INTRODUCCIÓN Y FILOSOFÍA DE TRABAJO

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1 1 Hemograma INTRODUCCIÓN Y FILOSOFÍA DE TRABAJO El hemograma es el examen que evalúa cuantitativa y cualitativamente los elementos celulares de la sangre. Es el examen complementario más solicitado en las consultas y forma parte de todos los chequeos de salud. Estadísticas del laboratorio del autor expusieron reiteradamente su presencia en la lista de exámenes en cerca del 48% de los pacientes en quienes se recolectó sangre. Esa preferencia universal denota que el hemograma es coadyuvante indispensable en el diagnóstico y control evolutivo de las enfermedades infecciosas, de las enfermedades crónicas en general, de las emergencias médicas, quirúrgicas y traumatológicas, y en el acompañamiento de quimioterapia y radioterapia, por lo que está relacionado con toda la Patología. Además, el hemograma es la Hematología. El autor, que tiene su consultorio de hematología clínica anexado al laboratorio, siempre ha realizado el hemograma simultáneamente a las consultas; con la tecnología actual, en pocos minutos. Un sinnúmero de veces ha hecho el diagnóstico a través del resultado del hemograma incluso antes de interrogar y examinar al paciente. Si se dispone de facilidades para ese procedimiento, se evita una larga elaboración diagnóstica mediante una simple mirada al monitor del contador electrónico, complementado, o no, por un minuto de microscopia. La historia clínica y el examen físico, orientados por la hipótesis fundamentada, se vuelven rápidos y eficientes. Otros exámenes, en caso de que sean necesarios, son escogidos entre aquellos exactamente apropiados al caso, y generalmente se realizan con la sangre que ya ha sido recolectada; no se pierde tiempo ni hay gastos inútiles. El paciente pasa una hora en el consultorio y, ya en su primera consulta, sólo con los exámenes específicos para su caso, vuelve a su casa con el diagnóstico y el tratamiento. En caso de

2 22 Renato Failace y cols. que se trate de una hemopatía seria, sale, en el acto, con un pedido de internación en el hospital que haya elegido; cuando se confirma que las alteraciones hematológicas que han sido causa de la consulta se deben a enfermedad de otra especialidad, se devuelve con un informe al colega que lo envió o a los especialistas adecuados. Esa práctica simple de hemograma en el acto, tan gratificante, económica y difícil de igualar en otras especialidades, pues en ninguna otra la biopsia es tan poco invasiva y el examen tan rápido, debe realizarse con especial atención, puesto que el hemograma varía según la hora y las condiciones en que se recolecte la sangre, lo que es analizado en la p. 28. El hemograma actual se hace en contadores electrónicos, que aspiran la sangre y realizan automáticamente todas las determinaciones en múltiples canales. Las cámaras para el recuento de glóbulos en el microscopio, la centrífuga de hematocrito, el colorímetro para hemoglobina, e incluso los contadores electrónicos con un solo canal de recuento y dilución externa de la sangre para examinar, son piezas históricas, relegadas al museo del laboratorio. A pesar de la diseminación de la tecnología electrónica, todavía existe una significativa variación entre laboratorios, pues el hemograma depende de la calidad del equipo, del grado de especialización del personal técnico, de la filosofía de trabajo y de las tradiciones locales. Puede variar incluso por decisiones político-económicas, de acuerdo con la procedencia de las solicitudes: en una institución cerrada, puede haber un hemograma para el cuerpo clínico (p. ej., solamente el informe original de la máquina electrónica) y otro para pacientes y médicos externos a la institución. Para interpretar el hemograma, es necesario conocer la tecnología empleada, los parámetros* proporcionados, la manera de expresar los resultados y la correlación con la Patología: sobre esto versa el presente libro. Los contadores electrónicos proporcionan un hemograma con todas (o varias de) las determinaciones hechas directamente (Tabla 1.1, A) y los parámetros derivados de éstas por cálculo, por el computador (Tabla 1.1, B). Algunas determinaciones sólo son proporciona- * Los datos numéricos, tanto los producidos por el contador electrónico (p. ej., recuentos de glóbulos, VCM, dosificación de hemoglobina), como los calculados a partir de éstos por el computador de la máquina (p. ej., hematocrito, HCM, histogramas), fueron inapropiadamente denominados parámetros por los fabricantes de ese equipo. El término se consagró por el uso.

3 Hemograma 23 TABLA 1.1 Componentes del hemograma A) Determinaciones hechas directamente por los contadores electrónicos Eritrograma Recuento de eritrocitos (E) en millones (M)/mL Valores de hemoglobina (Hgb) en g/dl Medida del volumen de los eritrocitos en fl (media = VCM) Medida de la concentración hemoglobínica individual de los eritrocitos (equipos de la línea Advia) Recuento de reticulocitos (Retics) en % y /ml (varios modelos avanzados) Índices reticulocitarios: maduración (por la carga de ARN), volumen, concentración hemoglobínica (ídem) Recuento de eritroblastos /100 leucocitos y /ml (ídem) Leucograma Recuento de leucocitos /ml Fórmula leucocitaria % y /ml Por volumetría (3 tipos celulares, en contadores pequeños) Por volumetría y citometría en flujo (5-9 tipos celulares y flags o estimativas para células anormales, en contadores grandes) Determinación de la fracción leucocitaria viable (WVF) (equipos más sofisticados de la línea Cell-Dyn) Inmunofenotipaje restringido (software especial en algunos de los modelos más sofisticados) Plaquetograma Recuento de plaquetas (Plaq.) /ml Medida del volumen plaquetario (media = VPM) en fl Recuento inmunofenotípico de las plaquetas (equipos más sofisticados de la línea Cell-Dyn) Recuento de plaquetas reticuladas (equipos más sofisticados de la línea Sysmex) B) Parámetros derivados por el computador Hematocrito (Hct): VCM x E Hemoglobina corpuscular media (HCM): Hgb E Concentración hemoglobínica corpuscular media (CHCM): HCM VCM (o Hgb Hct) Media (CHCM) y desviación estándar (HDW) de las concentraciones hemoglobínicas corpusculares individuales (línea Advia) Contenido hemoglobínico de los reticulocitos (HCr) (línea Advia) (Continúa)

