MEMORIA CIENTÍFICA 2003/2004. Centro de Investigaciones Biológicas CSIC

Transcripción

1

2 MEMORIA CIENTÍFICA 2003/2004 Centro de Investigaciones Biológicas CSIC Ramiro de Maeztu, Madrid, España Teléfono: (34) Fax: (34)

3 Cubierta Cover Fotografía derecha Imagen al microscopio electrónico de una célula meristemática de la raíz de cebolla preparada para su observación microscópica mediante un procedimiento que incluye la irradiación del material biológico con microondas junto al tratamiento con bajas concentraciones del fijadorquímico paraformaldehído. (F. Lería, R. Marco y F.J. Medina, 2004, Microsc. Res. Technique 65, ). Right picture Electron micrograph of an onion root meristematic cell prepared for microscopical observation by a procedure comprising microwave irradiation of the biological material together with its treatment with low concentrations of the chemical fixative paraformaldehyde. (F. Lería, R. Marco, and F.J. Medina, 2004, Microsc. Res. Technique 65, ). Recuadro Campo de Microscopía Electrónica obtenido para una preparación de DNA-PKcs, una quinasa humana implicada en la reparación de roturas de la doble hebra de ADN. Estas imágenes se utilizaron para generar una estructura 3D de la proteína a 13 Å de resolución (Rivera-Calzada et al., 2005) y que se muestra superpuesta en el centro de la figura. (Dr. Oscar Llorca). Insert Electron Microscopy Field obtained for DNA-PKcs, a human kinase involved in double-stranded DNA break repair. These images were used to build the 3D structure of the protein at 13 Å resolution (Rivera-Calzada et al., 2005), which is shown over imposed in the centre of the figure. (Dr. Oscar Llorca) Contraportada Mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Back-Cover Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Fondo Estatua sita en el edificio del CIB Background Sculpture located at the CIB building Coordinación Editorial: Mª Victoria Lafita Togores Pedro García González Fco. Javier Medina Díaz Félix Ortego Alonso Agradecimientos: A Mónica Mª Fontela Lago, Victoria Muñoz Martín y a Carmen Partearroyo Lacaba Impresión y Maquetación: P.G.M.

4 TABLA DE CONTENIDOS Introducción V Recuerdos del CIB (Prof. EMILIO MUÑOZ) VII Departamento de Biología Celular y del Desarrollo Biología Molecular de los Cromosomas Reproducción Celular Mecanismos de Acción de Drogas Antitumorales El sistema Polycomb de Regulación Epigenética Eliminación de Cromosomas en Insectos Citogenética Molecular Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos Biología Molecular de la Gametogénesis Biología de la Reproducción Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados Departamento de Biología de Plantas Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear Nucleolo de Células Vegetales Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear Patogénesis de Virus de Plantas y Mecanismos de Resistencia en Plantas Virología Molecular de Plantas Interacciones Planta-Insecto Departamento de Estructura y Función de Proteínas Fisiopatología Molecular de la Pared Vascular Modificación Postraduccional de Proteínas Bioenergética Mitocondrial Biología Estructural de Proteínas Biología Molecular de Bacterias Gram-positivas Péptidos Antibióticos Eucarióticos FtsZ y Tubulina y Bioinformática Parasitología Molecular Replicación y Expresión del DNA en Bacterias Gram-positivas Interacciones Macromoleculares en Procesos Celulares Esenciales: Organización Estructural, Energética y Dinámica Microscopía Electrónica y Reconstrucción Tridimensional de Macromoléculas Ficología Medioambiental Departamento de Fisiopatología y Genética Molecular Humana Genética Humana Biomarcadores de Estrés Oxidativo y Procesos de Envejecimiento Metabolismo y Patología Molecular

5 Tabla de contenidos Departamento de Inmunología Activación de Linfocitos T Adhesión Celular en el Sistema Inmune Quimioquinas y Migración Celular Metaloproteinasas de Matriz en Inflamación Receptores de Membrana Genomica Funcional y Computacional de la Respuesta Inmune Mediada por Célular Dendríticas Biología de las Células Mieloides Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer Mecanismos Celulares de Agentes Estabilizantes de Microtúbulos Patología General / Genética del Complemento Virología Molecular de Vaccinia Dpto. de Microbiología Molecular Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes Bioquímica de Hongos Virología en Acuicultura Carbohidratos Microbianos Genética Bacteriana Biotecnología Medioambiental Unidad de Genética Molecular de Aspergillus Iniciadores de la Replicación del DNA y Sistemas de Muerte Condicional en Microorganismos Diferenciación Celular en Dictyostelium discoideum Biología Molecualr de Hongos Basidiomicetos Servicios Especiales Microscopía Electrónica Servicio de Animalario Cromatografía Espectroscopía Cultivo de Células Animales Química de Proteínas Citometría de Flujo Esterilización y Cocina de Medios Microscopía Confocal y CCD Ultracentrifugación Analítica Servicio de secuenciación automática de DNA Protección Radiológica (Spr) Biblioteca Premios y Distinciones Organización de Congresos y Cursos Aula de Seminarios Personal de los Servicios Distribución por Sexos del Personal Científico según Categoría Profesional Organigrama Jubilaciones y Nuevas Incorporaciones de Personal Resumen de Datos Económicos Evolución del Número de Publicaciones y su Impacto Índice Alfabético de Investigadores y Teléfonos

6 INTRODUCCIÓN VICENTE LARRAGA RODRÍGUEZ DE VERA Director Esta memoria del Centro de Investigaciones Biológicas es la primera correspondiente a la segunda época del CIB y la primera que me corresponde a mí desde la responsabilidad de la dirección del mismo. El Centro se ha trasladado a una nueva sede con unas instalaciones tecnológicamente adecuadas a la realidad del comienzo del siglo XXI, en el entorno académico de la Ciudad Universitaria de Madrid. Atrás queda medio siglo de la mejor historia de la ciencia española en la Biología. El CIB de la calle Velázquez de Madrid fue el semillero de la reconstrucción de la Biología experimental en la España de la segunda mitad del siglo XX. En sus laboratorios se formó un elevadísimo porcentaje de los profesores universitarios en las diferentes disciplinas de la ciencia experimental, desde la Fisiología a la Biología Molecular pasando por la Microbiología. Varias generaciones de científicos entregaron lo mejor de su esfuerzo a conseguir levantar hasta niveles homologables a los existentes en los mejores centros de su época los trabajos que se realizaron en los laboratorios del Centro. No obstante, no podemos mirar solo hacia atrás. Con nuestro respeto y cariño a aquellos que nos han precedido, los grupos actuales del CIB tienen que embarcarse en un esfuerzo diario por mejorar nuestra capacidad y calidad científica. La buena producción de nuestros laboratorios que se muestra en esta memoria, no debe llevarnos a la tranquilidad sino a la exigencia de la mejora de nuestros trabajos cotidianos y a tener una presencia cada vez más activa en todos los foros, fundamentalmente los internacionales, porque la ciencia o tiene repercusión amplia y extiende sus beneficios intelectuales o económicos a las capas más amplias de la sociedad o no merece el nombre de tal. La formación de las jóvenes generaciones, ahora físicamente más cercanas, en la exigencia del trabajo bien hecho y equivalente en su calidad a las tendencias más innovadoras en cada campo, debe constituir también uno de los objetivos de nuestros científicos. Con ese espíritu debe contemplarse el futuro del Centro de Investigaciones Biológicas y la mejora de su equipamiento e instalaciones. Nunca debemos olvidar que la herramienta de trabajo más importante de un científico es su inteligencia que sabe poner al servicio de una idea de progreso e innovación intelectual. Solo con el esfuerzo continuado en la calidad y el rigor conseguiremos nuestro objetivo de avance y mejora permanente. En esta idea tienen que coincidir todas las generaciones de científicos que han pasado, están y pasarán por nuestro Centro. V

7 INTRODUCTION VICENTE LARRAGA RODRÍGUEZ DE VERA Director This review of the Biological Research Centre is the first which corresponds with the second period of the CIB and the first under my directorship. The centre has moved to a new building with the technological installations needed to satisfy the demands of the early 21st century, and finds itself located in the academic atmosphere of the University City of Madrid. Behind lies half a century of the best of Spanish biological history. The CIB in Velázquez Street, Madrid, was the focal point for the reconstruction of experimental biology in Spain during the second half of the 20th century. In its laboratories a very high percentage of university professors were formed, from physiology to molecular biology, including microbiology. Various generations of scientists dedicated the best of their efforts to raising the level of work carried out in the centre s laboratories to that existing in the best centres of the time. Nevertheless, we cannot only look back. Respecting and admiring those that have gone before, the groups working at present in the CIB have to make a daily effort to continue improving our scientific capacity and quality. The good results obtained by our laboratories in this review must not make us complacent but demands from us continual improvement in our everyday work, leading us little by little to a more active presence in all the working groups, especially internationally, because science either has wide repercussions and spreads intellectual or economical benefits to the widest levels of society, or does not deserve to be called Science. Training of the young generations, who are now more in contact with their elders, and the demand for work well done, equivalent in quality to the most progressive tendencies in each field must constitute one of our scientific objectives too. With that spirit we must look at the future of the CIB and to improving its equipment and installations. However, we must never forget that the most important work tool of a scientist is his intelligence that knows how to be put at the service of a progressive and innovative idea. Only by continuous efforts to improve in quality and seriousness will we reach our objective of permanent advancement and betterment. All the past scientific generations as well as those here and now and those to come who have passed or will pass through our centre must agree with this idea. VI

