UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales COLOQUIO N 6/15 FUNDAMENTOS DE SECUENCIACIÓN

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Francisca Escobar Núñez
hace 6 años
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1 COLOQUIO N 6/15 FUNDAMENTOS DE SECUENCIACIÓN OBJETIVO: el presente trabajo práctico tiene como objetivo principal que el alumno adquiera destreza en el análisis de electroferogramas generados por equipos automatizados de secuenciación. I. Introducción Secuenciación se define como el método que permite determinar el orden de los nucleótidos (G, A, T/U, C) en un fragmento de ADN o ARN. El término también hace referencia al orden de aminoácidos de la proteína. El fragmento a secuenciar puede ser pequeño (~500pb) como también puede ser el genoma entero de un organismo. El orden de A, C, G y T dentro de la cadena de ADN determina los codones START y STOP, cuando el gen es expresado y, lo mas importante, provee la información que especifica la secuencia de aminoácidos de la proteína, cuando el gen es codificante. El proceso detallado de secuenciación se realiza en el laboratorio y permite detectar pequeños cambios dentro del gen, los cuales pueden determinar un polimorfismo poblacional, una patología clínica, una nueva especie, etc. Uno de los métodos de secuenciación mas utilizado es el conocido como secuenciación de terminación de cadena (chain termination sequencing) o secuenciación enzimática o simplemente secuenciación de Sanger, en honor a su inventor el bioquímico Frederick Sanger (quien ganó su segundo premio Nobel por la técnica). El método de Sanger se basa en el principio de que las cadenas de ADN normalmente están formadas a partir de nucleótidos deoxi (dntps), aunque emplea también dideoxinucleótidos (didntps o simplemente ddntps). La diferencia entre los dos tipos de moléculas (Figura 1) se encuentra en la posición 3', lugar donde normalmente se establece la unión entre dos nucleótidos consecutivos para formar la cadena de ADN. Si no existe un grupo OH en esa posición, el enlace que une el nucleótido entrante no puede realizarse, interrumpiendo así la elongación de la cadena. Figura 1: Representación esquemática de la diferencia entre un dideoxinucleótido (llamado también stopnucleotide) y un deoxinucleótido (nucleótido normal).

2 La mezcla de reacción de la PCR de secuenciación contiene una miscelánea de nucleótidos deoxy (dntp s normales) juntamente con una pequeña cantidad de nucleótidos dideoxy (o terminadores). Durante este proceso de amplificación cada nucleótido incorporado es complementario al nucleótido existente (C si hay G o A si hay T, y viceversa) pero al azar (por ej. datp o didatp) en el extremo terminal 3' de la nueva cadena en crecimiento. Si la base incorporada es un dideoxinucleótido (por ej. didatp), la polimerasa no puede continuar elongando la cadena en crecimiento porque el extremo 3' posee un H. La nueva cadena deja de ser elongada en ese punto. Por el contrario, si la base incorporada es un deoxinucleótido (por ej. datp) la cadena continuará creciendo hasta que otro dideoxinucleótido se incorpore. Debido a que los dideoxy se encuentran en menor proporción, cada vez que al azar uno de ellos es incorporado, se aborta la síntesis de esa cadena. Esto genera una mezcla de cadenas de diferente longitud entre las varias cadenas que se sintetizan simultáneamente durante el proceso de amplificación de la PCR. Inicialmente, se usaba PAGE para ordenar las cadenas sintetizadas desde la mayor (parte superior del gel) hasta la de menor tamaño (parte inferior del gel) y posteriormente, mediante detección por rayos-x se determinaba el codon marcado radiactivamente en cada cadena. (Figura 2). Desde 1986, el proceso de lectura de la secuencia de las bases C, T, G y A de una molécula de ADN puede ser realizado en un secuenciador automático de fluorescencia (no radiactivo). Este aparato utiliza los mismos principios que el método de Sanger, o sea los nucleótidos terminadores, pero con la diferencia de que un láser escanea continuamente la región final del gel, detectando las bandas que migran. Mientras que el método manual usaba marcado radiactivo, los secuenciadores automáticos usan marcado fluorescente en los didntps. Esto hace posible que los 4 nucleótidos (dgtp, datp, dctp, y dttp) corran al mismo tiempo en el gel (y no en 4 reacciones separadas como en el método Sanger original) aumentando así en 4 veces la velocidad de la secuenciación. Posteriormente, aparecieron secuenciadores automáticos donde los geles fueron reemplazados por capilares, haciendo el método extremadamente eficiente y aplicable a cualquier tipo de fragmento de ADN. La resolución es tan alta que un simple nucleótido de más es suficiente para separar esa cadena de la próxima más larga y de la anterior mas corta. Al ser iluminados por un láser, cada uno de los 4 dideoxinucleótidos fluoresce con un color diferente que es detectado por un scanner automático el cual realiza la lectura de esa intensidad de luz, que es interpretada por un software que construye la secuencia impresa (Figura 3).

