Microanillos de Luz para Detectar Virus

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1 Por Carlos Angulo Barrios En los últimos meses una nueva enfermedad, la lamentablemente famosa gripe A causada por el virus H1N1, ha vuelto a alimentar el temor colectivo a una epidemia mundial causada por un virus devastador altamente contagioso capaz de diezmar la raza humana. Aunque pueda parecer exagerado, este miedo se fundamenta en casos reales ocurridos a lo largo de la historia. Los virus (de la palabra latina virus, toxina o veneno) causan muchas enfermedades humanas comunes, como resfriados, gripes, diarreas, varicela, sarampión o paperas. Algunas enfermedades víricas, como la rabia, la fiebre hemorrágica, la encefalitis, la poliomielitis, la fiebre amarilla o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), son mortales. Mientras que la rubeola y el citomegalovirus (un tipo de herpes) pueden provocar anomalías graves o la muerte en el feto. Se estima que hay entre y tipos de virus, de los que aproximadamente 250 son patógenos para el ser humano. No es de extrañar, por tanto, que éstos sean considerados como uno de los más formidables adversarios del hombre. Como ejemplo ilustrativo cabe mencionar que la Gran pandemia de gripe de 1918 (también conocida como gripe española ) mató a más de 25 millones de personas en todo el mundo en tan solo seis meses. Ahora que los virus se mueven de manera increíblemente rápida gracias a la explosión demográfica, los viajes en avión, los éxodos masivos de población por guerras o catástrofes naturales, y la ocupación humana de las selvas y los pantanos se requiere un mayor interés en estos pequeñísimos seres. Anticuerpos y antígenos Al producirse una infección vírica, los virus invaden las células sanas y las utilizan para reproducirse, tras lo cual las destruyen. Pero, cómo se defiende nuestro organismo de estos nocivos invasores? Ante la presencia de virus, el sistema inmunitario humano produce unas biomoléculas de defensa llamadas anticuerpos. La misión de estos miembros de las Fuerzas de Seguridad del cuerpo es identificar y neutralizar a los elementos patógenos. Esta identificación o reconocimiento ocurre mediante la unión del anticuerpo a una biomolécula, que forma parte del virus, llamada antígeno. Anticuerpo y antígeno encajan entre sí de manera perfecta y exclusiva como si se tratara de dos piezas de un puzzle. Este tipo de unión o encaje entre biomoléculas se conoce como reacción de afinidad. Una de las medidas preventivas más eficaces contra las enfermedades víricas es la vacuna. Ésta consiste en un preparado de antígenos que se introduce en el organismo intencionadamente. Estos antígenos, al ser solo partes del virus, no producen la enfermedad, pero hacen que el cuerpo reaccione generando anticuerpos, los cuales pueden combatir el virus en caso de una futura infección. Por otro lado, los medicamentos antivirales, que se utilizan para tratar las enfermedades víricas, se basan en sustancias que contienen anticuerpos preparados en los laboratorios farmacéuticos.

