11 Número de publicación: Int. Cl.: 74 Agente: Carpintero López, Francisco

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 3/76 (06.01) A61P 31/12 (06.01) A61P 3/00 (06.01) A61P 37/00 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Uso de cepas de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos antivirales y medicamentos contra el cáncer. Prioridad: DE DE Titular/es: AiCuris GmbH & Co. KG. Aprather Weg 18a Wuppertal, DE 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Fecha de la publicación del folleto de la patente: Inventor/es: Weber, Olaf; Schlapp, Tobias; Siegling, Angela; Knorr, Andreas; Hirth-Dietrich, Claudia; Theiss, Gudrun y Volk, Hans-Dieter 74 Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Uso de cepas de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos antivirales y medicamentos contra el cáncer. La presente invención se refiere al uso de una cepa de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos para uso en hombres y animales como producto inmunoterapéutico en inmunodeficiencias infecciosas o de naturaleza no infecciosa, así como para el tratamiento de enfermedades tumorales, infecciones virales y las enfermedades asociadas a las mismas. La presente invención se refiere además al uso de una cepa de Parapoxvirus ovis para la preparación de presentaciones farmacéuticas para uso como productos inmunoterapéuticos o productos inmunoprofilácticos en la metafilaxis de estrés para la reducción o la prevención de enfermedades infecciosas después de estrés (por ejemplo, operaciones); para uso en la profilaxis de infección para la reducción o la prevención de enfermedades infecciosas mediante la administración antes de operaciones o intervenciones (por ejemplo, antes de implantes de prótesis o antes de intervenciones dentales); para uso en la metafilaxis de infección o terapia aguda o crónica de infecciones virales, por ejemplo, del tracto respiratorio, de infecciones por papilomavirus, de infecciones por herpesvirus, de infección por VIH, de infección viral de órganos internos como, por ejemplo, de infección por virus de la hepatitis, en los que en el marco de la invención se usa como cepa de Parapoxvirus ovis la cepa NZ2. Pueden usarse además los descendientes obtenidos mediante pasada y/o adaptación a células determinadas, por ejemplo, WI-38, MRC- o células Vero de esta cepa, o partes o fragmentos de virus de esta cepa o sus descendientes. Por partes han de entenderse segmentos genómicos o subgenómicos expresados mediante vectores adecuados, por ejemplo, Vaccinia, en sistemas adecuados, por ejemplo, cultivos celulares de fibroblastos. Por fragmentos se entienden las fracciones obtenidas mediante purificación bioquímica, por ejemplo mediante cromatografía, por ejemplo, las partículas disgregadas físicamente mediante la acción de ultrasonidos. La presente invención se refiere además al uso de la cepa citada de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas. Además, la invención se refiere al uso de la cepa citada de Parapoxvirus ovis en combinación con otros agentes para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para terapia antiviral o del cáncer. Es conocido que las infecciones virales persistentes latentes y crónicas pueden activarse o reactivarse mediante una inmunosupresión, o a la inversa, que el sistema inmune expresa la enfermedad aguda que puede estar causada por un virus que está latente (por ejemplo, recurrir una infección por herpesvirus latente por inmunosupresión: ampollas labiales por estrés o administración de cortisona). Es conocido además que las infecciones virales persistentes y latentes crónicas son difícilmente o nada en absoluto sensibles a terapia con sustancias antivirales convencionales de bajo peso molecular. Una razón para ello puede ser la actividad enzimática viral ausente en dichas infecciones (por ejemplo, la falta de una actividad polimerasa viral que debe incorporar primero un inhibidor nucleosídico al ácido nucleico viral, para que éste pueda conducir, por ejemplo, a la interrupción de cadena en el ADN viral; por ejemplo, la falta de una actividad timidina quinasa viral que, por ejemplo, debe fosforilar primero un compuesto antiviral, para que pueda activarse éste) o también la falta de reconocimiento de células infectadas o degeneradas, por ejemplo, células cancerosas o antígenos antivirales por el sistema inmune del huésped. Es igualmente conocido que en infecciones virales persistentes crónicas una superinfección por otro virus puede conducir a efectos antivirales dirigidos contra el virus persistente crónico 1). Pudo mostrarse por los autores 1) la dependencia de este efecto de interferones como IFN-γ y TNF-α, que se secretan por células T, células asesinas naturales y macrófagos. Los resultados de estos autores confirmaron otro estudio anterior en el que se mostraba que células T citotóxicas restringidas a la clase I podían inhibir la expresión génica de HBV hepatocelular en ratones transgénicos HBV, que este proceso se desarrollaba sin destrucción de células hepáticas y que el proceso estaba provocado por TNF-α e IFN-γ 2). En la práctica veterinaria, se utiliza terapéutica, meta