4 24 Renato Failace y cols. Tabla 1.1 (Continuación) Histogramas: curvas de frecuencia del volumen corpuscular (de los eritrocitos) y de diversos otros parámetros Amplitud de distribución del volumen corpuscular (RDW) Scatterplots de la distribución de los leucocitos Amplitud de distribución del volumen plaquetario (PDW) Plaquetocrito (Pct): VPM x Plaq (generalmente borrado) Alarmas o avisos (flags) relativos a las tres series das por equipos de determinada procedencia o sólo por los modelos más sofisticados de una o varias líneas. Algunas son electivas (realizadas bajo comando del operador), otras exigen un software especial. A pesar de la excelencia de la tecnología, la microscopia sigue siendo necesaria en un significativo número de casos; las máquinas señalan sus propias dudas (flags = avisos), tanto en la exactitud de las cifras como en la identificación de las células, y todas deben ser dirimidas; pero las máquinas no lo ven todo, y algo de lo que no ven puede ser clínicamente relevante. Décadas de práctica diaria y amplio conocimiento en Patología son requisitos indispensables para que el hematólogo laboratorista cumpla satisfactoriamente esa tarea. Todos los contadores actuales ejecutan un conjunto de determinaciones básicas, que incluye eritrograma completo y recuento de leucocitos y plaquetas. Casi todos los modelos pequeños hacen, al mismo tiempo, una fórmula leucocitaria simplificada (de tres tipos celulares), que debe ser completada por la microscopia. Contadores electrónicos grandes (y de alto valor) hacen una fórmula leucocitaria completa, con cinco o seis tipos celulares y otros, presentados como flags; utilizando esos contadores, el uso de la microscopia se restringe a hemogramas alterados. La visión amplia de un médico hematólogo, con una vida profesional dividida entre la clínica y el laboratorio, agrega un toque de experto a las cifras de alta precisión de las máquinas electrónicas: una secuencia de hemogramas se transforma en una poderosa lista que suscita hipótesis clínicas y complementos diagnósticos. Médicos con esa ambivalencia son cada vez más escasos; los estudios de posgrado en Hematología no contemplan la Patología Clínica respectiva,

5 Hemograma 25 dedicándose casi exclusivamente a la oncología hospitalaria. En los Estados Unidos y Europa, hay hemopatólogos que hacen, a un tiempo, anatomía patológica y patología clínica de la sangre y de los órganos hematopoyéticos; esa especialidad hasta este momento no ha sido desarrollada en Brasil. En el laboratorio, la presencia de ese hematólogo en extinción genera una filosofía de trabajo: ofrecer sistemáticamente resultados esclarecedores, y no sólo listas de números para interpretar. Hemogramas anormales sólo se entregan tras un elaborado intento de aclaración o con sugerencias sobre cómo aclararlos. Para tal fin, a ese workaholic no le importa trasponer los límites de la solicitud del médico y de los horarios de trabajo. Frente a la falta de datos que permitan una interpretación total, llamadas telefónicas a los médicos solicitantes, para discutir el caso, son ampliamente utilizadas. Las llamadas a los pacientes, sin embargo, deben ser usadas con mucho comedimiento y sólo si el médico no ha sido encontrado. Por exigir diplomacia y autoridad, en la opinión del autor, solamente deben ser realizadas por el médico hematólogo; como regla, generan gratitud y confianza, pero en los casos en que son mal conducidas o en que están implicados pacientes emocionalmente inestables, pueden generar aprensión y desconfianza. La optimización de los servicios prestados en los términos de esa filosofía de trabajo no es subjetiva ni teórica; el autor la ha comprobado diariamente en sus 50 años de actividad profesional. Las horas y los insumos que se han gastado con exámenes no solicitados, con repeticiones para confirmar resultados, con llamadas telefónicas e informaciones, con discusiones internas con el personal de hematología, no elevan el precio cobrado por los exámenes, sino que elevan solamente el costo. Lo que se gana en calidad se logra a costa de la rentabilidad financiera. Gastar lo mismo en marketing, o en el establecimiento de relaciones participativas con médicos o instituciones, tal vez sería más lucrativo, pero, en la opinión del autor, la práctica no se correlaciona con una patología clínica ética y productiva: la rentabilidad financiera en la prestación de servicios médicos no se debe tener como fin, sino como un efecto colateral del inevitable éxito de esa filosofía. Por parte del médico solicitante, a su vez, se crea el deber de la elección consciente del(de los) laboratorio(s) que se indicarán a los pacientes. Conociendo que la mencionada filosofía, sustentada por una tecnología de punta, es tradicional en un laboratorio y que no cuesta más, es racional y ético indicarlo, prefiriéndolo a otros. A fin de cuentas, es su deber escoger lo mejor que exista para los pacientes!

6 26 Renato Failace y cols. La comunicación frecuente, escrita, por teléfono o por Internet, genera una buena relación recíproca, con comprensión y receptividad del médico a los resultados del laboratorio. Resultados considerados por el médico solicitante como dudosos, improbables o incompatibles con lo que se proveía, serán revisados después de un diálogo telefónico con el patólogo clínico, sin la presencia del paciente. Los médicos solicitantes deberán recibir con tolerancia las correcciones cuando son producto de mala transcripción de las cifras originales; en un laboratorio, donde circulan millones de datos cada día, inevitablemente alguno será emitido de manera errónea y no percibida. Se acordará repetir pruebas cuando se concluya que determinados resultados son improbables; todas las repeticiones y revisiones deberán ser gratuitas. Las ampliaciones de solicitaciones médicas, con exámenes no pedidos, pero considerados necesarios por el patólogo clínico, son éticas y recomendables, pero sólo serán cobradas al paciente con el beneplácito del médico y por intermedio de este. REGISTRO Y PROCESAMIENTO DE DATOS Mantener la calidad total en los laboratorios de patología clínica exige permanente control, desde el cuidado en los registros iniciales y la identificación de las muestras hasta la revisión final y entrega de los resultados. El registro de ingreso de los pacientes debe incluir nombre completo y fecha de nacimiento, teléfono, médico solicitante (digitado a través del número del Consejo Regional de Medicina), lista de los exámenes pedidos, observaciones o comentarios del médico (si los hay), y los datos contables pertinentes. La identificación por código de barras siempre es recomendable e indispensable en laboratorios grandes. El computador abre un registro numerado para el paciente, distribuye los registros contables en las cuentas de las respectivas instituciones solicitantes y mantiene la lista de los exámenes pedidos accesible en el sistema para todas las secciones técnicas. Exámenes anteriores del paciente, que se buscan en el computador por el nombre, y siempre confirmando la fecha de nacimiento para evitar errores de homonimia, deben estar disponibles por 3 a 5 años, para permitir comparaciones cuando sea pertinente. El traspaso de resultados del contador electrónico al computador del laboratorio, que emite los informes finales en el caso de hemogramas integralmente dentro de los límites de referencia arbitrados