2 Cómo detectar un virus: Biosensores Además de la prevención y el tratamiento, la detección o diagnóstico precoz de la enfermedad vírica resulta clave para poder aplicar la cura antes de que sea demasiado tarde. Una vez familiarizado con el papel que los anticuerpos y los antígenos juegan en el reconocimiento de los virus, el lector entenderá mucho mejor cómo podemos detectar su presencia en el ser humano. Aunque los síntomas típicos de la enfermedad ya indican al médico que el paciente puede estar infectado, siempre es necesario realizar una prueba analítica de alguna muestra de sangre, orina o saliva que confirme de manera inequívoca la presencia o no del virus en el organismo. Esta prueba se realiza mediante unos dispositivos denominados biosensores. Todo biosensor consta de dos partes: un receptor y un transductor. El receptor es una sustancia (generalmente biológica) que reconoce aquello que pretendemos detectar (el objetivo). Este reconocimiento se manifiesta a través de una reacción bioquímica entre la sustancia receptora y la sustancia objetivo. Se podría decir que el receptor es el sensor propiamente dicho ya que es capaz de identificar la sustancia que buscamos. Sin embargo, el receptor nos avisa de que ha encontrado el objetivo mediante señales de naturaleza química inapreciables para el ser humano. Es necesario convertir estas débiles señales de reconocimiento en señales que podamos observar o medir fácilmente, como, por ejemplo, una corriente eléctrica o un haz de luz. De esta conversión o traducción de señales se encarga el transductor (ver Figura 1). Un ejemplo típico de biosensor, muy conocido por las personas diabéticas, es el que mide la cantidad de glucosa en la sangre. En este caso, el receptor biológico esta formado por una enzima que actúa sobre las moléculas de glucosa produciendo un pequeño número de electrones. El transductor es un dispositivo electrónico que convierte estos electrones en una corriente eléctrica apreciable. La magnitud de esta corriente se mide y se relaciona con la concentración de glucosa en la muestra de sangre analizada. Selectividad y Sensibilidad Una característica muy importante que debe cumplir el receptor biológico es la selectividad. Es decir, el receptor debe reconocer única y exclusivamente el objetivo, siendo indiferente al resto de sustancias (microorganismos, compuestos químicos, etc) presentes en la muestra que no son de nuestro interés. Observe que, de acuerdo con lo descrito anteriormente, los anticuerpos son excelentes receptores biológicos para el reconocimiento de antígenos, y por tanto de virus. La exclusividad de la reacción de afinidad anticuerpo-antígeno asegura la selectividad en la identificación de virus. Las pruebas analíticas basadas en el reconocimiento antígeno-anticuerpo se denominan inmunoensayos. Además de la selectividad, que como hemos visto viene determinada por el receptor biológico, otra característica fundamental de un biosensor es la sensibilidad, la cual viene determinada por el transductor utilizado. Para ilustrar este concepto valga como ejemplo una clásica trampa para ratones. Su mecanismo es simple: cuando el ratón mueve involuntariamente una palanquita a la que está anclado un trozo de queso (el cebo), se libera un muelle que atrapa al desafortunado animal. Esta trampa se podría ver como un biosensor de ratones: el cebo sería el receptor, mientras que la palanquita sería el transductor. Es obvio que nos interesa que la ratonera se active al menor movimiento de la palanquita, esto es, que sea muy sensible. De otro modo el ratón podría comerse Carlos Angulo Barrios 2

3 tranquilamente el queso e irse sin sobresalto alguno. Cuanto mayor sea la sensibilidad de la trampa, mayor será la probabilidad de atrapar al roedor. Igualmente, los biosensores deben poseer una gran sensibilidad para detectar la más mínima presencia del virus objetivo en la muestra analizada y evitar así un diagnóstico erróneo. Es por esto que los ingenieros dedicados al diseño de biosensores destinan la mayor parte de su trabajo de investigación y desarrollo a conseguir transductores con la mayor sensibilidad posible. FIGURA 1. Carlos Angulo Barrios 3

