Lección 16. INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS CUANTITATIVO.

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1 Lección 16. INTRODUCCIÓN AL ANÁLISIS CUANTITATIVO. Análisis cuantitativo: Conceptos básicos. Propiedades analíticas de interés. Trazabilidad. Materiales de referencia. Calibración instrumental y metodológica. Validación. Análisis cuantitativo es el que tiene como objetivo determinar la cantidad o proporción en que se encuentran los analitos en un material. Origina una respuesta numérica que está caracterizada por la incertidumbre implícita en toda medida experimental. Métodos absolutos: Se relacionan directamente con patrones básicos. Ej.: Métodos gravimétricos Ej.: Volumetrías sustancias patrón que no contienen al analito la determinación se basa directamente en la relación estequiométrica de la reacción entre el valorante y el analito de la muestra. Métodos relativos: que precisan calibración metodológica de la respuesta del instrumento de medida respecto a la concentración del componente de interés mediante patrones químico-analíticos que sí contiene el mismo analito objeto posterior de determinación. Ej.: Métodos instrumentales kg patrón Métodos estequiométricos: tricos: Se relacionan con patrones de tipo químico-analítico que no contienen al analito CALIBRACIÓN Problema Analítico Información requerida Muestra Analitos Recursos instrumentales y humanos Coste TRAZABILIDAD Información cuali o cuantitativa Nivel de exactitud deseado Nivel de precisión deseado Rapidez Coste Supremos Exactitud Representatividad PARÁMETROS DE CALIDAD DE UN MÉTODO ANALÍTICO Básicos Límite de detección Sensibilidad Precisión Selectividad Robustez Complementarios Coste Rapidez Seguridad Método Adecuado Límite de de detección Exactitud Precisión Selectividad Robustez Requerimientos instrumentales Tiempo análisis Coste EXACTITUD Proximidad entre el resultado obtenido y el valor de referencia adecuado REPRESENTATIVIDAD Propiedad relacionada con la generación de resultados coherentes con las muestras recibidas en el laboratorio, el sistema en estudio y el problema analítico planteado.

2 LÍMITE DE DETECCIÓN Mínima cantidad de analito que proporciona una señal significativamente diferente de la señal del blanco LÍMITE DE DETERMINACIÓN Mínima cantidad de analito capaz de ser determinada por un método analítico con una exactitud y precisión aceptables SENSIBILIDAD Cambio que experimenta una determinada señal analítica por unidad de concentración PRECISIÓN Dispersión de los valores obtenidos alrededor del valor medio o proximidad entre los resultados obtenidos por aplicación del mismo procedimiento experimental varias veces bajo condiciones predescritas. Repetibilidad Reproducibilidad ROBUSTEZ o SOLIDEZ Evalúa la influencia de pequeños cambios en las condiciones analíticas sobre la fiabilidad del método analítico. Se determina introduciendo pequeños cambios en el método (por ejemplo, en las condiciones analíticas) y examinando las consecuencias (factores que originan las fluctuaciones o influencias sobre la señal analítica). Se define como la capacidad que tiene un método analítico para permanecer relativamente insensible a ligeros cambios SELECTIVIDAD en el procedimiento, en la calidad de los reactivos o en las condiciones experimentales Es una medida del grado de interferencia que producen los compuestos que acompañan al analito en la muestra. COSTE, RAPIDEZ, SEGURIDAD Características que también deben conocerse para hacer la selección de forma correcta. TRAZABILIDAD Se define de forma genérica como la aptitud de rastrear (conocer la historia, aplicación o localización de una entidad (producto, proceso, servicio, organización) por medio de identificaciones registradas. El término «trazabilidad» puede ser usado con tres enfoques principales: TRAZABILIDAD Aquella característica de un resultado analítico que implica su relación inequívoca con estándares o materiales de referencia apropiados a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones en las que la calibración juega un papel preponderante a) Si se refiere a un producto, está relacionado con el origen de los materiales y de las piezas, la historia de su producción y la distribución y localización del producto después de que haya sido entregado o distribuido. b) Si se refiere a la calibración, se aplica a la relación de los equipos de medida con los estándares nacionales o internacionales, con los estándares primarios, con las constantes o propiedades físicas básicas o con los materiales de referencia. c) Si se refiere a la adquisición n de datos, se relaciona con los datos generados y los cálculos utilizados. Resultado TRAZABILIDAD Instrumentos de medida Definición y relación de los estándares entre sí ESTÁNDARES Calibración