y profilácticamente desde hace mucho tiempo un producto para la inducción de inmunidad paraespecífica denominado inductor de parainmunidad. Los inductores de parainmunidad están compuestos, por ejemplo, por Parapoxvirus ovis inactivados químicamente, cepa D1701 (documento DE ). Un producto preparado basándose en este virus (Parapoxvirus ovis cepa D1701) es BAYPAMUN. El parapoxvirus inactivado induce en el animal una protección inespecífica contra infecciones por los agentes más distintos. Se supone que esta protección está mediada por distintos mecanismos del sistema de defensa propio del organismo. Entre estos mecanismos se cuentan la inducción de interferón, la activación de células asesinas naturales, la inducción de actividad estimuladora de colonias (CSA), así como la estimulación de la proliferación de linfocitos. Las investigaciones anteriores del mecanismo de acción mostraron la estimulación de interleucina 2 e interferón-α 3). 2

3 2 3 4 Por estos motivos, se propone por tanto el objetivo de mejorar además la utilidad terapéutica del notable efecto de Parapoxvirus ovis de forma de que aumente cualitativamente la inducción citada generalizada descrita anteriormente de una respuesta inmune paraespecífica de Parapoxvirus ovis cepa D1701, y de mejorar de forma de que mediante el uso de menores dosis puedan conseguirse mejores efectos antivirales o antitumorales. Esto permite esperar adicionalmente un efecto pobre en efectos secundarios. Era por tanto objetivo de la invención mejorar el efecto inmunológico del Parapoxvirus. El objetivo se consigue mediante el uso de las cepas citadas anteriormente de Parapoxvirus ovis en lugar de la cepa D1701 usada convencionalmente. La presente invención se refiere al uso de virus que pertenecen taxonómicamente a la cepa NZ2 de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos contra infecciones virales y cáncer en hombres y animales. La invención se refiere además al uso de descendientes de la cepa según la invención obtenidos mediante pasada o adaptación a sistemas celulares adecuados como, por ejemplo, células humanas como WI-38, MRC-, células de mono, por ejemplo, células Vero, células bovinas como, por ejemplo, BK-KI3A47/Reg o MDBK, y células ovinas como MDOK, para la preparación de medicamentos contra infecciones virales y cáncer en hombres y animales, y además tiene como objeto el uso de partes o fragmentos de la cepa citada y sus variantes de pasada o adaptación, en las que por partes ha de entenderse segmentos genómicos o subgenómicos expresados mediante vectores adecuados como virus Vaccinia en sistemas adecuados como cultivos celulares de fibroblastos, y por fragmentos las fracciones obtenidas mediante purificación bioquímica como cromatografía de las partículas virales expresadas o físicamente disgregadas para la preparación de medicamentos contra infecciones virales y cáncer en hombres y animales, y además tiene como objeto el uso de la cepa de Parapoxvirus ovis y derivados desarrollados como se describe anteriormente para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas como productos inmunoterapéuticos o inmunoprofilácticos en infecciones virales agudas y crónicas del tracto respiratorio y de los órganos internos, y además tiene como objeto el uso de la cepa y los derivados desarrollados para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para la metafilaxis de estrés y para impedir o prevenir enfermedades infecciosas después de estrés así como en la profilaxis de infección en el marco de operaciones e intervenciones dentales, y además tiene como objeto el uso de la cepa y los derivados desarrollados para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para uso en la metafilaxis de infección o terapia de infecciones virales agudas y crónicas, por ejemplo, del tracto respiratorio, de infecciones por papilomavirus, de infección por virus del grupo del herpes, de infección por VIH, de infección por virus de órganos internos como, por ejemplo, de infección por virus de la hepatitis, y además tiene como objeto el uso de la cepa y los derivados desarrollados para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para uso contra el cáncer, y además tiene como objeto el uso de la cepa y los derivados desarrollados a partir de la misma en combinación con otros agentes para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para terapia antiviral o del cáncer en hombres y animales. Es un objeto preferido de la invención el uso de la cepa de Parapoxvirus ovis en combinación con otros agentes para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para administración oral y/o en una formulación gastrorresistente para administración oral. La NZ-2 de Parapoxvirus ovis aquí citada se depositó el de julio de 01 en la European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Reino Unido. El número de depósito es ECACC Se ha encontrado, por ejemplo: 1. Análisis de la actividad terapéutica en ratones transgénicos de virus de hepatitis B 0 Para el ensayo de prueba de concepto, se usaron ratones transgénicos de virus de hepatitis B (cepa HBV 1.3 X tg). Se usaron 7 animales masculinos de 8 a semanas de edad en cada grupo. La administración de las distintas dosis se realizó por vía intraperitoneal en un volumen de 0, ml el día 1 (comienzo del experimento) y el día 4. Para la administración se prepararon las siguientes diluciones de cada una de las cepas virales para los grupos de dosis individual: 1ª dosis: 1, x 6 DICT 0 2ª dosis: x DICT 0 3ª dosis: 1, x DICT 0 4ª dosis: x 4 DICT 0 6 Como control de placebo sirvió PBS estéril libre de pirógenos. La concentración de los virus se realizó del siguiente modo: se ajustaron a la misma titulación viral 00 ml de 3

