LABORATORIO II: GEL FILTRACIÓN

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1 pág. 1 de 9 LABORATORIO II: GEL FILTRACIÓN Introducción El término cromatografía abarca una variedad de técnicas de separación de moléculas basadas en la capacidad de las mismas de distribuirse en forma diferencial sobre una fase estacionaria (sólida o líquida), cuando sobre ésta fluye una fase móvil (líquida o gas). Fase móvil y fase estacionaria se seleccionan de acuerdo a la propiedad fisicoquímica de los componentes de la mezcla, en base a la cual se van a separar. De esta forma se tiene cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión (gel filtración o filtración molecular), cromatografía gas líquido, entre otras. En la cromatografía de gel filtración, o exclusión molecular, los componentes de la mezcla se separan en base a su masa molecular o más precisamente en base a su radio de Stokes (el radio de Stokes describe una esfera con un comportamiento hidrodinámico igual al de la partícula irregular). En una separación por gel filtración el medio o matriz se empaqueta en una columna obteniéndose un lecho empaquetado. El medio es una matriz porosa en forma de partículas esféricas que debe ser física y químicamente estable e inerte (incapaz de reaccionar con o adsorber componentes de la muestra). El lecho empaquetado se equilibra con el buffer que llena los poros de la matriz y el espacio que queda entre las partículas. La matriz sólida y el líquido dentro de los poros (el gel) constituyen la fase estacionaria. El liquido interno de las partículas esta en equilibrio con el liquido fuera de ellas. Este último constituye la fase móvil. Existe una gran variedad de matrices, algunas se forman por el entrecruzamiento de polímeros como dextranos (polímeros de glucosa), agarosa (polímero de D-galactosa y 3,2-anhidro-L-galactosa) o polímeros sintéticos (poliacrilamida, polivinilo) unidos con agentes de entrecruzamiento. Hoy en día hay disponibles diferentes marcas comerciales de estos geles, ver tabla 1. Fabricante BioRad Pharmacia Merck Amicon Nombre comercial Bio Gel P Bio Gel A Sephadex Sepharose Sephacril Superdex Fractogel TSK HW Toyopearl Matrex Cellufine matriz poliacrilamida agarosa dextrano agarosa poliacrilamida agarosadextrano polivinilo polivinilo celulosa Tabla 1. Fabricante nombre comercial del gel y la matriz. Características de la matriz Geles de Sephadex Los Sephadex son matrices de dextranos entrecruzados con epiclorhidirna. Se hinchan en soluciones acuosas, formamida ó dimetilsulfóxido, formando geles. Controlando el grado de entrecruzamiento (más epiclorhidrina más entrecruzado) y el tamaño de las partículas se pueden lograr medios con altas selectividades para diferentes rangos de peso molecular. Estos vienen en forma de polvo, para su uso deben hincharse (swelling) en el medio en el que se va a trabajar. Hay varios tipos de Sephadex, tipo G, tipo LH; los G son aptos para trabajar en medio acuoso, en algunos casos en dimetilformamida o en soluciones acuoalcohólicas. En los Sephadex-LH se ha modificado la cadena de dextranos con grupos hidroxipropilo, lo que hace posible que se utilicen en solventes orgánicos poco