3 ESTANDARES DE REFERENCIA PATRONES Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National Institute of Standards and Tecnology, NIST) Farmacopea de los Estados Unidos (United States Pharmacopeia) MATERIAL DE REFERENCIA (RM) (Reference Material) MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (CRM) (Certified Reference Material) MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA (SRM) (Standard Reference Material) MATERIAL DE REFERENCIA material o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibración de un aparato, la estimación de un método de medición o para asignarles valores a los materiales MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO es un material en el que los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un procedimiento técnicamente válido, bien sea que esté acompañado de, o pueda obtenerse, un certificado u otra documentación emitida por un ente certificador. MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA material emitido por la oficina de normas de Estados Unidos (U.S. National Bureau of Standards, NBS) cuyo nombre fue cambiado a Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National Institute for Standards and Technology, NIST). Tienen propiedades físicas o químicas específicas certificadas (son emitidos con certificados). CALIBRACIÓN El uso de estándares de medida apropiados es fundamental en Análisis Cuantitativo ya que sin ellos no se podría medir ni comparar. CALIBRACIÓN INSTRUMENTAL CALIBRACIÓN METODOLÓGICA El objetivo de la calibración instrumental es garantizar el funcionamiento correcto del instrumento empleado para la cuantificación ( ej. balanza, bureta, espectrofotómetro,etc.) La calibración metodológica tiene como meta establecer una relación clara e inequívoca entre la respuesta instrumental y la cantidad/concentración del analito. MÉTODOS DE CALIBRADO En muchos tipos de análisis químicos se mide la respuesta del procedimiento analítico a cantidades conocidas de analito, y basándose en ellas se puede interpretar la respuesta de una muestra de contenido desconocido Implican la obtención de una función de calibrado que define la respuesta equivalente a concentraciones conocidas del componente analizado. Una vez conocida esta función, se utiliza para determinar la concentración a partir de la señal instrumental obtenida Función de calibrado Ajuste por mínimos cuadrados

4 Patrón Externo (directo) Adición patrón (adición estandar) Patrón Interno MÉTODO PATRÓN N EXTERNO Comparación de las señales de la muestra con las correspondientes a las del calibrado (disoluciones patrón) Estándares de diferente concentración del analito (preparados artificialmente para que su matriz sea semejante a la de la muestra real- El uso de estnadates puros puede conducir a errores sistemáticos importantes). Se someten al proceso los patrones y la muestra de forma independiente. En la determinación de un analito (A) por un método instrumental se obtienen los siguientes datos de calibración: C A (ppm) Señal 0,031 0,173 0,422 0,702 0,956 1, Representar la curva de calibración 2.-Calcular la concentración M de A (PF A =207,2) en una muestra cuya señal analítica es 0, Calcular el limite de detección y el de cuantificación sabiendo que la desviación estándar del blanco es s=0,0079 La relación entre la señal y la concentración de analito, se denomina "recta de calibrado" y es válida en el intervalo de concentraciones ensayado. La concentración de analito en la muestra problema se determina por interpolación

5 En la determinación de un analito (A) por un método instrumental se obtienen los siguientes datos de calibración: C A (ppm) Señal 0,031 0,173 0,422 0,702 0,956 1, Representar la curva de calibración 2.-Calcular la concentración M de A (PF A =207,2) en una muestra cuya señal analítica es 0, Calcular el limite de detección y el de cuantificación sabiendo que la desviación estándar del blanco es s=0, ,532 = 0,067 ppm + 0,030 7,49 = ppm (mg/l) M = (g/l) / PF M =7,49x10-3 / 207,2 Señal ppm m = 0,067 b = 0,030 CC = 0,999 M = 3,62 x C LD = 3 s B /m C LC = 10 s B /m C LD = 0,354 ppm C LC = 1,179 ppm Para eliminar los efectos de la matriz se trabaja sobre la matriz real ADICION PATRÓN N (ADICIÓN N ESTÁNDAR) ADICION PATRÓN N (ADICIÓN N ESTÁNDAR) Se desea asegurar un comportamiento similar de patrones y problema. Muestras complejas o matrices difíciles de reproducir (alimentos, muestras biológicas o medio ambientales) Calibración metodológica "in situ. PROCEDIMIENTO -Consiste en preparar los patrones con la misma muestra a analizar y añadir una cantidad conocida de la especie química a determinar. -A n alícuotas de la muestra real se la añaden concentraciones crecientes, por ejemplo de 0 a 5 unidades arbitrarias, del estándar puro del analito. Todas ellas contienen una concentración de analito que es la suma de la original (se busca) y la añadida

6 -Se someten las n alícuotas de muestras reales enriquecidas al proceso analítico, obteniéndose una señal para cada alícuota. -Se representan las señales en función de la concentración del estándar añadido. Se obtiene una recta de calibrado paralela a la que se obtendría con los estándares puros Siendo C= C x + C s Concentración del patrón adicionado Concentración del problema Y x = Señal debida al problema Y s = Señal debida al patrón Y Y C x C s -La señal sobre el eje de ordenadas es la que origina la muestra original. -La concentración de analito en la muestra se obtiene por extrapolación de la recta de calibrado, su cruce con la prolongación del eje de abscisas proporciona el dato buscado.