8 RECUERDOS DEL CIB El CIB: Manantial del conocimiento en las ciencias de la vida Emilio Muñoz Profesor de Investigación Departamento Ciencia, Tecnología y Sociedad Instituto de Filosofía, CSIC Al empezar a pergeñar este prólogo que me ha solicitado la Dirección del Centro de Investigaciones Biológicas para la Memoria, los recuerdos que me asaltan se entrecruzan con metáforas y conceptos con los que reflejar lo que ha representado el Centro de Investigaciones Biológicas para el desarrollo de la nueva? biología en España y lo que, a partir de esa trayectoria, puede representar para el próximo, y agitado, futuro. No podemos olvidar que en esta sociedad de la publicidad y del mercadeo, los eslóganes están a la orden del día. En este contexto, se nos bombardea con la referencia constante a que el siglo XXI va a ser el siglo de la biología. No me opongo afectivamente a esta referencia, aunque me atrevo a discrepar hasta cierto punto de ella. Creo que el siglo XXI va a ser el siglo de la confluencia entre disciplinas, va a ser testigo de un nuevo esfuerzo para la difícil síntesis, perseguida en diferentes momentos de la historia de la ciencia. Podemos identificar este proceso como el camino hacia la tecnociencia en la línea de las propuestas de Javier Echeverría o extenderlo al término de convergencia científica y tecnológica que empieza a hacer fortuna. Esta reflexión nos servirá, en cualquier caso, para un modesto ejercicio de prospectiva al finalizar estas líneas. Para volver a los orígenes, creo que la metáfora del manantial es la que mejor cuadra para entender lo que ha supuesto el CIB en la formación de una comunidad biológica española rica y diversa. El CIB se construyó a principios de los años 1950 para acoger a dos Institutos que recogían la tradición investigadora española promovida por la Junta de Ampliación de Estudios e Investigaciones en la primera mitad del siglo XX: el Instituto Cajal y el Instituto de Microbiología Jaime Ferrán a los que se unió un nuevo Instituto, el de Endocrinología y Metabolismo Gregorio Marañón. La genética tenía también su asiento por la vía de un Departamento relacionado con la Universidad Febrero 2005 Complutense. Los efectos de la posguerra civil afectaron negativamente al Instituto Cajal a pesar de los esfuerzos de los investigadores que lo integraban, mientras que el Instituto de Microbiología y sobre todo el Instituto Marañón fueron el hogar donde se cultivaba y crecía la moderna ciencia biológica. Este proceso no trascurría sin dificultades pues se perseguía la armonización entre las aproximaciones clásicas en anatomía y microbiología con las tendencias más reduccionistas que trataban de conocer e interpretar los procesos biológicos a través de las propiedades de las moléculas sobre las que se articula la estructura y se construye la dinámica funcional de los seres vivos y de las células como elemento básico vial. El desarrollo del CIB se puede interpretar en términos de la teoría evolutiva. Como fruto del desarrollo y de sus tensiones se fueron generando islotes de aproximación conceptual y metodológica. Surgieron así el Departamento de Enzimología, que luego daría lugar al Instituto del mismo nombre con su traslado a los locales de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid, hoy Instituto de Investigaciones Biomédicas, y el Instituto de Biología Celular. La biología molecular nace en España también en el CIB desde los trabajos pioneros llevados a cabo en el Instituto Gregorio Marañón y por algunos grupos del Instituto de Biología Celular. Toda la gran operación de gestación del Centro de Biología Molecular tuvo lugar en el CIB y su plasmación fue el resultado de un proceso de fusión entre los grupos que trabajaban en este área del conocimiento en los Institutos Gregorio Marañón, Biología Celular y en el grupo de Genética del Desarrollo. El Instituto Ramón y Cajal fue objeto de un proceso no muy frecuente en la historia de la política científica española. Su evaluación por un panel internacional, y la política de relanzamiento llevada a cabo desde el CSIC tuvieron como consecuencia el traslado a una nueva sede donde se ha producido un desarrollo VII

9 Recuerdos del CIB que me atrevo a calificar de muy satisfactorio. Si recurrimos a una nueva metáfora, el trasplante y el abonado han sido factores decisivos para el florecimiento del Instituto de Neurobiología Ramón y Cajal. He obviado conscientemente la referencia a nombres, a muchos nombres de gigantes y héroes que permitieron que el manantial del CIB diera origen a ríos y afluentes que constituyen una parte importante del mapa de la investigación biológica y biomédica en España. He tratado en este prólogo de mantenerme en una línea institucional y lo puedo hacer así porque ya disponemos de una serie de publicaciones que describen y analizan los orígenes de este desarrollo de la bioquímica, de la biología molecular y de una parte importante de la genética. En el apartado de referencias bibliográficas encontrará el lector interesado algunos frutos de este trabajo. He hecho mención hace unos momentos a que me inclino en este texto por un tratamiento institucional. Incluso en un país tan poco dado a este reconocimiento, el CIB representa de nuevo una excepción. A partir de la singularidad de su edificio fundacional, se ha convertido en un icono de la investigación en España, así como en una imagen representativa de la institución madre, el Consejo Superior de Investigaciones Biológicas. Este edificio, obra del arquitecto Miguel Fisac, situado en la confluencia de las calles de Velázquez y Joaquín Costa ha atraído, sin duda, la atención de muchos madrileños, españoles y visitantes de otros países, con la escultura del hombre pensativo y esforzado que presidía la fachada exterior del edificio. Este edificio con sus virtudes y sus defectos ha condicionado el desarrollo social y científico de la comunidad que trabajaba en este Centro, y me atrevería a decir que se había convertido en un entorno poco respirable. De ahí que fuera necesario un proceso de migración. Este proceso ha culminado y el CIB tiene una nueva sede en el Campus universitario de Moncloa. Se ha tardado mucho, quizá demasiado, en su construcción como un claro ejemplo de los problemas con los que el desarrollo científico y tecnológico se enfrenta en nuestro país. Pero la realidad está ahí y quiero proponer que esta realidad sirva para que el CIB deje de ser manantial y llegue a ser una gran reserva del desarrollo de la biología con las características de convergencia entre disciplinas, problemas conceptuales e instrumentos y tecnologías que la biología, la ciencia, del siglo XXI reclama. Existe otro concepto procedente de las orientaciones más sociales y humanistas de la economía que es el de la dependencia de la trayectoria. El CIB tiene ante sí un nuevo reto: ser fiel a su trayectoria pero dar un salto evolutivo para llegar a ser una vez más referencia del desarrollo científico español. Con la excepción de la referencia al arquitecto Fisac, he sido fiel al propósito de no mencionar nombres en estas líneas, dejando dicha mención detallada y documentada a las publicaciones que se citan. Sin embargo, al terminar quiero romper ese compromiso para dedicar un recuerdo a mi compañero de facultad y amigo, el Prof. Jorge Fernández López-Sáez, desaparecido con el fin del año 2004, hombre controvertido por su sentido de la sinceridad y del deber, pero ciudadano de buen corazón, brillante biólogo celular y ligado al CIB desde la fundación del Instituto de Biología Celular. Referencias bibliográficas Ávila, J., Perucho, M., López-Otín, C. (eds.) (2003). El fago φ29 y los orígenes de la biología molecular en España (Madrid: Consejo Superior de Investigaciones Científicas). Muñoz, E. (dir.) (2004). Cuarenta años de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular ( ) (Madrid: Sociedad Estatal de Conmemoraciones Culturales). Santesmases, M.J. y E. Muñoz (1997). The Scientific Periphery in Spain: The Establishment of a Biomedical Discipline at the Centro de Investigaciones Biológicas, Minerva 35, Santesmases, M.J. y E. Muñoz (1997). Scientific Organizations in Spain ( ): Social Isolation and International Legitimation of Biochemists and Molecular Biologists on the Periphery, Social Studies of Science 27, Santesmases, M.J. (2002). National politics and international trends: EMBO and the making of molecular biology in Spain ( ), Studies in History and Philosophy of Biological and Biomedical Sciences 33, VIII

