PROLOGO NOMBRE DEL ALUMNO: PROFESOR DE TEORÍA: PROFESORES DE LABORATORIO: GRUPO: PERIODO LECTIVO: CARRERA: ESCUELA:

Transcripción

1 PROLOGO El presente libro tiene la finalidad de dar apoyo a las asignaturas relacionadas con el cultivo, manejo, aislamiento, conservación e identificación de microorganismos para los estudiantes de educación media y superior del área biológica. Se presentan algunas técnicas básicas microbiológicas el cual tiene como principal objetivo poner en práctica el método científico para despertar el interés y seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia. Como una aportación a las estructuras didácticas de este libro, colocamos una serie de imágenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar. NOMBRE DEL ALUMNO: PROFESOR DE TEORÍA: PROFESORES DE LABORATORIO: GRUPO: PERIODO LECTIVO: CARRERA: ESCUELA: 2

2 ÍNDICE Pasos a seguir para trabajo diario de un laboratorio de microbiología 4 Procedimiento para la realización de un medio de cultivo 13 Realización de una preparación en fresco y fija 19 Técnicas de tinción 22 Microscopia 27 Preparación de material utilizado en microbiología 35 Diluciones y diluyentes 43 Aislamiento por estría cruzada y vaciado en placa 47 Cultivo de microorganismos 52 Microcultivo 59 Conservación de cepas 67 Pruebas bioquímicas 72 Toma de muestras 88 Determinación de OMA 97 Determinación de OCT 100 Determinación de mohos y levaduras 106 Aplicaciones de la temperatura (pasteurización de leche y control de calidad) 109 Preparación de reactivos 114 Medidas de seguridad 120 3

3 PASOS A SEGUIR PARA TRABAJO DIARIO DE UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA La calidad en nuestro trabajo en un laboratorio de Microbiología depende de una secuencia de pasos a seguir estrictamente por todo el personal que labora el, para ello sugerimos seguir los siguientes pasos para tratar de uniformar criterios. PASOS A SEGUIR: 1.- Preparación del área de trabajo 2.- Preparación de medios de cultivo 3.- Preparación de reactivos 4.- Preparación de material 5.- Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras para su análisis microbiológico 6.- Realización de la técnica 7.- Incubación de la muestra 8.- Recuento 9.- Realización de los cálculos 10.- Presentación del informe. El personal de nuevo ingreso al laboratorio de Microbiología deberá de leer el manual de aseguramiento de la calidad y pondrá más interés en su área de trabajo. PREPARACIÓN DEL ÁREA DE TRABAJO Las características del área de trabajo son las siguientes: 1.- La mesa debe ser de acero inoxidable con instalaciones de agua, luz, drenaje y gas, cada una de estas instalaciones deberá de tener los siguientes códigos de colores según la NOM-026-STPS, Colores y señales de seguridad e higiene e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías. LUZ ROJO IDENTIFICACIÓN DE TUBERÍAS CONTRA INCENDIO AGUA VERDE IDENTIFICACIÓN DE FLUIDOS DE BAJO RIESGO GAS AMARILLO IDENTIFICACIÓN DE FLUIDOS PELIGROSOS 2.- El área de trabajo cuenta con luz natural principalmente y/o luz artificial. 3.- Una campana de flujo laminar para la realización del sembrado con instalaciones de luz. 4.- Siempre al inicio y al final de nuestras actividades la mesa se limpiará con una solución de benzal al 10 % para desinfectarla, para ello siempre se debe tener una esponja y un atomizador con benzal, además se debe de tener un frasco de con benzal para cuando se necesite, este reactivo hay que prepararlo frecuentemente para evitar que se contamine. 5.- La mesa debe tener dos mecheros con manguera en buen estado y una balanza granataria de 600 g de capacidad para el pesado de las muestras. 6.- En el cajón de la mesa se debe tener papel aluminio, cucharas de plástico nuevas, espátulas, frasco con torundas de algodón, hisopos, cuchillos, tijeras, pinzas, tenedores, ligas, (algunos estériles y otros no porque se pueden esterilizar con alcohol cuando se requieran) 4