4 sobrenadante de Parapoxvirus ovis cepa NZ2 (titulación de aprox. 2 x DICT 0 /ml) y Parapoxvirus ovis cepa D1701 (titulación 1 x 7 DICT 0 /ml). Para ello, se utilizó una ultracentrífuga Beckmann (rotor SW28 a rpm, 3 horas, 4ºC). Después de la centrifugación, se ajustaron los sedimentos con volúmenes correspondientes de medio de dilución a una titulación de 1 x 7 DICT 0 /ml. Se usaron alícuotas de las dosificaciones correspondientes para una retitulación controlada que confirmó la titulación de estas dosificaciones. Se inactivaron las correspondientes dosis después de extracción de la alícuota de control durante 1 h a 6ºC. Medio diluyente: ml de EMEM x 2,7 ml de bicarbonato 2 g/l 1 ml de glutamina al 1% 86,3 ml de agua bidestilada. 2 3 El día, se sacrificaron indoloramente los animales y se extrajo el hígado y la sangre. Se procesaron aproximadamente mg de hígado de cada animal con QIAamp Tissue Kit (Qiagen, Hilden), se determinó la concentración del ADN fotométricamente y se controló electroforéticamente la integridad en gel de agarosa al 1%. El ADN se hibridó en un procedimiento de hibridación de transferencia por puntos con una sonda específica de HBV. Antes de ello, se trató el ADN con ARNasa A (Qiagen, Hilden) para excluir las señales provocadas por ARN. Se añadieron 0 µl de ADN ( µg) a una membrana de nailon (Boehringer Mannheim), se trataron 4 veces durante 3 minutos respectivamente con remojo I (NaOH 0, N, NaCl 1 M) y dos veces con remojo II (NaCl 3 M, Tris-HCl 0, M, ph 7,4), se calentó a 1ºC durante media hora y se prehibridó a continuación con un tampón de hibridación patrón ( x SSC, 0,1% de N-lauroilsarcosina p/v; 0,02% de SDS; reactivo de bloqueo 1x y ADN de esperma de pescado 0 µg/ml) sin sonda durante minutos a ºC. A continuación de esta etapa, se realizó la hibridación con una sonda cebada oligonucleotídica aleatoria que contiene el genoma de HBV completo (tampón de hibridación - ng/ml). Se lavó el filtro después durante minutos a 64ºC en 4 x SSC/0,1% de SDS, 2 x SSC/0,1% de SDS y 1 x SSC/0,1% de SDS. Se realizó la detección inmunológica con el sistema CDP-Star (Boehringer Mannheim) correspondientemente a las instrucciones del fabricante. Para la evaluación se usó un LumiImager (Boehringer Mannheim). Se realizó la cuantificación de ADN específico de HBV en la sangre mediante PCR cuantitativa. En primer lugar, se obtuvo el plasma mediante centrifugación de la sangre-edta. Se purificó el ADN mediante el HighPure 16 System Viral Nucleic Acid Kits (Boehringer Mannheim) y se analizaron mediante PCR cuantitativa con el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems) las señales específicas de HBV. Se utilizaron los siguientes cebadores y sondas: ayw-70f (con sentido): ayw-670r (sin sentido): Sonda: -CTGTACCAAACCTTCGGACGG-3 -AGGAGAAACGGGCTGAGGC ayw-613t: -CCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATT-3 Se amplificó el ADN en 0 µl de volumen de reacción (la reacción contenía 1,4 mm de cada dntp, MgCl 2 4,7 mm, pmol de cada uno de cebadores y sonda, µl de tampón PCR x [todos los reactivos de PCR procedían del kit de reactivos básico TaqMan; Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.] y 1,2 U de ADN polimerasa Taq y 0,2 U de Amp Erase. Después de una etapa inicial de desnaturalización ( min a 9ºC), se expusieron las muestras a ciclos de desnaturalización (9ºC, s) y asociación/extensión (6ºC, 1min). El análisis de los productos se realizó con el software estándar del sistema de detección de secuencia ABI PRISM Se realizó un análisis histoquímico mediante anticuerpos contra el antígeno central del virus de la hepatitis B (Dako). Para ello, se fijaron partes de un lóbulo hepático durante una noche con formaldehído al 4%, se embebieron en parafina y se cortaron ( µm). Después de la desparafinización y rehidratación, se inactivó la actividad peroxidasa endogénica con H 2 O 2 al 3% durante un intervalo de minutos. Se bloqueó la unión inespecífica con suero ovino normal. A continuación, se incubaron los cortes durante minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo diluido 1:00. Todas las etapas siguientes se llevaron a cabo con el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories) como se describe por el fabricante. La inmunoreacción se visualizó con tetracloruro de 3,3-diaminobencidina y peróxido de hidrógeno. Se tiñeron por contratinción los cortes con hematoxilina/eosina. Se realizaron los análisis estadísticos de los resultados mediante análisis de varianza y comparación post-hoc. Se constató sorprendentemente en el resultado que mediante el uso de la cepa NZ2 se consigue un aumento del efecto antiviral en comparación con la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis conocida. Por ello, es posible por primera vez 4