3 Figura 2: Ejemplificación gráfica de cómo se realizaba la secuenciación por el método Sanger original. Este método separa las moléculas por su tamaño en PAGE y posteriormente identificando los didntps radioactivos mediante rayos-x.

4 Figura 3: Ejemplo de cuatro corridas de secuenciación automática. En A y B se muestra en la parte superior el electrofenograma de la secuencia alterada (paciente afectado) y en la parte inferior se muestra la secuencia patrón (paciente normal). Animaciones complementarias en:

5 Protocolo para secuenciación automática Paso 1: Primera PCR Realizar una reacción de PCR estándar del fragmento que se desea secuenciar (ver prácticos anteriores) Paso 2: Purificar la muestra de ADN amplificado Este paso es extremadamente importante ya que permite eliminar todos los componentes que sobran de la 1º PCR (restos de primers, dntp, enzima Taq, etc.) los cuales podrían inhibir o contaminar los pasos siguientes. Los métodos de purificación son varios y dependen del tipo de secuenciador que se disponga (Megabase, ABI, ROCHE etc.) una de las opciones utiliza sucesivos pasos de centrifugación con kits de columnas descartables que tienen la capacidad de retener el ADN amplificado pero dejando pasar las impurezas. Después de realizar el proceso de purificación, independientemente de cual sea, se procede a constatar la concentración de la muestra del ADN. Se toman 2 µl de la muestra (con 1 µl de buffer de carga) y se aplica juntamente con un patrón de intensidad de bandas, en un gel de chequeo de agarosa al 2%. La comparación de la intensidad de la banda de nuestra muestra con el patrón (Figura 4) nos permite determinar visualmente la concentración (en ng) del ADN. Con la concentración establecida podemos ahora determinar cuántos µl de ADN usaremos para realizar la segunda PCR. Paso 3: Reacción de secuenciación Para secuenciar un fragmento de cadena simple de DNA, su cadena complementaria es sintetizada usando una segunda reacción de PCR especial cuyo mix contiene: Una mezcla de los 4 nucleótidos normales (deoxi) en grandes cantidades o datp + dgtp + dctp + dttp una mezcla de los 4 dideoxinucleótidos, cada uno presente en cantidades limitadas y marcado con un "tag" fluorescente de diferente color o didatp + didgtp + didctp + didttp ADN polimerasa el fragmento de ADN a secuenciar (previamente amplificado) primers # agua ultra pura (o Milli-Q) autoclavada

6 Todos los componentes se colocan en un tubo que va a la máquina de PCR (ver practico anterior), debidamente identificadas com nombre o número e indicando el tipo de primer. 100ng 60ng 40ng 20ng 10ng 5ng Figura 4: En la imagen se muestra el patrón Low DNA mass ladder (Invitrogen) usado para cuantificar la concentración del ADN en agarosa al 2%. Los nanogramos (ng) de cada banda corresponden a 2µl de del marcador sembrado. # ATENCION: el secuenciador no puede leer ambas cadenas (molde y complementaria) simultáneamente. Por eso cada cadena se secuencia por separado. Para la 2º PCR un tubo contiene el cóctel de PCR y solo un primer (e.g. únicamente forward) y en otro tubo se coloca el mismo mix de PCR pero con el primer restante (e.g. únicamente reverse). Paso 4: Precipitación con etanol Algunos secuenciadores reciben la muestra a secuenciar en seco y solamente en los minutos previos a colocar la muestras para la lectura, resuspenden el material en formamida (ABI) o en otros loadings especificos (Megabase). Por este motivo explicaremos la precipitación con etanol. Al tubo que contiene la muestra se le agrega 28µl de etanol 100% helado y se centrifuga el tubo a 15000g por 15 min.

7 Posteriomente, se aspira y descarta con la pipeta todo el sobrenadante con cuidado de no tocar las paredes del tubo donde el ADN se encuentra adherido. Por segunda vez se coloca etanol 75%, pero un volumen mayor (100µl). La mezcla se resuspende y centrifuga igual que en el paso anterior. Finalmente, se aspira y descarta todo el sobrenadante (sin tocar las paredes o el fondo del tubo) y se deja secar el tubo por 24hs a temperatura ambiente y protegido de la luz (porque los didntps son fluorescentes y por tanto fotosensibles). Las muestras son sometidas al secuenciador, juntamente con una ficha identificando cada tubo. La identificación no sólo se refiere al origen de la muestra (e.g. nombre o número de la muestra), sino que también información referida al primer que se encuentra en cada tubo (forward o reverse); esto significa que serán entregados dos tubos por cada paciente/muestra.

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