4 7.- Debe existir un frasco de 2 litros de capacidad con 1 litro de benzal para colocar las puntas de las pipetas que se estén utilizando durante el análisis perfectamente etiquetado (PUNTAS DE PIPETAS SUCIAS). 8.- En la mesa procurar distribuir el material que se necesita de tal manera que contemos con el espacio suficiente para manipular las muestras tanto en el pesado de la muestra como el sembrado, de tal forma que sugerimos apilar las placas de Petri del lado izquierdo para irlas corriendo al lado derecho. 9.- Debajo de la mesa se tendrá un recipiente con una bolsa de plástico para desechar lo que no sirve, nunca las muestras, estas se guardan hasta que el análisis y reporte estén terminados El área de trabajo estéril no debe tener corrientes de aire para evitar contaminaciones El analista debe traer una bata de preferencia blanca, limpia y en buen estado, con el pelo recogido y cubierto con una cofia, además de utilizar un cubrebocas y guantes al manipular la muestra Se debe de programar la fecha y hora de dar mantenimiento a las instalaciones así como la hora para la limpieza de este El analista debe evitar en lo posible la entrada de personal ajeno al laboratorio o en zonas donde se preparen medios, reactivos, o área de sembrado de muestras Al final de cada día de trabajo el analista indicará al personal de lavado de material cual es el que tendrá que lavar y esterilizar para ser utilizado nuevamente Al desechar las muestras sobre todo las sólidas utilizar una coladera para evitar que las partículas sólidas de gran tamaño se vayan por el drenaje. 5

5 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO El personal encargado de la preparación de medios de cultivo debe conocer la NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo para poder clasificarlos, para ello mencionaremos lo siguiente: Un Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad, proporcionándoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo, estos requieren elementos que se encuentran en su composición química. Los factores que se deben regular durante el crecimiento son los nutrientes, ph, temperatura, aireación, concentración de sales, y potencia iónica del medio. Los componentes necesarios que debe contener un medio de cultivo deben ser: a.- Fuente de carbono Los microorganismos obtienen su energía a través de la fotosíntesis o de la oxidación de compuestos orgánicos, son capaces de utilizar el CO 2 como fuente principal de carbono. El carbono se suministra generalmente en forma de carbohidratos b.- Fuente de nitrógeno El nitrógeno es un componente de primer orden de las proteínas y ácidos nucleicos, las fuentes pueden ser los nitratos, nitritos, nitrógeno, amonio y aminoácidos. c.- Fuentes de azufre El azufre es uno de los constituyentes orgánicas de la célula, constituye parte de la estructura de diversas coenzimas y se encuentra formando parte de la metionina y cisteína, la mayoría de las bacterias toman el azufre del ión sulfato, otros más lo pueden obtener a partir del H 2 S. d.- Fuente de fósforo Se requiere fosfato como componente de ATP, ácidos nucleicos y coenzimas como el NAD, NADH y flavinas. El fosfato se asimila como fosfato inorgánico. e.- Fuentes minerales Algunos microorganismos requieren de iones Mg 2+ y ferroso Fe 2+, el magnesio es un componente de la molécula de clorofila y el hierro es parte de las coenzimas de los citocromos y las peroxidasas. El potasio se requiere para la función de los ribosomas y el calcio es un constituyente de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas f.- Factores de crecimiento Se llama factor de crecimiento a la sustancia que favorece el crecimiento pero que el microorganismo es incapaz de sintetizar. Los factores de crecimiento pueden ser vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, biotina), algunas de estas sustancias se pueden obtener del suero, yema de huevo o sangre. g.- Agar El agar utilizado en bacteriología es un medio que esta libre de metales tóxicos, compuestos nitrogenados, sales insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos. El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus partículas, que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la solución disminuye en su temperatura, gelificando a los C. Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a : a.- Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora. 6

