Int. Cl. 7 : C12N 9/ Inventor/es: Kajiyama, Naoki. 74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

Transcripción

1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N 9/02 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Enzima que participa en la regeneración de la luciferina. Prioridad: US P 73 Titular/es: KIKKOMAN CORPORATION 339 Noda Noda-shi, Chiba , JP 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Kajiyama, Naoki 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Enzima que participa en la regeneración de la luciferina La presente invención se refiere a una enzima que participa en la regeneración de luciferina. La bioluminiscencia es una reacción de oxidación catalizada por la luciferasa con la luciferina como sustrato de luminiscencia, y se forma oxiluciferina como el producto de la reacción. La enzima luciferasa se ha aislado y se ha purificado a partir de la Luciola cruciata (EP-A , Kikkoman Corporation). Esta oxiluciferina se conoce como inhibidor de esta reacción de la luciferasa, por lo que se sabe que la luminiscencia de la reacción luciferina/luciferasa disminuye rápidamente tras la luminiscencia instantánea inmediatamente tras la reacción. Se ha sugerido la posibilidad de conversión de oxiluciferina a luciferina in vivo (Okada et al, Tetrahedron Letters Nº 32, págs , 1974). Sin embargo, no se aisló, ni se purificó, ninguna enzima que actuara sobre la oxiluciferina para regenerar la luciferina como sustrato de luminiscencia. De hecho, Okada et al establecen que la transformación de oxiluciferina en luciferina puede que no se catalice enzimáticamente. Si se encontrara y se añadiera tal enzima al sistema de reacción luciferina/luciferasa, caben esperarse mejoras en la durabilidad de la luminiscencia y conducirán, por ejemplo, a la reducción de la cantidad de luciferasa y luciferina utilizadas. El objeto de la presente invención es proporcionar una enzima que tenga la capacidad de regenerar luciferina actuando sobre la oxiluciferina y la D-cisteína. Como resultado de una intensa investigación, los presentes inventores encontraron que una enzima que tiene la capacidad de regenerar la luciferina actuando sobre la oxiluciferina y la D-cisteína está presente en los coleópteros vivos, y aislaron y purificaron satisfactoriamente la enzima. En consecuencia, la presente invención proporciona una enzima derivada de los coleópteros, con un peso molecular de aproximadamente.000, tal como se determina por SDS-PAGE, y que regenera la luciferina a partir de la oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la que el ph óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera la luciferina son ph 7-8 y de 3 a 0ºC, respectivamente. La presente invención también proporciona una enzima derivada de los coleópteros, con un peso molecular de aproximadamente.000, tal como se determina por SDS- PAGE, y que regenera la luciferina a partir de la oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la que el ph óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera la luciferina son ph 8-9 y de 0 a 70ºC, respectivamente. La invención también proporciona el uso de la enzima de la invención en un sistema de reacción luciferina/luciferasa. Tal enzima con capacidad para regenerar la luciferina actuando sobre la oxiluciferina y la D-cisteína, puede obtenerse mediante la purificación de un extracto a partir de un coleóptero a través de etapas de purificación que incluyen una etapa cromatográfica. La enzima puede obtenerse así a partir de un coleóptero, normalmente una luciérnaga. La luciérnaga puede ser la Photinus pyralis (luciérnaga de Norteamérica). Alternativamente, la luciérnaga es una luciérnaga japonesa, en concreto la Luciola cruciata o la Luciola lateralis. La enzima de la invención tiene un peso molecular de aproximadamente.000 tal como se determina por SDS- PAGE. El ph óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera la luciferina son ph 7-8 y de 3 a 0ºC, respectivamente. Alternativamente, el ph óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera la luciferina son ph 8-9 y de 0 a 70ºC, respectivamente. La presente invención se describe en detalle a continuación. Para producir la presente enzima, puede utilizarse cualquier método. Por ejemplo, puede mencionarse el método siguiente. Las fuentes de la presente enzima incluyen coleópteros, tales como las luciérnagas, extractos de enzimas brutos obtenidos a partir de luciérnagas comercialmente disponibles, y recombinantes producidos mediante el uso de medios de recombinación genética. A continuación, tales fuentes que contienen la presente enzima se disgregan, se lisan o se solubilizan en un tampón. El tampón no está limitado, a menos que la presente enzima se inactive en él. Ejemplos son el tampón Tris, el tampón fosfato, el tampón glicilglicina, etc. 6 Para su destrucción puede utilizarse: un mortero y mano de mortero, un homogeneizador, una trituradora ( waring blender ), una prensa francesa ( French press ), etc. Para el lisado puede utilizarse un tratamiento con lisozima, etc. 2