5 inducir con ayuda de Parapoxvirus ovis la compleja capacidad del sistema inmune con una potencia que se diferencia significativamente de la potencia de acción de los inductores de parainmunidad conocidos hasta ahora. 2 Sorprendentemente, se han obtenido los siguientes resultados: Hígado: En animales tratados con NZ2 se constató una reducción significativamente mayor del ADN específico de HBV en comparación con los animales tratados con D1701. En comparación con D1701, NZ2 es más potente en su actividad antiviral: en el grupo de dosis más alta, la administración de NZ2 reduce el ADN específico de HBV en un factor mayor de 4 mejor que la administración de la misma cantidad de D1701, en el grupo de dosis más baja, en un factor de 7. En plasma, la administración de NZ2 reduce el ADN específico de HBV en el grupo de dosis menor en un factor mayor de mejor que la administración de la misma cantidad de D1701. Por ello, se ha mostrado que la actividad terapéutica de la cepa NZ2 de Parapoxvirus ovis es significativamente mejor que la de la cepa D1701. En las figuras, se muestra la reducción de las señales específicas de HBV en comparación con el grupo de placebo (éste se equiparó con 0%). La Figura 1 muestra los resultados del tratamiento de ratones transgénicos HBV con la cepa D1701 o NZ2. El ADN específico de HBV se reduce significativamente en el hígado en todos los grupos de dosis en ambas cepas en comparación con el grupo de placebo, pero más mediante la cepa NZ2. En las dos dosificaciones más bajas de NZ2, se presenta una reducción significativamente mayor del ADN específico de HBV que en los grupos de dosis de D1701 equivalentes. En la Figura 2, se muestra el resultado del tratamiento de ratones transgénicos HBV con la cepa D1701 o NZ2 en el plasma. El ADN específico de HBV se reduce significativamente en el plasma en todos los grupos de dosis en ambas cepas en comparación con el grupo de placebo, pero más mediante la cepa NZ2. En contraposición con la dosificación de NZ2 más baja, la dosis más baja de la cepa D1701 no actúa ya de forma significativamente antiviral. 2. Inducción de citocinas Se mantuvieron ratones Balb/c hembra de 7 a 8 semanas de edad en condiciones estériles y se usaron para el ensayo. Se asignaron aleatoriamente los animales y se distribuyeron respectivamente en grupos de 6 animales. Se usó el siguiente esquema de tratamiento: 3 Grupo 1: Grupo 2: Grupo 3: Grupo 4: Grupo : Grupo 6: Placebo Parapoxvirus ovis cepa D1701; x 4 DICT 0 /dosis Parapoxvirus ovis cepa NZ2; x 4 DICT 0 /dosis Placebo Parapoxvirus ovis cepa D1701; x 4 DICT 0 /dosis Parapoxvirus ovis cepa NZ2; x 4 DICT 0 /dosis El volumen de administración ascendió a ml/kg, la administración se realizó por vía intraperitoneal. 6 horas después de la administración, se sacrificaron los animales de los grupos 1 a 3, 12 horas después de la administración los animales de los grupos 4 a 6. Se obtuvieron células peritoneales mediante lavado con PBS enfriado con hielo, así como se aislaron nódulos linfáticos portales y mesentéricos. Se concentraron las células peritoneales mediante una etapa de centrifugación ( min a rpm a temperatura ambiente en una centrífuga de sobremesa Eppendorf), a continuación se recogieron con 0,2 ml de tampón de lisis (disolución de lisis: citrato de sodio 2 mm, isotiocianato de guanidinio 4 M, 0,% de N-lauroilsarcosina), se congelaron rápidamente y se dispusieron a -7ºC hasta la preparación de ARN. La preparación de ARN total se realizó mediante extracción ácida con fenol/cloroformo. Para ello, se descongelaron a temperatura ambiente las muestras congeladas en tampón de lisis y se mezclaron para extracción con las siguientes disoluciones: 1/ de volumen de tampón de lisis de acetato de sodio 2 M (ph 4,0), 1 volumen de tampón de lisis de fenol saturado de agua, 1/ de volumen de tampón de lisis de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Se mezcló esta preparación durante segundos en un vórtex y a continuación se acondicionó térmicamente durante minutos con hielo. Se realizó la separación de fases mediante centrifugación a.36 g y a 4ºC durante minutos. Después, se transfirió la fase acuosa a un nuevo recipiente y, para aislamiento del ARN que se encuentra en esta fase, se añadieron 8 ml de RNA-MATRIX del kit Rnaid plus (DIANOVA) y se incubó durante minutos a temperatura ambiente. Se sedimentó el complejo ARN/RNA-MATRIX formado mediante centrifugación a g y se desechó el sobrenadante. Se lavó el sedimento a continuación 2 x con ml de RNA-WASH (DIANOVA) cada vez, y después del último lavado se secó mediante centrifugación a vacío. Se eluyó el ARN mediante la adición de - ml de agua destilada libre de ARNasa mediante acondicionamiento térmico a ºC durante minutos. Después de centrifugación