6 b.- Su estabilidad química, le permite mantener el medio al estado sólido prácticamente en cultivos de cualquier bacteria c.- Su punto de fusión, superior a 80 C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se incuban hasta temperaturas de 65 C. d.- Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma líquida. e.- Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente del orden del 1 al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos f.- Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtención de medios semisólidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad En algunas ocasiones un medio de cultivo posee algunas otras sustancias como colorantes o inhibidores para favorecer o inhibir el crecimiento de un microorganismo. Los colorantes e indicadores son de importancia en la preparación de la mayor parte de los medios de cultivo diferenciales pues, pueden actuar de la siguiente manera: a.- Como agentes bacteriostáticos b.- Como indicadores de los cambios de acidez o alcalinidad c.- Como indicadores redox en ciertos medios de cultivo. CLASIFICACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Según la NOM los clasifica por: A.- Su aspecto físico, los medios de cultivo preparados pueden ser: a.- Líquidos, b.- Semisólidos, c.- Sólidos. a.- Medios líquidos. Se emplean fundamentalmente para: - Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos. - Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. - Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas. b.- Medios semisólidos. - Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda. c.- Medios sólidos. - Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología. B.- Su uso, se clasifican en: a.- Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés. b.- Medios selectivos de enriquecimiento. Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros. c.- Medios diferenciales. 7

7 Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias. d.- Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos. Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. e.- Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos. f.- Medios de transporte. Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes. g.- Medios para filtración a través de membrana. Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana. Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del medio de la membrana. h.- Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras. i.- Medios especiales para cultivo de protozoarios. C.- Especificaciones El fabricante debe especificar en cada medio: a.- Contenido de humedad (medio deshidratado). b.- Composición del medio. c.- Método de preparación. d.- Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado (en autoclave). e.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso. f.- Características de desarrollo de los microorganismos en el medio. g.- Advertencia sobre la conservación de los medios preparados. h.- Resultados de las pruebas de estabilidad del medio. i.- Resultado de las pruebas de viabilidad del medio. j.- ph del medio preparado. k.- Fuerza de gel (si procede). D.- Etiquetado El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma español, con caracteres claros y legibles, de conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud, su Reglamento en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto, debiendo incluir además: - Nombre comercial del producto. - Uso. - La leyenda "Agente de Diagnóstico". - Presentación. - Datos de conservación y almacenaje. - Fecha de caducidad. - Número de lote. 8

8 - Número de Registro SSA. - Nombre y domicilio del fabricante. - Nombre y domicilio del distribuidor. - Método de preparación y ph final. - Fórmula. Por lo tanto haciendo uso de la reglamentación mexicana tenemos ejemplos de los medios de cultivo por su aspecto físico. a) Medios líquidos.- Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de microorganismos o bien para la producción de algún metabolito además de estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, se puede obtener el tubo o en matraz y en caso de cultivar a los mohos se puede hacer por agitación o sin agitación. Figura 1: Cultivo en medio liquido (caldo nutritivo y caldo glucosa sales) b) Medios semisólidos.-se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad y su contenido de agar es de 13 g/l Figura 2: Medio semisólido (medio SIM), para observar la movilidad de un microorganismos c) Medios sólidos.- Se elaboran en una placa para obtener colonias aisladas de microorganismos y la concentración de agar es de 15 g/l, también lo utilizamos en medios sólidos inclinados y cuando se trata de sembrar en tubo se colocan en ellos y después de la esterilización se inclinan sobre una varilla de vidrio para dejar una superficie de aproximadamente 3 cm. 9

9 Figura: 3 Medio sólido inclinado, sólido en placa y en matraz para vaciado en placa B.- Por su uso se clasifican en: a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés. Figura 4: Medios selectivo agar eosina azul de metileno. b) Medios selectivos de enriquecidos.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden la reproducción de otros como por ejemplo el agar Baird Parker que sirve para el aislamiento de S. aureus, estos medios de cultivo le adicionamos una sustancias enriquecida de composición desconocida como suero, sangre, huevo, leche, extracto de hígado, etc. Figura 5 Medio enriquecido c) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores de ácido base para detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia. 10

