentan las comparaciones de a pares de todas las combinaciones. Trat. Ranks Cal 3:exp 54,50 A Cal 3:Tes 58,50 A Inf:exp 65,83 A Inf:Tes 75,53 A B Deg:exp 82,05 A B Deg:Tes 104,53 B C Cal 2:exp 119,25 C D Cal 1:Tes 128,40 C D Cal 2:Tes 141,63 D E Cal 1:exp 174,80 E Medias con una letra común no son significativamente diferentes(p<= 0,05) Gráfico de barras de los rangos medios del análisis de varianza 180 E 147 DE 114 ABC CD CD A A A Cal3:exp Cal3:Tes Inf:exp AB AB Inf:Tes Deg:exp Deg:Tes Cal2:exp Cal1:Tes Cal2:Tes Cal1:exp

10 Conclusiones -El uso de la ablación folicular es tan efectiva como el B.E para inducir el crecimiento de una nueva onda folicular. -La respuesta superovulatoria en vacas Brahman resulta ser más constante, cuando se procede a la remoción física de los folículos a 5mm de diametro, dentro de un periodo de 24 horas antes del inicio de la aplicación de la FSH. -El uso de la ablación folicular resulta en una mejora de la cantidad y calidad del total de de estructuras viables colectadas. Recomendaciones - Seria de mucho beneficio al momento de realizar trabajos similares usar semen de un mismo toro, o por lo menos con una misma vaca en los 2 tratamientos, para eliminar la variabilidad del toro.

11 ANEXOS Protocolos usados Tratamiento testigo Dia Tratamiento 0 (am) Ultrasonido iniciar solo con CL Aplicación de CIDR + B.E 2mg 4 (am) Folltropin 2 ml 4 (pm) Folltropin 2 ml 5 (am) Folltropin 1,5 ml 5 (pm) Folltropin 1,5 ml 6 (am) Folltropin 1ml + 7 cc lutalyse 6 (pm) Folltropin 1 ml + Lutalyse 3 ml retirar dispositivo 7 (am) Folltropin 0,5 ml 7 (pm) Folltropin 0,5 ml 8 (am) Celos I.A + conceptal 5 cc 8 (pm) Celos I.A 9 (am) Celos I.A 15 (am) Colecta de embriones Tratamiento experimental Dia Tratamiento 0 (am) Ultrasonido iniciar solo con CL + opu foliculos 5mm + CIDR 1 (am) Folltropin 2 ml 1 (pm) Folltropin 2 ml 2 (am) Folltropin 1,5 ml 2 (pm) Folltropin 1,5 ml 3 (am) Folltropin 1ml + 7 cc lutalyse 3 (pm) Folltropin 1 ml + Lutalyse 3 ml retirar dispositivo 4 (am) Folltropin 0,5 ml 4 (pm) Folltropin 0,5 ml 5 (am) Celos I.A + conceptal 5 cc 5 (pm) Celos I.A 6 (am) Celos I.A 12 (am) Colecta de embriones

12 Cantidad de estructuras colectadas durante el estudio por animal para el tratamiento testigo y experimental. Cantidad Numero de animales Tratamiento testigo Tratamiento experimental 5592/ / / / / / / / / / / / / / / / / /4 9 8 total promedio 11,75 11,65

13 Cantidad de estructuras colectadas durante el estudio por animal, según su calidad, para el tratamiento testigo y experimental. Infertil degenerado Calidad 1 Calidad 2 Calidad3 transferible N animal testi exper testi exper testi exper testi exper testi exper testi exper 5592/ / / / / / / / / / / / / / / / / / Total Promedi 0,7 0,6 2,1 1,2 4,6 7,2 4,1 2,8 0,1 0 8,8 10

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