Manual de laboratorio de Biotecnología

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1 Manual de laboratorio de Biotecnología NORMAS DE SEGURIDAD PARA LA UTILIZACIÓN DEL ESPACIO EN PRÁCTICAS DE LABORATORIO *Use bata de laboratorio para cada práctica y no utilice calzado destapado *Use guantes, tapaboca, lentes de protección, y máscara con filtros, cuando se requieran. *No pipetee con la boca, use un pipeteador *No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningún reactivo pues sus vapores pueden ser tóxicos *No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio *No use durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares *No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que allí se produce *No se admiten en el laboratorio personas que no estén matriculadas en el respectivo curso, por favor no reciba visitas *No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo UTILIZACIÓN DE REACTIVOS *Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo preparó y la fecha de preparación *No arroje por los sumideros ácidos, bases o algún otro reactivo, por favor depositelos en los recipientes de desecho *Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que algún compañero se queme la piel o se deteriore la ropa. *No arroje al piso ningún reactivo *No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la basura.

2 INTRODUCCIÓN Práctica N. 1: CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES El cultivo in vitro, micropropagación o propagación vegetal in vitro, es el cultivo de células, tejidos u órganos de plantas en un medio aséptico que le aporta los nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones físicas y químicas apropiadas, las células tienen la habilidad de desarrollarse, desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un organismo entero" (Dodds & Roberts, 1985), en cuyo caso, la nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre, y su desarrollo se dará en un periodo de tiempo mucho mas corto. Así pues, para lograr cualquiera de estos propósitos se debe iniciar con la utilización de pequeñas muestras de tejidos vegetales (explante) que tras una adecuada desinfección superficial, son transferidos asépticamente a medios nutritivos líquidos o semisólidos y almacenados bajo condiciones ideales de temperatura y fotoperíodicidad que garanticen un rápido desarrollo. Los medios de cultivo, líquidos o semisólidos, difieren básicamente por la presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y energía (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminoácidos, suplementos orgánicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintéticos conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros químicos vegetales secretados en un determinado tejido y que actúan en el mismo tejido, o en otro distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulación del crecimiento en plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscísico y Etileno. OBJETIVO GENERAL: Esta práctica pretende que el estudiante conozca e implemente algunas técnicas básicas del cultivo de tejidos vegetales. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Inducir desdiferenciación tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos vegetales.

3 Acelerar el crecimiento de plantas utilizando medios nutritivos suplementado con fitohormonas. Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. REACTIVOS Y MATERIALES A EMPLEAR: Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 6-benzilaminopurina (BA), hipoclorito de sodio, alcohol industrial, etanol, agar, sacarosa, medios de cultivo, bisturí, pinzas, mecheros, frascos, placas de vidrio, gasa, algodón, papel de aluminio, papel craft, vinilpel, cinta de enmascarar, probetas, erlenmeyer, pipetas, balanza, ph-metro, agitador magnético, cámara de flujo laminar, guantes, tapabocas, gorro, material vegetal (fríjol verde, zanahoria, plantas aromáticas) PROCEDIMIENTO 1. Preparación de los medios de cultivo: Para esta práctica se deben preparar y esterilizar bajo condiciones de calor húmedo (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo: Inducción de callos: preparar 60 ml de MS (ver tabla 1)(pH: ), suplementado con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relación auxina:citoquinina (1:1 o 2:1) Crecimiento: preparar 60 ml de MS (ver tabla 1) )(ph: ), enriquecido con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relación auxina:citoquinina (1:1 o 1:2) 2. Proceso de desinfección del material vegetal Una vez lavado el material vegetal con agua y jabón, se sumerge inicialmente en etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de sodio (2%, 15 min.) al que previamente se le han agregado algunas gotas de Tween 80. Pasado este período de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres lavados consecutivos (5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estériles a los medios de cultivo y se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad. SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRÁCTICA

