Conocen alguna otra técnica para marcar de manera fluorescente una proteína? Lic. Micaela Daiana Garcia

Transcripción

1 Inmunofluorescencia Técnica que se utiliza para la detección de estructuras subcelulares que nos permiten estudiarlas con la utilización de anticuerpos acoplados a fluoróforos. Conocen alguna otra técnica para marcar de manera fluorescente una proteína? Lic. Micaela Daiana Garcia

2 Por qué estudiar la localización subcelular de una proteína? La expresión de proteínas de una célula es dinámica. Esto depende de los estímulos que reciban, los requerimientos energéticos y como ésta interprete los mismos manifestará cambios en la expresión y distribución de las proteínas de su repertorio genético. Localización subcelular Ejemplo: Escalas temporales Interacciones Función de una proteína Sin estímulo Endocitosis y señalización Con estímulo Migración celular

3 La inmunofluorescencia es un conjunto de técnicas en donde se emplean anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y/o tejidos. Inmunodetección Tubulina Núcleo Paxilina Transfección Mitocondrias Núcleo Actina Fibroblastos de ratón. Inmunodetección con anti beta tubulina (citoesqueleto), y con anti paxilina (adhesiones focales). El núcleo se tiñó con DAPI un intercalante del ADN. Células BHK 21 fueron transfectadas con el plásmido DsRed Mitocondria. Luego la detección de actina se hizo con faloidina acoplada a Alexa Fluor 488 (citoesqueleto). No confundir inmunodetección con Transfección! Proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos ó físicos.

4 Pasos claves de una inmunofluorescencia Fijación Permeabilización Bloqueo Inmunodetección: Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta

5 1 Fijación: Preservar la localización, composición y estructura del material biológico a analizar manteniendo lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo. Existen distintos métodos de fijación de material biológico. Esto dependerá de distintos factores como: el tipo de microscopia a utilizar, la estructura subcelular que se quiera detectar, entre otras. Glutaraldehído Paraformaldehído Metanol/Acetona Modo de acción Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por precipitación de proteínas y carbohidratos Uso más frecuente Microscopía electrónica y algunos estudios de fluorescencia Estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos Gran variedad de estudios Ventajas / Desvantajas Provee la mayor preservación de estructura fina. Es el más severo de los fijadores. Altera los epitopes. Provoca fluorescencia inespecífica. Produce menos autofluorescencia que el glutaraldehído. Genera menor cantidad de puentes que el glutaraldehído. Penetra más rápidamente dentro de la célula. La fijación es más rápida que con los aldehídos. Puede alterar el patrón de localización de los antígenos. Fija y permeabiliza al mismo tiempo. Puede generar contracción en la muestra.

6 2 Permeabilización: Existen distintos métodos de permeabilización que son mas suaves o mas fuertes. Esto dependerá de la naturaleza del compuesto permeabilizante a utilizar. Produce poros en las membranas celulares. Lo que permite el ingreso de los anticuerpos a la célula si queremos detectar estructuras internas de la célula. Célula fijada Permeabilización Anticuerpo específico Célula positiva Inmunodetección Isotipo Célula negativa Se utilizan generalmente detergentes no iónicos que solubilizan los lípidos de la membrana produciendo de manera irreversible o reversible poros en la membrana (por ejemplo Tritón X 100, NP40).

7 3 Bloqueo Su función es impedir interacciones inespecíficas de los anticuerpos con el material biológico a analizar y así reducir la marcación inespecífica. En general se utilizan soluciones protéicas concentradas (Generalmente Albúmina bovina sérica o gelatina de pescado). El anticuerpo primario debe competir con la proteína bloqueante para unirse a su epitope y así detectar la estructura de interés. Se reduce la unión inespecífica del anticuerpo por epitopes no específicos.

8 4 Inmunodetección: Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer específicamente y unirse con alta afinidad a otras moléculas (antígenos). La molécula que es reconocida por los anticuerpos se denomina antígeno. Cada antígeno tiene al menos un epitope o región reconocida por un anticuerpo.

9 Anticuerpos Se trata de moléculas sintetizadas por linfocitos B y capaces de reconocer y unirse con alta afinidad a otras moléculas Lic. Eliana Fernandez

10 Cómo están compuestos? Las inmunoglobulinas se encuentran formadas por 4 cadenas polipeptídicas: 2 cadenas pesadas (H, en verde) ( dalton) y 2 cadenas livianas (L, en amarillo) ( dalton) Cada cadena posee regiones variables que permiten el reconocimiento específico de antígenos y otra región Constante.

11 El antígeno es reconocido por la región variable del anticuerpo. La parte del antígeno reconocida se denomina epitope. Paratope Epitope

12 Epítopes antigénicos Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

13 Anticuerpos policlonales Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos Mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno Anticuerpos monoclonales Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos Población de anticuerpos homogéneos que reconocen el mismo epitope de un antígeno

14 Cómo se obtienen los anticuerpos policlonales?

15 Cómo se obtienen los anticuerpos monoclonales? Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón. Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y son inmortales como el mieloma que le dio origen. César Milstein Premio Nobel de Química 1984

16 Cómo debe ser el anticuerpo secundario?

17 Cómo se obtienen los anticuerpos secundarios? IgG anti IgG de conejo hecha en ratón IgG purificadas de conejo

18 Gracias!