7 Hemograma 27 y sin flags debe hacerse por interface directa con las máquinas, sin interferencia humana. Con límites precisos y sensatamente definidos para hemogramas cuyos resultados automatizados no necesiten de más aclaraciones, ese procedimiento elimina los errores humanos de transcripción e impide la manipulación peligrosa de los datos por personal menos calificado. En el caso de hemogramas con interface rechazada debido a la presencia de flags o por cifras que se encuentren fuera de los límites arbitrados, el autor sugiere que el programa haga que la máquina imprima un resultado completo (algunas proporcionan una laboratory worksheet detallada), que será enviado para que sea revisado por un técnico sénior; éste define la necesidad de microscopia y se responsabiliza por todas las manipulaciones complementarias que le parezcan necesarias, hasta proporcionar el resultado final. Algunos laboratorios prefieren incluir las correcciones y/u observaciones directamente en el resultado en el sistema, otros, en la copia impresa, y digitar en el sistema el nuevo resultado final. En cualquier caso, existe la posibilidad de error humano. Para minimizarlo, el autor ofrece algunas sugerencias: Agregar observaciones a los resultados a través de códigos que generan leyendas. Ejemplos: código POLI hace imprimir policromasia, GTOX, granulaciones tóxicas en los neutrófilos, etc., con la respectiva semicuantificación, descrita más adelante en este capítulo. Eso evita errores al digitar frases largas o palabras complejas, como anomalía de Pelger-Huët. Los códigos numéricos son más fáciles de usar, pero también es más fácil que se cambien por error. Incluir en el programa del computador una serie de límites y correlaciones numéricas lógicas entre los parámetros del hemograma. Excepciones a esa regla arbitraria pasan a ser aceptadas en el programa, por digitación o modificación de resultados en el sistema, sólo cuando están acompañadas por dígitos de control preestablecidos, anotados por el técnico senior. Es decir, mediante la inclusión del dígito de control, el técnico confirma la veracidad del dato alterado; cuando este dígito falta, el programa lo rechaza. Ejemplos: el programa sabe que VCM = Hct E; si el VCM es mayor que 110 (número arbitrado), exige un dígito de control que signifique macrocitosis; si el VCM alto se debe a error de digitación o modificación involuntaria en el recuento de eritrocitos o hematocrito, el resultado es rechazado por la falta del dígito.

8 28 Renato Failace y cols. Delimitar extremos para lo posible de cada parámetro o de sus correlaciones. Ejemplos: el resultado absurdo causado por la presencia de crioaglutininas, como el de la Figura 5.4 (p. 146), no es aceptado por el sistema aunque el técnico desee ofrecerlo. Un Hct = 24% es incompatible con una Hgb = 14,0 g/dl; el rechazo es automático e irreversible. Si Hct, HCM, CHCM no corresponden a las respectivas fórmulas de cálculo, nunca serán aceptados. La digitación hecha en doble es un método de seguridad muy usado, pero insatisfactorio: errores cometidos por el técnico en el boletín original son digitados de la misma manera en las dos versiones. Salvaguardas incluidas en el sistema son siempre más fáciles y seguras, por lo tanto preferibles a controles por trabajo humano. RECOLECCIÓN DE MATERIAL A pesar de que hay una disminución del volumen plasmático cuando se pasa del reposo, en la posición horizontal, a la posición vertical, debido a acumulación gravitacional y transudación en los miembros inferiores, lo que aumenta las cifras eritroides del amanecer al atardecer en 2-3% (puede llegar a 5-10% en obesos y cardiópatas), y pese a que hay una elevación circadiana, de la mañana a la tarde, en el recuento de leucocitos, las diferencias suelen ser clínicamente irrelevantes, de modo que la recolección de sangre para hemograma puede ser hecha a cualquier hora. Se evita solamente tomar la muestra después de ejercicio físico, lo que causa considerable leucocitosis (neutrofilia), y en las dos horas que suceden a comidas abundantes o ricas en grasas. Las neutropenia en hemograma recolectado en condiciones basales exige que se confirme mediante una recolección al final de la mañana o en la segunda mitad de la tarde. La poliglobulia en hemograma recolectado al final del día exige confirmación en recolección en las primeras horas de la mañana. Para hemograma, se usa sangre recolectada de vena superficial de la parte anterior del codo, con aguja de calibre compatible con el volumen que será recolectado. El autor recomienda los calibres (Ø) siguientes: Ø 0,6 mm para muestras de hasta 2 ml (sala cuna y venas afectadas por quimioterapia) Ø 0,7 mm para muestras de hasta 5 ml (dorso de la mano y pulso, pediatría)

9 Hemograma 29 Ø 0,8 mm (es el usual) para muestras de hasta 20 ml (para 20 ml completos, mejor Ø 0,9 mm). Cantidades mayores, que no suelen ser necesarias para patología clínica, exigen butterfly. La yugular externa es segura y útil para niños pequeños y pacientes con venas difíciles o esclerosadas. El riesgo de punción arterial o de vena profunda es difícilmente justificable para exámenes rutinarios de patología clínica. Sólo se realiza hemograma de sangre capilar en unidades de oncopediatría, con personal para recoger la muestra y tecnología especializados. El dolor del pinchazo de la aguja disminuye con el aumento del ángulo de penetración, pero el riesgo de atravesar la vena aumenta en la misma proporción. La reacción vasovagal por extracción de sangre es inusual, pero ocurre. Quien recoge la muestra debe estar atento; en caso de que note palidez, o si el paciente se queja de mareo, inmediatamente debe hacer que se acueste. La reacción es fugaz e inocua; el riesgo está en la caída. Contención del paciente sólo puede hacerse con autorización del responsable y, por lo tanto, sólo se aplica a niños o personas mentalmente inválidas; pacientes anestesiados o comatosos constituyen la excepción obvia. La sangre se recoge en un tubo que contenie de 1 a 2 mg de EDTA sódico o potásico por ml recogido. El volumen recomendado para el tubo debe ser respetado; la desproporción sangre/edta causa error preanalítico. Si existe predilección por un tubo que contenga EDTA en solución, la gota debe ser insignificante para el volumen de sangre recolectado; un volumen de sangre inferior al recomendado hace que sea significativa la dilución por el anticoagulante, con reducción de las cifras hematimétricas. Material insuficiente exige una nueva recoleción. Como hay tubos pediátricos para hemograma, con minidosis de EDTA, compatibles con la recolección de 0,5 a 1 ml de sangre, conviene tenerlos a la mano para una eventual extracción escasa. La recolección lenta y difícil, por falta de flujo en la vena puncionada, favorece la agregación plaquetaria y la coagulación: nunca aceptarla! Es necesario cambiar el material y punzar otro lugar. La heparina no es adecuada como anticoagulante para leucograma y recuento de plaquetas, pues destruye los leucocitos y causa una coloración de fondo violeta en las láminas, pero es tolerable para el eritrograma, aunque en mínima cantidad para evitar dilución. La diferencia entre el hemograma de la sangre de venas y de arterias periféricas es insignificante; el eritrograma puede ser

