COMISIÓN NACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA MARCACIÓN DE INSULINA CON Y SU USO EN TÉCNICA "IN-VIVO E IN- VITRO"

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1 CNEA-185 REPÚBLICA ARGENTINA COMISIÓN NACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA MARCACIÓN DE INSULINA CON Y SU USO EN TÉCNICA "IN-VIVO E IN- VITRO" por Aldo E. A. Mitta y Hernán Juárez Peña Ka BUENOS AIRES 1965

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3 MARCACIÓN DE INSULINA CON Y SU USO EN TÉCNICAS IN-VIVO E IN-VITRO Aldo E. A. Mitta y Hernán Juárez Peñalva Comisión Nacional de Energía Atómica INTRODUCCIÓN Desde el descubrimiento de la insulina por Banting y Best en el año 1921 el pronóstico de los enfermos con Diabetes Sacarina, mejoró notablemente a medida que se fué conociendo mejor su uso. Dada su estructura proteica, y debido a la imposibilidad de formar un compuesto insulínico administrable por vía oral, la única vía de administración de la insulina, en todas sus formas, es la parenteral. Además, por tratarse de una proteína y debido a que la insulina obtenible en forma comercial proviene de páncreas de animales vacunos o porcinos, la formación de anticuerpos- anti-insulina es un fenómeno conocido, como asimismo las reacciones alérgicas locales y generales. Uno de los métodos modernos de diagnóstico para la determinación de anticuerpos anti-insulina en suero, utiliza la insulina radiactiva marcada con Las determinaciones de anticuerpos con insulina descriptas en la literatura médica, se han efectuado utilizando el producto comercial de los Laboratorios Abbott de U. S.A. (1) y en los experimen tos publicados por Berson y col. (2), el producto marcado por el mismo. La División Moléculas Marcadas del Departamento de Química de la Dirección de Investigaciones de la Comisión Nacional de Energía Atómica, recientemente ha logrado obtener insulina marcada con El objeto de esta comunicación es describir brevemente lá técnica de marcación de esta insulina 1-131, como asimismo los resultados obtenidos con su uso, en el estudio del turaover hepático in-vivo en enfermos no diabéticos y diabéticos, y "en la determinación in-vitro para el estudio de la capacidad de la globulina sérica de unirse a la insulina-i-131.

4 4 Antecedentes. MARCACIÓN DE LA INSULINA Los métodos de marcación de insulina se basan en la fijación del yodo radiactivo sobre la proteína. El yodo radiactivo se libera de la solución para su posterior fijación por acción de un oxidante como el sulfato de hierro (3), nitrito de sodio (4, 5, 6, 7), yodato de potasio (8, 9), cloramina-t (10, 11), dicromato de potasio (11),o bien se usa en forma de cloruro de yodo radiactivo (12, 13, 14). De los métodos señalados hemos elegido, por su sencillez y fácil manipulación, el de J. J. Haxle y P. J. Kestens (14), que utiliza cloruro de yodo, y la eliminación del yoduro radiactivo la hemos hecho por diálisis (11). Este método permite, poniendo en juego pocos milicuries de yoduro de sodio, radiactivo, obtener una actividad especifica suficientememte alta. Además la insulina radiactiva no aparece dañada, Lo que hace innecesaria su purificación por columna de celulosa. Durante los ensayos preliminares se utilizó otro método (8) comprobándose que la insulina resultaba dañada. Técnica Utilizada. Se utiliza insulina pura, 7 veces recristalizada. En un tubo de 10 mi de capacidad, se colocan 8 mci de yoduro de sodio-i-131 sin portador ni reductor, se Le, añaden 3 gotas de solución de cloruro de yodo (14) y 5 gotas de buffer de glici na PH 9. Aparte se toman 0,250 mg de insulina en buffer de glicina ph 9; se mezclan y ambas soluciones, se dejan en contacto 3 minutos y se baja luego el ph a 7.3 coa HC1 0.1N; se pasa a un tubo de diálisis y se deja 12 horas bajo agua corriente.se extrae y coloca en un frasco antibiótico, previo pasaje por un filtro de milliporo. Controles. Aparte del control radiactivo del producto preparado, se lo somete a control de esterilidad, carencia de substancias pirógenas y se determina la presencia de yoduros inorgánicos. Para este ensayo se utilizan: a) Cromatografía sobre placas delgadas (15), usando como disolventes (16) una mezcla de acetona; n-butanol; amoníaco concentrado y agua (65: 20: 20: 5). Tiempo de corrida, 30 minutos; Rf de insulina, 0-00 y Rf de yoduro, b) Electroforesis sobre papel Whatman en solución de barbiturato de sodio ph minutos (9). TURNOVER HEPÁTICO El paciente reposando en decúbito dorsal; sobre región hepática, distante 7 cm, se coloca un cabezal provisto de un cristal de dos pulgadas, unido a un esca límetro 20 sujetos normales (testigos), 15 diabéticos que no necesitaban insulinoterapia y 20 diabéticos que requerían terapéutica insulínica, fueron estudiados. A cada enfermo se administró uci de insulina por vía intrava nosa; desde un minuto después de la inyección y por espacio de 40 y 80 minutos, se e- fectuaron lecturas cada minuto: a partir del momento del valor máximo (c.p.m.) de