10 MEMORIES OF THE CIB The CIB: Spring of knowledge in the sciences of life Emilio Muñoz Research Professor Science Department, Technology and Society Institute of Philosophy, CSIC February 2005 On beginning to prepare this foreword that I have been requested to write by the Management of the Biological Research Centre, the memories that come to my mind are intermingled with metaphors and concepts which have come to reflect what the Biological Research Centre has come to represent in the development of the "new" biology in Spain and what, by continuing on this course, it could represent in the immediate and uncertain future. We cannot forget that in this society of publicity and marketing, catchphrases are the order of the day. And in this context, we are constantly being bombarded with the idea that the 21st. century will be the century of biology. For my part, I don't really oppose this idea, though I do beg to differ to a certain extent. I believe that the 21st. century will be the century of the coming together of the different fields of study, and will witness a renewed effort to obtain this difficult synthesis, already attempted on various occasions in the history of science. This process can be identified as the way forward towards techno science along the lines proposed by Javier Echeverría, or in other words as "scientific and technological convergence" that begins to be profitable. In any case, this idea will do for a modest exercise in evaluating prospects on concluding these lines. To return to the beginning, I believe that the metaphor of the spring of knowledge is the better way of picturing the role that the CIB (Biological Research Centre) has played in the formation of a rich and diverse Spanish biological community. The CIB was formed at the beginning of the 1950's to bring together two Institutes that epitomized Spanish research tradition and had been fostered by the Board for the advancement of Studies and Research in the first half of the 20th. century, namely, the Cajal Institute and the Jaime Ferrán Institute of Microbiology, to which was added a new Institute, the Gregorio Marañón Institute of Endocrinology and Metabolism. Genetics was also present through the inclusion of a Department connected with the Complutense University. The after-effects of the civil war negatively affected the Cajal Institute in spite of the efforts of its researchers, while the Institute of Microbiology and especially the Marañón Institute saw the development and growth of modern biological science. This process did not proceed without difficulties because it was pursuing the harmonization of the classical approaches to anatomy and microbiology with the more reductionist tendencies that tried to understand and interpret biological processes by studying the properties of the molecules that make up the structures and functional dynamics of living things and of cells as basic elements of this process. We can interpret the development of the CIB as an evolutionary process. The results of this process and the tensions it produced generated islands of conceptual and methodological approach. In this way the Department of Enzymology arose that later made way for the Institute of the same name and its transfer to the premises of the Medicine Faculty of the Autonomous University of Madrid, today known as the Institute of Biomedical Research, and the Institute of Cellular Biology. Molecular biology also came into being in Spain in the Biology Research Institute as a result of the pioneer work carried out in the Gregorio Marañón Institute and by some groups in the Institute of Cellular Biology. The whole development process leading to the formation of the Centre of Molecular Biology took place in CIB and was the result of a fusion process of the groups that worked in this field in the Institutes of Gregorio Marañón and Cellular Biology as well as in the Genetics of Development group. The Ramón and Cajal Institute was the object of a process not very frequently found in Spanish scientific history. Its evaluation by an international panel, and the policy renewal carried out by the CSIC (Consejo Superior de Investigaciónes IX

11 Memories of the CIB Científicas) resulted in its transfer to a new headquarters where I dare to qualify as very satisfactory the development that has taken place. If we resort to a new metaphor, the transplanting and fertilizing have been decisive factors in the flowering of the Institute of Neurobiology Ramón and Cajal. I have consciously avoided making reference to names, to the many names of giants and heroes that made it possible for the "spring of knowledge" of the CIB to feed rivers and streams that now constitute an important part of the map of biological and biomedical research in Spain. I have tried in this foreword to stay along institutional lines and I have done so because we already have a series of publications which describe and analyze the origins of this development of biochemistry, molecular biology and an important part of genetics in Spain. In the section of bibliographical references any interested reader will find some fruits of this work. A few moment ago I mentioned that in this text I had favoured a treatment along institutional lines. Even in a country so little given to this kind of recognition, the CIB represents an exception again. Starting with the singularity of its first building it has become an icon of research in Spain, as well as representative of its mother institution, el Consejo Superior de Investigaciones Biológicas (the Superior Council of Biological Investigations). This building, the work of the architect Miguel Fisac, located at the junction of the streets Velázquez and Joaquín Costa, has attracted without a doubt, the attention of many who live in Madrid, as well as other Spaniards and visitors from other countries, because of the sculpture of the pensive but struggling man who presides over the external facade of the building. This building with its virtues and its defects conditioned the social and scientific development of the community that worked in this Centre, and I would dare to say, became a very cramped environment. With the result that it was necessary to move elsewhere. This has now been done and the CIB now has a new headquarters in the university Campus of Moncloa. Its construction has taken a long time, perhaps too long, a clear example of the problems that scientific and technological development faces in our country. But the reality is there and I want to propose that this reality results in the CIB becoming not just a spring but a great reserve for the development of biology characterized by the convergence of different fields, such as conceptual problems, instruments and technologies that biology, the science of the 21st. century demands. Another concept which springs from the most social and humanist orientations in the economy is that of the "dependence on the trajectory". The CIB therefore has before it a new challenge: to be faithful to its trajectory but at the same time to make an evolutionary leap towards becoming once again the reference for Spanish scientific development. With the exception of the reference to the architect Fisac, I have been faithful to my purpose of not mentioning names in these lines, leaving such details and documentation to the publications listed below. However, on concluding I want to break that commitment to dedicate a thought to my able partner and friend, Prof. Jorge Fernández López-Sáez, deceased in 2004, a controversial man due to his sincerity and sense of duty, but a good-hearted citizen, a brilliant cellular biologist, and committed to the Biological Research Centre since the foundation of the Institute of Cellular Biology. Bibliography Ávila, J., Perucho, M., López-Otín, C. (eds.) (2003) El.fago 029 and the origins of the molecular biology in Spain (Madrid: Superior Council of scientific Investigations). Muñoz, E. (dir.) (2004): Forty years of the Spanish Society of Biochemistry and Molecular Biology ( ) (Madrid: State Society of Cultural Commemorations). Santesmases, M.J. and E. Muñoz (1997 to): The Scientific Periphery in Spain: The Establishment of to Biomedical Disciplines at the Center of Biological investigations", Minerva 35: Santesmases, M.J. and E. Muñoz (1997b): Scientific Organizations in Spain( ): Social Isolation and International Legitimation of Biochemists Molecular and Biologists on the Periphery", Social Studie.s of Science 27: Santemases, MI (2002): National politics and international trends: EMBO and the making of molecular biology in Spain ( )", Studies in History and Philosophy of Biological and Biomedical Sciences X

12 Departamento de Biología Celular y del Desarrollo Department of Cell and Developmental Biology Jefe de Departamento LUCAS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ (2003) Department Head MIGUEL ANGEL VIDAL (2004) Profesores de Investigación Investigadores Científicos Científicos Titulares Personal Técnico Secretaria CONSUELO DE LA TORRE GARCÍA-QUINTANA FLORA DE PABLO DÁVILA LUCAS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ PATRICIO ALLER TRESGUERRES ENRIQUE J. DE LA ROSA CANO JOSÉ LUIS DÍEZ CORTES PEDRO ESPONDA FERNÁNDEZ JORGE BERNARDO SCHVARTZMAN BLINDER JESÚS DEL MAZO MARTÍNEZ CLARA GODAY BAYLINA BEGOÑA GRANADINO GOINECHEA PABLO HERNÁNDEZ VALENZUELA DORA B. KRIMER SMUNIS JAVIER REY CAMPOS MIGUEL ÁNGEL VIDAL CABALLERO ISABEL ALVÁREZ ELENA DE BLAS BROTONS MARGARITA CARRASCOSA CEBRIÁN MARÍA JOSEFA FERNÁNDEZ-CABRERA BAZÁN ASCENSIÓN GONZÁLEZ DÍAZ CRISTINA IGLESIAS GUISASOLA JOSÉ LUIS MARCILLA CABANILLAS Mª LUISA MARTÍNEZ ROBLES DOLORES MATEOS MOYA AMELIA PARTEARROYO LACABA Mª PILAR ROBLES GONZÁLEZ ANA Mª ROBLES LOBO CARMEN PARTEARROYO LACABA

13 Biología Molecular de los Cromosomas Molecular Biology of Chromosomes JORGE BERNARDO SCHVARTZMAN BLINDER Jefe de Grupo / Group Leader PABLO HERNÁNDEZ VALENZUELA DORA BEATRIZ KRIMER SMUNIS Investigadores de Carrera / Staff Scientists ROSA RODRÍGUEZ PÉREZ (Hasta VIII-2004) Investigadora Contratada / Research Associate MARÍA JOSÉ FERNÁNDEZ NESTOSA MARTA FIERRO FERNÁNDEZ ANA GARCÍA SACRISTÁN (Hasta XI-2004 ) MARÍA DOLORES MAYÁN SANTOS EVA MARÍA MEJÍA RAMÍREZ DE ARELLANO LETICIA OLAVARRIETA SCAPPINI (Hasta VIII-2003) LEONOR RODRÍGUEZ SÁNCHEZ RAÚL TORRES TORRES B. Predoctorales / Graduate Students Mª LUISA MARTÍNEZ ROBLES Mª PILAR ROBLES GONZÁLEZ Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Replicación, Barreras, Superenrollamiento, Encadenados, Nudos Estudio de los cambios topológicos que experimenta el DNA durante la replicación El análisis de intermediarios de replicación por electroforesis bidimensional en geles de agarosa (2D gels) junto con otras técnicas (PCR, ensayo de actividad helicasa, microscopía electrónica, etc.) nos han permitido demostrar que en todos los plásmidos con dos orígenes ColE1 enfrentados, el origen silencioso actúa como una barrera para el progreso de la horquilla iniciada en el otro origen. Esto se debe a la incapacidad de la helicasa DnaB de Escherichia coli para desplazar el extremo 3 del RNA de los híbridos RNA-DNA, lo que explica la inestabilidad de los palindromes con orígenes ColE1. El bloqueo de las horquillas da lugar a la acumulación de intermediarios de replicación con una burbuja interna, lo que permite que las topoisomerasas de tipo II Keywords: Replication, Barriers, Supercoiling, Catenanes, Knots Changes in Topology During DNA Replication Two-Dimensional Agarose Gel Electrophoresis (2D gels) combined with other techniques (PCR, Helicase Assay, Electron Microscopy, etc.) led us to show that in bacterial plasmids containing more than one origin, initiation of DNA replication occurs at only one of the potential origins per replication round, regardless of origin orientation. This phenomenon is called origin interference and its nature is still unknown. In those plasmids with inversely oriented origins, the silent origin acts as a polar barrier for the replication fork initiated at the other origin. This is due to the incompetence of Escherichia coli DnaB helicase, which leads the replication fork in vivo, to unwind the RNA 3 end of RNA-DNA hybrids. Blockage of the replication fork leads to the accumulation of replication intermediates (RIs) 2