10 30 Renato Failace y cols. realizado con la sangre tomada para gasometría arterial siempre que no sea diluida con exceso de heparina. La recolección de sangre de catéteres profundos es necesaria en muchos pacientes, especialmente en aquellos que están recibiendo quimioterapia. Necesaria, pero técnicamente indeseable. Se debe aspirar inicialmente un volumen significativo de sangre y despreciarlo, porque estaba en estasis y con heparina en el catéter. Con ese cuidado, la sangre obtenida es satisfactoria para eritrograma y leucograma; el recuento de plaquetas, sin embargo, siempre será inseguro debido a la pérdida inevitable en el trayecto. En pacientes internados, es recomendable que la muestra sea tomada por personal propio de la unidad. La recolección en el recién nacido se analiza en el Capítulo 19. La recolección con jeringas y agujas desechables es más fácil para quien toma la muestra y causa menos hematomas en los pacientes que la recolección con tubos sellados al vacío y agujas bipolares, pero implica un mayor riesgo de herida accidental con la aguja. Se recomienda usar guantes de goma, pero es cierto que la reducción del tacto interfiere en el trabajo y que los guantes no protegen contra el riesgo citado, de modo que la recomendación no es universalmente seguida. El uso de guantes es reglamentario y obligatorio para todo el personal que manipula materiales biológicos en las secciones técnicas del laboratorio. Como quien toma la muestra trabaja solo y tiene las manos ocupadas, cabe al propio paciente o a un acompañante comprimir el sitio de la punción para detener el sangrado. Incluso, aun cuando se los insta con insistencia (en las salas de recolección del laboratorio del autor había un póster mostrando la manera correcta de presionar), generalmente no lo hacen con la presión y durante el tiempo adecuados; la consecuencia es un hematoma local, pues la tela adhesiva, sin una firme compresión previa por 3-4 minutos, es ineficaz para evitarlo. Aun con personal de recolección capacitado y experimentado, la coagulación incipiente o total de una muestra de sangre cada 500 a suele ocurrir en todos los laboratorios, hace que necesario tomar una nueva muestra. El extendido sistemático de láminas con gotas de sangre nativo, de la punta de la aguja, era recomendada por algunos patólogos clínicos para que las células siempre se pudieran ver al microscopio sin alteraciones causadas por el anticoagulante. El riesgo de cambios, el atraso en la secuencia de la recolección, el desvío de la atención de quienes recolectan del paciente a ese trabajo, el aumento del riesgo de acciden-

11 Hemograma 31 tes y el secado lento de las láminas debido a la dificultad de usar un secador en la sala de extracción llevan a que actualmente se prefiera el extendido de láminas a partir de la sangre ya anticoagulada. Debe realizarse, siempre que sea posible, antes de cuatro horas, como máximo seis; si el transporte hasta un laboratorio central demanda un mayor plazo, es necesario preparar el extendido en el lugar de origen. Las muestras de sangre enviadas deben ser transportadas 5ºC y con un mínimo de agitación. Láminas ya extendidas no deben ser dejadas en el ambiente refrigerado junto con las muestras, pues pueden hemolizar por la humedad. Es necesario envolverlas separadamente y transportarlas, evitando exposición a temperaturas > 32ºC. La sangre transportada debe contar con recepción preferencial en el laboratorio de destino, de modo que pase inmediatamente a la sección técnica para ser procesada. CONTADORES ELECTRÓNICOS El recuento electrónico de glóbulos empezó con la patente, solicitada por Wallace Coulter y su hermano, en los años 50, de un dispositivo capaz de contar y medir los pulsos de conductividad (impedancia) causados por el paso de partículas a través de un orificio por el cual fluye una corriente eléctrica. El contador primitivo tenía un asta hueca, con el interior comunicado con el exterior por un orificio de pequeño diámetro, con un electrodo metálico interno y otro externo, y una fuente generadora de corriente continua. Una bomba neumática aspiraba la sangre, apropiadamente diluida en solución electrolítica, desde fuera hacia adentro por el estrecho orificio, hasta alcanzar un volumen exacto predeterminado. Al cruzar individualmente el orificio, los glóbulos, debido a la menor conductividad, desencadenaban pulsos de impedancia, sentidos por el galvanómetro del instrumento. Los pulsos eran contados y medidos, y la calculadora, tomando en cuenta la dilución y el volumen aspirado, convertía el resultado en número de glóbulos por ml de sangre. El método se mostró adecuado a la finalidad que se proponía: recuento y medición de los glóbulos sanguíneos. Los instrumentos primitivos, que exigían un diluidor manual externo para las muestras de sangre por examinar, evolucionaron en los años 60 e inicios de los años 70, y llegaron a ser instrumentos capaces de aspirar la sangre, distribuirla, en porciones apropiadamente diluidas, por canales se-