6 a g y a temperatura ambiente durante 1 minuto, se separó la matriz mediante transferencia de la disolución de ARN a un nuevo recipiente. Se ensayó la calidad del ARN mediante electroforesis en gel. Se dispuso el ARN a -70ºC. Se realizó la síntesis de ADNc mediante transcripción inversa del ARNm usando cebadores de oligo(dt) como moléculas iniciadoras para la polimerización. En la preparación de síntesis, estaban presentes los siguientes componentes: 0 ng-2 µg de ARN total, 2 µl de transcriptasa inversa M-MLV (0 U/µl) (GIBCO/BRL), 8 µl del tampón x RT asociado (GIBCO/BRL), 1 µl de DTT (0,1 M) (GIBCO/BRL), 4 µl de dntp (2, mm) (SIGMA), 2 µl de cebador oligo(dt)12-18 (0 µg/ml) (PROMEGA), 1 µl de inhibidor de ARNasa placental humana (.000 U/ml) (GIBCO/BRL) y agua hasta µl de volumen total. La preparación se acondicionó térmicamente durante minutos a temperatura ambiente y a continuación se incubó durante 4 minutos a 37ºC, después se calentó durante 3 minutos a 9ºC y enseguida se enfrió con hielo. Se dispuso el ADNc sintetizado de este modo a -ºC. Se estandarizaron las cantidades de ADNc mediante un gen doméstico (β-actina). La PCR cuantitativa se llevó a cabo con el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems). Se utilizaron los siguientes cebadores: β-actina con sentido: -TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3 sin sentido: -TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G3 IFN-γ con sentido: -AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG sin sentido: -GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3 TNF-α con sentido: -GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3 sin sentido: -ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3 IL- con sentido: -GCC AAC TGG ATA GAT GTA AGA TAT GAC CT-3 Sin sentido: -CGT GTT GAT GAA CAT TTG GAC AAT GCG TAT-3. Se amplificó el ADN en 2 µl de volumen de reacción (la reacción contenía 1,4 mm de cada dntp, MgCl 2 4 mm, 0,3 µmol de cada uno de cebadores y sondas, 2, µl de tampón PCR x con SYBR Green [todos los reactivos PCR procedían del kit reactivo básico SYBR Green PCR; Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.] y 1,2 U de ADN polimerasa Taq y 0,2 U de Amp Erase. Después de una etapa inicial de desnaturalización (9ºC durante min), se expusieron las muestras a ciclos de desnaturalización (9ºC, s) y asociación/extensión (ºC, 1, min). El análisis de los productos se realizó con el software estándar del sistema de detección de secuencia ABI PRISM Los análisis estadísticos de los resultados se realizaron con análisis de varianza y comparación post-hoc. Sorprendentemente, se obtuvieron los siguientes resultados: Se indujo la expresión de interferón-γ después de tratamiento con la cepa D1701 o la cepa NZ2 6 y 12 horas después de la administración (Figura 3). Esta inducción es significativamente mayor en la cepa NZ2, tanto frente al placebo como frente a la cepa D1701. El nivel observado, después de la administración de D1701, de expresión del interferón-γ no es significativo frente al control de placebo. Se representan los valores que se midieron en células obtenidas mediante lavado peritoneal. 2. Se indujo la expresión de TNF-α 12 horas después de tratamiento con la cepa D1701 o 6 y 12 horas después del tratamiento con la cepa NZ2 después de la administración (en la que después de 12 horas puede constatarse ya una caída en comparación con el valor de 6 horas; Figura 4). Esta inducción es a las 6 horas después de la administración de la cepa NZ2 significativamente mayor en comparación con la cepa D1701. Se representan los valores que se midieron en células obtenidas mediante lavado peritoneal. 3. Se indujo la expresión de IL- después de tratamiento con la cepa D1701 o con la cepa NZ2 6 y 12 horas después de la administración (Figura ). Esta inducción es a las 6 horas después de la administración de la cepa NZ2 significativamente mayor en comparación con la cepa D1701 o placebo. El nivel observado, después de administración de D1701, de expresión de IL- no es significativo con respecto al control de placebo. Se representan los valores que se midieron en células obtenidas mediante lavado peritoneal. 3. Análisis de la actividad terapéutica en ratones desnudos portadores de tumor 6 Se cultivaron células MDA-MB231 (ATCC Nº HTB26) en medio completo (DMEM 88, % de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina (respectivamente de Gibco Life Technologies)) a 37ºC y % de CO 2 en un incubador. El día del transplante, las células eran confluentes hasta aproximadamente 70%. Se tripsinizaron las células, se lavaron con HBSS, se contaron y se ajustaron a 2, x 7 células/ml con PBS preenfriado. Se usaron 6