4 1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales una vez por semana y anotar los avances que estos presenten, incluyendo aparición de callos, contaminaciones, organogénesis y aumento en longitud o tamaño. 2. Realizar subcultivos rutinarios cada cuatro semanas y continuar la práctica según el desarrollo de cada uno de los grupos de trabajo Tabla 1. COMPOSICIÓN Y PREPARACIÓN DEL MEDIO MURASHIGE Y SKOOG (Medio MS) (Murashige Skoog, 1962) Constituyente Concentración de la solución madre (g/l) Volumen de la solución madre por litro de medio Macros NH 4 NO 3 16,5 KNO 3 19 CaCl 2.2H 2 O 4,4 100 ml MgSO 4.7H 2 O 3,7 KH 2 PO 4 1,7 Micros MnSO 4.H 2 O 1,69 ZnSO 4.7H 2 O 0,86 H 3 BO 3 0,62 KI Na 2 MoO 4.2H CuSO 4.5H 2 O 10 ml de sol ml mg/100ml CoCl 2.6H 2 O 10 ml de sol. 25 mg/100ml Fuente de hierro FeSO 4.7H 2 O Na 2 EDTA.2H 2 O ml Vitaminas Inositol 10 Nicotínico 0,05 HCl-Piridoxina 0,05 Glicina 0,2 10 ml HCl-Tiamina 0,01 Adicionar al medio 3% de sacarosa y 0.7% de agar. GLOSARIO

5 Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que producen elongación celular, y en algunos casos división celular; frecuentemente inducen la aparición de raíces adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los vástagos). Ejemplo el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que inducen la división celular y frecuentemente la formación yemas adventicias (en los vástagos). En la mayor parte de los casos inhiben el desarrollo de raíces adventicias. Las citoquininas disminuyen la dominancia apical. Ejemplo: 6- benzilaminopurina (BA). Callo: Tejidos no organizados, formados por células diferenciadas y no diferenciadas, que se dividen de forma activa y que generalmente se originan en zonas dañadas (por heridas), o en cultivo de tejidos. BIBLIOGRAFIA farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia, Seccional Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronomía. Murashige T., Skoog F., 1962, A revised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15: Pierik R.L.M., 1990, Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi- Prensa, Madrid. Práctica No. 2 CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS INTRODUCCIÓN El cultivo de células animales permite la realización de diferentes actividades docentes que tienen importancia en el ámbito de la biotecnología. Los diferentes tipos celulares animales tienen dos opciones de crecimiento, en suspensión y

6 adheridas, el estudiante deberá conocer los dos sistemas. Para ello deberá realizar cultivos a corto plazo máximo una semana y realizar dos experiencias, la primera la obtención de cromosomas y la segunda la criopreservación. OBJETIVO GENERAL Dar al estudiante las bases del cultivo de células en suspensión (linfocitos) y de células adheridas (línea celular). OBJETIVOS ESPECÍFICOS Obtener cromosomas de un cultivo de linfocitos de sangre de diferentes especies.de mamíferos. Cultivar células adheridas, para establecer cambios morfológicos durante su crecimiento. Criopreservar células conservando las características morfológicas iniciales MATERIALES Jeringa de 2,5cc, frasco de cultivo ( Boterito), pipeta de 5ml, pipeta de 1 ml, incubadora a 37oC, tubos cónicos de centrífuga, centrífuga, pipetas pasteur, láminas portaobjetos, láminas cubreobjetos, aceite de Inmersión, microscopio de luz (100X), heparina, medio de cultivo RPMI, suero fetal bovino, extracto de frijol, solución hipotónica de KCL 0.075M, colchicina, metanol, ácido acético, colorante de Giemsa PROCEDIMIENTO La muestra que será suministrada a los estudiantes, será tomada en forma estéril de la vena yugular en una jeringa heparinizada (Liquemine, Roche). Estas muestras han de ser identificadas. La siembra debe hacerse en condiciones estériles y se sembrarán 10 gotas de sangre en 5 ml de medio RPMI (Roswell Park memorial Institute) suplementado con suero fetal bovino al 10% y 100ul de Fitohemaglutinina (50Ugrml). Se lleva el cultivo a una incubadora de 37oC por 72 horas. OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS Se adiciona al cultivo 0,1 ml de Colcemid (5ugr/ml)y se deja en incubacón por 30 minutos, luego se centrifugan 10 minutos a 1800 rpm. Se descarta el