12 32 Renato Failace y cols. parados, uno para contar y medir plaquetas y eritrocitos, otro para contar y medir leucocitos y dosificar hemoglobina por espectrofotometría, después de hemólisis por el líquido diluyente. Perfeccionados en la mecánica, en la electrónica y, principalmente, en el software del computador de apoyo, los contadores electrónicos por impedancia, esto es, con tecnología basada en el principio Coulter, pasaron a ser reproducibles y seguros, proporcionando cifras hematimétricas fidedignas; son fabricados y muy utilizados hasta hoy, con la designación usual de contadores electrónicos de pequeño tamaño. A fines de los años 70, la tecnología de impedancia fue complementada por citometría de flujo, maravilla tecnológica con innumerables perspectivas y variantes para la identificación celular, dando origen a los actuales contadores electrónicos de gran tamaño. Las nuevas máquinas son capaces de proporcionar la multiplicidad de parámetros listados en la Tabla 1.1, y son utilizadas en la generalidad de los grandes laboratorios. La mecánica de los instrumentos, en los años 80, fue automatizada por la técnica de perforación secuencial con una aguja aspiradora (probe) de la tapa de los frascos de sangre, dispuestos en estantes móviles, identificados por código de barras. Esa automatización elimina el riesgo de la manipulación de la sangre por los operadores y reduce la perspectiva de cambio de material por error humano. A fines de los años 90, se crearon sistemas robotizados, anexando a los modelos más sofisticados algunas líneas de equipos automáticos, capaces de extender y colorear láminas de manera selectiva, bajo comando de criterios incluidos en el software de una central inteligente. Esa mejora hace que el equipo sea muy caro, y, por eso, poco difundido en Brasil hasta ahora. En los países desarrollados, con el elevado costo de la mano de obra, se está generalizando rápidamente. La robotización agrega rapidez y trae un cierto aumento de la seguridad contra error humano al procedimiento, pero no interfiere en la calidad del producto final: el resultado del hemograma. El hemograma hecho en contadores de gran tamaño es el que tendrá sus resultados transcritos, analizados e interpretados en este libro. Hemograma en contadores electrónicos de pequeño tamaño Todos los fabricantes ofrecen aparatos pequeños y de bajo costo, tanto de adquisición como de mantenimiento e insumos, con tecnología que se restringe al recuento y medición de pulsos de impedancia

13 Hemograma 33 (principio Coulter). En Brasil, se usan en la mayoría de los laboratorios pequeños, con hasta 100 hemogramas al día. Como no realizan automáticamente una fórmula leucocitaria completa, laboratorios con esas máquinas deben siempre completar el hemograma con una fórmula hecha al microscopio (fórmula visual, o manual ). En esos contadores, el resultado proporcionado es uno e indivisible. Solicitudes separadas de leucograma, hematocrito o recuento de leucocitos pertenecen a una tecnología en desuso. Hay una excepción aceptable. Si el interés es sólo por la serie roja como al seleccionar donantes en banco de sangre, en exámenes periódicos del embarazo o de pacientes renales crónicos en diálisis y conociéndose que el laboratorio del servicio (o contratado) trabaja con contador electrónico pequeño, es decir, sin fórmula leucocitaria automatizada, se justifica el pedido aislado de eritrograma. En ese caso, el laboratorio ahorra el trabajo de preparar extendidos y realizar la aburrida fórmula al microscopio, proporcionando sólo el eritrograma deseado, con ahorro de costo o precio. Tampoco tiene sentido el pedido aislado de recuento de plaquetas, pues la máquina no se presta a hacerlo sin los demás conteos; el recuento de plaquetas siempre forma parte del hemograma. Un resultado típico de contador de pequeño tamaño (Coulter T/ MD) puede ser observado en la Figura 1.1. El histograma superior corresponde al leucograma; la medición de las células, simultánea al recuento, muestra un pico entre 35 y 95 fl, que corresponde a los linfocitos (incluye los basófilos), y una elevación rasa entre 160 y 400 fl, que corresponde a los granulocitos. Entre ambas, a los fl, se sitúan monocitos, algunos granulocitos no segmentados y eosinófilos y, cuando presentes, granulocitos inmaduros y linfocitos activados. La fórmula numérica, vista en la columna a la derecha, es incompleta e imprecisa, pero permite distinguir neutrofilias de linfocitosis. La fórmula al microscopio es indispensable para un resultado completo, eosinófilos y basófilos; esa trabajosa necesidad, por otro lado, hace con que esos hemogramas de tecnología pobre mantengan la característica histórica de evidenciar datos citológicos no advertidos por la electrónica (por ejemplo, pequeños desvíos a la izquierda, eliptocitosis sin anemia y otros). El segundo histograma es el del volumen corpuscular eritroide. Es similar al obtenido en los contadores de gran tamaño, que será analizado más adelante. Los resultados numéricos relativos al eritrograma se ven en la columna a la derecha. Son satisfactoriamente reproducibles y exactos.

14 34 Renato Failace y cols. El tercer histograma es el del volumen plaquetario; la curva es semilogarítmica. El recuento de plaquetas, definidamente inferior en fidedignidad al proveniente de contadores mayores, y el VPM están anotados a la derecha. Hemograma en contadores electrónicos de gran tamaño Los contadores electrónicos de gran tamaño actuales, capaces de realizar las determinaciones de la Tabla 1.1, son variados, de múltiples procedencias y con extensa gama tecnológica. El autor tuvo amplia experiencia personal con los instrumentos MAX M y STKS (Coulter), Cell- Dyn 3500 y 4000 (Abbott) y Sysmex XE 2100; tuvo, también, oportunidad de familiarizarse con la tecnología y los resultados del Advia 120 (Siemens). Son las líneas de instrumentos de mayor expresión interna- A REL NO. SAMPLE ANALYSIS NORMAL DISTRIBUTION 05/25/ ID LAB 120 WBC 4,3 LY 56,7 MO 9,2 GR 54,1 EO # (,7 BA # (,2 WBC RBC 3,98 HGB 12,9 HCT 37,0 MCV 93,0 MCH 32,4 MCHC 34,9 RDW 15,0 PLT 418, MPV 7,0 RBC PLT FIGURA 1.1 Resultado de hemograma en el Coulter T/MD.