7 ratones desnudos NCr hembra (tacónicos). Los ratones tenían entre 8 y semanas de edad y pesaban aprox. 22 g. Todas las manipulaciones en los animales se llevaron a cabo en condiciones estériles. Se inyectaron por vía subcutánea x 6 células en un volumen total de 0,2 ml en la región del flanco. Después, se mantuvieron los ratones otros siete días hasta los tumores alcanzaron una masa media de aprox. 80 mg. Se midieron los tumores y se distribuyeron los ratones aleatoriamente en tres grupos de diez animales respectivamente. Los grupos individuales recibieron la siguiente administración: Grupo 1: Grupo 2: Grupo 3: Placebo (PBS) Parapoxvirus ovis cepa D1701 Parapoxvirus ovis cepa NZ2 2 3 Se administró D1701 a una dosis de 2, x DICT 0, NZ2 a una dosis de 1 x DICT en total, respectivamente cuatro veces separadas respectivamente tres días. Se midieron los tumores dos veces por semana. Se determinaron las significaciones mediante el test de Student. La Figura 6 muestra el tamaño medio de los tumores (en miligramos) en animales de los grupos 1 a 3 durante el tiempo de ensayo (en días). (Símbolos: grupo 1, círculo; grupo 2, triángulo; grupo 3, cuadrado). Sorprendentemente, se ha encontrado en el sistema experimental una actividad dirigida contra tumores significativa en comparación con el grupo de control (p<0,0). A este respecto, la cepa NZ2 mostró ser claramente más potente que la cepa D1701. Para conseguir el mismo efecto, fue necesario sólo aproximadamente la mitad de cantidad de NZ2 en comparación con D1701. Este descubrimiento prueba claramente la actividad terapéutica de las preparaciones virales según la invención en ratones desnudos portadores de tumor. Los ratones desnudos son inmunodeficientes y no disponen de células T funcionales. La actividad dirigida contra los tumores depende supuestamente en el sistema experimental mediante los clientes naturales (NK), otras células y el efecto directo de citocinas/quimiocinas. En un sistema inmune completo e intacto habría que suponer que la mejor actividad de NZ2 fuera aún más claramente evidente. 4. Diferencias biológicas adicionales entre NZ2 y D1701 Se ha encontrado que el parapoxvirus NZ2, en contraposición con la cepa D1701, es continuamente pasable sobre líneas celulares humanas. Esto muestra diferencias fundamentales en el comportamiento de replicación y/o en los receptores virales de NZ2 y D1701. La adaptación a líneas celulares humanas es un requisito importante para la producción de cepas virales sobre líneas celulares humanas a) Capacidad de pasada continua sobre células MRC- humanas Se representa en la Figura 7 un ensayo de adaptación de las cepas NZ2 y D1701 a la línea celular diploide humana MRC-. MRC- es adecuada para la producción de principios activos biológicos y vacunas. Las cepas se utilizaron con la misma titulación de partida y se prosiguieron los correspondientes sobrenadantes de cultivo celular durante pasadas en células MRC-. Se representa la titulación de las muestras de los sobrenadantes de las células MRC- infectadas respectivamente en DICT 0 frente al número de pasada. Únicamente la cepa NZ2, pero no la D1701, era titulable de nuevo sobre cultivos de células renales bovinas (BK clon 3a). Esto señala las diferencias biológicas principales de ambas cepas en el comportamiento de infección y replicación. Al mismo tiempo, este resultado muestra que NZ2 puede reproducirse en un espectro más amplio de células que D1701, lo que proporciona la posibilidad de un procedimiento de producción basado en células humanas. 4.b) Capacidad de pasada de NZ2 y D1701 sobre células WI-38 y células BK clon 3a 6 Se muestran también claramente las diferencias biológicas esenciales entre las cepas NZ2 y D1701 mediante los experimentos representados en la Figura 8 y la Figura 9. La Figura 8 muestra la titulación viral en los ensayos de pasada de D1701 sobre células bovinas BK clon 3a y sobre células WI-38 humanas frente al número de pasadas. Se observa que D1701 puede pasarse continuamente sobre células BK clon 3a, pero no sobre células WI-38 humanas. Se comporta de forma distinta la cepa NZ2. Esta cepa puede pasarse continuamente durante varios días tanto sobre células BK clon 3a como sobre células WI-38 (Figura 9). 7

8 También estos resultados señalan las claras diferencias en el comportamiento de infección y replicación de NZ2 y D c) Efecto dependiente de la dosis de NZ2 en el ensayo de infección por herpesvirus después de pasada sobre WI-38 Para investigar las propiedades inmunoestimulatorias de cepas NZ2 que se han pasado sobre células WI-38, se llevaron a cabo ensayos de infección por herpesvirus en ratones. Se trataron tres grupos respectivamente de animales de ensayo respectivamente con 1 x 4 DICT 0, x 4 DICT 0 y 1 x DICT 0, un grupo de control recibió un placebo. Se representa la tasa de supervivencia de los cuatro grupos de ensayo en la Figura frente al tiempo después de la infección por herpesvirus. Sorprendentemente, se constata que NZ2 no ha perdido sus propiedades inmunoestimulatorias mediante la pasada sobre células WI-38. Todos los resultados experimentales de este ejemplo señalan las diferencias biológicas fundamentales en el comportamiento de infección y replicación de NZ2 y D1701. Sorprendentemente, se ha encontrado que la preparación de NZ2 para uso como inmunomodulador en contraposición con D1701 no está ligada a células renales bovinas como línea celular de producción. Basándose en la conocida relación de la influencia de una respuesta inmune Th1 sobre infecciones virales persistentes latentes y crónicas 4,), así como enfermedades proliferativas, por ejemplo cáncer 8,9) y las mejores propiedades inmunomodulatorias en comparación con Parapoxpvirus ovis cepa D1701 de Parapoxvirus ovis cepa NZ2, es posible el uso de inmunomoduladores basados en Parapoxvirus ovis cepa NZ2 o una de las cepas anteriormente citadas como monoterapia o en combinación con compuestos biológicos