14 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes Figura 1.- Una visión topológica del replicon. (A) Forma no replicativa de un plásmido superenrollado negativamente. (B) Intermediario negativamente superenrollado y replicado al 25% en el que la doblehélice parental presenta enrollamiento dextrógiro mientras las dos dobles-hélices hermanas se enrollan de forma levógira. (C) Intermediario replicado al 50% y totalmente relajado. (D) Intermediario positivamente superenrollado y replicado al 75% en el que la doble-hélice parental presenta enrollamiento levógiro mientras las dos dobles-hélices hermanas se enrollan de forma dextrógira. (E) Intermediario negativamente superenrollado y replicado al 75% en el que la doble-hélice parental presenta enrollamiento dextrógiro mientras las dos dobleshélices hermanas se enrollan de forma levógira. (F) Moléculas encadenadas. (E ) Intermediario negativamente superenrollado y replicado al 75% con un nudo en la región ya replicada. (D ) Intermediario replicado al 75% y totalmente relajado con dos horquillas en retroceso. Las flechas rojas indican los pasos más frecuentes. Las flechas grises indicas pasos alternativos poco frecuentes. La doble-hélice parental se indica en azul y verde, mientras que las cadenas nacientes se indican en rojo (Schvartzman & Stasiak, 2004). Figure 1.- The topological cycle of a replicon. (A) Unreplicated ( ) supercoiled plasmid. (B) Twenty-five per cent replicated ( ) supercoiled RI where the parental duplex winds right-handed, whereas the sister duplexes wind in a left-handed manner. (C) Fifty per cent replicated RI where supercoiling is zero. (D) Seventy-five per cent replicated (+) supercoiled RI where the parental duplex winds left-handed, whereas the sister duplexes wind in a right-handed manner. (E) Seventy-five per cent replicated ( ) supercoiled RI where the parental duplex winds righthanded, whereas the sister duplexes wind in a left-handed manner. (F) One-hundred per cent replicated catenane. (E ) Seventy-five per cent replicated ( ) supercoiled RI bearing a knotted replication bubble. (D ) Seventy-five per cent replicated RI where supercoiling is zero containing two branched four-way Holliday-like junctions, called chicken-foot structures. Red arrows indicate the putative most frequent pathway. Grey arrows show alternative pathways. The parental duplex is indicated in blue and green, whereas nascent strands are depicted in red (Schvartzman & Stasiak, 2004). 3

15 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes generen nudos en la región ya replicada del plásmido. La gran mayoría de los cruces de los nudos de estas burbujas son de signo positivo, lo que indica que en los plásmidos parcialmente replicados, las dobles-hélices hijas están entrelazadas negativamente. El bloqueo de las horquillas no es temporal, ya que conduce a una terminación prematura de la replicación. Las moléculas de DNA con una burbuja interna acumulada son susceptibles de sufrir una reversión de las horquillas. Hemos caracterizado la migración de topoisómeros, moléculas anudadas y encadenadas cuando se las analiza en geles bidimensionales y hemos demostrado que en sistemas eucarióticos con un origen bidireccional, la terminación de la replicación no ocurre en un sitio fijo sino que puede ocurrir en cualquier sitio dependiendo de la sincronía de partida y de la velocidad de progresión de las horquillas. Hemos comprobado que las drogas cloroquina y bromuro de etidio, que inducen el superenrollamiento positivo de las formas plasmídicas no replicativas, no son capaces de superenrollar postivamente plásmidos parcialmente replicados. Esto se debe a que el superenrollamiento positivo es inmediatamente adsorbido por un retroceso de las horquillas con la consiguiente formación de estructuras de tipo Holliday. El número de burbujas anudadas aumenta durante la replicación en función del grado de preencadenamiento y el tamaño de la burbuja y la colisión frontal entre transcripción y replicación favorece la formación de containing an internal bubble, which may serve as substrate for inadvertent knotting events resulting from topo II-type action that tend to fix some of the crossings present in interwound supercoiled molecules. For this reason most of these nodes have a positive sign. This observation strongly suggests that precatenanes exist in negatively supercoiled plasmids in vivo. Blockage of the replication fork is not just a pause but permanent, as it leads to a premature termination event. Interestingly, RIs containing an internal bubble may undergo reversion of the fork, at least in vitro. We characterized also the migration behaviour of different families of supercoiled, knotted molecules and catenanes when analyzed by 2D gels. In eukaryotic plasmids with a bidirectional origin, termination does not occur at a fixed site but may take place anywhere depending on the firing synchrony of both forks at the origin and the rate of forks progression. Chloroquine and ethidium bromide, which induce positive supercoiling in non-replicating plasmids, are not able to positively supercoil partially replicated molecules. This occurs because in partially replicated plasmids, positive supercoiling is adsorbed by replication fork reversal with the concomitant formation of Holliday-like junctions. Head-on collision of transcription and replication is generally avoided in nature. This type of collision leads to DNA knotting. During DNA replication, the number of knotted bubbles increases as function of bubble size, suggesting it is affected by both the degree of precatenation and bubble size. We recently found that in Saccharomyces cerevisiae, plasmids bearing the rdna replication fork barrier (RFB) in its active orientation are unstable and become rapidly integrated via homologous recombination in sir2 mutant cells. This observation strongly suggests that Figura 2.- Electroforesis bidimensional en geles de agarosa mostrando que el bloqueo de la replicación en dos de las tres barreras presentes en el rdna de S. pombe requiere del factor terminador de la transcripción reb1p. Figure 2.- Two-dimensional agarose gel electrophoresis showing that fork blockage at two out of three replication fork barriers in S. pombe rdna, requires the transcription termination factor reb1p. 4

16 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes nudos. Hemos comprobado que en la levadura Saccharomyces cerevisiae, los plásmidos que contienen la barrera para el progreso de las horquillas (RFB) del rdna son inestables y se integran rápidamente por recombinación homóloga en estirpes sir2, lo que sugiere que la proteína Sir2p (que también regula el envejecimiento) modula el acceso de la maquinaria de recombinación a las horquillas de replicación detenidas en las RFBs (Benguría et al., 2003). Finalmente, en colaboración con el Dr. Andrzej Stasiak, de la Universidad de Lausanne, Suiza, hemos publicado una revisión sobre la topología del replicon (Schvartzman & Stasiak, 2004). Sir2p (which also modulates aging in yeast) regulates access of the recombination machinery to the forks stalled at the rdna RFB Palabras clave: Replicación del DNA, Bloqueo de horquillas, DNA ribosómico, Inestabilidad del DNA, Expansión de tripletes repetidos Barreras para las horquillas de replicación e inestabilidad del DNA El desplazamiento del complejo de replicación a lo largo del DNA no es homogéneo, sino que, frecuentemente, encuentra obstáculos que constituyen barreras o paradas temporales para las horquillas de replicación. Estas barreras pueden ser producidas por lesiones presentes en el DNA, estructuras secundarias inusuales o proteínas unidas al DNA. Existen varias evidencias de que en muchos casos, una horquilla de replicación bloqueada o colapsada constituye una verdadera lesión en el DNA ante la que la célula responde activando puntos de chequeo y procesos de reparación orientados a la reactivación de la horquilla, entre los que la reparación por recombinación homóloga juega un papel Figura 3.- Expresión de Ran, c-myc. EKLF y a-globina a lo largo de la diferenciación inducida con HMBA de células MEL. Figure 3.- Expression of Ran, c-myc, EKLF and (-globin throughout HMBAinduced cell differentiation in MEL cells. 5