15 Hemograma 35 cional, y todas están representadas en Brasil; las empresas fabricantes y/o distribuidoras locales ofrecen contratos de leasing y comodato, que incluyen la entrega de insumos y la asistencia técnica, pagando por examen, con un número mínimo preestablecido y precios que varían favorablemente de acuerdo con el número mensual alcanzado. A continuación se presenta una lista simplificada, pero bastante abarcadora, de la tecnología de esas cuatro líneas de instrumentos: 1. Medición y recuento de los pulsos de impedancia, causados por los glóbulos, al cruzar un orificio por el cual fluye una corriente continua (principio Coulter): recuento y medición del volumen de eritrocitos y plaquetas en todos los instrumentos; recuento de leucocitos en la mayoría. 2. Medición de la conductividad eléctrica de los glóbulos, en radiofrecuencia, en el orificio de impedancia: sensible a la estructura interna de las células, usada para diferenciar los tipos de leucocitos en la fórmula de las líneas Beckman Coulter y Sysmex. 3. Análisis, en varios ángulos, de la dispersión * de la luz (foco luminoso de tungsteno o láser) enfocada en los glóbulos en citometría de flujo: identificación (en algunos, recuento) de los tipos celulares en todas las líneas de instrumentos. 4. Dispersión y absorbancia de la luz (láser) tras reacción de la mieloperoxidasa: identificación de los granulocitos (peroxidasa +) en la línea Advia. 5. Ídem, tras efecto lítico preferencial del solvente sobre el citoplasma de los leucocitos: identificación de los basófilos, resistentes a la lisis, en varias líneas de instrumentos; identificación de células inmaduras (resistentes por falta de lípidos en la membrana) en la línea Sysmex. 6. Ídem, tras tinción supravital del ácido ribonucleico (ARN): identificación de los reticulocitos en la línea Beckman Coulter. 7. Dispersión de luz polarizada: identificación de los eosinófilos por el efecto despolarizante, en varias líneas de instrumentos. 8. Evaluación de la fluorescencia tras marcar el ARN citoplasmático con derivados de la fluoresceína: identificación de los reticulocitos en las líneas Cell-Dyn, Sysmex y Advia. * Dispersión de la luz (light scatter o laser scatter) tiene, aquí, el sentido de dispersión por reflexión y refracción, y no de apertura del espectro cromático.

16 36 Renato Failace y cols. 9. Evaluación de la fluorescencia del ADN nuclear tras marcar con yoduro de propidium: identificación de leucocitos inviables (membrana permeable al marcador) y eritroblastos en la línea Cell-Dyn. 10. Evaluación de la fluorescencia en leucocitos tras permeabilización de la membrana por solvente y tras marcar con una coloración fluorescente de polimetina: identificación de los leucocitos y de plaquetas reticuladas en la línea Sysmex. 11. Evaluación de la fluorescencia tras marcar las células con anticuerpos monoclonales fluorescentes (inmunofenotipaje limitado), lo que se realiza con software especial por algunos modelos top of line: recuento de plaquetas (con anti-cd61) y de linfocitos CD3, CD4 y CD8 en la línea Cell-Dyn. Otras aplicaciones todavía en fase experimental. 12. Espectrofotometría: es usada de modo universal para dosificar hemoglobina; las diversas líneas de instrumentos difieren en cuanto a la conversión de la Hgb antes de la colorimetría: cianometahemoglobina (Beckman Coulter), hemoglobina-lauril-sulfato de sodio (Advia y Sysmex), metahemoglobina-imidazol (Cell-Dyn). Todas las líneas de contadores hacen uso del principio Coulter (ítem 1, arriba) como método básico para los recuentos; eritrocitos y plaquetas, que se distinguen por umbrales de volumen, generalmente comparten un mismo canal de impedancia. Asimismo, el hemolizado destinado a la dosificación espectrofotométrica de la hemoglobina (ítem 12, arriba) también usa se para el recuento de leucocitos. Las líneas Coulter y Sysmex utilizan el trayecto de impedancia para la medición de conductividad de los leucocitos (ver ítem 2, en la página anterior). Los demás principios para la identificación celular (puntos 3 a 11, arriba) dependen de la técnica de citometría de flujo (flow cytometry); los glóbulos son orientados hacia una tubería delgada, donde fluyen uno tras otro, envueltos en una vaina de solvente y enfocados por técnica hidrodinámica. Al entrar en los múltiples canales del sistema, las porciones son diluidas, y las células, suspendidas en una variedad de líquidos, con características específicas de tonicidad, de actividad como solvente, con tinciones o sin ellas, sean de impregnación, enzimáticas o inmunológicas, algunas fluorescentes. Finalmente, pasan por un punto del trayecto (flow cell) donde son contados y sometidos a los diversos procesos de identificación.

17 Hemograma 37 En la flow cell, los glóbulos en columna son alcanzados individualmente por rayos luminosos en diversos ángulos para analizar la difracción de la luz y por láser para estimular fluorescencia en aquellos que tomaron las coloraciones marcadas con fluoresceínas. Múltiples fotodetectores reciben la luz difractada, otros identifican la fluorescencia en una o en varias longitudes de onda. La energía es convertida en pulsos eléctricos, que son digitalizados y enviados al computador. El software recibe las informaciones de esas decenas de miles de células que pasan por el trayecto en segundos y distribuye la inmensa cantidad de datos en clusters de identificación predeterminados, permitiendo una evaluación cualitativa y cuantitativa integral de las poblaciones en test. El término fantástico es pequeño frente a esta tecnología. Los instrumentos de las cuatro líneas analizadas proporcionan, de modo idéntico, aunque mediante tecnologías variadas, recuentos y volumetría de eritrocitos y plaquetas, recuento y fórmula diferencial de leucocitos, dosificación de hemoglobina, índices hematimétricos, histogramas del volumen corpuscular (eritroide y plaquetario), scatterplots leucocitarios utilizados para diferenciación celular, flags y comentarios, codificados o escritos, sobre anormalidades. La tecnología empleada en los recuentos de glóbulos en cada línea se resume en la Tabla 1.2. La de la fórmula leucocitaria, debido a la gran disparidad entre los instrumentos, se describe individualmente en el texto correspondiente, junto con innovaciones, características y parámetros únicos de cada línea. Para un análisis técnico detallado, el lector debe consultar, en internet, los sitios de las empresas fabricantes y los manuales de cada instrumento en particular, que se obtienen junto a los distribuidores locales. Línea Beckman Coulter (Coulter STKS, GEN*S y LH750) En el eritrograma, se destaca la alta calidad del histograma, alargado en la abscisa, bajo en la ordenada y con trazado firme, porque el software edita pulsos aberrantes. En opinión del autor, es más fácilmente interpretable que los histogramas de las demás líneas y, por eso, predomina en las ilustraciones de este manual. El leucograma ha sido hecho con la tecnología que la Coulter denomina VCS :