4 Proyecto SABIO Entre los años 2006 y 2009, la Universidad Politécnica de Madrid (UPM) ha participado en un proyecto europeo cuyo principal objetivo ha sido la realización de un diminuto biosensor de gran sensibilidad para diagnosticar enfermedades víricas. El acrónimo de este proyecto: SABIO, procede de su título en inglés: ultrahigh sensitivity Slot-wAveguide BIOsensor on a highly integrated chip for simultaneous diagnosis of multiple diseases, que se traduciría como Biosensor de ultra-alta sensibilidad basado en una guía-ranurada e integrado en un chip para el diagnóstico simultáneo de múltiples enfermedades (ante títulos de esta longitud el lector se habrá dado cuenta de lo conveniente que resulta utilizar un acrónimo). Además de la UPM, han colaborado en este proyecto universidades de Suecia y Francia, empresas de base tecnológica dedicadas a la comercialización de biosensores de Suiza y Reino Unido, y el hospital universitario de Innsbruck, en Austria. SABIO ha sido un proyecto altamente multidisciplinar en el que se han integrado los conocimientos y la experiencia de cada uno de los socios en áreas científicotecnológicas tan dispares como la bioquímica, la óptica, la nanofabricación y la dinámica de fluidos. Los investigadores de la UPM han sido los encargados de realizar las siguientes tareas clave del proyecto: el diseño del transductor, parte de su fabricación, y la caracterización (prueba) del biosensor de antígenos. La UPM ha aportado así su experiencia en los campos de la óptica, la nanofabricación, y el estudio de materiales y dispositivos avanzados, además de sus instalaciones científicas de vanguardia. Anillo de luz El transductor desarrollado en la UPM se basa en un delgadísimo hilo de un material transparente (nitruro de silicio). La luz se propaga por este hilo, denominado guía óptica, de manera análoga a como lo hace por una fibra óptica fibra del espesor de un cabello que se utiliza en telecomunicaciones y exploraciones médicas (endoscopias). La guía de nuestro transductor tiene un espesor de 0,9 micras (un milímetro contiene mil micras), es decir, diez veces más delgada que una fibra óptica! Además se encuentra formando un círculo o anillo sobre un pequeño chip de silicio (ver Figura 2). La razón de hacer que la guía describa un círculo es obligar a la luz que circula por ella a recorrer el mismo camino una y otra vez, esto es, a que resuene. Resonadores Un resonador es un sistema que oscila (resuena) de forma natural a unas frecuencias concretas llamadas frecuencias de resonancia. Un ejemplo típico de resonador (acústico) es una flauta dulce. Al soplar por la boquilla, el aire en su interior vibra y resuena a una frecuencia audible por el ser humano. Esta frecuencia acústica resonante o tono de sonido se puede modificar variando la longitud del tubo de aire (longitud acústica) mediante el cierre de los agujeros del cuerpo de la flauta. En el caso de nuestra guía óptica circular, al iluminarla, la luz resuena a una frecuencia óptica o color determinada por la longitud del camino cerrado que recorre (longitud óptica). La luz cuyo color coincide con la frecuencia óptica de resonancia queda atrapada en el anillo, dando vueltas indefinidamente. A esta guía circular se la denomina anillo óptico resonador. Carlos Angulo Barrios 4

5 Un resonador puede llegar a ser extremadamente sensible a cualquier perturbación de su entorno. Igual que el muelle de una trampa de ratones de gran sensibilidad salta al menor movimiento de la palanquita, la frecuencia de un resonador acústico u óptico cambia a la menor variación de su longitud acústica u óptica producida por un elemento externo. Por esta razón (sensibilidad ultra-alta), como responsable del diseño del biosensor de antígenos en el proyecto SABIO, elegí un resonador como transductor. Variando la frecuencia de resonancia Para comprender mejor el principio de funcionamiento del transductor en forma de anillo resonador, imagine la siguiente situación: usted ha salido a practicar con la flauta dulce en un frondoso bosque una mañana húmeda de otoño (supongamos que esta atmósfera melancólica le resulta musicalmente inspiradora). El ambiente esta poblado de multitud de pequeñas hojas amarillas que el viento mantiene flotando en el aire hasta que lentamente se depositan en el suelo. Mientras pone a punto la flauta soplando por la boquilla, una hoja se deposita sobre uno de los agujeros y se mantiene adherida debido a la humedad. El cierre del agujero por la hoja hace que el sonido emitido cambie. Si, a continuación, otra hoja se adhiere a otro de los agujeros, el sonido cambia nuevamente. Y así sucesivamente hasta que todos los agujeros quedan tapados por hojas. El efecto que producen las hojas sobre la flauta es similar al que producen los antígenos de los virus sobre nuestro anillo resonador. La adhesión de antígenos sobre el anillo varía su longitud óptica, modificando así la frecuencia óptica de resonancia, del mismo modo que la adhesión de las hojas sobre la flauta varía la longitud acústica de ésta, y por tanto la frecuencia acústica o tono del sonido emitido. Igual que podemos detectar la presencia de una hoja sobre la flauta escuchando el cambio de sonido, podemos detectar la presencia de un antígeno sobre el anillo midiendo el cambio de frecuencia óptica. En el caso de la flauta (transductor acústico) utilizamos nuestro oído como instrumento de medida, mientras que en el caso del anillo (transductor óptico) la variación de frecuencia óptica se mide mediante un aparato denominado espectrómetro. Observe que la flauta, como transductor que es, se limita a convertir el cierre de sus agujeros en sonidos. Un agujero podría ser tapado por cualquier objeto: una hoja de abedul, una hoja de chopo, una hoja de papel, un trozo de plástico, etc, y producir el mismo sonido. La flauta por sí sola no nos sirve como biosensor de, por ejemplo, hojas de abedul, ya que no dispone de un receptor que se encargue de que sólo (recuerde: selectividad) las hojas de abedul se adhieran a los agujeros de la flauta. Lo mismo ocurre con el anillo resonador: éste puede detectar la presencia sobre su superficie de cualquier biomolécula (proteína, glúcido, ADN, etc) pero no es capaz de identificarla. Como el lector ya habrá adivinado, para convertir el anillo en un auténtico biosensor de virus es necesario añadirle un receptor biológico que haga que, de entre todos los microorganismos y biomoléculas contenidas en la muestra a analizar, únicamente los antígenos del virus objetivo se adhieran al transductor. Inmunoensayo. Identificación de antígenos. Como vimos anteriormente, los anticuerpos son excelentes receptores de antígenos ya que son altamente selectivos. Así pues, para identificar antígenos, nada mejor que recubrir o tapizar la superficie de nuestro anillo resonador con anticuerpos. Pero antes conviene determinar las condiciones experimentales bajo las cuales se realizarán las pruebas de identificación. Carlos Angulo Barrios 5