3 1 A continuación, se obtiene una solución de enzima bruta mediante la centrifugación o la filtración de los materiales disgregados, lisados o solubilizados de una manera habitual para la eliminación residuos. Si es necesario, puede obtenerse polvo de enzima bruta a partir de la solución de enzima bruta mediante la elección adecuada de precipitación con sulfato de amonio, precipitación con alcohol, precipitación con acetona, etc. Puede obtenerse una preparación de enzima purificada a partir de la solución de enzima bruta o polvo de enzima bruta mediante una elección adecuada de una de las técnicas siguientes: filtración en gel utilizando Sephadex (marca registrada), Ultrogel (marca registrada), Bio-Gel (marca registrada), etc., un método de adsorción - elución utilizando intercambiadores iónicos, electroforesis utilizando gel de poliacrilamida, etc., un método de adsorción - elución utilizando hidroxiapatita, sedimentación tal como la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, etc., separación basada en una diferencia en el punto isoeléctrico, cromatografía de afinidad, fraccionamiento utilizando una membrana de tamiz molecular, membrana de fibra hueca, etc. El efecto de la presente invención es tal como sigue: se proporciona una enzima con la capacidad de regenerar la luciferina mediante actuación sobre la oxiluciferina y la D-cisteína según la presente invención, y mediante la adición de esta enzima a un sistema de reacción luciferina/luciferasa, puede persistir la luminiscencia y pueden reducirse la cantidad de luciferasa y luciferina utilizadas. Ejemplos A continuación, la presente invención se describe en más detalle haciendo referencia a los ejemplos. Ejemplo Se disolvieron 4 g de extracto del órgano luminoso de la luciérnaga (SIGMA) en 0 ml de tampón A (ph 7,0), es decir, tampón Tris(hidroximetil)aminometano - ácido clorhídrico (Tris-HCl) 2 mm que contiene cloruro de sodio 0 mm, ditiotreitol 1 mm, etilendiaminotetraacetato de disodio 1 mm, y glicerol al % (p/v). La solución así obtenida se precipitó con sulfato de amonio de manera habitual, y el precipitado que se produce entre el % y el % de saturación con sulfato de amonio se disolvió en ml de tampón A. A continuación, esta solución se sometió a cromatografía de filtración en gel haciéndola pasar a través de una columna de Ultrogel (marca registrada) AcA34 (IBF) previamente equilibrada con el tampón A para dar una fracción activa. La fracción así obtenida se dializó frente al tampón B (ph 6,), es decir, tampón TRIS-HCl que contenía ditiotreitol 1 mm, etilendiaminotetraacetato de disodio 1 mm, glicerol al % (p/v) y cloruro de sodio 1 mm. La solución resultante se adsorbió en una columna de S-Sepharose FF (Pharmacia Biotech) previamente equilibrada con el tampón B, y la enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1-0 mm para dar una fracción activa. La fracción activa así obtenida se dializó frente al tampón C (una solución a ph 8,0 con la misma composición que el tampón B), después se adsorbió en una columna de HPLC de intercambio iónico (gel TSK Super Q-PW, disponible de Tosoh Corporation) previamente equilibrada con el tampón C, y la enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1-0 mm para dar una fracción activa. La fracción activa así obtenida pudo purificarse satisfactoriamente haciéndola pasar a través de una columna de HPLC de filtración en gel (gel TSK G00SWXL, disponible de Tosoh Corporation) previamente equilibrada con el tampón A. La fracción tras esta filtración en gel se analizó mediante SDS-PAGE (Laemmli, U.K.: Nature, 227, 680, (1970). El resultado indicó que el peso molecular de la enzima purificada era de aproximadamente El ph óptimo y la temperatura óptima de la presente enzima fueron ph 7-8 y 3-0ºC, respectivamente. La presente enzima mantuvo el 80% o más de la actividad original incluso tras el tratamiento térmico a 0ºC durante minutos. Ejemplo 2 Se añadieron los órganos luminosos de 0 luciérnagas (Luciola cruciata) (adquiridos de Seibu Department Store) a 1 ml de tampón A, después se disgregaron con Hiscotoron MR (NITI-ON Medical y Physical Instrument Manufacturing), y se centrifugaron a r.p.m. durante minutos para dar 14 ml de sobrenadante como una enzima bruta. Esta solución de enzima bruta se precipitó con sulfato de amonio y los precipitados que se produjeron entre el y el % de saturación con sulfato de amonio, se separaron mediante centrifugación a r.p.m. durante minutos y después se disolvieron en ml de tampón A. 3