7 sobrenadante y se adicionan 8 ml de solución hipotónica y se homogeniza bien la muestra y se incuba 10 minutos a 37oC, posteriormente se adiciona 1 ml de Carnoy ( Metanol: Acido acético 3.1), se homogeniza y se centrífuga.1800 rpm x 10 minutos. All pellet se le adicionan 10 ml, se homogeniza y se deja por 30 minutos en refrigeración (5oC). Se centriufa por 10 minutos, el pellet se resuspende en 5 ml de fijador y se vuelve a centrifugar, esta operación se repite dos veces mas. Al final el pellet se resuspende en 0,5 ml de Fijador, finalmente se colocan 2 o 3 gotas de fijador sobre la lámina, esta se deja secar. Las láminas son coloreadas con colorante de Giemsa y se observan al microscopio las metafases. Seguimiento: El cultivo debe revisarse a las 24 horas para evidenciasr signos de contaminación. Las láminas una vez coloreadas deben revisarse para observar la presencia de metafases y si es posible tomar fotograficas para analizarlas. GLOSARIO Medio de cultivo : Solución de aminoácidos, vitaminas y sales que es capaz de soportar el desarrollo celular Colchicina: Inhibidor de la despolimerización de los microtúbulos, necesario para detener las células en metafase Fitohemaglutinina: Mitógeno, utilizado para promover la división de los linfocitos en el cultivo Cultivo: Procedimiento mediante el cual una suspensión de células son puestas a crecer en condiciones controladas Práctica No.3 CULTIVO Y CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS ANIMALES INTRODUCCIÓN Dentro del proceso de aprendizaje el estudiante conocerá el comportamiento de las células que crecen adheridas y sumado a esto realizara un ejercicio de crió preservación de las mismas.

8 Las células que crecen dependientes de anclaje son aquellas que necesitan un soporte sólido para su desarrollo in Vitro, usualmente son las células del cuerpo que sirven de sostén, fibroblastos, tejido conectivo. Ellas crecen tomando formas especificas que sirven para su identificación y caracterización. La crió preservación nació hace aproximadamente 50 anos y puede definirse como el procedimiento mediante el cual se conservan las células a temperaturas inferiores 0 0 C, esto se pudo dar gracias a dos desarrollos importantes, el primero el descubrimiento de los crioprotectores y el desarrollo de sistemas de frió. Los crioprotectores mas usados son el glicerol y el dimetil sulfoxido son moléculas pequeñas, hasta 150 kd que entran a la célula desplazando el agua intracelular lo que impide que a bajas temperaturas se formen cristales de hielo que rompen la membrana. Posteriormente se realiza la curva de congelación que en ocasiones es muy rápida, caso fibroblastos o lenta caso espermatozoides. Se pueden congelar cualquier tipo de células, pero lo más importante es que al descongelar se encuentre viabilidad y funcionalidad de las mismas, por eso aunque se hable de congelación es igual o más importante la descongelación, esta se hace transfiriendo las células a 37 0 C por 5 minutos. Para que la preservación de las células pueda hacerse por largo tiempo se utilizan sistemas que producen o generan frió, en el primer caso la nevera de hasta menos C, en el segundo gracias a someter a presión los gases estos se licuan a temperaturas bajas, en el caso del nitrógeno C y el helio C. Criopreservar es detener el tiempo, esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se congelan células germinales, espermatozoides y/o óvulos, pues no se puede asegurar que la respuesta de la información genética a los efectos medioambientales sea la misma que cuando fueron congeladas. OBJETIVO GENERAL Conocer el proceso de congelación y descongelación en un modelo de células dependientes de anclaje. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Conocer los cambios morfológicos que ocurren en los cultivos de células dependientes de anclaje. Criopreservar células eucarioticas Materiales

9 Células, pipetas de 5 ml, pipetas de 1ml, cajas de petri para cultivo, tubos cónicos de centrífuga, crioviales, congelador de - 80 oc, microscopio, centrífuga, medio de cultivo Ham F12, suero fetal bovino, solución de Tripsina, glycerol o Dimetil sulfóxido, solución Salina Bufferada Procedimiento Las células son recuperadas cuando la población alcanza el máximo dentro del frasco de cultivo, idealmente las céulas se han de cosechar cuando están en su fase mayor de crecimiento (log phase). Las células se deben mantener a 37 oc, con un ph entre 7.2 y 7.5, una osmolaridad de 220 mosm, alta humedad, con una fase gaseosa en equilibrio (C02 con el bicarbonato del medio) y en lo posible protegido de la luz. CULTIVO Y CRIOPRESERVACION A cada grupo se le entregara una suspensión de células, que deberá lavar, contar (al menos mirar la microscopio cuantas tiene por campo) y determinar su viabilidad. Ellos sembraran en cajas de petri de 30 mm con medio RPMI suplementado con suero al 10%, algún grupo puede usar otro medio como Ham s F12 o Dulbecco. Allí las dejarán observando los cambios morfológicos hasta la confluencia, una vez confluentes procederán a soltarlas y a criopreservarlas. Tripsinización de células adherentes Evalué la densidad celular de su cultivo (frasco, botella, etc), si tiene confluencia o usted estima conveniente remover las células pase al paso No 2., remueva el medio de cultivo (OPCIONAL: Lave una o dos veces con solución salina bufferada (PBS) su cultivo con el fin de remover las proteínas, adicione 1 ml de Tripsina 0.25 % y déjelo por 10 minutos a 37oC. A los 5 minutos observe si las células se están soltando. Cuando las células estén totalmente sueltas, adicione 5 ml de medio sin suero fetal bovino, transfiera la suspensión celular a un tubo de ensayo y centrifuge a 1800 rpm x 10 minutos. Descarte el sobrenadante y resuspenda en 5 ml de medio con suero fetal bovino y dependiendo de sus necesidades, determine la concentración y la viabilidad Ajuste con medio de cultivo de acuerdo con sus necesidades, si simplemente va a duplicar un cultivo existente añada 10 ml de medio con suero y siembre de a 5 ml en una cada frasco Criopreservación

