APTT HEMOSTASIS Instrucciones de Uso
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- Eva María Blanco Silva
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1 APTT HEMOSTASIS Instrucciones de Uso Ref.:02 Tiempo de tromboplastina parcial activada Finalidad. Reactivo para la determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y medición de los factores de coagulación basada en el tiempo de tromboplastina parcial activada. [Solamente para uso diagnóstico in vitro.] Principio. El reactivo conteniendo activador plasmático (ácido elágico) desencadena el mecanismo de coagulación de la vía intrínseca a través de la activación del factor XII (Hageman), que forma un complejo con el cininógeno de alto peso molecular (HMWK) y con la pre-calicreína (PK). El factor XII activado actúa sobre el factor XI generando el factor XIa que en presencia de fosfolípidos y calcio transforma el factor IX en una enzima activa (factor IXa), que activa el factor VIII, formando el complejo IXa-fosfolípido-VIIIa que activa el factor X. Este factor activado transforma la protrombina en trombina que actúa sobre el fibrinógeno generando fibrina. La formación de fibrina está macroscópicamente demostrada por la aparición de un coágulo. El TTPA se realiza incubando el plasma citratado con el reactivo que contiene el activador y fosfolípidos. Después de la adición del calcio, se realiza la medición del tiempo de formación del coágulo. Característica del sistema. APTT Hemostasis - Labtest contiene sustitutos de fosfolípidos plaquetarios que, junto con un activador soluble, el ácido elágico, proporciona condiciones óptimas para la activación por contacto de los factores de la coagulación (vía intrínseca). A pesar de ser sensible a deficiencias de todos los factores de la coagulación, con excepción del factor VII, el sistema APTT Hemostasis detecta desórdenes hemorrágicos secundarios principalmente a deficiencia de los factores VIII, IX, XI, XII y Pre-calicreína. APTT Hemostasis puede ser utilizado también con éxito para monitorear pacientes en terapia con heparina. El sistema es suficientemente sensible para discriminar diferentes concentraciones de este anticoagulante, presentando una prolongación del tiempo de coagulación proporcional a la concentración de heparina en el plasma. Metodologia. Reactivo Coagulometría. Reactivo 1 - Almacenar entre 2-8 ºC. Contiene ácido elágico 99 µ mol/l, fosfolípidos de cerebro de conejo 0,007%, fenol 3 mmol/l, albúmina bovina 0,00%, estabilizadores y conservante. Listo para usar. Reactivo 2 - Almacenar entre 2-30 ºC. Contiene cloruro de calcio mmol/l y azida sódica 0,09%. Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas, son estables hasta la fecha de expiración impresa en los rótulos. Después de abiertos, los reactivos deben ser manipulados de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza química y microbiana que pueden provocar reducción de su estabilidad. El Reactivo 1 debe permanecer abierto y fuera de la temperatura de almacenamiento, solamente el tiempo necesario para obtener el volumen a utilizar en el ensayo. La exposición prolongada del Reactivo 1 al aire puede comprometer el desempeño del mismo. La estabilidad del Reactivo 1 puede comprometerse con la introducción de puntas mal lavadas. Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la manipulación del reactivo. El Reactivo 2 contiene azida sódica que es tóxica. No ingerir y, en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con abundante cantidad de agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos altamente explosivos con las cañerías de plomo y cobre. Por lo tanto, utilizar gran cantidad de agua para descartar el reactivo. Material necesario y no provisto Precauciones y cuidados especiais Baño-María mantenido a temperatura constante (37 ºC); Pipetas para medir muestras y reactivo; Cronómetro. Influencias pre-analíticas. El TTPA puede estar aumentado en individuos que usan ácido acetilsalicílico, aztreonam, ofloxacino, metronidazol y fenitoína. La reducción del TTPA puede observarse en individuos que usan antihistamínicos, digitálicos, anticonceptivos orales, tetraciclina y estrógenos conjugados. Es importante también que la muestra sea recogida, preparada y almacenada conforme se describe en el ítem MUESTRA. Muestra Usar plasma recogido en citrato trisódico anhidro 109 mmol/l (3,2%). Se debe crear un Procedimiento Operativo Estándar (POE) que establezca procedimientos adecuados para la toma, preparación y almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la muestra pueden ser mayores que los errores ocurridos durante el procedimiento analítico. Considerando que a calidad de la muestra es fundamental para la exactitud de los resultados, se recomienda la utilización de los 1-3 procedimientos que siguen. 01 Espanhol - Ref.: 02