10 Fig. 9 Medio de transporte para la realización de exudados faríngeos. C.- También podemos clasificar a los medios de acuerdo a nuestras necesidades y lo podemos hacer de la siguiente forma. A.- POR SU COMPOSICIÓN a).- Medio sintético.- Si un medio se le conoce el 100 % de su composición química. b).- Medio complejo.- Si un medio de cultivo no conocemos su composición química. La calidad del trabajo microbiológico en el análisis de muestras se encuentra vinculada tanto con la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos, como de la limpieza del material de vidrio y/o plástico que se utilizan durante su preparación y/o envase. Las mejores instalaciones y equipo disponible y la habilidad del analista pierden todo su valor si la composición de los medios de cultivos no corresponde a la requerida y si durante la preparación de éstos no se respetan las indicaciones del fabricante. NOTAS: -Leer siempre las instrucciones del fabricante, las cuales están en la etiqueta del frasco -Realizar los cálculos para pesar exactamente lo solicitado. -Se debe siempre de fundir el medio (agar), a la temperatura de ebullición y sobre un soporte con rejilla o sobre una parrilla de calentamiento. -Utilizar un recipiente al doble de la capacidad que se vaya a preparar -Verificar el ph con un potenciómetro -Una vez preparado el medio de cultivo, si son placas y ya están solidificadas se colocan en bolsas de plástico nuevas y en posición invertida para evitar la deshidratación y se colocaran en el refrigerador hasta su uso. -Si son tubos se tienen que inclinar, para ello se coloca una pipeta en una mesa plana y se sujeta con un masking, posteriormente se acomodan los tubos, de tal manera que al solidificarse quede un área de aproximadamente 3 cm de longitud. Una vez solidificados se colocan dentro de un bote de lámina y este se introduce en una bolsa de plástico, para ser guardados en el refrigerador -Los medios que son líquidos se quedan en el interior del bote y una vez fríos se colocan en el refrigerador. - No olvidar colocar en la incubadora, al menos una muestra de cada medio para testigo. -Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasión. -El ácido tartárico se esteriliza por filtración con membrana. 11

11 Figura 10 Medio de cultivo donde podemos preparar el medio siguiendo las instrucciones del fabricante Fig. 11 Medios de cultivo preparados. Los cuales llevan un control de calidad y son probados con cepas ATCC, por ejemplo para el agar de sal y manitol es probado con: Microorganismo Cepa de referencia Resultado E. coli ATCC Crecimiento inhibido S. aureus ATCC Colonias con pigmento amarillo característico y halo de color amarillo (manitol positivo) S. epidermidis ATCC12228 Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo) P. mirabilis ATCC Inhibición parcial Tabla No. 1 cepas de referencia para control positivo y negativo del agar de sal y manitol. MÉTODO DE PRUEBA La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia) ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS Los medios de cultivo deberán almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador 12