10 A 4 ml de suspensión de células agregue 4 ml de suero fetal bovino y 1 ml de glycerol, homogenize y transfiera a los crioviales. Una los crioviales y envuélvalos en gasa. Llévelos a -80 oc, y déjelos allí mínimo 72 horas. Descongelación Tome un vial y llévelo al baño de maria a 37 oc espere a que el vial se descongele totalmente, transfiera el contenido del vial a un tubo de centrífuga con medio de 5 ml de medio de cultivo, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de medio con suero fetal bovino al 20%, siembre las células en las cajas de cultivo y observe el crecimiento SEGUIMIENTO 24 horas después de la siembra de debe verificar si hay o no contaminación. Cada 24 horas se observa el cultivo para ver el crecimiento de las células y la formación de monocapas Verificación del crecimiento después de la descongelación. GLOSARIO Criopreservación: Procedimiento de almacenamiento celular mediante el cual estas se conservan vivas a temperaturas inferiores a - 70 grados centígrados Tripsinización: Procedimiento mediante el cual, se aplica una solución de tripsina a células adheridas para que estas se suelten. Vial: Recipiente pequeño, de un volumen no mayor a 2 ml usado para almacenar células. Pasaje: Procedimiento mediante el cual, una vez formada la monocapa de células estas se sueltan y son sembradas en dos o mas nuevos frascos de cultivo. BIBLIOGRAFÍA 1. Bergenholtz, A., Halimus, G., Hanstrom, m. anat. Rec. 189, Burrows, M.T. J.A.V.M.A Carrel, A. J.J. Exp. Med. 15, Curtis, A.S.G., Varde, N.J. Nat. Cancer. Inst. 33, Elsdale, T., Tolbert, W.R. Scientific American. 54, Freshney, R.I. Culture of animal cells. A manual of basic technics. Alan, R. Ciss. Inc. New York

11 7. Góngora, A, Villamil, L.C. Vera, V., Parra, JL., Ramírez, G., López, G. Aislamiento de un herpes virus bovino tipo-1 (HVB-1) de secreción nasal y esmegma prepucial en un toro reproductor. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLIII. No. 1.pp Harrison, R.G. Proc. Soc, Exp. Biol. 4, Harrison, R.G. J. Exp. Zool. 17, Jaime, J., Villamil, L.C., Vera, V., Ramírez, G. infección persistente con el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en hatos lecheros de la Sabana de Bogotá. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLIV. No. 1 pp Köler, G., Milstain, C. continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefine specificity. Nature. 256, Leighton, J.J. Nat. Cancer. Inst. 12, Littlefield, J. W. Science. 145, Mendigaña, C., Vera, V., Villamil, L.C., Jaime, J. Caracterización proteica de cepas colombianas citopáticas y no citopáticas del virus de la Diarrea Viral Bovina. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLII. No. 1 pp Moscona, A.A, Moscona, M.M. J. Anat. 86, Morgan, S.J.; Darling, D.C. cultivo de células animales. Editorial Acribia Parulekar, S., Hassel, T., Tripathi, S. Recent development in vertebrate cell culture technology. In: Wang, J., Frienlander, M. Academic Press. USA. Pp Pollard, J.: Walker, J. Animal cell culture. In: Methodos In Molecular Biology. Fd. Pollard J. And Walker H. in Humana Press, New Jersey, Vol Parra, J.L., Vera, V., Villamil, L.C., Ramírez, G. Seroepidemiología de la diarrea viral bovina en explotaciones lecheras de la Sabana de Bogotá. Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLLL. No 1. Pp Práctica No. 4 Producción in vitro de embriones de ratón INTRODUCCIÓN Desde hace tiempo el hombre ha querido conocer los secretos más íntimos de su naturaleza, especialmente en lo relacionado con el desarrollo, esto es, el proceso mediante el cual los gametos fusionados en el zigoto se convierten en un ser humano. Para ello ha utilizado diferentes modelos algunos mas cercanos evolutivamente que otros a si mismo. Se sabe mucho de la biología del desarrollo en especies como la Drosophila Melanogaster o el Xenopus laevis, estas especies