17 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes relevante. Estamos estudiando dos tipos de estas barreras para la replicación del DNA: las barreras naturales presentes en el rdna de organismos eucarióticos, denominadas RFBs, y aquellas inducidas por repeticiones trinucleotídicas, cuya expansión constituye la mutación responsable de una serie de enfermedades hereditarias humanas. Hemos comprobado que en Saccharomyces cerevisiae, las horquillas bloqueadas son potencialmente recombinogénicas. En mutantes sir2, plásmidos que llevan estas barreras activas se integran rápidamente en el rdna cromosómico, probablemente por un mecanismo de recombinación homóloga (Benguría et al., 2003), sugiriendo que esta proteína silenciadora y desacetilasa de histonas Sir2 modula el acceso de la maquinaria de recombinación a las horquillas bloqueadas en el rdna. En el rdna de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, hemos identificado tres barreras naturales que bloquean la replicación de una manera polar. Dos de estas RFBs se producen por la unión del factor terminador de la transcripción del rrna reb1p a sus dos secuencias de unión localizadas cerca del extremo 3 del gen 25S, mientras que la tercera RFB es independiente de reb1p (Sánchez-Gorostiaga et al., 2004). Esta es la primera demostración in vivo de un factor de terminación de transcripción que también bloquea la maquinaria replicativa que se mueve en dirección contraria, sugiriendo que una de sus funciones podría ser impedir la colisión frontal de ambas maquinarias en el locus rdna. La estructura secundaria adoptada por algunas secuencias de DNA pueden ocasionar el bloqueo de la replicación, sin la intervención aparente de factores asociados. Este parece ser el caso de la parada de la replicación inducida por microsatélites trinucleotídicos, cuya expansión constituye la mutación responsable de un elevado número de enfermedades hereditarias humanas. Hemos comprobado que el trinucleótido repetido GAA TTC, cuya expansión es la causa de la ataxia de Friedreich, induce la parada del complejo de replicación de forma polar, siendo esto una de las causas de su inestabilidad. Nuestros resultados indican que existe un factor adicional que también contribuye a esta inestabilidad y que está relacionado con la estructura en DNA tríplex que este microsatélite adopta. Palabras clave: Eritroleucemia, Diferenciación celular, Expresión génica, Librerías cdna, clk/sty (Benguria et al., 2003). Finally, in collaboration with Dr. Andrzej Stasiak, from the University of Lausanne, Switzerland, we published a review on a topological view of the replicon (Schvartzman & Stasiak, 2004). Keywords: DNA replication, Arrested forks, Ribosomal DNA, DNA instability, Expansion of triplet repeats Replication fork barriers and DNA instability Movement of the replication complex along the DNA is not uniform. Frequently, the replisome encounters obstacles that function as replication barriers producing pausing or blockage of the replication fork. DNA lesions, unusual DNA structures and proteins bound to the DNA are among the potential causes of replication fork arrest. Several research lines indicate that arrested or collapsed replication forks trigger DNA damage checkpoints and are the substrate for DNA repair machinery to rescue collapsed forks. Recombinational repair plays a relevant role in the reactivation of arrested forks. We study two of these DNA replication barriers: the natural barriers present in the eukaryotic rdna, named RFBs, and the replication arrest induced by trinucleotide tandem repeats. The expansion of trinucleotide repeats is the mutation responsible for a series of hereditary human diseases. In Saccharomyces cerevisiae, we found that forks blocked at the rdna RFBs are potentially recombinogenic. In sir2 mutant strains, RFB-bearing plasmids integrate into the chromosomal rdna, probably by homologous recombination (Benguría et al., 2003), suggesting that the histone deacetylase silencing protein Sir2 modulates access of the recombination machinery to the forks stalled at the rdna RFBs. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe rdna, we identified three natural RFBs that arrest replication in a polar manner. Two of these RFBs require both the transcription termination factor reb1p and its two binding sites near the 3 end of the 25S gene, whereas the other RFB function in the absence of these cis- and trans-acting factors (Sánchez-Gorostiaga et al., 2004). This is the first description of an in vivo transcription termination factor that also arrests the replication machinery approaching in the opposite direction, suggesting that its function could be to prevent head-on collision between replication and transcription within the rdna locus. 6

18 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes Regulación de la diferenciación inducida con HMBA en células eritroleucémicas Las enfermedades tumorales involucran una pérdida del control de la proliferación y un bloqueo de la diferenciación celular. Existen evidencias que indican que bajo condiciones apropiadas, las células tumorales son capaces de reiniciar y completar su programa de diferenciación, incluyendo el camino hacia la división celular terminal. Desde hace ya varios años, uno de los objetivos de nuestro grupo es avanzar en el conocimiento de cómo la transformación oncogénica interfiere con los mecanismos de regulación en células tumorales y cómo estas perturbaciones pueden ser revertidas para reestablecer los controles normales. Nuestro planteamiento se basa en el estudio de las bases moleculares del bloqueo de la diferenciación en células de la eritroleucemia murina (MEL) y de los cambios que tienen lugar cuando estas células son inducidas a una diferenciación terminal. Las células MEL, bloqueadas a nivel de proeritroblastos por integración del complejo vírico Friend, pueden ser inducidas a reiniciar el programa de diferenciación mediante agentes como el HMBA. Uno de nuestros objetivos es la identificación de genes cuya activación (o represión) tenga lugar durante las primeras etapas de la determinación celular. El empleo de técnicas de hibridación diferencial y librerías de substracción nos ha permitido identificar genes cuya expresión es modulada a lo largo de la diferenciación inducida de células MEL (Vanegas et al, 2003) En colaboración con el grupo del Dr J. del Mazo hemos ampliado este estudio a etapas tempranas del desarrollo del ratón (López-Casas, 2002, 2003) Actualmente nuestro interés se centra en dos proyectos concretos: a) Regulación de la proteína quinasa clk/sty a lo largo de la diferenciación. Clk/STY es una proteína quinasa de doble acción, capaz de fosforilar residuos de serina/treonina así como de tirosina, que interactúa preferencialmente con las proteínas de la familia SR. Hemos comprobado que clk se activa a lo largo de la diferenciación inducida de células MEL y que la expresión exógena de clk acelera la aparición de células diferenciadas. Utilizando vectores de expresión inducibles por tetraciclina, estamos analizando en qué momento del proceso actúa clk y cuáles son los efectos de un bloqueo en distintos momentos de Secondary structure of some DNA sequences can also induce replication arrest per se without the requirement of additional factors. This seems to be the case for trinucleotide tandem repeats expanded in a series of hereditary human diseases. We have found that the repeated trinucleotide GAA TTC, that is expanded in Friedreich ataxia, induces fork arrest in a polar fashion. This fork pausing is one of the causes of the unstable behavior of this repeated triplet. An additional factor related to the capacity of this trinucleotide to form triplex DNA, also contributes to this instability. Keywords: Erythroleukemia, Cell differentiation, Gene expression, cdna libraries, clk/sty Regulation of HMBA induced Differentiation in Murine Erythroleukemia Cells Tumor cells are characterized by a loss of control of cell proliferation and blockage of cell differentiation. In many instances, however, cells are able to reinitiate and successfully complete the differentiation program, including reestablishment of terminal cell division. One of the main goals of our group is to understand how oncogenic transformation interferes with mechanisms of regulation and how the normal process can be reconstituted. Our studies are based on the molecular analysis of blockage of differentiation in murine erythroleukemia (MEL) cells. MEL cells blocked at the proerithroblast stage by the integration of the Friend complex virus, can be induced to reenter their terminal differentiation program by the action of several agents such as HMBA. We want to identify genes that are activated or repressed during the early steps of cell commitment. Our working hypothesis is that a temporal sequence of changes in expression of certain genes is an essential part of switching tumor cells back into terminal differentiation. Using differential hybridization and subtracted libraries we identified genes whose expression is modulated throughout MEL induced differentiation (Vanegas et al, 2003) In collaboration with Dr J. del Mazo we also studied expression of these genes during mouse development (López-Casas et al, 2002, 2003) 7

19 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes la diferenciación. Asimismo, estamos llevando a cabo estudios similares con otros miembros de la familia clk (clk2, 3 y 4) b) Aislamiento de genes que se expresan diferencialmente en líneas MEL resistentes al HMBA. Hemos establecido líneas celulares resistentes que no se diferencian en presencia de HMBA. El empleo de técnicas RDA (representational differential analysis) nos ha permitido aislar genes que sólo se expresan en estas líneas resistentes. Actualmente estamos trabajando en la caracterización de algunos de estos genes. We are currently working in two main projects: a) Regulation of protein kinase clk/sty throughout differentiation. Clk/STY is a dual protein kinase that phosphorylate serine/threonine or tyrosine residues and interacts with SR proteins. We showed that clk is up regulated during MEL differentiation and that exogenous clk expression accelerates the appearance of committed cells. We are using tetracyclin inducible expression vectors to study the effects of clk during different stages of MEL differentiation. We are also studying other members of the clk/sty family (clk2, 3 and 4) b) Identification of differentially expressed genes in HMBAresistant MEL cells. We have established MEL cell lines resistant to HMBA that have lost the capacity to differentiate. We used RDA to identify and isolate genes that are differentially expressed in this cell line. Characterization of some of these genes is currently underway. Organismos Financiadores/Funding Agencies CAM, 08.5/ ( ) CAM, 08.1/ ( ) DGICYT, SAF ( ) DGICYT, BMC ( ) Tesis/Theses Leticia Olavarrieta Scappini. Análisis de la topología del DNA durante la replicación. Universidad Autónoma de Madrid. Marzo, Director: J.B. Schvartzman Blinder. Alicia Sánchez Gorostiaga. Estudio de las barreras para la replicación en el DNA ribosómico de Schizosaccharomyces pombe. Universidad Autónoma de Madrid. Marzo, Director: P. Hernández Valenzuela. Ana García Sacristán. Caracterización de la familia de proteínas quinasas CLK (CLK/STY, CLK2, CLK3 y CLK4) y su implicación en el control de la diferenciación en células de la eritroleucemia murina. Universidad Complutense de Madrid. Octubre, Directora: D.B. Krimer Smunis. 8

20 Biología Molecular de los Cromosomas / Molecular Biology of Chromosomes Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Benguría, A., Hernández, P., Krimer, D.B., and Schvartzman, J.B. (2003). Sir2p suppresses recombination of replication forks stalled at the replication fork barrier of ribosomal DNA in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 31, López-Casas, P.P., López-Fernández, L.A., Párraga, M., Krimer, D.B., and Del Mazo, J. (2003). Expression pattern of Ran- GTPase in mouse testis. Developmental regulation of expression for Ran/M1 and Ran/M2 isoforms. Intl. J. Develop. Biol. 47, Vanegas, N., García-Sacristán, A., López-Fernández, L.A., Párraga, M., del Mazo, J., Hernández, P., Schvartzman, J.B., and Krimer, D.B. (2003). Differential expression of Ran GTPase during HMBA-induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Leukemia Res. 27, Sánchez-Gorostiaga, A., López-Estraño, C., Krimer, D.B., Schvartzman, J.B., and Hernández, P. (2004). Transcription termination factor reb1p causes two replication fork barriers at its cognate sites in fission yeast rdna in vivo. Mol. Cell Biol. 24, Schvartzman, J.B., and Stasiak, A. (2004). A topological view of the replicon. EMBO Reports 5,