6 Cuando los ingenieros nos disponemos a evaluar experimentalmente un prototipo tecnológico, primero realizamos pruebas sencillas utilizando elementos o condiciones bien conocidas y controladas. Con esto pretendemos estudiar alguna característica concreta de nuestro prototipo, eliminando los efectos que otros elementos presentes en un entorno real tendrían sobre su funcionamiento. En nuestro caso la característica concreta, y fundamental, que los investigadores de SABIO deseábamos comprobar era si nuestro sensor de anillo era capaz de detectar y cuantificar antígenos. Para ello, utilizamos antígenos de albúmina de suero bovino (conocidos por sus siglas en inglés como BSA). Los antígenos de BSA son proteínas que se usan muy a menudo en investigación biomédica por su estabilidad y bajo coste (un factor importante que un ingeniero debe considerar). Además, para evitar los efectos debidos a la multitud de sustancias biológicas contenidas en la sangre y la orina, los antígenos de BSA se disolvieron directamente en agua ultra-pura. De este modo nos aseguramos de que cualquier respuesta del biosensor es debida únicamente al reconocimiento de antígenos BSA por los correspondientes anticuerpos. Una vez definidos los experimentos a realizar, los bioquímicos de SABIO adhirieron los anticuerpos al anillo mediante un tratamiento químico. A continuación, en los laboratorios de la UPM, procedimos a realizar la prueba de fuego : el inmunoensayo, es decir, el reconocimiento de antígenos (BSA). Para esto depositamos sucesivas disoluciones acuosas con distintas concentraciones de antígeno sobre el anillo; tras un tiempo de incubación necesario para que los antígenos se difundan hasta el anillo- lo iluminamos y medimos su frecuencia de resonancia. Para nuestra satisfacción, pudimos observar como esta frecuencia variaba a medida que cambiábamos la concentración de antígenos en la disolución. Nuestro biosensor no sólo detectaba la presencia de antígenos sino que además nos informaba de la cantidad de éstos que había en la muestra. El inmunoensayo realizado con nuestro pequeño biosensor de anillo había sido un éxito. Además, éste se comportó de acuerdo con nuestros cálculos iniciales y resultó ser extremadamente sensible, siendo capaz de detectar la presencia de cantidades ínfimas de antígenos. Objetivo conseguido! Biochips de silicio El anillo biosensor descrito tiene un radio de tan sólo 70 micras (el espesor de una hoja de papel es de 100 micras). Debido a su reducido tamaño, sería posible situar hasta 30 biosensores sobre la cabeza de un alfiler sin solaparse entre ellos. En un chip de silicio (biochip) con una superficie de medio centímetro por medio centímetro se podrían fabricar más de anillos! Suponga que depositamos la muestra de sangre que queremos analizar sobre este biochip, esto es, sobre los biosensores. Cada uno de ellos nos daría información acerca de la misma muestra, pero en puntos diferentes. Esto aumentaría notablemente la probabilidad de detectar el virus buscado. Recuerde la analogía de la flauta: imagine que, además de usted, hay otros flautistas practicando al mismo tiempo en el mismo bosque. La probabilidad de que una hoja se adhiera a una de las flautas es, sin duda, considerablemente mayor que si estuviese usted sólo. La posibilidad de utilizar de manera simultánea todos los biosensores contenidos en un solo biochip es uno de los grandes atractivos del proyecto SABIO. Por una parte se puede obtener un gran número de datos que permitan realizar un análisis estadístico, aumentando así la fiabilidad del inmunoensayo, y por otra parte es posible tapizar los anillos con distintos anticuerpos para reconocer diferentes tipos de antígenos que Carlos Angulo Barrios 6