12 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO 1.- Asegurarse que el frasco que contiene el medio de cultivo esté bien cerrado, no presente grumos, no esté hidratado y se encuentre dentro de su vigencia. 2.- Leer cuidadosamente las especificaciones del fabricante, generalmente son las siguientes: 2.1 Contenido de humedad (medio deshidratado). 2.2 Composición del medio. 2.3 Método de preparación Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso Características de desarrollo de los microorganismos en el medio Advertencia sobre la conservación del medio preparado. 2.8 Resultados de las pruebas de estabilidad del medio. 2.9 Resultado de las pruebas de viabilidad del medio ph del medio preparado. 3.- Calcular ÚNICAMENTE la cantidad de medio de cultivo que se necesita y anotar los cálculos en la bitácora. 4.- Abrir el frasco y auxiliándose de un espátula o cucharilla, pesar en balanza, previamente calibrada, la cantidad calculada. 5.- Colocar la pesada en un recipiente cuya capacidad sea por lo menos dos veces mayor a la del volumen de medio que se desea preparar. 6.- Adicionar el volumen de agua deseado, agitar vigorosamente y dejar reposar para iniciar su disolución. NOTA: Antes de usar el agua, verificar el ph de la misma. 7.- Si para la disolución completa se requiere calentar, efectuar esta operación en platina caliente o sobre una rejilla de asbesto calentando con mechero. NO APLICAR CALOR DIRECTO AL MEDIO DE CULTIVO, porque puede sufrir alteración. 8.- Ajustar el ph a 25 ºC con potenciómetro ajustado. NO USAR PAPEL INDICADOR EN ESTA OPERACIÓN. 9.- Esterilizar los medios y/o soluciones preparadas, usando calor húmedo a temperaturas y tiempos establecidos por el fabricante, dicho valor lo obtenemos de la etiqueta del frasco de medio. Controlar el proceso de esterilización usando como bioindicadores al Geobacillus stearothermophilus y para calor seco utilizar al B. subtilis. Para sustancias termolábiles, esterilizar mediante el proceso de filtración y el bioindicador utilizado es Pseudomonas diminuta, a.- Medios sólidos en placa Cuando se necesite preparar placas de medios de cultivo, efectuar el proceso de vaciado en campana de flujo laminar o bien en la zona de trabajo bacteriológico del mechero, siguiendo las siguientes recomendaciones. 1.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una temperatura de 45 ± 2 C. 2.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y proceder a vaciar el medio 13

13 Fig. 12 Medio sólido a 45 C y vaciado en placa del medio 3.- Dejar entreabiertas las placas un momento para que el agua se evapore y no se condense en la tapa, una vez desplazada el agua tapar rápidamente. Fig.13 Diferentes placas con medio de cultivo El medio sólido también es utilizado para realizar el recuento y aislamiento de microorganismos por la técnica de extensión con varilla, en esta técnica contamos con el medio ya solidificado y adicionamos 0,1 ml del inoculo en la superficie del medio, posteriormente esterilizamos la varilla y dejamos enfriar para extender la muestra. 14

14 Fig. 14 Técnica de extensión con varilla Medio sólido en placa, dejar entreabierta la tapa de la caja de lo contrario se formará agua de condensación, tal y como se muestra en la figura En caso de existir burbujas en el medio hay que flamear con la flama del mechero, procurando agarrar el collarín para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar. Fig. 14 Cuando al vaciar nos queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobre ellas (Nunca hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra) 5.- Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas de plástico. 6.- Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparación. 7.- De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 ºC durante 48 horas como prueba de esterilidad. b.- Medios en matraz para vaciado en placa Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapón de algodón con gasa y fundir el medio. 1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante. 2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una temperatura de 45 ± 2 C. 3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio. 4.- Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y dejar solidificar. 15

15 Fig. 15Técnica de vaciado en placa Fig. 16 Medios de cultivo a temperatura de 45 C para realizar la técnica de vaciado en placa c.- Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras. Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapón de algodón con gasa y fundir el medio. 1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante. 2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una temperatura de 45 ± 2 C y adicionarle 1.4 ml de ácido tartárico al 10 % por 100 ml de medio. 16