21 Reproducción Celular Cell Reproduction CONSUELO DE LA TORRE GARCÍA-QUINTANA Jefa de grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist GONZALO GIMÉNEZ MARTÍN Investigador Emérito / Emeritus Scientist JUAN FRANCISCO GIMÉNEZ ABIÁN Investigador Contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist JUANA PINCHEIRA VEGA (I -III y IX-X 2003) MARÍA ELIS LÓPEZ (X-XI 2004) Investigadoras Visitantes/ Visiting Scientists ANTONIA MONARDES MUÑOZ (Desde X-2003) MERCEDES SORIANO CASTÁN (V-VII 2004) B. Predoctorales /Graduate Students MARGARITA CARRASCOSA CEBRIÁN JOSÉ LUIS MARCILLA CABANILLAS Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Proliferación celular, Rutas de chequeo, Estructura cromosómica Mecanismos de chequeo en plantas Se ha demostrado la dispensabilidad de las rutas de chequeo en los primeros ciclos después de la estimulación fisiológica de proliferación en los primordios de raíces durmientes. En cuanto a la ruta de chequeo G2, se ha demostrado el requerimiento de la expresión de HSP90 para su activación y que esta ruta controla el estado de las secuencias de replicación tardía (centrómeros y telómeros). Se ha demostrado también que la ruta de chequeo G2 presenta, al igual que las redes neuronales, capacidad computacional, integrando señales mitogénicas y antimitogénicas. Entre las primeras, se computa el contenido en Keywords: Cell proliferation, Checkpoint mechanisms, Chromosome Structure Plant checkpoints We have proved the dispensability of checkpoints during the first cell cycles after the physiological stimulation to proliferate brought about in the dormant root primordial. We have also shown the need for HSP90 expression to activate the G2 checkpoint, and that this mechanism surveys the state of the late replicating sequences (centromeres and telomeres). The G2 checkpoint displays computational abilities like the neuronal networks. It integrates both mitogenic and antimitogenic signals to provide a single output. Specifically, when a mitotic cyclin (the B2;2) is ectopically expressed, the checkpoint 10

22 Reproducción Celular / Cell Reproduction Figura 1.- Segregación cromosómica en células Hela (esparcidos teñidos con Giemsa). Metafase en vista polar (izquierda) y anafase (derecha). Figure 1.-Chromosome segregation in Hela cells (spreads plus Giemsa). Polar view of a metaphase cell (left) and anaphase (right). una ciclina mitótica (la B2;2). Su expresión ectópica induce la adaptación al bloqueo, tanto después de radiación ionizante, como durante la persistencia de catenaciones no replicativas, producidas durante la individualización cromosómica premitótica. La expresión ectópica de ciclina mitótica B2;2 durante el periodo S permite que la cafeína sea también capaz de cancelar rutas de chequeo intra-s. Por una vía ajena a la que permite a la cafeína cancelar la ruta de chequeo G2, esta purina potencia daño cromosómico residual en mitosis durante la reparación de bases alquiladas en el DNA. Finalmente, en híbridos de caña de azúcar (S. officinarum x S. spontaneum), un 5% de los cromosomas son recombinantes entre ambas especies, indicando su origen en una previa inestabilidad genómica. Segregación cromosómica en mamíferos Esta segregación en anafase depende de la eliminación de los complejos de cohesina de los cromosomas. La mayor parte de los complejos de cohesina se disocian de los brazos cromosómicos durante profase y prometafase (presumiblemente por fosforilación) mientras pequeñas cantidades de cohesina, localizadas en los centrómeros, son eliminadas en el paso metafase-anafase endures adaptation in response to ionizing radiation and also to failures in the resolution of non-replicative catenations induced during premitotic chromosomal individualization. Control of the timing when the mitotic cyclin B2;2 is expressed proved to be responsible for the caffeine inability to cancel the intra-s checkpoints. Caffeine lowered the repair efficiency of alkylated DNA, independenly from checkpoint cancellation. Finally, 5% of the chromosomes in sugar cane hybrids were recombinants between the chromosomes of the two introgressed species. This supports the fact that they are the consequence of previous genome instability. Chromosome segregation in mammals Sister chromatid separation in anaphase depends on the removal of cohesin complexes from chromosomes. In vertebrates, the bulk of cohesin is already removed from chromosome arms during the prophase and prometaphase, whereas cohesin remains at centromeres until metaphase, when the Scc1 subunit is cleaved by separase. Polo Like Kinase 1 (Plk1) is involved in the removal of cohesin from chromosome arms as shown by depleting the Plk1 pools by RNAi. In the absence of Plk1 higher amounts of cohesin are detected in condensed chromosomes all 11

23 Reproducción Celular / Cell Reproduction Figura 2.- Inmunolocalización de cohesina en células Hela. Azul: -tubulina; Verde: Smc2 (condensina, ejes cromosómicos); rojo: Scc1 con cola de myc detectada por anti-myc (cohesina). La célula superior es una metafase control en la que se observa la cohesina localizada entre los ejes cromosómicos con mayor abundancia en las regiones centroméricas. La célula inferior corresponde a una prometafase de knock down de Plk1. Se observa una mayor abundancia de cohesina entre los ejes cromosómicos y carencia de la localización preferencial en los centrómeros. Figure 2.- Cohesin localization in Hela cells. Blue, -tubulin; green, Smc2 (condensin); red, myc-scc1 (cohesin). The upper cell corresponds to a control metaphase. Preferential localization of cohesin at the centromeres is observed though cohesin also localizes at chromosome arms. The bottom cell is a Plk1 RNAi prometaphase. Higher amounts of cohesin between chromosome cores is observed while preferential localization at the centromeres is not. Figura 3.- Huso mitótico en knock-down de Plk1. Immunolocalización de -tubulina (rojo), centrina (verde) y DNA (DAPI-azul). La célula superior derecha es una célula control en metafase en la que se observan los centriolos localizados en el extremo del huso bipolar. El resto corresponde a RNAi de Plk1 que muestra husos achatados o monopolares en los que los centriolos localizan independientemente de los polos celulares. Figure 3.- Mitotic spindles in Plk1 knock-down. Immunolocalization of - tubulin (red), centrin (green) and DNA-DAPI (blue). The upper right cell is a control metaphase showing centriole pairs located at both spindle poles. The other cells are Plk1 RNAi cells and display unfocussed or monopolar spindles in which centrioles localize independently of spindle poles. 12

24 Reproducción Celular / Cell Reproduction mediante el corte de la subunidad Scc1 por parte de la proteasa separasa. Mediante interferencia de RNA hemos determinado la implicación de la Polo Like Kinase 1 (Plk1) en la eliminación de cohesinas in vivo de los brazos cromosómicos durante mitosis temprana. Así, en ausencia de Plk1 grandes cantidades de cohesina permanecen uniendo las cromátidas hermanas a lo largo de toda su longitud en cromosomas con un grado de condensación metafásico. A pesar de ello, hemos comprobado que el disparo anafásico y la consiguiente activación de separasa son capaces de eliminar estas cantidades excesivas de cohesina. Hemos analizado también el papel de Plk1 en la correcta organización del huso mitótico. En ausencia de Plk1 el huso mitótico carece de polos bien definidos los cuales se localizan con independencia de los centrosomas. En respuesta a ello y a una deficiente organización del centrómero, el punto de chequeo del huso permanece activado en ausencia de Plk1 impidiendo a las células progresar a anafase. along their length. However, the triggering of anaphase and the subsequent separase activation can still remove all cohesin from chromosomes. We have also analysed the role of Plk1 in spindle organization. When Plk1 is depleted mitotic spindles are unfocussed and the spindle poles localize independently of centrosomes. This, together with an aberrant centromere morphology, triggers the spindle assembly checkpoint delaying cells from entering into anaphase. Organismos Financiadores/Funding Agencies MCyT, DGI (BMC ) CAM, 08.3/0011/2001 ( ) Tesis doctoral/doctoral Thesis Jesús Ángel Carballo González-Corroto. Destinos alternativos de células proliferantes de plantas tratadas con radiación ionizante. Universidad Autónoma de Madrid. Marzo, Directora: C. de la Torre. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/ Journal Articles De la Torre, C., Pincheira, J., and López-Sáez, J.F. (2003). Human syndromes with genomic instability and multiprotein machines that repair DNA double strand- breaks. Histology and Histopatholology 28, Del Campo, A., Samaniego, R., Giménez-Abián, J.F., Giménez-Martín, G., López-Sáez, J.F., Moreno Díaz de la Espina, S., and De la Torre, C. (2003). G2 checkpoint targets late replicating DNA. Biology of the Cell 95, Giménez-Abián, J.F., and Clarke, D.J. (2003). Replication-coupled topoisomerase II templates the mitotic chromosome scaffold? Cell Cycle 2,