12 de genoma relativamente pequeño y corto intervalo generacional no permiten extrapolar totalmente a los eventos del desarrollo mamífero. El ratón es el modelo mas parecido al humano, por su versatilidad se ha convertido en la especie de elección para el estudio de la biología de los embriones y la genética del desarrollo Se conoce desde hace más de 30 años que se pueden manipular gametos y embriones, gracias a ello y a los diferentes avances conceptuales y técnicos hoy en día esa manipulación puede ser usada en el tratamiento de la infertilidad humana. La falla reproductiva, entendida como la inhabilidad para concebir, gestar y parir un individuo se puede cuantificar y expresarla como una proporción determinada en cada especie siendo el ser humano una de las más ineficientes, en esta especie si una pareja no se embaraza luego de un año sin relaciones sexuales sin protección se considera infértil. Una de las técnicas mas usadas hoy en día es la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), una técnica costosa y de la cual aún se desconocen algunos aspectos de sus efectos sobre los nacidos vivos, es por eso que se plantea la posibilidad de utilizar las técnicas de manipulación existentes con el fin de intentar obtener fertilización de la forma mas natural posible. En este manual se presenta información derivada de los procedimientos de manipulación de gametos y de cirugía utilizados para el desarrollo del proyecto de investigación " Efecto de la remoción de la Zona Pelúcida sobre el desarrollo embrionario" Para incrementar el número de oocitos que son ovulados se administran gonadotropinas exógenas a las hembras antes del apareamiento, permitiendo recuperar grandes números ( hasta 35, de nuestra experiencia ) de embriones preimplantatorios que pueden utilizarse en los diferentes tipos de experimentación ( microinyección de huevos, infección viral de mórula y marcaje metabólico de los embriones con radioisótopos). La fuente mas común de gonadotropinas son las que se obtienen del suero de yegua preñada (PMSG), esta tiene un marcado efecto estimulador del desarrollo folicular ( acción folículo estimulante, FSH) y la gonadotropina coriónica humana (hcg) cuyo efecto es similar a la función de la hormona luteinizante (LH). Una superovulación eficiente depende de la edad, el peso y las condiciones de salud. Usualmente se utilizan hembras prepúberes entre las 3 y 5 semanas de edad, el peso bajo o la enfermedad alteran la respuesta a las gonadotropinas y reducen el número de oocitos obtenidos en la superovulación.; la dosis de gonadotropinas empleada con mayor frecuencia es 5 UI de PMSG y 5 UI de hcg estas son inyectadas intraperitonealmente en volúmenes muy bajos que no exedan 0.2 ml; con un intervalo de 42 a 48 horas en su administración, primero es la PMSG y posteriormente la hcg. Una cepa de ratones se clasifica como buena respondedora cuando ovulan entre 40 a 60 oocitos y mala respondedora si ovulan 15 o menos.