16 3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio d.- Medios líquidos en tubo. 1.- Preparar el medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 ml y proceder a colocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapón de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una campana de Durham. 2.- Procurar no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten. 3.- Colocar los tubos en un bote de lámina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las condiciones que indica el fabricante. 4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la evaporación. 5.- Cuando se requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros Fig. 17 Preparación de medios de cultivo líquido en tubo Las principales causas de error en la preparación de medios de cultivo son: Diferencias en la medición o peso de los medios y /o ingredientes. Falta de frescura del medio por estar bastante tiempo almacenado en el refrigerador el cual genera la deshidratación del medio Presencia de residuos de detergente en el material utilizado. Efecto germicida de algunas sustancias presentes en el material de vidrio por mal lavado y enjuagado. Que la calidad del agua destilada utilizada no sea la indicada o que presente ciertas trazas de impurezas. Diferencias en el ajuste del ph antes de la esterilización o disminución de este después de la esterilización por efecto del calentamiento o bien por parte del analista. Aunque los medios sean de buena calidad podría en un momento dado tener sustancias que inhiban el crecimiento de los microorganismos. Al vaciar los medios si no se hace a la temperatura sugerida puede tener agua de condensación y al sembrarlo puede generarnos colonias extendidas. Una mala esterilización por parte del personal que lo realice ya sea un sobrecalentamiento del medio trayendo como consecuencia que se desnaturalicen algunas sustancias y en ocasiones pueden perder su poder diferencial o su consistencia. Siempre que la técnica indique esterilizar por separado alguna sustancia se deberá de realizar nunca mezclarlos porque es una causa de error, que pudiera repercutir en el resultado de manera muy significativa. El esterilizar los medios más de una vez corremos el riego de perdida de agua por lo que el medio estará más duro de lo que debe estar, por lo tanto se deben de pesar solo cantidades necesarias. Revisar frecuentemente el funcionamiento del manómetro de la autoclave. 17

17 EXPRESIÓN DE RESULTADOS Los bioindicadores no deben presentar desarrollo alguno a las 48 horas de incubación en el baño María INFORME DE LA PRUEBA Del lote elaborado el 5 % de las cajas d Petri o matraces preparados para el vaciado en placa no deben de presentar desarrollo alguno. Esta prueba se debe realizar siempre que se prepare material. 18

18 Elaboración de una preparación en fresco y una preparación fija Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos. A.- Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases, pero antes debemos limpiar los portaobjetos de la siguiente manera. Limpieza de los portaobjetos y cubreobjetos Es preferible utilizar material nuevo, pero en ocasiones presentan algo de grasa por lo que debemos desengrasarlos con alcohol y secarlos con un paño fino que no deje pelusa, si no se utilizan en el momento se deben de envolver con papel higiénico, de esta manera quedan protegidos del polvo y únicamente se abre el paquete en el momento de hacerlos servir. B.- Preparación de Frotis: Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol. a) Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha. Método A a) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. (para este paso no se necesita que el agua sea estéril y que se tenga que esterilizar el asa) b) Encender el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm 2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla. c) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operación una vez más. El calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en el dorso de la mano. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir. Fig. 18 Preparación de un frotis para una preparación Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis 19

19 Método B a) Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero. b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión. c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor. OBSERVACIÓN DE UNA PREPARACIÓN EN FRESCO DE UN MOHO a) En un portaobjetos limpio coloca una gota pequeña de azul de algodón lactofenol b) Con el asa coloca un poco del micelio del moho y colócale un cubreobjetos. Observa al microscopio a 40 X y realiza un esquema de lo observado. Fig. 19 Preparación de una muestra de mohos con azul de algodón lactofenol 20

20 TÉCNICAS DE TINCIÓN Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es necesario teñir la célula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoquímicos muy complejos, algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teñido en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados. La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes están formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que están bien asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unión a componentes con carga contraria presentes en la célula. Los colorantes se designan como ácidos o básicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de ph en solución, sino más bien si una parte significativa de la molécula es aniónica o catiónica. Desde el punto de vista práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida. En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación. Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H 2 O. Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero. Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos: TINCIÓN NEGATIVA: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina). TINCIÓN SIMPLE: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células. Tomar la preparación y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de disección sacarlo del recipiente. Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua Dejar secar la preparación y observarla al microscopio. Fig. 20 Pasos para la realización de una tinción simple, donde se pueden colocar varias preparaciones en un mismo portaobjetos 21