25 Reproducción Celular / Cell Reproduction Moreno Díaz de la Espina, S., Samaniego, R., Yu, W., and De la Torre, C. (2003). Intermediate filament proteins with nuclear functions: Numa, lamin-like proteins and MFP1. Cell Biology International 28, Pelayo, H.R., Pincheira, J., Giménez-Abián, J.F., Clarke, D.J., and De la Torre, C. (2003). p53-independent checkpoint control in a plant cell model. Biological Research 36, Pérez-Talavera, S., Carballo, J.A., and De la Torre, C. (2003). Lack of mitotic delays at the onset of proliferation in dormant root primordia challenged by ionizing radiation. Biologia Plantarum 46, Pérez-Talavera, S., Carballo, J.A., and De la Torre, C. (2003). Unimpeded onset of proliferation and conserved processing of DNA damage in two Allium species after their challenge by ionizing radiation. Plant Biosystems 137, Pincheira, J., López-Sáez, J.F., Carrera, P., Navarrete, M.H., and De la Torre, C. (2003). Effect of caffeine on in vivo processing of alkylated bases in proliferating plant cells. Cell Biol. Int. 27, Weingartner, M., Pelayo, H.R., Binarova, P., Zwerger, K., Melikant, B., De la Torre, C., Heberle-Bors, E., and Bögre, L. (2003). A plant cyclin B2 is degraded early in mitosis and its ectopic expression shortens G2-phase and alleviates the DNA-damage checkpoint. J. Cell Sci. 116, Cerná, A., Cuadrado, A., Jouve, N., Moreno Díaz de la Espina, S., and De la Torre, C. (2004). Z-DNA, a new in situ marker for transcription. Eur. J. Histochem. 48, Cuadrado, A., Acevedo, R., Moreno Díaz de la Espina, S., Jouve, N., and De la Torre, C. (2004). Genome remodelling in three modern S. officinarum x S. spontaneum sugarcane cultivars. J. Exp. Bot. 55, Giménez-Abián, J.F., Sumara, I., Hirota, T., Hauf, S., Gerlich, D., De la Torre, C., Ellenberg, J., and Peters, J.M. (2004). Regulation of sister chromatid cohesion between chromosome arms. Current Biol. 14, Giménez-Abián, M.I., Giménez-Abián, J.F., Utrilla, L., and De la Torre, C. (2004). Nuclear ploidy is contingent on the microtubular cycle responsable for plant cytokinesis. Protoplasma 224, Giménez-Abián, M.I., Rozalén, A.E., Carballo, J.A., Botella, L.M., Pincheira, J., López-Sáez, J.F., and De la Torre, C. (2004). HSP90 and checkpoint-dependent lengthening of the G2 phase observed in plant cells under hypoxia and cold. Protoplasma 223, Sumara, I., Giménez-Abián, J.F., Gerlich, D., Hirota, T., Kraft, C., De la Torre, C., Ellenberg, J., and Peters, J.M. (2004). Roles of polo-like kinase 1 in the assembly of functional mitotic spindles. Current Biol. 14, Wirth, K., Ricci, R., Giménez-Abián, J.F., Taghybeeglu, J.F., Judo, M.R., Jochum, W., Vasseur-Cognet, M., and Nasmyth, K. (2004). Loss of the Anaphase-Promoting Complex in quiescent cells causes unscheduled hepatocyte proliferation. Genes Dev. 18, Capítulos de libros/book chapters De la Torre, C, Giménez-Abián, J.F., Magyar, Z., and Bögre, L. (2003). Checkpoint in G2 and early mitosis activated in response to DNA structural changes. Recent Research in Developmental Plant Science. 1. S. Pandalai (ed). Kerala (India) pp Giménez-Martín, G., Giménez-Abián, J.F., and Giménez-Abián, M.I. (2003). Bases moleculares del ciclo proliferativo. En: Cáncer. Instituto de España. García Barreno, Espinós Pérez, Cascales Angosto (eds). Madrid. pp

26 Mecanismos de Acción de Drogas Antitumorales Mechanisms of Action of Antitumour Drugs PATRICIO ALLER TRESGUERRES Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist ADORACIÓN GÓMEZ QUIROGA (Desde IX-2004) Investigadora Visitante / Visiting Researcher ADRIÁN MARIO RAMOS B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow DONNA AMRÁN COHÉN CARLOS FERNÁNDEZ SÁEZ PATRICIA SANCHO ANDRÉS B. Predoctorales / Graduate Students ELENA DE BLAS BROTONS Personal Técnico /Technician Palabras clave: Drogas antitumorales, Apoptosis, Necrosis, Estrés oxidativo, Proteínas quinasas, Células leucémicas mieloides Inducción de muerte celular (apoptosis y necrosis) por drogas antitumorales con componente metálico. Regulación por oxidación celular, proteínas quinasas, y proteínas HSP La aplicación de fármacos antitumorales representa el modo más común de tratamiento frente a diversos tipos de cáncer. Uno de los aspectos que ha de contemplar la quimioterapia consiste en controlar debidamente el mecanismo de ejecución de la destrucción celular es decir, lograr que se genere muerte por apoptosis (u otra forma de muerte programada), evitando en lo posible la muerte necrótica, que puede causar daño orgánico por diseminación de residuos celulares. Por ello, para la optimización del uso de los fármacos antitumorales es importante conocer los mecanismos que regulan la activación y ejecución de la apoptosis, y los factores que deciden la selección entre muerte apoptótica y necrótica. Esta problemática está siendo investigada en el laboratorio utilizando preferentemente cisplatino (y análogos platinados), y Keywords: Antitumour drugs, Apoptosis, Necrosis, Oxidative stress, Protein kinases, Myeloid leukemia cells The induction of cell death (apoptosis and necrosis) by metalbased antitumour drugs. Regulation by intracellular oxidation, protein kinases ans HSP proteins The administration of antitumour drugs represents the most common approach to cancer treatment. In this regard, one of problems to be faced by the chemotherapy consists in the strict control of the mechanisms of cell destruction i.e, to induce apoptosis (or other forms of programmed cell death) with minimum necrosis, since necrotic cell death may cause organic damage due to the free dissemination of cell debris. Hence, in order to optimize the use of antitumour drugs it is of great importance to underscore the mechanisms that regulate the activation and execution of apoptosis, and the factors that decide the selection between apoptosis and necrosis. These problems are currently under investigation in our laboratory, preferentially using the metal/metalloid-based antitumour drugs cisplatin (and related platinated drugs) and arsenic trioxide (As2O3, ATO). We mainly employ human myeloid 15

27 Mecanismos de Acción de Drogas Antitumorales / Mechanisms of Action of Antitumour Drugs el agente antileucémico trióxido de arsénico (As2O3, ATO), a los que la presencia de un componente metal o metaloide ( metal-based antitumor drugs ) confiere propiedades de regulación específicas. Utilizamos sobre todo modelos de células leucémicas mieloides humanas (promonocítica U937, promielocítica aguda NB4, y mielomonocítica HL60); ocasionalmente líneas celulares derivadas de carcinomas (p.e., HepG2); y células epitaliales de túbulo renal de rata NRK-52E (como modelo de citotoxicidad colateral). Los principales aspectos de interés son: (1) El estudio de la regulación de la apoptosis y necrosis por estrés oxidativo. Ello incluye (a) la determinación de la acumulación de especies reactivas de oxígeno, y el análisis de la acción protectora de antioxidantes; y (b) el estudio de los efectos derivados de la supresión de glutation (GSH) intracelular, como antioxidante endógeno mayoritario. Estos efectos se comparan con los provocados por aplicación de H2O2 exógeno, como tratamiento oxidante paradigmático. (2) El estudio de la regulación de la citotoxicidad de las drogas antitumorales por actividades proteína quinasas, especialmente MAPKs y PI3K/Akt. De particular interés en esta apartado ha sido la demostración de la existencia de interconexiones entre la modulación de actividades quinasas y alteraciones en el estado redox dependiente de glutation. (3) La determinación del comportamiento de factores involucrados en la ejecución de la apoptosis, particularmente en la vía intrínseca (citocromo c, Apaf-1, niveles de ATP, y cascada de caspasas 9/3) y su regulación por miembros anti- y pro-apoptóticos de la familia Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-XL; Bax, Bak, Bid). La participación de otras vías de ejecución de la apoptosis ( extrínseca ), y factores determinantes de otras formas de muerte programada (AIF, EndoG) son también objeto actualmente de consideración. Como elemento especial dentro de este último bloque, hemos prestado particular atención a la posible relación entre ejecución de la muerte celular y activación de la respuesta de estrés - medida por la expresión de HSPs (proteínas de choque térmico ). Los resultados obtenidos han permitido (a) demostrar la capacidad dispar de los agentes pro-apoptóticos para inducir la respuesta de estrés; (b) corroborar la acción anti-apoptótica (pero no aparentemente anti-necrótica) de la HSP70 y HSP27, debido a su capacidad de bloquear la salida de citocromo c mitocondrial; y (c) demostrar la capacidad de agentes antioxidantes para bloquear la respuesta de estrés, debido a la inactivación del factor transcripcional HSF1. leukemia cell lines (U937 promonocytic, NB4 acute promyelocytic, and HL60 myelomonocytic); occasionally human hepatocarcinoma HepG2 cells; and rat epithelial renal tubular NRK- 52E cells (as a model of collateral drug toxicity). The main aspects under investigation are: (1) The regulation of apoptosis and necrosis by oxidative stress. This includes (a) the determination of the intracellular accumulation of reactive oxygen species, and the protective action of antioxidants; and (b) the analysis of the effects derived of intracellular glutathione (GSH) depletion, the main endogenous intracellular antioxidant. These effects are compared with those provoked by the action of exogenous H2O2, a paradigmatic oxidant treatment. (2) The study of the regulation of drug cytotoxicity by protein kinases, especially MAPKs and PI3K/Akt. Of particular interest in this aspect was the demonstration of relationships between changes in protein kinase activities and alterations in the glutathione-dependent redox state. (3) The determination of the behaviour of factors involved in apoptosis execution, mainly in the intrinsic pathway (cytochrome c, Apaf-1, ATP levels, caspase 9/3 cascade), and its regulation by anti- and pro-apoptotic members of the Bcl-2 family (Bcl-2, Bcl-XL; Bax, Bak, Bid). Other pathways of apoptosis ( extrinsic ), and the factors responsible for other forms of programmed cell death (AIF, EndoG) are also under consideration. Concerning this later aspect, we paid particular attention to the relationship between cell death execution and activation of the stress response as measured by the expression HSPs ( heat-shock proteins). The obtained results allowed (a) to demonstrate the disparate capacity of pro-apoptotic agents to induce the stress response; (b) to corroborate the pro-apoptotic (but not apparently anti-necrotic) action of HSP70 and HSP27, due to their capacity to block cytochrome c extrusion from mitochondria; and (c) to demonstrate the capacity of antioxidant agents to block HSF1 transcription factor activation, and hence the stress response. 16