2 1. Obtener la sangre por punción venosa y evitar el agarrotamiento prolongado, la hemólisis, la formación de burbujas y la aspiración de líquido tisular (factor lll). La aguja debe penetrar directamente en la vena en la primera tentativa (punción venosa no traumática). La sangre debe fluir libremente sin que sea necesario aplicar demasiada fuerza al émbolo. No realizar el TTPA en muestras cuya punción fuera difícil (punción venosa traumática). 2. Recoger la muestra con jeringa de plástico y centrifugar en tubos de plástico. El uso de material de vidrio no siliconado activa los factores de la coagulación y reduce falsamente el TTPA. Después de sacar la aguja, utilizar la porción central de la muestra en la jeringa, dejando las porciones anterior y posterior para otros ensayos. En los sistemas de recolección al vacío, usar tubo de plástico o de vidrio siliconado. Tomar 2 muestras cuando la recogida se destine solamente a ensayos de coagulación. La primera en un tubo sin anticoagulante o en un tubo conteniendo citrato (tapa azul) que debe ser despreciada. La segunda muestra recogida en tubo conteniendo citrato (tapa azul) debe ser utilizada para la realización de los ensayos. En el caso de una recogida múltiple, la muestra para los ensayos de coagulación debe ser obtenida después de la toma de la muestra en tubo sin anticoagulante y antes de la recogida en tubo contiendo EDTA. 4. Mezclar 9 partes de sangre con 1 parte de citrato ó 3 ml de sangre y 1 gota de Trombstab (Labtest Ref.: 4). Homogeneizar 3 ó 4 veces por inversión suave. No usar oxalato, pues el Factor V es muy sensible a este anticoagulante.. En pacientes que presentan un hematocrito mayor a % la relación entre los volúmenes de sangre y de anticoagulante debe ser ajustada para garantizar la exactitud del resultado. Para calcular el volumen de anticoagulante necesario en función del hematocrito y del volumen de sangre, utilizar la siguiente fórmula: Volumen de anticoagulante (ml) = 0,0018 x volumen de sangre (ml) x (100 - hematocrito) Ejemplo. Para un hematocrito de 60% usar 0,22 ml de citrato y completar a 3,0 ml con sangre. Para usar Trombstab (Labtest Ref.: 4), adicionar 2 gotas a 0, ml de agua y usar en la proporción indicada por el cálculo. 6. Centrifugar hasta 1 hora después de la recogida a 3000 rpm o a 100 g durante 1 minutos. No es necesario remover el plasma del tubo. Mantener el tubo tapado hasta la realización del examen para prevenir alteraciones del ph de la muestra que pueden interferir en los resultados. 7. Mantener las muestras entre 2-24 ºC y realizar el TTPA hasta 4 horas después de la recolección. En caso de que exista posibilidad de congelamiento rápido, el plasma, separado de las células, puede ser congelado a ºC negativos por 2 semanas o a 70 ºC negativos por 6 meses. Sugerimos congelar el material en alícuotas de 0, ml y, para evitar la evaporación del material durante el período de almacenamiento, utilizar frascos adecuados para congelamiento ( criotubos ). Las muestras deben ser descongeladas rápidamente a 37 ºC y ensayadas inmediatamente La presencia de coágulos implica el rechazo de la muestra. Las muestras de sangre deben ser consideradas como potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manipularlas se deben seguir las normas establecidas para bioseguridad. Para descartar los reactivos y el material biológico, sugerimos aplicar las normas locales, estatales o federales de protección ambiental. Interferencias Muestras ictéricas, lipémicas y hemolisadas pueden modificar los resultados de modo imprevisible. Procedimiento 4 El siguiente procedimiento se aplica a la técnica manual. El reactivo puede ser empleado para la determinación del TTPA utilizando equipos automáticos y semi-automáticos. Se recomienda seguir exactamente las instrucciones de operación propuestas por los fabricantes. Realizar el ensayo en tubos de vidrio rigurosamente limpios. La temperatura del baño-maría debe estar entre 36,0 y 38,0 ºC. Pre-calentar el Reactivo 2 ( mmol/l) a 37 ºC. Incubar a 37 ºC, 0,1 ml del plasma a ser medido (control o paciente) como mínimo 1 minuto y como