activos de bajo peso molecular, por ejemplo antivirales, en hombres y animales, y de utilidad terapéutica para la terapia antiviral de infecciones por el virus de la hepatitis B; el virus de la hepatitis C o todos los demás agentes del grupo de virus causantes de la hepatitis, así como otras infecciones virales de los órganos internos, así como infecciones, también acompañadas de otras enfermedades, por los distintos tipos de herpesvirus simplex (HSV), los distintos tipos de papilomavirus humano (HPV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la varicela zóster, el citomegalovirus humano (HCMV), así como las correspondientes enfermedades virales en animales. Además, pueden llevarse a cabo con las cepas anteriormente citadas de Parapoxvirus ovis, debido al mecanismo de acción mostrado, especialmente los siguientes prometedores tratamientos profilácticos o terapéuticos: El impedimento de la recurrencia en infecciones por herpesvirus, la metafilaxis, es decir, el impedimento del establecimiento de infecciones virales (por ejemplo VIH) cuando se trata inmediatamente después de la exposición al agente 7). Es igualmente posible el tratamiento del cáncer debido al mecanismo de acción 8,9). Según el problema clínico, se administra el producto terapéutico basado en Parapoxvirus por vía sistémica, así, por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, oral o local. El Parapoxvirus se presenta a este respecto purificado y liofilizado y/o se suspende inmediatamente antes de la administración en un disolvente adecuado, o se presenta en otra formulación adecuada, o se presenta en una forma de administración gastrorresistente u otra forma de administración oral. Pueden prepararse igualmente preparaciones adecuadas mediante pasada y/o adaptación en células determinadas, por ejemplo, WI-38, MRC- o células Vero, descendientes obtenidos a partir de NZ2 y las demás cepas citadas o partes o fragmentos de NZ2 y las demás cepas citadas o estos descendientes. Por partes han de entenderse segmentos genómicos o subgenómicos expresados mediante vectores adecuados, por ejemplo Vaccinia, en sistemas adecuados, por ejemplo, cultivos celulares de fibroblastos. Por fragmentos se entienden las fracciones obtenidas mediante purificación bioquímica, por ejemplo mediante cromatografía, por ejemplo, las partículas disgregadas físicamente mediante la acción de ultrasonidos. Pueden ser necesarias a este respecto varias administraciones o un tratamiento a largo plazo que corresponda a los requisitos del problema clínico. 6 Así, se muestra como especialmente prometedor en la terapia del cáncer, por ejemplo (pero sin limitaciones), la aplicación según el siguiente esquema: Administración intramuscular de respectivamente 6 a 7 DICT 0 (dosificación infecciosa de cultivo de tejido) durante 4 semanas cada 3 días seguida de 2 semanas de pausa; de nuevo administración intramuscular de respectivamente 6 a 7 DICT 0 durante 4 semanas cada 3 días, seguida de 2 semanas de pausa; de nuevo administración intramuscular de respectivamente 6 a 7 DICT 0 durante 4 semanas cada 3 días, seguida de 2 semanas de pausa; según el grado de gravedad y el éxito de la curación, pueden completarse estos ciclos con ciclos adicionales; como alternativa, puede indicarse también un esquema en el que se administra la formulación cada 3 a días durante al menos 3 meses. En infección viral crónica, se administran, por ejemplo, 6 a 7 DICT 0 de la formulación por vía subcutánea en la zona del vientre o por vía intramuscular en la zona del deltoides o el cuadriceps cada 3 días, en total veces. Pueden realizarse desviaciones de este esquema correspondientes a las necesidades que surjan a partir de la enfermedad. Para 8

9 la profilaxis de resfriados, ha de gargarizarse la formulación y repetir diariamente esta aplicación mientras que exista riesgo de contagio. Para la prevención de infecciones después de intervenciones oroquirúrgicas (por ejemplo, operaciones dentales), ha de gargarizarse la víspera de la intervención durante 1-2 min. Bibliografía 1. Guidotti, L.G., Borrow, P., Hobbs, M.V., Matzke, B., Gresser, J., Oldstone, M.B.A. y Chisari, F.V. (1996): Viral cross talk: Intracellular activation of the hepatitis B virus during an unrelated viral infection of the liver, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: Guidotti, L.G., Ando, K., Hobbs, M.V., Ishikawa, T., Runkel, L., Schreiber, R.D. y Chisari, F.V. (1994): Cytotoxic T lymphocytes inhibit hepatitis B virus gene expression by a noncytolytic mechanism in transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: Steinmassl, G., G. Wolf (1990): Bildung von Interlekin 2 und Interferon- durch mononukleäre des Schweines nach in vitro-stimulation mit verschiedenen Viruspräparaten, J. Vet. Med. B37,, P. Lucin, S., Jonjic, M., Messerle, B. Polic, H. Hengel, U.H. Koszinowski (1994): Late-Phase inhibition of murine cytomegalovirus replication by synergistic action of interferon gamma and tumor necrosis factor alpha, J. Gen. Virol. 