7 puedan estar presentes en la muestra. Así podríamos detectar varias enfermedades simultáneamente mediante el uso de un único chip. Esta es una de las grandes ventajas de la miniaturización de biosensores. Otra es el coste. Cuantos más biosensores seamos capaces de incluir en un chip, más podremos fabricar utilizando los mismos recursos materiales y humanos. Nos saldrá mas barato crearlos y se podrán comercializar a menor precio. FIGURA 2. Carlos Angulo Barrios 7

8 Hay otro factor importante que contribuye a reducir considerablemente el coste del biochip desarrollado en SABIO. El principal material del que está hecho, el silicio, es la base de la industria microelectrónica, es decir, de la fabricación de microchips. Esto permite aprovechar esta tecnología altamente desarrollada para producir biochips en masa y a bajo coste. Los ingenieros-investigadores de SABIO hemos estimado que un biochip como el desarrollado en el proyecto se podría comercializar por unos 2 euros. Por este precio, los chips se podrían desechar una vez utilizados ya que saldría más barato adquirir uno nuevo que reutilizar el usado. La reutilización de un chip requiere excesivo tiempo y dinero debido a las tareas de limpieza con productos químicos y el uso de equipamiento especializado. Además de ser más baratos, estos biochips de usar y tirar también aumentarían la fiabilidad y rapidez de los análisis, y facilitarían su uso en sistemas portátiles de diagnóstico. Futuro Gracias a la unión de conocimientos de distintas áreas de la ciencia y la tecnología, los investigadores del proyecto SABIO hemos diseñado y fabricado un diminuto biosensor óptico capaz de detectar pequeñísimas cantidades de antígenos. Este biosensor es el primer paso hacia la realización y comercialización de biochips ópticos de silicio para diagnosticar enfermedades víricas de manera rápida, eficaz y barata. No obstante, aún queda trabajo de investigación y desarrollo que hacer. Es necesario llevar a cabo más pruebas experimentales con el fin de estudiar el funcionamiento del biosensor con muestras reales de sangre, orina o saliva que contengan virus tales como el H1N1. También hay que desarrollar una pequeña carcasa para el biochip de modo que lo proteja de los golpes, polvo, humedad, etc, a la vez que permita un fácil uso. Otro aspecto importante es la realización de un pequeño equipo electrónico de medida portátil para poder emplear el biochip más allá del laboratorio de investigación. Y todo esto sin dejar nunca de lado el factor económico. No cabe duda de que el esfuerzo conjunto de ingenieros, físicos, químicos, biólogos y médicos hará posible disponer de biosensores de excelentes prestaciones que nos ayuden a controlar y combatir las enfermedades infecciosas que nos acechan. Por cierto, si se le ha ocurrido alguna ingeniosa idea para detectar selectivamente hojas de abedul con una flauta, puede que haya descubierto su verdadera vocación: los biosensores. Carlos Angulo Barrios 8

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