máximo 10 minutos. Adicionar 0,1 ml del Reactivo 1, homogeneizar e incubar a 37 ºC por 3 a minutos (tiempo de activación). Para obtener resultados reproducibles el tiempo de activación debe ser estandarizado para todas las muestras. Adicionar 0,1 ml del Reactivo 2 (previamente calentado a 37 ºC) y disparar simultáneamente el cronómetro. Mezclar suavemente y mantener en el baño-maría a 37 C por 1 a segundos. Extraer el tubo, inclinarlo constantemente a intervalos menores a 1 segundo y observar la formación de un coágulo que interrumpe el movimiento del líquido. Detener inmediatamente el cronómetro y registrar el tiempo. interno de la calidad. El laboratorio debe mantener un programa de control interno de calidad que defina claramente: regulaciones aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para especificaciones de calidad y límites de tolerancia, acciones correctivas y registro de las actividades. Se deben usar materiales de control para evaluar la imprecisión y desvíos de la calibración. Se sugiere utilizar las especificaciones CLIA para el cálculo del error total. 6-8 Intervalo de referencia. Los intervalos deben ser usados sólo como orientación. Se recomienda que cada laboratorio establezca, en la población atendida, sus propios intervalos de referencia. 02 Espanhol - Ref.: 02
3 Edad 2 meses meses Niños a partir de los 6 messes y adultos Características de desempeño Estudios de comparación. El método propuesto fue comparado con un método similar, obteniéndose los siguientes resultados: Número de muestras Tiempo de tromboplastina parcial activada (segundos) Media da las estimativas (segundos) Ecuación de regresión Coeficiente de correlación Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total estimado en el tiempo de 26,7 segundos es igual al 1,76% y en el tiempo de 6,6 segundos es igual al 11,2%. Estudios de precisión. Los siguientes resultados fueron obtenidos en los estudios de precisión: Muestra 1 Muestra 2 Evaluación del error total. El error total (error aleatorio + error sistemático) estimado en el tiempo de 26,7 segundos es igual a 3,13% y en el tiempo de 6,6 segundos es igual a 13,6%. Los resultados indican que el método cumple con la especificación CLIA para el error total ( 1,0%). Sensibilidad a la heparina. N El TTPA se utiliza para monitorear la terapia con heparina, considerando que la prolongación del tiempo de formación del coágulo es directamente proporcional al aumento de la cantidad de heparina. 9 Intervalo (segundos) 26,3-46,9 26,1-4,9 26,7-37,6 Método Comparativo 21,9-0 Media 26,8 66,6 Método Labtest 21,0-167,8 34,6 32,7 Labtest = 0,8232 x Comparativo + 4,2 0,98 Repetitividad - Imprecisión intra-ensayo Reproducibilidad - Imprecisión total Muestra 1 Muestra 2 N Media 26,7 6,6 DP 0,08 0,60 DP 0,19 0,79 CV (%) 0,3 0,9 CV (%) 0,7 1,2 La acción anticoagulante de la heparina depende de muchos factores, tales como: nivel adecuado de antitrombina III, activación plaquetaria y subsecuente exposición del Factor 4 plaquetario. Los medicamentos, la tasa de metabolización y la forma de administración de la heparina y el tiempo entre la obtención de la muestra y la realización del ensayo interfieren en el test de sensibilidad. La sensibilidad relativa del reactivo APTT Hemostasis a la heparina, puede ser determinada estableciendo una curva de sensibilidad a la heparina. La curva debe construirse adicionando cantidades conocidas de heparina a un pool de plasma normal y realizando el ensayo para la determinación del TTPA. El laboratorio debe realizar el ensayo de sensibilidad utilizando heparina de la misma fuente que la administrada al paciente y teniendo en cuenta las variables que influyen en el test. El ejemplo que sigue ilustra la relación entre concentración de heparina y el tiempo en segundos obtenido con el reactivo APTT Hemostasis y un coagulómetro foto-óptico. Sensibilidad a la deficiencia de los factores de coagulación. Plasmas con deficiencia moderada y grave de varios factores fueron evaluados con el reactivo APTT Hemostasis y el reactivo demostró sensibilidad apropiada a las deficiencias de los factores de la coagulación, conforme se muestra en la siguiente tabla: Observaciones 1. Concentración de Heparina (unidades/ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0, 0,6 0,7 Factor VIII VIII IX IX XI XI XII XII Pre-calicreína Actividad del factor% TTPA (segundos) 24,3 27,3 33,6 42,1 3,0 6, 77,9 93,7 TTPA (segundos) 82,0 44,8 83, 40,9 134,2 47,8 >0 36,2 69, La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de resultados correctos. 03 Espanhol - Ref.: 02