7: 1-1; P.M.. Smith, R.M., Wolcott, R., Chervenak, S.R. Jennings (1994): Control of acute cutaneous herpes-simplex virus-infection- T-cell mediated viral clearance is dependent upon interferon gamma, Virology 2 (1): Y. Kawanashi, N. Hayashi, K. Katayama, K. Ueda, T. Takehara, E. Miyoshi, E. Mita, A. Kasahara, H. Fusamoto, T. Kamada (199): Tumor necrosis factor alpha and interferon gamma inhibit synergistically viral replication in hepatitis B virus replicating cells, J. Medical Virology 47 (3): Dhawan, S., L.M. Wahl, A. Heredia, Y.H. Zhang, J.S. Epstein, M.S. Meltzer, I.K. Hewlett (199): Interferon gamma inhibits HIV-induced invasiveness of Monocytes, J. Leukocyte Biology, 8 (6): J.F. Bromberg, C.M. Horvath, Z.L. Wen, R.D. Schreiber, J.E. Darnell (1996): Transcriptionally active stat1 is required for the antiproliferative effects of both interferon alpha and interferon gamma, PNAS 93 (): M. Klouche, H. Kirchner, F. Holzel (1994): Antiproliferative effects of interferon gamma in combination with alpha-difluoromethylornithine on human carcinoma cell cultures, J. Cancer Research and Clinical Oncology 1 (12):

10 REIVINDICACIONES Uso de virus que pertenecen taxonómicamente a la cepa NZ2 de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos contra infecciones virales y cáncer en hombres y animales. 2. Uso de descendientes de virus según la reivindicación 1 obtenidos mediante pasada o adaptación a sistemas celulares adecuados como, por ejemplo, células humanas como WI-38, MRC-, células Vero, células bovinas como BK-KI3A47/Reg o MDBK, y células ovinas como MDOK, para la preparación de medicamentos contra infecciones virales y cáncer en hombres y animales. 3. Uso de partes o fragmentos de virus según la reivindicación 1 ó 2, en el que por partes ha de entenderse segmentos genómicos o subgenómicos expresados mediante vectores adecuados, por ejemplo Vaccinia, en sistemas adecuados como, por ejemplo, cultivos celulares de fibroblastos, y por fragmentos se entiende las fracciones obtenidas mediante purificación bioquímica como cromatografía de partículas virales expresadas o disgregadas físicamente, y en el que las partes o fragmentos de los virus inducen una respuesta inmune paraespecífica, para la preparación de medicamentos contra infecciones virales y cáncer en hombres y animales. 4. Uso según una de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas como productos inmunoterapéuticos o en infecciones virales agudas y crónicas del tracto respiratorio y de los órganos internos.. Uso según una de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para impedir o prevenir enfermedades infecciosas después de estrés, así como en la profilaxis de infección en el marco de operaciones e intervenciones dentales. 6. Uso según una de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para uso en la metafilaxis de infección o la terapia de infecciones virales agudas del tracto respiratorio, de infecciones por papilomavirus, de infección por herpesvirus, de infección por VIH, de infección viral de órganos internos como, por ejemplo, la infección por virus de la hepatitis. 7. Uso según una de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para uso contra enfermedades proliferativas de los órganos internos, de la piel, de la sangre, del sistema nervioso central y sus anejos incluyendo los ojos, incluyendo el cáncer. 8. Uso según una de las reivindicaciones 1-3 en combinación con otros agentes para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para terapia antiviral o del cáncer en hombres y animales. 9. Uso según una de las reivindicaciones 1-3 en combinación con otros agentes para la preparación de medicamentos y preparaciones farmacéuticas para administración oral y/o en una formulación gastrorresistente para administración oral

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16 LISTA DE SECUENCIAS <1> Bayer AG <1> Uso de cepas de Parapoxvirus ovis para la preparación de medicamentos antivirales <1> Parapoxvirus ovis cepa NZ2 <1> <141> <1> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <2> 1 <211> 2 <213> Mus sp. <2> <223> cebador de beta-actina, sin sentido <0> 1 taaaacgcag ctcagtaaca gtccg 2 <2> 2 <211> 2 <213> Mus sp. <2> <223> cebador de beta-actina, con sentido <0> 2 tggaatcctg tggcatccat gaaac 2 <2> 3 <211> 26 <213> virus de la hepatitis B <2> <223> sonda HBV, ayw-613t <0> 3 ccatcatcct gggctttcgg aaaatt 26 <2> 4 <211> 19 <213> Virus de la hepatitis B <2> <223> cebador HBV, ayw-670r (sin sentido) <0> 4 aggagaaacg ggctgaggc 19 6 <2> <211> 21 1

17 <213> Virus de la hepatitis B <2> <223> cebador HBV, ayw-70f (con sentido) <0> ctgtaccaaa ccttcggacg g 21 <2> 6 <211> 24 <213> Mus sp. <2> <223> cebador IFN-gamma (sin sentido) <0> 6 gtcacagttt tcagctgtat aggg <2> 7 <211> 26 <213> Mus sp. <2> <223> cebador IFN-gamma (con sentido) <0> 7 agcggctgac tgaactcaga ttgtag 26 <2> 8 <211> <213> Mus sp. <2> <223> cebador IL- (sin sentido) <0> 8 cgtgttgatg aacatttgga caatgcgtat <2> 9 <211> 29 <213> Mus sp. <2> <223> cebador IL- (con sentido) <0> 9 <2> <211> 2 gccaactgga tagatgtaag atatgacct 29 2

18 <213> Mus sp. <2> <223> cebador TNF-alta (sin sentido) <0> acattcgagg ctccagtgaa ttcgg 2 <2> 11 <211> 2 <213> Mus sp. <2> <223> cebador TNF-alfa (con sentido) <0> 11 ggcaggtcta ctttggagtc attgc

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