18 38 Renato Failace y cols. Volumen (medido por impedancia); Conductividad (en frecuencia de ondas de radio); Laser Scatter. La figura plana del scatterplot del leucograma es el plano frontal de una imagen tridimensional, un cubo, elaborada por el computador del aparato, con las medidas VCS distribuidas por las tres aristas que parten del origen. Los resultados obtenidos para cada célula son ploteados y generan conglomerados espaciales, que la máquina separa por planos móviles, vistos frontalmente como líneas. Hay un conglomerado de linfocitos (LY), de neutrófilos (NE), de monocitos (MO) y de eosinófilos (EO); los basófilos (BA), atrás de los linfocitos, sólo son vistos en otra incidencia. En la pantalla del instrumento, el scatterplot es coloreado con un código de colores correspondiente al número de eventos en cada punto (Figura 1.2, A). Son listados los porcentajes de cada tipo celular (fórmula relativa) así como su conversión en cifras por ml (fórmula absoluta). Hay flags en la serie leucocitaria para desvío a la izquierda y granulocitos inmaduros, linfocitos atípicos y blastos, y un más amplio slide review; en la plaquetaria, hay flags para exceso de pulsos junto TABLA 1.2 Tecnología utilizada en los recuentos de glóbulos por las cuatro líneas de instrumentos analizadas en el texto Beckman Cell-dyn Sysmex Advia Coulter Abbott Roche Siemens Eritrocitos Impedancia Impedancia Impedancia Impedancia y óptica Leucocitos Impedancia Óptica y Impedancia Óptica fluorescencia y óptica Plaquetas Impedancia Óptica Impedancia; Óptica impedancia; óptica/fluoinmunofluo- rescencia rescencia (alternativa) (opcional) Reticulocitos Coloración Fluorescencia Fluorescencia Fluorescencia (opcional) con nuevo con CD4K530 con polimetina con oxazina azul de 750 metileno

19 Hemograma 39 a los extremos del intervalo volumétrico y presencia de agregados. La máquina proporciona una interpretación de fábrica, que imprime macrocitosis o microcitosis, hipocromía o hipercromía, etc., de acuerdo con los límites de referencia que atribuye a las cifras; identifica y señala incluso población dimórfica mediante el análisis del histograma. El canal de reticulocitos (determinación opcional) proporciona el recuento, el volumen promedio de los reticulocitos y la fracción reticulocitaria inmadura. El más avanzado y reciente modelo de la serie, el Coulter LH750, puede ser ofrecido anexado a un equipo capaz de preparar extendidos y teñir láminas (Figura 1.3) obedeciendo criterios de una central inteligente. Línea Cell-Dyn Abbott (Cell-Dyn 4000 y Sapphire) Esta línea tiene las siguientes características, algunas innovadoras: n Óptica con láser de argón, con potencia capaz de excitar fluorescencia en las células marcadas con yoduro de propidium para el ADN, y con una fluoresceína propia (CD4K530 ) para el ARN, lo A B FIGURA 1.2 Scatterplots, vistos en el monitor, de leucogramas del Coulter STKS (A) y del Cell-Dyn 4000 (B). El punteado verde excesivo en (B) indica eosinofilia.

20 40 Renato Failace y cols. que permite identificar la fracción de leucocitos inviables, los eritroblastos, y hacer el recuento de reticulocitos. Lectura simultánea de todos los datos en la flow cell, con laser scatter en cuatro ángulos y fluorescencia. Impedancia perfeccionada por flujo forzado. Las células son marcadas con códigos de color. Un ejemplo del scatterplot en el monitor se ve en la Figura 1.2 (B); el punteado verde excesivo ilustra presencia de eosinofilia. Un ejemplo completo de la worksheet en colores, ofrecida como opción para uso en el laboratorio, de hemograma muy alterado de un recién nacido puede verse en la Figura 19.1, p Recuento de leucocitos reproducible hasta /mL. Recuento de plaquetas por doble tecnología, automáticamente extendida en casos con trombocitopenia; mantiene satisfactoria precisión entre y 2 millones/ml. Existe, además, un recuento inmunofenotípico opcional, con marca fluorescente del CD61, considerado como método de referencia para recuento de plaquetas. La misma coloración inmunofluorescente permite, de modo opcional, el recuento de linfocitos CD4 y CD8. Figura 1.3 Contador Coulter LH750, acoplado a equipo automatizado para extender y teñir láminas. (Cortesía del Laboratorio del Hosp. St. Louis, París, 2007.)

21 Hemograma 41 El modelo Cell-Dyn 4000 salió de línea y fue sustituido por el nuevo modelo Cell-Dyn Sapphire, que puede verse en la Figura 1.4. Abbott ofrece otros dos modelos de contadores de gran tamaño, más sencillos y económicos: Cell-Dyn 3500 y Línea Sysmex Roche (Sysmex XE 2100) El uso de tecnología de impedancia con corriente eléctrica de doble frecuencia se asemeja al de la línea Coulter. El sistema es alineado en foco hidrodinámico, con vaina de solvente, impidiendo falsos pulsos. Los leucocitos son contados en el sistema de impedancia y, nuevamente, en la citometría de flujo. La identificación se hace por light scatter frontal (mide el tamaño) y lateral (evalúa el contenido, principalmente las características nucleares). La fluorescencia se evalúa en fotodetector lateral. El canal de reticulocitos, con un software apropiado que viene junto con el instrumento, permite una evaluación en unidades arbitrarias (RET Y y RBC Y) del volumen de los reticulocitos y de los eritrocitos y un recuento de plaquetas reticuladas (ver Capítulo 18, p. 312). Figura 1.4 Cell-Dyn Sapphire. (Cortesía del Laboratorio Richet, Río de Janeiro, 2008.)

22 42 Renato Failace y cols. La línea Sysmex tiene buena aceptación en Brasil porque equilibra calidad/precio. La Sysmex-Roche también ofrece un modelo con tecnología de preparación automática de láminas en casos seleccionados por una central inteligente (ver Figura 1.5) y un modelo, también de gran tamaño, pero más sencillo y económico (XS-1000). Línea Advia Siemens (Advia 120) Desde los primeros modelos, en los años 70, esa línea, originalmente japonesa, de contadores electrónicos utiliza dos técnicas únicas: Coloración citoquímica de mieloperoxidasa para identificación de granulocitos en el leucograma; el canal de peroxidasa es eficaz en la diferenciación y permite el diagnóstico inmediato de la deficiencia genética, no rara, de mieloperoxidasa. El recuento y la medición de eritrocitos (tras esferación isovolumétrica) y de plaquetas se hace por laser scatter en dos ángulos; el Figura 1.5 Dos conjuntos Sysmex XED-SP 1000 con dispositivos automáticos para distensión y tinción de láminas. (Cortesía del Laboratorio Weinmann, Porto Alegre, 2008.)