5 5 captación hepática, se midió el tiempo medio(t/2) en que la radioactividad decayó al 50% y se compararon las distintas curvas. Se obtuvieron muestras sanguíneas a los 2,15,30, y 60 minutos después de la inyección de la substancia trazadora. Previa centrifugación y una vez separado el suero, se midió la radiactividad de las mismas en 1.0 mi alícuotas de suero y en el precipitado de este con, ácido tricloroacético al 10%, en un contador de centelleo unido a un pozo conteniendo un cristal de 2 por 2 pulgadas. La radiactividad del precipitado se consideró como unida a las proteínas (insulina no metabolizada) y se la expresó en, por ciento de la radiactividad total. TÉCNICA IN-VITRO Estos estudios se realizaron usando el papel de resina que contiene una resina débil cambia aniones, Papel-WB-2*. El buffer usado fué el de acetato a ph4- La técnica empleada fué la propuesta por Mitchell (17). RESULTADOS Como lo demuestra la Fig.l las curvas de los controles normales y de los diabéticos no tratados con insulina, tienen un t/2 de 25/45 minutos. Los enfermos diabéticos con exceso de anticuerpos y los que reciben tratamiento insulínico, prolongan este tiempo medio. El caso extremo, en el cual el t/2 esta muy prolongado, corresponde a los enfermos diabéticos resistentes a la insulina; este ultimo tipo de enfermos no es frecuente,' no obstante hemos tenido la oportunidad de estudiar a 3 de ellos. La degradación de la insulina in vivo, tiene una correlación paralela al turno ver hepático. En las muestras sanguíneas seriadas obtenidas, el porcentaje de radiactividad del precipitado sérico fué, en los controles normales, del 50-65% a los minutos después de inyectada la insulina; el suero de los enfermos diabéticos que responden al tratamiento insulínico, mostró en su precipitado un 70-75% de la radiactividad total, sugiriendo por lo tanto que un 25-30% de insulina ha sido utilizada. El precipitado sérico de los enfermos resistentes a la insulina mostró a los 60 minutos, y aún después de varias horas, el % de la radiactividad total, sugiriendo por lo tanto, una falta absoluta de utilización de insulina. El índice de unión de la insulina por las globulinas séricas, medido in vitro, disminuye a medida que aumentan los anticuerpos. La figura 2 muestra nuestros resultados, en donde pueden apreciarse estas variaciones; no se han incluido los resultados de los diabéticos resistentes a la insulina, pero en estos, el índice fué aún menor (5-30%), hecho por otra parte comprobado por Mitchell y col. (17-18). DISCUSIÓN Entre las técnicas de marcación que aparecen en la literatura, hemos adoptado por su rapidez, sencillez y fácil manipulación, el método de Haxle y Kestens y para purificar, el de R. Banerjee y col., habiéndose conseguido una insulina de mci/mg. * Obtenido de Reeve Ángel Clifton - New Jersey - U.S.A.

6 6 Los resultados expuestos en el presente informe, reproducen observaciones anteriores (1, 17); en este estudio, se utilizó Insulina-I-131 marcada por la Comisión Nacional de Energía Atómica. La marcación de este producto por la CNEA, lograda recientemente, facilita los envíos periódicos y el menor costo; ha permitido, además, la puesta a punto de técnicas necesarias en el campo de la investí gación clínica y básica, así como en métodos modernos de diagnóstico. La técnica recientemente descripta por Randle (19), para medir actividad ir.sulínica en suero, se efectúa con insulina 1-131, esta técnica, basada en un fenómeno inmunológico, quizá reemplace a la propuesta hace unos años por Berson y Yallow (20), sobre todo para efectuar estas determinaciones en enfermos no diabéticos y en diabéticos que nunca han recibido insulina, dada su mayor simplicidad y la actividad específica menor del isótopo que emplea. La discusión fisiopatológica de los resultados expuestos en este trabajo, escapa a las intenciones de los autores, y será efectuada en otra próxima publicación que será completada con los resultados del estudio de transporte de insulina mediante Li electroforesis de contracorriente, usando insulina Si bien es cierto que la marcación de ciertas moléculas interesa más al médico investigador que al médico práctico,, en el caso en particular de i a insulina 1-131, interesa a ambos, por cuanto algunas de las técnicas descriptas tienen a veces mucha importancia en el diagnóstico y evolución terapéutica de los cas<^s de resistencia a la insulina (21, 22), y es de gran importancia en el diagnóstico de los insulinomas hiperfuncionantes (23). La información obtenida mediante estos estudios, es un recurso complementario para perfeccionar el estudio de ciertos enfermos. El desarrollo de estas técnicas y otras, mediante el uso de la insulina marcada con yodo radiactivo, en los laboratorios adecuadamente montados para ello, complementa el diagnóstico y la orientación terapéutica (a veces muy importante), de ciertas afecciones mencionadas anteriormente. Los autores agradecen a los Laboratorios Eli Lilly and Company of Argentina, Inc. (Buenos Aires), la insulina utilizada para estas experiencias. Asimismo agradecen al Profesor Dr. Héctor Cotta, las críticas y sugerencias en la confección de este Trabajo.

7 XDiabético resistente e Diabético no tratado con insulina Diabético tratado con insulina Diabético con aumento de anticuerpos Enfermo no diabético-controi ~i r~ 1 1 i minutos figura i

8 8 normales diabéticos no tratados con insulina diabéticos tratados con insulina < 50 u diabéticos tratados con insulina u figura 2

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