Clonación. Producción de un gran número de copias de una región de ADN (fragmentos o

Transcripción

1 CLONACIÓN

2 Clonación Producción de un gran número de copias de una región de ADN (fragmentos o genes) o de ADNc

3 Clonación Celular Acelular Célula anfitriona PCR

4 Secuenciación Estudio de estructura de ácido nucleicos Amplificación Estudio de homología entre especies Identificación de mutaciones; por ej. asociadas a enfermedad Objetivos de la clonación Estudio del proceso de transcripción y traducción Estudio de regulación (promotores) Expresión Para su identificación Producción de proteína o ARN (formas normales o alteradas) Para su estudio (propiedades función) Para aplicarla (producción comercial), diagnóstico, terapéutico, nutrición, industria. Ingeniería de proteína con alteraciones de sus propiedades (para estudio o aplicación)

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6 Etapas Preparación del inserto de ADN a clonar Preparación del vector Unión del fragmento de ADN al vector Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona 5. Propagación celular y selección del clon con el gen de interés 6. Análisis del gen clonado

7 Preparación del inserto de ADN a clonar

8 Preparación del inserto de ADN a clonar

9 Preparación del inserto de ADN a clonar ARNm 5 ---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA Cebador oligo dt 5 Cola poli A ---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA 3 dntps 3 TTTTTTTTT 3 5 Transcriptasa inversa 5 3 Hibrido ARNm:ADNc ---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA ---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT CTPs Transferasa terminal (añade al extremo 3 ) ---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA 3 CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT 5 Hidrólisis alcalina (degrada sólo el ARN) ADNc monocatenario 3 CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT Oligo dg + dntps 5 DNApolI GGGGG---GATTGCAATCG----AAAAAAAA ADNc bicatenario 3 CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT 5

10 DNA recombinante vector Enzima de restricción ADN Ligasa * VECTORES * ENZIMAS * PREPARACIÓN DEL INSERTO * METODO DE TRANSFORMACIÓN * SELECCIÓN DE CLONES

11 Etapas Preparación del inserto de ADN a clonar Preparación del vector Unión del fragmento de ADN al vector Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona 5. Propagación celular y selección del clon con el gen de interés 6. Análisis del gen clonado

12 Vector de clonación Un vector es una molécula de ADN de tamaño pequeño, fácil de aislar y caracterizar, con secuencia y mapa de restricción conocidos. Deben ser fáciles de introducir en una célula anfitriona y una vez allí deben tener capacidad de REPLICACIÓN AUTÓNOMA. Muchos sitios de restricción Por lo menos un gen marcador que permita distinguir cuales células llevan el ADNr Vectores de clonación y de expresion

13 Vectores de clonación

14 Vectores de clonación Plásmidos lacz polylinker puc pb amp ori EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII

15 Vectores de clonación Plásmidos DNA recombinante vector Enzima de restricción ADN Ligasa * VECTORES * ENZIMAS * PREPARACIÓN DEL INSERTO * METODO DE TRANSFORMACIÓN * SELECCIÓN DE CLONES

16 Vectores de clonación Virus

17 Vectores de clonación Virus

18 Vectores de clonación Quimeras: Cósmidos Combina las ventajas de plásmidos y fagos El fragmento plasmídico proporciona las características de tamaño pequeño, circularidad, un origen de replicación, sitios de restricción, marcadores seleccionables y la propagación en bacterias como si fueran plásmidos El fragmento del fago proporciona las secuencias cos que permite el empaquetamiento en cápside vírica

19 Vectores de clonación Cromosomas artificiales BACs: contienen genes que reducen su capacidad de copia, es mas estable y no sufre reordenamientos YACs: contiene secuencias de centrómero, telómeros y un origen de replicación.

20 Etapas Preparación del inserto de ADN a clonar Preparación del vector Unión del fragmento de ADN al vector Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona 5. Propagación celular y selección del clon con el gen de interés 6. Análisis del gen clonado

21 Unión del fragmento de ADN al vector: Formación del ADNr

22 Etapas Preparación del inserto de ADN a clonar Preparación del vector Unión del fragmento de ADN al vector Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona 5. Propagación celular y selección del clon con el gen de interés 6. Análisis del gen clonado

23 Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona Célula anfitriona: procariota Escherichia coli Fácil de obtener Fácil manipulación Fácil de multiplicar Se conoce su genética

24 Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona Célula anfitriona: eucariota Mas difíciles de obtener y mantener, se utilizan con fines específicos como análisis de la regulación génica y expresión de proteínas Saccharomyces cerevisiae Células individuales Crecimiento rápido y económico, manipulables Organización eucariota De interés biotecnológico por su capacidad de expresión y maduración de proteínas

25 Métodos de introducción del ADNr

26 Etapas Preparación del inserto de ADN a clonar Preparación del vector Unión del fragmento de ADN al vector Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona 5. Propagación celular y selección del clon con el gen de interés 6. Análisis del gen clonado

27 Propagación celular y selección del clon con el gen de interés

28 Detección y selección del clon con el gen de interés Métodos de hibridación Métodos inmunoquímicos Métodos genéticos o de selección fenotípica. Genes que codifican una proteína detectable Genes de resistencia a antibiótico Genes que complementan defectos nutricionales

29 Detección y selección del clon con el gen de interés

30 Expresión génica

31 UN EJEMPLO. Cómo hago para obtener una secuencia de un gen desconocido?

32 Lacasa

33 5 I II III IV 3

34 PCR-inversa

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36 Genotecas

37 PREGUNTAS???