CINÉTICA ENZIMÁTICA: VALORACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA

Transcripción

1 Departamento de Biología de Sistemas Unidad Docente de Bioquímica y Biología Molecular CINÉTICA ENZIMÁTICA: VALORACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA 1.- FUNDAMENTO TEÓRICO Cinética enzimática Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de catalizadores, macromoléculas específicas denominadas enzimas. Muchas reacciones enzimáticas pueden esquematizarse así: E + S E-S E + P Así, la enzima se combina transitoriamente con un sustrato (S) acelerando su transformación en un producto (P). El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad (V) o actividad enzimática; se define como la cantidad de sustrato transformado (o de producto formado) en la unidad de tiempo. Para muchas enzimas, la velocidad de la reacción catalizada (V) varía con la concentración de sustrato [S] en la forma que muestra la figura 1 (modelo de Michaelis y Menten). Figura 1: representación de V en función de [S], para una enzima que sigue la cinética de Michaelis y Menten. Figura 2: representación de dobles recíprocos de la cinética enzimática. (Lineweaver y Burk) Los parámetros cinéticos de una enzima, V máx. y K M, pueden calcularse utilizando distintos tipos de representación gráfica. Uno de los más habituales es el de dobles recíprocos que aparece en la figura 2. Sin embargo, en esta práctica emplearemos la regresión directa de los datos a la ecuación de Michaelis y Menten, que es un procedimiento estadísticamente más correcto y, por ello, más exacto. 1

2 Medida de la actividad enzimática Los métodos más comunes de valoración de enzimas son: a) Volumétricos, cuando en la reacción enzimática se consume o se produce un compuesto gaseoso. b) Colorimétricos, cuando el producto formado es coloreado o da color en una reacción posterior (por ejemplo en la valoración de la fosfatasa alcalina). c) Espectrofotométricos, para aquellas reacciones enzimáticas que utilizan NAD(P) o NAD(P)H como coenzimas. d) Radiométricos, utilizando un sustrato marcado radiactivamente. Fosfatasa alcalina Las fosfatasas alcalinas son una familia de enzimas que catalizan la liberación de ácido fosfórico de algunos ésteres monofosfóricos a un ph elevado. Son por tanto fosfohidrolasas ortofosfóricas (EC ) Son glicoproteínas de membrana cuya parte glucídica está formada por cadenas de oligosacáridos que llevan generalmente ácido siálico en el extremo más alejado de la proteína. Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, especialmente en aquellos que tienen funciones relacionadas con el flujo de nutrientes (hígado, placenta, intestinos y riñón) y en el hueso durante el proceso de calcificación (niños, adultos con fracturas recientes, etc.). Tanto su aumento como su disminución en plasma tienen significado clínico. Por ejemplo, se ha detectado un aumento de fosfatasa alcalina en suero en enfermedades hepáticas y óseas, y una disminución en casos de cretinismo y déficit de vitamina C. La fosfatasa alcalina es un ejemplo de enzima cuya actividad puede medirse empleando un método colorimétrico. Este se basa en la transformación de un sustrato, el para-nitrofenilfosfato (pnfp), en para-nitrofenol (pnf), producto coloreado que en disolución alcalina absorbe a 405 nm. incoloro amarillo (máx 405 nm) 2

3 2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Recta de calibrado de pnf. La primera parte de la práctica consiste en la obtención de la curva de calibrado del p-nitrofenol (pnf), que se utilizará en el apartado 3 para calcular, a partir de las absorbancias medidas, la concentración de pnf producida en la reacción enzimática. Deben prepararse 6 tubos como sigue: tubo tampón agua pnf 625µM NaOH 0.2M [pnf] (producto) 0 1,5 ml 1,20 ml ml Abs. 405 nm 1 1,5 ml 1,17 ml 0,03 ml 0.3 ml 2 1,5 ml 1,14 ml 0,06 ml 0.3 ml 3 1,5 ml 1,11 ml 0,09 ml 0.3 ml 4 1,5 ml 1,05 ml 0,15 ml 0.3 ml 5 1,5 ml 1,00 ml 0,20 ml 0,3 ml Calcular la concentración de pnf (producto) en cada tubo, por ej. considerando V C = V' C'. Anotar en la tabla anterior los valores obtenidos. Representar gráficamente las absorbancias frente a la concentración de pnf en cada tubo y trazar la recta de calibrado Efecto de la concentración de sustrato A continuación se realiza un estudio del efecto de la [S] sobre la velocidad de reacción enzimática. A partir de dicho estudio se determinarán los parámetros cinéticos V máx y K M Preparar 6 tubos del siguiente modo (el extracto de hueso debe ser lo último que se añade): tubo tampón agua pnfp 10 mm (sustrato) extracto de hueso (enzima) 0 1,5 ml 1,10 ml -- 0,1 ml 1 1,5 ml 1,07 ml 0,03 ml 0,1 ml 2 1,5 ml 1,04 ml 0,06 ml 0,1 ml 3 1,5 ml 0.95 ml 0,15 ml 0,1 ml 4 1,5 ml 0,80 ml 0,30 ml 0,1 ml 5 1,5 ml 0,50 ml 0,60 ml 0,1 ml tras 10 min, añadir 0,3 ml de NaOH 0,2 M Abs. 405nm [pnf] (producto formado en la reacción) [pnf] V = t 3

4 a) Mezclar el contenido de cada tubo b) Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. c) Añadir 0,3 ml de NaOH 0,2 M (para detener la reacción) d) Leer absorbancias a 405 nm, frente al blanco. e) Interpolar el valor de estas absorbancias en la recta patrón de pnf (apartado 2.1) con el fin de conocer la concentración de producto obtenido. Anotar cada valor en la tabla, indicando las unidades. f) Calcular la velocidad de reacción, o actividad enzimática, V, y anotar los valores en la tabla de arriba Calcular la concentración de sustrato [pnfp] en cada tubo, teniendo en cuenta que: V C = V' C' y anótalo en la siguiente tabla junto con la velocidad. Tubo [S] V TRATAMIENTO Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS Representar gráficamente V frente a [S] (representación de Michaelis-Menten). A continuación, empleando la regresión no lineal *, calcular, incluyendo sus unidades, la K M y la V máx de la fosfatasa alcalina para p-nfp como sustrato. Verificar sobre la gráfica que los valores son razonables. *. Regresión de los datos: En formato compacto (móvil): 4. MATERIALES Y REACTIVOS Materiales Reactivos Tubos de ensayo NaOH 0,2 M Colorímetro y cubetas de colorímetro Tampón carbonato/bicarbonato 20 mm, ph 10,5 Sustrato: p-nitrofenilfosfato (pnfp) 10mM Muestra biológica (enzima): extracto de hueso Producto: p-nitrofenol (pnf) 625 µm 4

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