4 2. El laboratorio clínico tiene como objetivo fornecer resultados exactos y precisos. La utilización de agua de calidad inadecuada es una causa potencial de errores analíticos. El agua desionizada o destilada utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones y para su uso en enjuague final de la vidrería, debe tener resistividad 1 megaohm.cm o conductividad 1 microsiemens/cm y concentración de silicatos <0,1 mg/l. Cuando la columna desionizadora está con su capacidad saturada, se produce agua alcalina con liberación de varios iones, silicatos y sustancias con gran poder de oxidación o reducción que deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los resultados de modo imprevisible. Por lo cual es fundamental establecer un programa de control de la calidad del agua. Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas de interferencia en los resultados y en la metodología se sugiere consultar Referencias 1. International Committee for Standardization in Hematology.Thromb Haemostas 1976;36: NCCLS. Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays; Approved Guideline- Fourth Edition. NCCLS document H21-A4, 0 NCCLS. Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture; Approved Standard-Fifth Edition. NCCLS document H3-A, 0 4. NCCLS. One-Stage Prothrombin Time (PT) Test and Activated Partial Thromboplastin Time (APTT) Test; Approved Guideline. NCCLS document H47-A, Flanders MM, Crist RA, Roberts WL, Rodgers GM. Clinical Chemistry 0;1: Jacobs DS, DeMott WR, Oxley DK. Laboratory Test Handbook, a edição, Lexi-Comp Inc: Hudson (Cleveland), 01, Labtest: Datos de archivo. Presentación Producto APTT Hemostasis Referencia 02-1/4 Están disponibles las aplicaciones para sistemas automáticos y semiautomáticos. Informaciones al consumidor [Términos y Condiciones de Garantía] Contenido 1X4mL 1X6mL Labtest Diagnóstica garantiza el desempeño de este producto, dentro de las especificaciones, hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos, siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en los rótulos y en estas instrucciones, sean seguidos correctamente. Labtest Diagnóstica S.A. CNPJ: / Av. Paulo Ferreira da Costa, Vista Alegre - CEP Lagoa Santa. Minas Gerais Brasil - Servicio de Apoyo al Consumidor sac@labtest.com.br 1 2. CLIA Requirements for Analytical Quality. Disponible en < 6. Conway AM, Hinchliffe RF, Finn A, Bell F. Clin. Lab Haem 1999;21: Edición: Febrero, 07 Ref.: Copyright by Labtest Diagnóstica S.A. Reproducción bajo previa autorización 04 Espanhol - Ref.: 02
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6 Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitro Símbolos usados con productos diagnósticos in vitro Symbols used with ivd devices Conteúdo suficiente para <n>testes Contenido suficiente para <n>tests Contains sufficient for <n>tests Risco biológico Riesgo biológico Biological risk Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa) Estable hasta (aaaa-mm-dd o mm/aaaa) Use by (yyyy-mm-dd or mm/yyyy) Marca CE Marcado CE CE Mark Calibrator Material Tóxico Tóxico Poison Calibrator Material Reagente Reactivo Reagent Limite de temperatura (conservar a) Temperatura limite (conservar a) Temperature limitation (store at) Fabricado por Elaborado por Manufactured by Representante Autorizado na Comunidade Europeia Representante autorizado en la Comunidad Europea Authorized Representative in the European Community Número do lote Denominación de lote Batch code Consultar instruções de uso Consultar instrucciones de uso Consult instructions for use e Número do catálogo Número de catálogo Catalog Number e negativo negativo Negative control Adições ou alterações significativas Cambios o suplementos significativos Significant additions or changes e positivo positivo Positive control Produto diagnóstico in vitro Dispositivo de diagnóstico in vitro In vitro diagnostic device e Liofilizado Liofilizado Lyophilized Corrosivo Corrosivo Corrosive Ref.: Espanhol - Ref.: 02
TEMA 8: HEMATOLOGÍA. Hematíes: < Anemia, > Policitemia Leucocitos:<Leucopenia,>Leucocitosis Plaquetas: <Trombocitopenia, > Trombocitosis
b) Métodos automáticos: basados en variaciones en la conductividad o resistencia, basados en la difracción Células: TEMA 8: HEMATOLOGÍA Hematíes: < Anemia, > Policitemia Leucocitos:Leucocitosis
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