13 Además para maximizar el número de oocitos fertilizados es necesario mantener ratones con fertilidad probada, un alto conteo espermático y una buena proporción de formación de tapón vaginal en las hembras apareadas. Materiales y Equipos Ratones, Jeringa de 1cc, Tijeras y Pinzas, Cajas de Petri de 30mm, Cajas de cultivo de cuatro pozos, Agujas calibre 16, Pipetas Pasteur (2), Mechero, Esteromicroscopio y/o microscopio invertido, Algodón, Alcohol, Gonadotropina Sérica de Yegua Preñada, Gonadotropina Coriónica Humana, Medio de cultivo Hams F10 u otro similar, Albúmina Sérica Bovina, Solución salina Bufferada INYECCION INTRAPERITONEAL Para realizar la inyección intraperitoneal se deben tener en cuenta dos factores: el primero relacionado con tomar el ratón de la caja y el segundo el proceso de inyección propiamente dicho. Recuerde que usted debe utilizar un adecuado equipo y protección para evitar ser herido por el animal. Para la primera tome el ratón por la cola y colóquelo en una superficie firme y seca, no mantenga el ratón por mas dos 2 minutos de la cola pues causa una gran cantidad de estrés. Coloque el ratón en una superficie firme y rugosa de forma que el animal pueda fijarse en ella por sus garras. Con la otra mano, una vez el ratón esta fijo, tómelo por la nuca asegurándose de abarcar toda la piel de la zona, finalmente coloque la cola del animal entre los dedos y permita que la otra mano quede libre para hacer cualquier procedimiento de manipulación. Para la superovulación se utilizan generalmente jeringas de tuberculina, previamente llene la jeringa con el volumen que vaya a inyectar. Fije un ratón de la forma anteriormente mencionada, incline el animal 45 o con la cabeza abajo, con esta práctica los intestinos se desplazan cranealmente al sitio de inyección. Limpie con alcohol el área donde va ha hacer la inyección. Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen formando un ángulo de 30 o C, aspire una pequeña cantidad de aire con el fin de asegurar la localización de la aguja. En la región entre el diafragma y la vejiga, administre el fluido que vaya a inyectar. Sacrificio por dislocación cervical Tome el ratón por la cola y póngalo en una superficie firme y rugosa de forma que el animal pueda fijarse en ella por sus garras, con la otra mano fije el ratón de la nuca asegurándose de tomar la mayor cantidad de piel posible, fije la nuca y estire el animal de la cola, hasta sentir que la cabeza se separa de la columna vertebral.

14 FABRICACIÓN DE LAS PIPETAS PARA RECOLECTAR Y MANIPULAR EMBRIONES Las pipetas utilizadas para la manipulación de óvulos y embriones se fabrican en el laboratorio, tomando Pipetas Pasteur, usualmente de 2 " de longitud en su parte estrecha. Estas se mantienen estériles en recipientes y son adelgazadas hasta el diámetro necesario en el momento de la manipulación embrionaria. Para adelgazarlas se calientan las pipetas Pasteur con una llama fina, bien sea de mechero a gas o de alcohol, se fijan los dos extremos, cuando está lo suficientemente caliente y se siente que el vidrio está blando, se estira para producir un tubo con un diámetro interno de aproximadamente 200 (m. Es de anotar que se hace el estiramiento manteniendo los dos extremos fijos, no se trata de hacer un capilar con un extremo cerrado, se hace un tubo muy delgado, posteriormente con el microscopio se observa el diámetro de la pipeta y se corta por el sitio que mas se ajuste al tipo de célula o de procedimiento a realizar. Con la llama se deben pulir los bordes de la pipeta. FERTILIZACIÓN IN VITRO Se inyectan las hembras con PMSG y hcg para inducir la superovulación. Obtención de espermatozoides: Los machos se sacrifican por dislocación cervical 12 horas después de que las hembras han sido inyectadas con hcg, se deben utilizar machos que se hayan tenido por lo menos 3 días de abstinencia sexual. Se realiza una incisión media ventral y se fija el animal por las extremidades, una vez abierto se identifica y extrae la cola del epidídimo, removiendo la mayor cantidad de tejido adiposo como sea posible. Se corta el conducto deferente lo más cerca posible al epidídimo y luego se coloca en un plato con 500 µl de medio de cultivo suplementado con 30 mg/ml de albúmina sérica bovina. Utilizando unas pinzas finas se presiona el epidídimo para facilitar la salida de los espermatozoides. Los espermatozoides así obtenidos se deben incubar durante 90 minutos a 37 C con 5 % de CO2 para capacitarlos. Obtención de óvulos Se sacrifican las hembras por dislocación cervical 12.5 horas después de la inyección de la hcg, se extraen los oviductos, se sacan las masas de oocitos y se colocan en un plato con 1000 µl de medio de cultivo con 30 mg/ml de albúmina sérica bovina y se llevan a incubadora con 5% de CO2 en aire y 37 C de temperatura. Luego de que hayan transcurrido 13.5 horas después de haber