2 polares o en mezcla de solventes orgánicosagua. El número después de la G o LH (ver tabla 2), por ejemplo Sephadex-G 200, esta relacionado con el rendimiento en volumen luego del hinchamiento en agua, en este caso con 1 g de gel seco se obtienen aproximadamente 20 ml de gel hinchado. El rango de fraccionamiento expresado en unidades de peso molecular es el rango entre cuyos límites la matriz puede separar. Un Sephadex G-50 podrá fraccionar moléculas cuyo tamaño esté entre y Da. tipos de gel tamaño de partícula seca (µm) Sephadex G Sephadex G- 25 coarse Sephadex G- 25 medium Sephadex G- 25 fine Sephadex G- 25 superfine Sephadex G- 50 coarse Sephadex G- 50 medium Sephadex G- 50 fine Sephadex G- 50 superfine rango de fraccionami ento * Tabla 2. Algunos tipos de matrices sephadex G * Para proteínas globulares en Da El sephadex se encuentra disponible en diferentes tamaños de partículas que determinan que existan, además de los diferentes tipos-g; geles de partículas finas, medias o superfinas. Las partículas finas se empaquetan mejor que las gruesas dando menor ensanchamiento de bandas y por lo tanto mejor resolución. Aspectos prácticos Una vez hinchado el gel se empaqueta en una columna formando un lecho a través del pág. 2 de 9 cual pasa el eluyente (fase móvil). La muestra cuyos componentes se quieren separar, se aplica en la parte superior de la columna. Luego se va adicionando eluyente en forma continua, a medida que éste recorre la columna las moléculas de la muestra se van distribuyendo entre el líquido que está dentro de las partículas del gel, y el líquido que esta fuera. Aquellas moléculas cuyo tamaño sea menor que el tamaño de los poros del gel, podrán difundir al interior de las esferas y se irán retardando en su recorrido, mientras que las moléculas de tamaño mayor a los poros quedarán excluidas de las esferas del gel y recorrerán la columna junto con el eluyente. Por lo tanto las moléculas eluyen de la columna en orden decreciente de peso molecular, las más grandes eluyen primero y luego las más pequeñas que se retardaron en su recorrido (ver figura 1). Figura 1: Esquema de la separación de moléculas de 2 tamaños diferentes Los geles de Sephadex son estables en un rango amplio de condiciones de trabajo, generalmente se trabaja en condiciones moderadas de ph y fuerza iónica. El gel se hincha en el mismo buffer que se utilizará como eluyente, el que a su vez debe mantener incambiadas las condiciones de la muestra. Cualquier cambio de condiciones puede provocar que los solutos precipiten en la columna o se desnaturalicen en el caso de proteínas lo que además llevaría a la perdida de actividad biológica.

3 A la salida de la columna el eluyente se recoge en fracciones de determinado volumen. En cada una de ellas se monitorea la presencia del componente de interés. Para proteínas y ácidos nucleicos se controla la absorbancia a 280nm y 260 nm, respectivamente. El resultado de la separación se visualiza en el diagrama de elución o cromatograma (figura 2), que muestra la variación de concentración de los solutos en el eluyente en función del volumen de eluyente que ha pasado a través de la columna. pág. 3 de 9 B Cuando el volumen de la muestra no es despreciable con respecto al volumen de elución, el Ve se mide desde la mitad del volumen de la muestra a la posición del máximo de pico (B). C Cuando el volumen de muestra es muy grande, lo cual da una región plateau en la curva de elución, el Ve se mide desde que se aplicó la muestra hasta el punto de inflexión en la parte ascendente del pico de elusión (C). Figura 2: Izquierda esquema de separación de moléculas, derecha diagrama de elusión. A partir de este diagrama puede determinarse volumen de elución (Ve) para cada uno de los solutos. Diferentes criterios se utilizan para determinar el volumen de elusión: A Cuando la muestra aplicada a la columna de gel filtración tiene un volumen despreciable comparado con el volumen de elución, la posición del máximo de pico en el diagrama de elución se toma como el Ve (A). Ve no define completamente el comportamiento de un soluto ya que depende del volumen total del lecho empaquetado (Vt) y geometría de la columna (diámetro y altura) y también del empaquetamiento, por lo tanto para el mismo soluto en el mismo gel pero en diferentes columnas el volumen de elución no es comparable. Al igual que otras cromatografías de partición la elución del soluto está mejor caracterizada por una constante de distribución, Kd definida como sigue:. K d = (Ve Vo ) / Vi (1) Kd representa la fracción de fase estacionaria en el cual puede difundir libremente el soluto.