4 Esta solución se sometió a filtración en gel a través de Ultrogel (marca registrada) AcA34 (IBF) previamente equilibrada con tampón A para dar una fracción activa La solución así obtenida se dializó frente al tampón B (ph 6,), y después se adsorbió en una columna de S-Sepharose FF (Pharmacia Biotech) previamente equilibrada con tampón B, y la enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1-0 mm para dar una fracción activa. La fracción activa así obtenida se dializó frente al tampón C (una solución a ph 8,0 con la misma composición que el tampón B), después se adsorbió en una columna de HPLC de intercambio iónico (gel TSK Super Q-PW, disponible de Tosoh Corporation) previamente equilibrada con tampón C, y la enzima se eluyó en un gradiente lineal de NaCl 1-0 mm para dar una fracción activa. La fracción activa así obtenida pudo purificarse satisfactoriamente haciéndola pasar a través de una columna de HPLC de filtración en gel (gel TSK G00SWXL, disponible de Tosoh Corporation) previamente equilibrada con tampón A. El ph óptimo y la temperatura óptima de la presente enzima fueron ph 7-8 y 3-0ºC, respectivamente. La presente enzima mantuvo el 80% o más de la actividad original incluso tras el tratamiento térmico a 0ºC durante minutos. Ejemplo 3 Se añadieron los órganos luminosos de 0 luciérnagas (Luciola lateralis) (adquiridos de Seibu Department Store) a 1 ml de tampón A, después se disgregaron con Hiscotoron MR (NITI-ON Medical y Physical Instrument Manufacturing), y se centrifugaron a r.p.m. durante minutos para dar 13 ml de sobrenadante como una enzima bruta. Esta solución de enzima bruta pudo purificarse satisfactoriamente con los mismos procedimientos que en el ejemplo 2. El ph óptimo y la temperatura óptima de la presente enzima fueron ph 8-9 y 0-70ºC, respectivamente. La presente enzima mantuvo el 80% o más de la actividad incluso tras el tratamiento térmico a 0ºC durante minutos, o el % o más de la actividad incluso tras el tratamiento térmico a ºC durante minutos. Ejemplo 4 Se examinó el efecto sobre la reacción de luciferina/luciferasa de la enzima purificada en el ejemplo 1. Se añadieron µl de la enzima purificada en el ejemplo 1 a una mezcla de µl de luciferasa de luciérnaga americana 0, µg/ml, µl de luciferina 1 mm, µl de D-cisteína mm y 0 µl de un tampón de medición de la actividad (glicilglicina 2 mm más sulfato de magnesio,4 mm (ph 7,8)). Se introdujeron 0 µl de ATP mm a esta disolución y se midió la intensidad de la luminiscencia que se producía a intervalos de segundos durante 1 minuto. Los resultados se muestran en la tabla siguiente. Como control se utilizaron µl del tampón de medición de la actividad en lugar de la enzima. Como resultado, se encontró que la adición de la presente enzima mejora la durabilidad de la luminiscencia. TABLA Tiempo (segundos) 0 0 Enzima añadida (conteo x 3 ) 7,9 6, 6, 6, 6,0 6,0 Control (conteo x 3 ),1 3,7 3,2 3,0 3,0 2,8 6 * Conteo = número de fotones regenerados Además pudo confirmarse el mismo efecto cuando se utilizó la enzima purificada en el ejemplo 2 y 3. Método de medición de la actividad Se preparó una mezcla de sustrato añadiendo 1 ml de D-cisteína 0,01 mm y 0, ml de oxiluciferina 1 mm a 8, ml del tampón de medición de la actividad (glicilglicina 2 mm más sulfato de magnesio,4 mm (ph 7,8)). Se añadieron µl de la muestra de medición a 0 µl de la mezcla anterior y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 4 horas. Esta solución de reacción, µl, se añadió a 0 µl de tampón de medición de la actividad, seguido de la introducción de 0 µl de la mezcla de ATP / luciferasa (es decir, luciferasa 0, mg/ml en ATP mm) y se acumuló la luminiscencia que se produjo durante segundos. 4

5 REIVINDICACIONES 1 1. Enzima derivada de coleópteros, con un peso molecular de aproximadamente.000, tal como se determina por SDS-PAGE, y que regenera luciferina a partir de oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la que el ph óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera luciferina son ph 7-8 y de 3 a 0ºC, respectivamente. 2. Enzima derivada de coleópteros, con un peso molecular de aproximadamente.000, tal como se determina por SDS-PAGE, y que regenera luciferina a partir de oxiluciferina en presencia de D-cisteína, en la que el ph óptimo y la temperatura óptima a la que la enzima regenera luciferina son ph 8-9 y de 0 a 70ºC, respectivamente 3. Enzima según la reivindicación 1 ó 2, que se deriva de una luciérnaga. 4. Enzima según la reivindicación 3, que se deriva de Luciola cruciata o Luciola lateralis o Photinus pyralis.. Uso de una enzima según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un sistema de reacción luciferina/luciferasa