PRÁCTICA 9 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

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1 INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 9 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA La electroforesis es una técnica que permite separar moléculas cargadas eléctricamente, entre las cuales se encuentran los ácidos nucleicos (DNA y RNA) o las proteínas. Las proteínas pueden tener carga neta positiva o negativa, los ácidos nucleicos tienen carga neta negativa debido a sus grupos fosfato, de forma que la carga del ácido nucleico está condicionada por el número de grupos fosfato. Durante la electroforesis, el movimiento de las moléculas cargadas se hace a través de una matriz porosa (o gel), que está inmersa en un medio acuoso. Bajo el campo eléctrico aplicado, las diferentes moléculas de la muestra se mueven a través de la matriz a diferentes velocidades, de forma que al final de la electroforesis las distintas moléculas se pueden diferenciar como bandas separadas a distintas posiciones en la matriz. Dichas bandas se detectan mediante tinción o autorradiografía, o pueden transferirse a una superficie membranosa. Tipos de electroforesis Dentro de las electroforesis que usan algún soporte (gel) se pueden distinguir entre electroforesis vertical y electroforesis horizontal. Aparte de diferenciarse por la posición que adopta cada cubeta, existen una serie de ventajas e inconvenientes para cada uno: Electroforesis horizontal: Ventajas: Sencillez del aparato. Posibilidad de aplicar la muestra en cualquier zona del gel. Inconveniente: Carece de refrigeración. Electroforesis vertical: Ventaja: Posible refrigeración. Inconveniente: La muestra sólo se aplica en la parte superior del gel. Para la electroforesis horizontal se suelen usar geles de almidón o geles de agarosa, mientras que para la electroforesis vertical se usan habitualmente geles de poliacrilamida. En los geles de almidón se cargan muestras de proteínas, en los de agarosa se cargan ácidos nucleicos (DNA y RNA), y en los geles de poliacrilamida tanto proteínas como ácidos nucleicos. 43

2 El gran inconveniente de los geles de almidón es la imposibilidad de definir el tamaño del poro, mientras que, tanto en los geles de agarosa como en los de poliacrilamida, el tamaño del poro viene definido por la concentración a la que se hace el gel, a mayor concentración menor tamaño de poro y viceversa; de forma que a mayor concentración, aumenta la resistencia al paso de las moléculas a través del gel, y mayor será su selectividad. La agarosa es un polisacárido originalmente obtenido de algas, derivado del agar-agar, pero de composición más homogénea. El rango de concentraciones normales de trabajo varía entre 0.4% y 4% (w/v), concentraciones por fuera de este rango crearían propiedades mecánicas que haría inútil al gel, ya que por encima del 4% los poros son demasiado pequeños como para que pase alguna molécula, y por debajo del 0.4% son demasiado grandes como para poder discernir diferentes moléculas. Las principales ventajas del uso de la electroforesis en gel de agarosa son su simplicidad, versatilidad y el amplio rango de separación posible. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA En esta práctica los alumnos visualizarán el DNA extraído en la práctica anterior, comprobando su estado e interpretando los resultados. MATERIALES Productos y equipos -DNA en estudio -Micropipetas p20 -Puntas amarillas -H 2 O estéril -Tampón de carga -Agarosa -Microondas -Tampón TBE 0,5X -Placa molde -Peine -Cubeta -Fuente PROCEDIMIENTO Preparación del gel de agarosa Lo primero que se debe hacer a la hora de preparar la electroforesis es preparar el molde donde va a solidificar el gel, dicho molde puede montarse dentro de la misma cubeta de electroforesis o fuera de ella. El molde lleva uno o varios peines para que, al retirarlos, se formen los pocillos donde vamos a introducir la muestra. 44

3 Una vez montado el molde, se hace el gel. Por ejemplo, para elaborar un gel de agarosa de 100 ml al 1% primero, se disuelve 1 g de agarosa en 100 ml de tampón TBE 0.5X calentándolo en el microondas y evitando su ebullición, y así sucesivamente hasta que quede perfectamente disuelto. Después se deja enfriar unos minutos, y se adicionan 100 L de bromuro de etidio al gel (aun líquido).posteriormente, se vierte la agarosa en el molde dejando que polimerice al aire. Momentos antes de cargar las muestras se quitan los peines y los límites superiores que les hayamos puesto al molde (ya sean cuñas o cinta adhesiva), se rellena la cubeta de electroforesis con TBE 0.5X o 1X hasta cubrir completamente el gel. Preparación de las muestras Antes de cargar las muestras de DNA en los pocillos del gel hay que mezclarlas con Tampón de Carga (TC), el cual contiene glicerol y azul de bromofenol. El glicerol le da una cierta densidad a la muestra para ayudar a que se deposite en los pocillos, el azul de bromofenol sirve para tener una monitorización continua del avance de la electroforesis. Además se cargará un marcador de peso molecular. Estos marcadores nos van a informar que tamaño y que concentración tiene una banda determinada. Dos ejemplos de marcadores son el marcador molecular XIV (marcador de 100 pb) y el marcador lambda-hindiii. El primero tiene una primera banda a 2600 pares de bases aproximadamente, la segunda banda es de 1500 pb, y a partir de aquí cada banda que esté por debajo varía en 100 pb (1500, 1400, 1300, etc.) hasta llegar a la última banda de 100 pb. El marcador lambda-hindiii presenta 7 bandas de tamaño superior a la que puede alcanzar el marcador XIV, la primera banda es de

4 pb, la segunda de 9476 pb, la tercera de 6557 pb, la cuarta de 4361 pb, la quinta de 2322 pb, la sexta de 2077 pb y la séptima de 564 pb. Condiciones de electroforesis Antes de realizar la electroforesis, se llena la cubeta hasta cubrir el gel Con TBE 0,5X o 1X y se conectan los cables desde la cubeta hasta la fuente. El TBE es el mismo utilizado para hacer el gel, y es una disolución salina compuesta por una mezcla de Tris, Bórico y EDTA cuyas características principales son: (i) mantener el ph de la disolución durante toda la electroforesis, (ii) tiene la suficiente carga iónica (debido al ácido bórico) para que transcurra la electroforesis, y (iii) al contener EDTA, evita que las DNasas degraden las muestras de DNA. La electroforesis transcurre normalmente a voltios, a temperatura ambiente, y suele durar entre 1 hora o 2 horas en función de las muestras en estudio. Para visualizar las moléculas de DNA se utiliza bromuro de etidio, que es un colorante fluorescente que se intercala entre las bases de DNA y RNA. El bromuro de etidio se utiliza generalmente adicionándolo al gel antes de solidificar. Al irradiarle luz UV, reemite en el naranja, revelándonos la posición del DNA en el gel. Pero el bromuro d etidio es un agente mutagénico que causa irritación de la piel. 46

5 Actualmente existen como alternativa al bromuro de etidio otros productos comerciales que no son mutagénicos y tampoco peligrosos, como por ejemplo BLUXYO el cual se utiliza mezclándolo directamente con la muestra de DNA. Este producto contiene: bromophenol blue, xylene cyanol y orange G y aporta la viscosidad necesaria para que las muestras se depositen en el fondo de los pocillos, por lo tanto no sería necesario utilizar tampón de carga. 47

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