15 inyectado las ratonas con hcg se adicionan 100 µl de espermatozoides a los platos donde se encuentran los oocitos, se debe ajustar a una concentración de espermatozoides móviles de 1x106 a 2x 106 espermatozoides/ml. Incubar los espermatozoides con los oocitos durante 4 horas a 37 C. Luego de que hayan transcurrido las 4 horas de incubación se transfieren los oocitos a medio de cultivo con 4 mg/ml de albúmina sérica bovina, con la menor la menor cantidad de espermatozoides como sea posible. Unas 12 a 16 horas posterior a la inseminación de los oocitos, se evalua la fertilización mediante la observación de los pronucleos masculino y femenino y la extrusión del segundo cuerpo polar. CULTIVOS EN MICROGOTAS En un plato de cultivo estéril se vierten gotas de 20 a 40 µl de medio M16, luego se cubren con aceite de parafina y se transfieren los embriones al medio de cultivo, por último se llevan a una incubadora con atmósfera de CO2 al 5% y se verifica su desarrollo hasta llegar al estadio de blastocisto SEGUIMIENTO Una vez fertilizados a las 18 horas se realiza la evaluación de los pronucleos, es decir la fertilización. Cada 24 horas se evalua el desarrollo embrionario hasta el estado de blastocisto. GLOSARIO Oocito.: Gameto femenino Oocito maduro: Gameto femenino que una vez ovulado se encuentra en metafaseii Pronucleo: Estado del desarrollo embrionario en el que se encuentra previos a la singamia. Singamia: Proceso mediante el cual se unen los genomas femenino y masculino (pronucleos). Embrión: Estado de desarrollo del ser, previo a la implantación. Blastocisto: Estado de desarrollo del embrión en el que se forma una cavidad, previo a la implantación.

16 Gonadotropinas : Hormonas que se suministran a los animales para la inducción del desarrollo folicular y ovulación. Peritoneo : Capa de tejido que cubre la cavidad abdominal. Práctica No. 5 ESTABILIZACIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA MEDIANTE PROCESOS BIOXIDATIVOS AEROBIOS (COMPOSTAJE) INTRODUCCION La tierra se considera como un sistema termodinámico cerrado. En consecuencia, la única posibilidad de generación de nueva biomasa es el reciclaje de la materia. Los denominados biosistemas han evolucionado en consecuencia con esta condición termodinámica hasta generar una clasificación, basada en la transformación de la materia, que determina la configuración de tres tipos de organismos: Productores, consumidores y descomponedores. Se denomina como productores a los biosistemas que están en capacidad de biotransformar la energía lumínica procedente del sol en energía química almacenada en forma de moléculas reducidas. El segundo tipo de biosistemas que se denominan consumidores se caracterizan por ser intermediarios de la energía química. Finalmente, se denominan descomponedores a los organismos especializados generar energía química a expensas de la biooxidación de la biomasa generada en los otros dos tipos de biosistemas. Con la consolidación del urbanismo en el siglo XX se estableció una doble problemática: En primera el deterioro paulatino de los suelos con vocación agrícola y en segunda instancia la contaminación ambiental por acumulación de materia orgánica. Ante esta doble problemática, se vienen buscando alternativas científicas y tecnológicas que puedan dar respuesta en ambos sentidos: En el sentido agronómico buscar formular sustratos que permitan recuperar la fracción orgánica del suelo y, en el sentido ambiental al minimizar el impacto de la acumulación de materia orgánica. El compostaje se considera hoy como una de las alternativas más plausibles a la condición anotada. El compostaje se puede entender como el proceso acelerado e irreversible de la degradación biooxidativa y catabólica seguida de un proceso de resíntesis de un substrato orgánico sólido, a través de organismos descomponedores endémicos (normalmente artrópodos y microorganismos), endo y exoenzimas presentes en el medio, que actúan sobre la matriz orgánica hasta la obtención de un producto heterogéneo denominado compost, con apariencia

17 completamente independiente del material de origen y que se caracteriza por su estabilidad química y sanitización, con respecto a parámetros de referencia establecidos por un patrón. El objeto de la presente práctica es dar una serie de herramientas a los estudiantes sobre los tratamientos bioxidativos de materiales orgánicos de desecho, para la generación de insumos agrícolas. OBJETIVO GENERAL Diseñar, producir y evaluar un proceso bioxidativo aerobio (compostaje) bajo condiciones de laboratorio. OBJETIVOS ESPECIFICOS Definir las materias primas aptas para el proceso de compostaje mediante la evaluación de variables físicas, químicas, biológicas y ambientales. Establecer las mezclas adecuadas para dar inicio a un proceso de compostaje. Evaluar cinéticamente el proceso (variables físicas, químicas y biológicas) para definir el punto final del proceso en consideración a la normatividad vigente. MATERIALES Como materias primas se utilizarán residuos sólidos urbanos (con separación en fuente), gallinaza (estiércol) y aserrín. Además un reactor con capacidad para 25 lts según se presenta en el esquema siguiente. Sistema de biofiltros aire Termómetro