4 El volumen muerto Vo, es el volumen de elución de las moléculas que son mas grandes que los poros mas grandes de la matriz y por lo tanto no pueden ingresar al interior de las esferas. Puede determinarse experimentalmente eluyendo un soluto de alto peso molecular y de fácil detección. Por ejemplo Blue Dextrano de de Da, que en cualquiera gel que se utilice siempre eluye en el volumen muerto y tiene color azul (máximo de absorción a 600 nm). El volumen de buffer interno (Vi) es el volumen dentro de las esferas que esta disponible para moléculas muy pequeñas. Por lo tanto, es el volumen de elución de las moléculas que se distribuyen libremente entre la fase móvil y estacionaria menos el volumen muerto. En la práctica Vi es difícil determinar, en (1) se sustituye Vi por la expresión (Vt Vo ) y se obtiene: pág. 4 de 9 Para ello debe elegirse el gel apropiado según el peso molecular estimado o conocido de los componentes de la mezcla Determinación de pesos moleculares. En el caso de proteínas globulares es posible determinar su peso molecular mediante gel filtración, para ello se calibra la columna con patrones de peso molecular, hay una relación lineal, entre el PM y Kav, se debe trabajar en el rango lineal del gel. Una vez eluída la proteína de interés se interpola de la curva para conocer su PM. La figura 2 muestra una curva de calibración en una columna G-200. K av = (Ve Vo ) / (Vt Vo ) (2) Kav es una constante de distribución aparente, pero para cada tipo de gel se relaciona de manera constante con Kd. Vt es el volumen total del lecho empaquetado (volumen geométrico de la columna). Para un soluto el mínimo Ve es el Vo, con lo cual para cualquier soluto que eluya en el volumen muerto Kav vale 0 (ecuación 2). Para un soluto que eluya en el Vt, Kav vale 1; para aquellos solutos que entren dentro del rango de fraccionamiento del gel, el volumen de elución estará entre el volumen muerto y el volumen total del gel y Kav estará entre 0 y 1. Aplicaciones de la gel filtración Análisis de mezclas. Una de las aplicaciones más comunes de la gel filtración es el análisis de la mezcla de solutos de diferente tamaño molecular, como polisacáridos, cadenas de ácidos nucleicos de diferente tamaño, proteínas, péptidos y oligopéptidos. Figura 3: Curva de calibración en una columna sephadex G Desalado Es muy común en las primeras etapas de la purificación de proteínas, la precipitación salina con sulfato de amonio, una forma fácil de eliminarlo es desalando, habitualmente se utiliza Sephadex G-25 que tiene un rango de fraccionamiento de Da, las proteínas eluyen en el volumen muerto y las sales en el volumen total.

5 pág. 5 de Aplicaciones industriales Columnas de Sephadex se utilizan para la purificación en gran escala en la industria farmacéutica y bioquímica, por ejemplo el desalado de seroalbumina bovina en plantas de producción se lleva a cabo en columna de G-25 grado grueso. Referencias Bibliográficas Gel filtration in Scopes, R. Protein purification. Principles and practice. 2da edición. Springer- Verlag Gel filtration. Principles and Methods. 0D9F933EC1256F90000DD697?OpenDocument Sephadex LH-60 chromatography in organic solvents. Folleto técnico Pharmacia Fine Chemicals Material de apoyo 2002.

6 pág. 6 de 9 Introducción: Información general sobre Hemoglobina y Mioglobina Las hemoproteínas, son proteínas que contienen un grupo prostético (no proteico), llamado grupo hemo, que consiste en un anillo orgánico porfirínico con un átomo de hierro unido (ver figura 1). El hierro del grupo hemo es capaz de ser oxidado y reducido. Hay muchos tipos de grupos hemo (hemo A, hemo B, hemo C, hemo M, hemo S, hemo L y hemo O) Figura 1.: Grupo Hemo B La hemoglobina es una hemoproteína que transporta el oxígeno en los eritrocitos de la sangre de mamíferos y otros animales. Está constituida por subunidades proteicas globulares con un grupo hemo B cada una. La forma más común de la hemoglobina es un tetrámero de aprox 68 KDa, (aprox. 17 KDa por subunidad). El color de la hemoglobina cambia con el grado de oxigenación. La hemoglobina oxigenada es roja intensa, mientras que la deoxigenada es púrpura. El cambio de coloración implica un cambio en el espectro de absorción. La hemoglobina totalmente oxigenada tiene dos máximos de absorción a los 575 nm y 540 nm. La hemoglobina deoxigenada tiene un solo pico a los 565 nm. Figura 2.: Estructura tridimensional de la hemoglobina. Las cuatro subunidades se muestran en amarillo y rojo, mientras que el grupo hemo aparece en verde.