23 Hemograma 43 índice de refracción se correlaciona con la densidad celular y permite determinar la concentración hemoglobínica individual de los eritrocitos. La máquina proporciona la media (CHCM = cell hemoglobin concentration mean) y una curva de frecuencia de los valores individuales, cuantificando hipocromía e hipercromía con números estadísticos. La técnica también se aplica al canal de reticulocitos: se obtiene el volumen (VCMr) y el contenido hemoglobínico (HCr) reticulocíticos promedio. La Figura 1.6 muestra el instrumento Advia 120. El precio y la dificultad de mantenimiento de la línea Advia en Brasil hacen que sea menos competitiva que la Sysmex, razón de que sea menos difundida. Sysmex Cella Vision Es un contador electrónico acoplado a un sistema de microscopia de alta calidad. El instrumento busca los leucocitos en el exten- Figura 1.6 Instrumento Advia 120 en la mesa de trabajo. (Cortesía del Laboratorio de la Santa Casa de Misericordia, Porto Alegre, 2008.)

24 44 Renato Failace y cols. dido sanguíneo, digitaliza y traspone las imágenes microscópicas al sistema, identifica los tipos celulares por comparación con un banco de datos y proporciona una fórmula leucocitaria visual automatizada. Todas las imágenes pueden ser revisadas y la fórmula puede ser modificada por un observador, con la facilidad de notable ampliación (Figura 1.7), liberada directamente para la interface, o bien las imágenes pueden ser enviadas por Internet para que sean examinadas por especialista en la central técnica del laboratorio. Ese notable equipo, a pesar de ser caro, ya se encuentra operando en Brasil. MICROSCOPIA Aunque la observación tradicional al microscopio sigue siendo insustituible en casos particulares, la imposibilidad de mantener un cuadro de personal, con técnicos experimentados, capaces de examinar centenas o miles de láminas al día, venció la resistencia y los escrúpulos de los más intransigentes adeptos de la microscopia uni- FIGURA 1.7 Instrumento Cella Vision con leucocitos en la pantalla. (Cortesía de la Sysmex.)

25 Hemograma 45 versal. En todos los grandes laboratorios que utilizan contadores con fórmula leucocitaria completa, el examen al microscopio actualmente sólo se realiza en casos seleccionados. En lugares donde esa política, que actualmente es general, aun compite con hemogramas hechos al viejo estilo, con contadores pequeños y fórmula visual (manual), esa orientación debe ser anotada en el resultado. Con excepción del hemograma de instituciones cerradas (como hospitales universitarios), en que el cuerpo clínico está formalmente informado de los nuevos tiempos, cabe al médico solicitante incluso pedir examen microscópico complementario cuando lo juzgue necesario. En muchos hospitales, los médicos reciben el resultado directamente del contador, on line con el sistema de computadores de la entidad. El solicitante sabe lo que va recibir al solicitar el hemograma. Pero en laboratorios abiertos al público y a los médicos en general, ha sido difícil difundir el conocimiento de que recibirán un hemograma increíblemente exacto en cuanto a los números, pero limitado a la visión de las máquinas en la identificación celular. A pesar de la maravillosa tecnología electrónica, las máquinas no lo ven todo, y lo que no ven puede ser clínicamente significativo o, al menos, biológicamente relevante. Criterios para indicación de microscopia La consulta a varios laboratorios de gran tamaño en Brasil mostró cierta homogeneidad de criterios; suelen ir a la microscopia láminas de los hemogramas que se encuadran en ciertos criterios de identificación y procedencia, que tengan flags de las máquinas o tengan resultados numéricos fuera de los límites de referencia, todos analizados a continuación: 1. Edad: < 5 años. Motivo: la frecuencia de desvío a la izquierda por diarrea o virosis y la dificultad de definir valores de referencia en ese grupo etario. 2. Edad: > 75 años. Motivo: la gran prevalencia de enfermedades crónicas subclínicas; incluso con números normales podrá haber policromasia ( anoxemia?), rouleaux, neutrófilos hipersegmentados, etc. 3. Procedencia: hemogramas provenientes de clínicas oncohematológicas, todos los pacientes internados o solamente los de la UTI, o de otros sectores en que predominen pacientes graves.

26 46 Renato Failace y cols. 4. En laboratorio de hospital o clínica en que la informática permita delta-check: hacerlo, limitándolo a 30 días y tolerando ± 10% de variación. 5. Pedidos médicos específicos: investigación de linfocitos atípicos, de esferocitos, pedido de monotest, etc. 6. Flags emitidos por el aparato: no suelen diferir mucho entre los diversos contadores electrónicos. Generalmente son: ImmGrans/ bands, Blasts, Variant lymphs, NRBC, Plt.Clumps, Review slide. Todos exigen microscopia. 7. Límites de referencia de los parámetros numéricos: varían poco entre los laboratorios consultados. Los números del cuadro presentado más abajo son los recomendados por el autor. La concordancia de criterios entre los laboratorios locales no implica en concordancia internacional. A continuación, ejemplos ilustrativos. El laboratorio del Hospital Saint Louis (París) opta por una política simplista: los médicos reciben solamente una transcripción por interface de los datos numéricos proporcionados por las máquinas, sin participación humana alguna salvo en el control de calidad; sólo se hace microscopia mediante pedido escrito del médico solicitante. Por otro lado, los laboratorios del St. Mary s Hospital (Londres) y del New York-Presbiterian (Cornell Medical Center, New York) se Eritrocitos < 3,8 > 6 M/mL Hemoglobina < 1 > 17 g/dl VCM < 78 > 100 fl CHCM < 31 > 36 % RDW > 15 % Leucocitos < > /ml Neutrófilos < > /ml < 30 > 75 % Linfocitos < > /ml Monocitos > /ml Eosinófilos > /ml Basófilos >2 % Plaquetas < > /ml