18 METODOS Definición de materias primas. En función del origen, la humedad y la relación carbono/nitrógeno se estima la mezcla más adecuada para iniciar el proceso. Estudio cinético. Una vez definidas la mezcla inicial, con intervalos de dos semanas, obtener una muestra para la realización de un estudio cinético. Para el caso presente se realizará el estudio por 60 días. Determinación de punto final del proceso y calidad del producto final. Carbono orgánico Para determinar la cantidad de carbono orgánico, las moléculas orgánicas deben romperse en unidades de carbono simples y ser convertidas en una forma molecular sencilla que pueda medirse de forma cuantitativa. Se sigue el protocolo descrito a continuación. Transferir a un Matraz de Erlenmeyer 1.0 g (0.5 g o menos sí es alto en materia orgánica el material debe pasar una malla N 80) Adicionar 10.0 ml de Dicromato de Potasio 1 N Inmediatamente adicionar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado sobre la disolución anterior y agitar vigorosamente por 1 minuto Reposo por 30 minutos Adicionar 200 ml de agua y 10 ml de ácido fosfórico Adicionar 0.5 ml de difenilaminosulfonato de Bario antes de titular Titular con FeSO 4.7 H 2 O hasta que aparezca un ligero verde fosforescente

19 Cenizas Es un parámetro útil en definiciones cinéticas (dado que debe aumentar en función del tiempo) e igualmente necesario para el reconocimiento de la calidad del producto final. Debe tenerse en cuenta que realmente se determina tanto contenido de cenizas como el carbono orgánico fijo. Materiales y procedimiento Crisol de porcelana, horno mufla, desecador y balanza analítica con sensibilidad de g. Para iniciar, se pesan 2 g de la muestra en un crisol de porcelana, previamente tarado a la temperatura de trabajo, se lleva la muestra a un horno mufla precalentado a 250 C y se calienta gradualmente, hasta alcanzar una temperatura de 550 C. Se calcina la muestra durante cuatro horas, se enfría en un desecador y se pesa. CÁLCULOS El contenido de cenizas, expresado como porcentaje, se calcula aplicando la siguiente ecuación: % de Cenizas = (B - C)/(A - C) x 100 Donde: A: Peso de la cápsula más muestra en gramos, B: Peso de la cápsula más cenizas en gramos y C: Peso de la cápsula vacía en gramos Nitrógeno Dado que es un macronutriente, es trascendental definir las cantidades presentes. El nitrógeno calculado corresponde a nitrógeno total y el procedimiento empleado para la determinación de nitrógeno total es el método de Kjeldhal, que consiste en convertir el nitrógeno presente en sulfato de amonio por digestión con ácido sulfúrico concentrado en presencia de un catalizador. El amonio formado se libera por adición de NaOH en exceso, luego se destila sobre una disolución de H 2 SO 4 ó HCl y se titula el exceso de ácido con disolución valorada de NaOH o KOH. Reactivos: Catalizador: Pesar 100 g de sulfato de potasio (K 2 SO 4 ) y mezclarlos con 1.6 g de sulfato de cobre (CuSO4) NaOH al 50 %: Pesar 50 g de hidróxido de sodio en escamas y adicionar 50 ml de agua destilada, Acido clorhídrico 0.1 N, Acido Sulfúrico concentrado (98%) e Indicador Tashiro

20 Para calcular el nitrógeno total se emplea la siguiente ecuación: % de N = [ (V HCl x N HCl ) (V NaOH x N NaOH ) ] 14x 100 / g de muestra El protocolo se ilustra a continuación Muestra 0.4 g Balón Kjeldhal Adicionar 10.0 ml de H 2 SO 4 Concentrado Adicionar 4.0 g de catalizador Digestión Aprox. 1 hora Adicionar Lavar con agua paredes del balón Reposo Hasta temperatura ambiente Traspasar Balón destilación realizando lavados Adicionar 40.0 ml de NaOH al 50 % Destilar Recibir Aprox. 100 ml sobre 50 ml de HCl de concentración conocida Titular NaOH 0.1 N

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