7 pág. 7 de 9 La mioglobina es una pequeña proteína globular ( Da) muscular de cadena simple (153 aminoácidos) capaz de unir oxígeno. Su función es almacenar oxígeno y facilitar su difusión durante la contracción muscular. Esta proteína tiene un hierro protoporfirínico, o grupo hemo capaz de unir oxígeno, similar al que se encuentra en la hemoglobina La mioglobina tiene además una estructura tridimensional similar a la subunidad polipeptídica de la hemoglobina. Si embargo, aunque su estructura es muy parecida, sólo presentan aminoácidos idénticos en 27 posiciones Separación de los componentes de una mezcla por gel filtración Objetivos: Separar una mezcla de: hemoglobina-azul Dextrano (H-AD) o mioglobina-azul Dextrano, o Azul Dextrano Azul Xilencianol por gel filtración. Materiales: columna de Sephadex G-100 en PBS (buffer fosfato salino) Buffer PBS para eluir Soporte con pinza

8 pág. 8 de 9 Pipetas Pasteur Tubos para recoger los eluídos Espectrofotómetro visible Procedimiento: 1. Cada subgrupo trabajará con una columna de Sephadex G-100 empaquetada y una de las mezclas arriba indicadas. Se deben tener los siguientes cuidados: la columna debe estar vertical en el soporte el empaquetamiento debe ser uniforme, sin caminos preferenciales ni grietas. el gel no debe secarse, para evitarlo siempre debe haber buffer sobre la superficie del gel. no debe distorsionarse la superficie superior del lecho, para ello aplicar la muestra y el buffer de elusión lentamente, contra las paredes de la columna ayudados por una pipeta Pasteur. 2. Adicionar cuidadosamente fracciones de buffer hasta completar un volumen de 10 ml. Para ello se debe abrir la salida de la columna y adicionar buffer a medida que este eluye. 3. Cerrar la salida de la columna dejando aprox. 1 ml de buffer en la superficie del gel. 4. Inmediatamente antes de aplicar la muestra a la columna abrir la salida y dejar un volumen mínimo de buffer en la superficie del gel. Cerrar la columna. 5. Aplicar cuidadosamente la muestra, dejar caer por la pared de la columna sin distorsionar la superficie del gel: 60 µl de mezcla H-AD, o 90 µl de mezcla M-AD o 50 µl de la mezcla AD-AX según el subgrupo de trabajo. Abrir la salida de la columna para que la muestra entre y cerrar. 6. Adicionar cuidadosamente 200 µl de buffer en la parte superior de la columna, dejando correr sobre las paredes de la columna, para lavar la misma. Abrir la salida de la columna y comenzar a recoger el volumen eluído en un tubo. Cerrar la llave de salida de la columna. No dejar secar el gel. 7. Adicionar cuidadosamente buffer hasta completar la columna. Para eluir, abrir la salida de la columna y recoger fracciones de 0.5 ml en tubos (estos deben contener 0.5 ml de PBS para asegurar un volumen final de 1 ml por tubo). Observar el color de las bandas en la columna y en los diferentes tubos. 8. Después de la última fracción coloreada recoger 3 fracciones más y dejar la columna cerrada. Lavar la columna con 15 ml de PBS. 9. Leer en cada tubo la absorbancia a: 600 nm y 410 nm (a esta longitud todos los grupos hemos absorben y se conoce como Banda de Soret). 10. Dibujar el diagrama de elusión o cromatograma. 11. Calcular: Vt de la columna Vo de la columna Ve para cada componente de la muestra. Cuestionario: Cuál es el rango de fraccionamiento del Sephadex G-100? Calcule el Kav de los componentes de su muestra. Está dentro de lo esperado?

9 pág. 9 de 9 Considerando los pesos moleculares de la hemoglobina, la mioglobina y el Azul Dextrano, en qué orden espera que eluyan de la columna cada una de estas moléculas si se siembran juntas en un mismo gel de Sephadex G100? Cómo se puede mejorar la separación o resolución de dos moléculas de tamaño similar en una misma matriz de gel filtración? En que fracción de volumen o volumen de elución espera obtener la elución de una sal inorgánica (tamaño muy pequeño)?