7 La determinación de Fe en vinos se realiza por AA usando el método de la adición patrón. Se añaden 10 ml de muestra y cantidades variables de una disolución de Fe patrón de 10 ppm enrasándose a 50 ml con agua desionizada y midiendo la AA, obteniéndose los siguientes datos: ml Fe AA 0,040 0,062 0,081 0,102 0,135 Hay que pasarlos a ppm Calcular la ecuación de la recta de regresión y la concentración (ppm) de Fe en el vino. La determinación de Fe en vinos se realiza por AA usando el método de la adición patrón. Se añaden 10 ml de muestra y cantidades variables de una disolución de Fe patrón de 10 ppm enrasándose a 50 ml con agua desionizada y midiendo la AA, obteniéndose los siguientes datos: ml Fe AA 0,040 0,062 0,081 0,102 0,135 Hay que pasarlos a ppm Calcular la ecuación de la recta de regresión y la concentración (ppm) de Fe en el vino AA m = 0,023 b = 0,038 CC = 0, ppm V.10 = 50 ppm y = b + mx y = 0 x = -b / m ppm = -0,038 / 0,023 ppm = 1,65 V inicial C inicial = V final C final 10 x ppm = 50 x 1,65 R.- 8,26 ppm MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO OBJETIVO: -minimizar fluctuaciones instrumentales -establecer referencias con fines cualitativos y cuantitativos. Estándar o patrón interno diferente al de la calibración convencional. PROCEDIMIENTO Supongamos una muestra que contiene el analito X que queremos determinar, el procedimiento consiste en: 1.- Preparar mezclas conocidas del patrón interno (I) y de los patrones del analito/os a determinar (X) para construir una curva patrón. El patrón interno es una cantidad conocida de un compuesto o elemento, no presente en la matriz de la muestra, que se adiciona tanto a los estándares como a la muestra problema

8 2.- Cuando una cantidad conocida de patrón se agrega a una muestra problema, la curva de calibrado puede utilizarse para hallar la concentración del problema. 3.-Las fluctuaciones en la señal afectan por igual al analito y al patrón pero no a la relación. Señal debida X Señal debida I Y X I Concentración X Concentración I Características del patrón interno -compatibilidad (p.e. solubilidad) con la muestra y el patrón -características químicas y fisico-químicas similares al analito -respuesta discriminada respecto del analito Se determina mediante HPLC la concentración de ácido acetilsalicílico (AAS) y Cafeína (CAF) en comprimidos analgésicos usando ácido salicílico (AS) como estándar interno. Para ello se preparan una serie de patrones con concentraciones conocidas de AAS y CAF, se les añaden 100 ml de metanol y 10 ml de una disolución estándar de p.i. y se enrasan a 250 ml obteniéndose los siguientes resultados Una muestra de un comprimido analgésico se patrones AAS(mg) CAF(mg) H AAS /H AS H CAF /H AS coloca en un matraz de 250 ml, se disuelve en ,5 10,6 100 ml de metanol, se le añaden 10 ml del p.i. y se filtra. El análisis de esta muestra da una ,1 23,0 relación de alturas de picos de 23,2 para AAS ,9 36,8 y 19,7 para CAF. Calcular los mg de AAS y CAF en el comprimido Se determina mediante HPLC la concentración de ácido acetilsalicílico (AAS) y Cafeína (CAF) en comprimidos analgésicos usando ácido salicílico (AS) como estándar interno. Para ello se preparan una serie de patrones con concentraciones conocidas de AAS y CAF, se les añaden 100 ml de metanol y 10 ml de una disolución estándar de p.i. y se enrasan a 250 ml obteniéndose los siguientes resultados Una muestra de un comprimido analgésico se patrones AAS(mg) CAF(mg) H AAS /H AS H CAF /H AS coloca en un matraz de 250 ml, se disuelve en ,5 10,6 100 ml de metanol, se le añaden 10 ml del p.i. y se filtra. El análisis de esta muestra da una ,1 23,0 relación de alturas de picos de 23,2 para AAS ,9 36,8 y 19,7 para CAF. Calcular los mg de AAS y CAF en el comprimido H AAS /H AS m = 0,104 b = -0,5 CC = 0,998 H CAF /H AS m = 0,655 b = -2,73 CC = 0,999 mg AAS mg CAF y = m x + b y = m x + b 23,2 = 0,104 x -0,5 17,9 = 0,655 x -2,73 x = 288 mg / comprimido x = 31,5 mg / comprimido

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