Índice Vías de señalización Mecanismos de la ruta de secreción celular Vía de endocitosis... 34

Transcripción

1 Índice

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3 Índice Abreviaturas Introducción El Corazón Estructura y función Metabolismo cardiaco El infarto agudo de miocardio Epidemiología Fisiopatología del infarto de miocardio El metabolismo cardiaco durante y después del IAM Diagnóstico y tratamiento convencional del IAM Terapias avanzadas para el tratamiento del IAM mediante el uso de células madre mesenquimales (MSC) Características de las MSC Mecanismos terapéuticos inducidos por las MSC: Hipótesis Paracrina Los micrornas en la enfermedad cardíaca: características generales de los micrornas Los micrornas en la patología cardiaca Los micrornas y la regeneración cardiaca Mecanismos de comunicación celular Vías de señalización Mecanismos de la ruta de secreción celular Vía de endocitosis Tráfico intracelular de transportadores de glucosa (GLUTs) Exosomas como mecanismos de comunicación intercelular Objetivos Materiales y métodos Animales Cultivos Celulares Cultivos Primarios Cultivo primario de cardiomiocitos neonatales de rata y ratón Cultivo primario de endotelio Cultivo primario de endotelio humano Cultivo primario de células mesenquimales humanas Líneas Celulares

4 Expansión celular y criopreservación Recuento de la viabilidad celular Condiciones experimentales Plásmidos, Transfecciones y marcaje Lentiviral Plásmidos utilizados para la monitorización del tráfico intracelular de transportadores de glucosa Marcaje Lentiviral de exosomas Marcaje lentiviral de MSC Co-cultivos Aislamiento de exosomas a partir de medios de cultivo Método de ultracentrifugación Purificación mediante ensayo de afinidad Técnicas bioquímicas Obtención de extractos proteicos Cuantificación de proteínas Electroforesis en geles de poliacrilamida Transferencia mediante western blot Técnicas moleculares Extracción de rna Cuantificación del rna RT (transcripción reversa) y PCR en tiempo real Síntesis de cdna: Transcripción reversa Amplificación del cdna en tiempo real (qpcr) Análisis del producto de la qpcr Identificación y análisis de micrornas de exosomas provenientes de cardiomiocitos neonatales de ratón y de MSC y MSC-HIF Extracción de micrornas exosomales Síntesis de cdna, qpcr y análisis Inmunocitoquímicas Técnicas de imagen Microscopía óptica de fluorescencia Microscopía confocal Microscopía Electrónica e inmunocarcaje con oro Co-Cultivos: Análisis de transferencia de exosomas y GLUTs entre células Microscopia confocal de paso de tiempo (Time Laspe Confocal Microscopy) Cuantificación de la transferencia de exosomas y GLUTs en los co-cultivos...64

5 Cuantificación en Incell de la colocalización de GLUTs y CD63 en cultivos de CM neonatales de rata Cuantificación de síntesis y secreción de exosomas Western Blot Actividad Acetilcolinesterasa Cuantificación en InCell Analyzer Ensayos funcionales in vitro con exosomas Internalización de exosomas Activación de vías de señalización Captación de Glucosa Inhibición de GLUTs exosomales Actividad transcripcional de HUVEC Actividad Lactato Deshidrogenasa (LDH) Cuantificación de Piruvato Citometría Proteómica Técnicas in vivo: estudio del efecto terapéutico de los exosomas derivados de MSC y MSC-HIF en la reparación del IAM Animales Procedimientos quirúrgicos El infarto agudo de miocardio Parámetros de función cardiaca Eutanasia Análisis Estadístico Resultados MSC transfectadas con pwipi-hif-gfp sobreexpresan HIF-1α MSC y MSC-HIF liberan exosomas al medio de cultivo Análisis de micrornas contenidos en exosomas de MSC y MSC-HIF Efecto de los exosomas derivados de MSC y MSC-HIF en un modelo de IAM en rata El ayuno de glucosa incrementa la síntesis y la secreción de exosomas de cardiomiocitos neonatales de rata El ayuno de glucosa incrementa la secreción de exosomas de un cultivo de cardiomiocitos neonatales de rata El ayuno de glucosa incrementa la síntesis de exosomas de un cultivo de CM neonatales de rata. 87

6 El ayuno de glucosa en CM incrementa la actividad transcripcional de genes relacionados con el tráfico vesicular y las vías secretoras Análisis de la transferencia de exosomas desde CM hacia células endoteliales Caracterización de cultivos primarios de células endoteliales Caracterización de células endoteliales primarias de rata Caracterización de células endoteliales primarias de ratón RFP Marcaje lentiviral de exosomas Comportamiento de células H9c2-CD63-GFP Transferencia de Exosomas desde células cardiacas hacia células endoteliales Análisis de exosomas liberados por CM Análisis de micrornas exosomales de CM neonatales de ratón Análisis masivo del contenido de proteínas en exosomas de CM neonatales de rata Exosomas liberados por CM alteran la actividad de células endoteliales Los exosomas derivados de CM neonatales de rata alteran la actividad transcripcional de las células HUVEC Los exosomas derivados de células cardiacas activan vías de señalización en células HUVEC Los exosomas derivados de CM neonatales de rata incrementan la captación de glucosa en células endoteliales de rata Estudio de la transferencia de GLUTs entre células cardiacas y endoteliales por mediación de exosomas Los exosomas derivados de CM ayunados de glucosa contienen GLUTs Co-localización entre CD63 y GLUTs en CM neonatales de rata Transferencia de GLUTs entre células cardiacas y endoteliales Los exosomas derivados de células H9c2 incrementan la actividad glicolitica de células HUVEC Los exosomas derivados de células cardiacas contienen LDH y GAPDH Los exosomas derivados de células H9c2 incrementan la actividad LDH de células HUVEC Los exosomas derivados de células H9c2 incrementan la cantidad de Piruvato producido por células HUVEC Discusión Conclusiones Bibliografía.133