28 Mecanismos de Acción de Drogas Antitumorales / Mechanisms of Action of Antitumour Drugs Organismos Financiadores/Funding Agencies FIS, 01/0946 ( ) CAM, 08.3/0011/2001 ( ) MCYT, SAF ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Patricia Sancho Andrés. Inducción de muerte apoptótica y necrótica en células promonocíticas: regulación por oxidación y proteínas de estrés. Universidad de Alcalá, Director: P. Aller. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Sancho, P., Troyano, A., Fernández, C., De Blas, E., and Aller, P. (2003). Differential effects of catalase on apoptosis induction in human promonocytic cells. Relationships with heat-shock protein expression. Mol. Pharmacol. 63, Troyano, A., Sancho, P., Fernández, C., De Blas, E., Bernardi, P., and Aller, P. (2003). The selection between apoptosis and necrosis is differentially regulated in hydrogen peroxide-treated and glutahione-depleted human promonocytic cells. Cell Death. Differ. 10, Fernández, C., Ramos, A.M., Sancho, P., Amrán, D., De Blas, E., and Aller, P. (2004). 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate may both potentiate and decrease the generation of apoptosis by the antileukemic agent arsenic trioxide in human promonocytic cells. Regulation by extracellular signal-regulated protein kinases and glutathione. J. Biol. Chem. 279, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Amrán, D., Sancho, P., Fernández, C., Esteban, D., Ramos, A.M., De Blas, E., Gómez, M., Palacios, M.A., and Aller, P. (2005). Pharmacological inhibitors of extracellular signal-regulated protein kinases (ERKs) attenuate the apoptotic action of cisplatin in human myeloid leukemia cells via glutathione-independent reduction in intracellular drug accumulation. Biochim. Biophys. Acta (en prensa/in press). Miguel, B.G., Rodríguez, M.E., Aller, P., Martínez, A.M., and Mata, F. (2005). Regulation of cadmium-induced apoptosis by PKCδ in U-937 human promonocytic cells. Biochim. Biophys. Acta (en prensa/in press). Ramos, A.M., Fernández, C., Amrán, D., Sancho, P., De Blas, E., and Aller, P. (2005). Pharmacological inhibitors of PI3K/Akt potentiate the apoptotic action of the antileukemic drug arsenic trioxide via glutathione depletion and increased peroxide accumulation in myeloid leukaemia cells. Blood (en prensa/in press). 17

29 El sistema Polycomb de Regulación Epigenética Epigenetic Control by the Polycomb Group of Genes MIGUEL ANGEL VIDAL CABALLERO Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist JON SCHOORLEMMER (Desde II-2003) Investigador Contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist Mª DEL MAR LORENTE PÉREZ (Hasta IX-2004) TERESA MELGAR FERNÁNDEZ DE HENESTROSA (Hasta XII-2003) MÓNICA ROMÁN TRUFERO (Desde XII-2003) CARMEN SANCHEZ LASHERAS (Desde IX-2003) B. Predoctorales / Graduate Students NOEMI ARELLANO SÁNCHEZ (Hasta XII-2003) Personal Técnico / Technician Figura. Mapas de densidad de carga (negativa en rojo; positiva en azul) y estructura tridimensional de los dominios RING finger de Ring1B salvaje (A) y mutante (B). Este dominio es necesario para la monoubiquitinación de la histona H2A, y que está ausente la actividad que participa en la forma mutante (R70C). Los dominios has sido modelados por M. García (servicio Bioinformática) a partir de la estructura tridimensional deducida de patrones de difracción de rayos X o RMN de dominios relacionados. Figure. (A,B) Charge density plots (red and blue are negative and positive, respectively) on the modeled structure of the RING fingers corresponding to wild type (A) and R70C mutant Ring1B proteins. The monoubiquitylation of histone H2A of Ring1B depends on the RING finger as indicated by the lack of activity of the mutant form. Modelling of these RING fingers was carried out by M. Garcia (Bioinformatic, CIB). 18

30 El sistema Polycomb de Regulación Epigenética / Epigenetic Control by the Polycomb Group of Genes Palabras clave: Polycomb, Ring1, RYBP, Ratones transgénicos, Ratones knock-out, células ES Nuestro laboratorio estudia la función de los genes del grupo Polycomb (PcG), un sistema evolutivamente conservado implicado en el mantenimiento de estados transcripcionales inactivos. Los productos de los genes PcG forman complejos heterogéneos que se asocian a la cromatina, donde participan en el control de la actividad transcripcional a través de, entre otros mecanismos, la modificación de histonas. Ratones mutantes en genes PcG presentan fenotipos de desarrollo embrionario o en el sistema hematopoyético, asociados a la desregulación de genes imprinted, de reguladores de proliferación celular y de otros importantes en el desarrollo embrionario. En humanos, la desregulación de la función de algunos productos PcG está asociada a fenotipos tumorales. Caracterización funcional de genes del grupo Polycomb (PcG) de ratón La actividad del laboratorio está centrada en el estudio funcional de los genes que codifican Ring1A, Ring1B y RYBP, proteínas identificadas con anterioridad en nuestro laboratorio. Este estudio se extenderá mediante la identificación, por procedimientos proteómicos, de complejos en los que participan estas proteínas. Por otro lado, hemos iniciado un proyecto para el estudio del papel otros genes PcG en la función de células stem embrionarias (células ES). Análisis genético de la función de las proteínas Ring1A y Ring1B (Rnf2) Para abordar el estudio de la función de Ring1B hemos generado una línea de ratones con alteraciones en el locus Rnf2 que permiten su inactivación condicional, solucionando así el problema asociado a la letalidad embrionaria de la deficiencia constitutiva de Ring1B. La disponibilidad de una línea de ratones deficiente en Ring1A permitió obtener fibroblastos embrionarios doblemente deficientes en las proteínas Ring y así mostrar (en colaboración con el Dr. N. Brockdorf, en Londres y el Dr. H. Koseki en Yokohama) el papel de estas proteínas en la monoubiquitinación de la histona H2A. Ahora estamos estudiando el papel de estas proteínas en el sistema hematopoiético, tanto en Keywords: Polycomb genes, Ring1A, Rnf2, RYBP, Genetically modified mice, ES cells We are interested in the study of the function of the Polycomb group (PcG) of genes, an evolutionary conserved system involved in the maintenance of transcriptionally repressed states. The products of the PcG genes form heterogeneous chromatin-bound complexes. Although the precise molecular mechanism(s) through which they act are not known, they involve, at least in part, the modification of histones. Mutations in PcG genes result in alterations of embryonic development and of the hematopoietic system. These mutations are associated to the deregulation of developmentally relevant genes, regulators of proliferation or imprinted genes. The deregulation of some PcG genes is also found in some cancer patients. Functional characterization of PcG genes The laboratory is focused on the function of the products of the Ring1A, Rnf2 and RYBP genes, which we have previously identified. These studies will be extended by the proteomic analysis of complexes containing these polypeptides. On the other hand, we have recently started an analysis of the function of other PcG genes in stem cells. Genetic analysis of the murine Ring1A and Ring1B (Rnf2) genes We have generated a conditional mouse mutant for the Rnf2 gene which will allow us to overcome the embryonic lethality of the constitutive deficiency of Ring1B. Because we also have a Ring1A-deficient mouse mutant line, we can approach the function of Ring1 proteins. Thus, fibroblasts double deficient in Ring1A and Ring1B allowed, in collaboration with Dr. N. Brockdorf (London) and H. Koseki (Yokohama), to show a role for Ring1B in the monoubiquitylation of the histone H2A. We are currently studying the function of the Ring1 proteins in the hematopoietic system of mutant mice and in ES cell differentiation models. We have also shown, in collaboration with Dr. I. Guerrero (Madrid) and Dr. S. Pimpinelli (Roma) that the D. melanogaster PcG gene Sex combs extra (Sce) is the ortholog of vertebrate Ring1 genes. 19

31 El sistema Polycomb de Regulación Epigenética / Epigenetic Control by the Polycomb Group of Genes ratones como en sistemas de diferenciación in vitro a partir de células ES. Por otro lado, hemos demostrado, en colaboración con la Dra. I. Guerrero (Madrid) y S. Pimpinelli (Roma), que el gen Sex combs extra codifica Dring1, el producto del gen ortólogo de D. melanogaster. Análisis genético de la función de RYBP (proteína que interacciona con Ring1 y YY1) Para el análisis funcional de RYBP hemos generado (en colaboración con el Dr. H. Koseki) un ratón con una deleción de secuencias codificantes en el locus RYPB. En homocigosis, esta mutación es letal embrionaria debido, al menos en parte, a defectos en la formación de la placenta. En heterocigosis, esta línea presenta alteraciones moderadas del esqueleto axial, que se modifican en ausencia de Ring1A. Estos datos, junto con la asociación a cromatina de regiones de los loci de genes Hox, muestran que RYBP se comporta como un gen PcG. Proteínas PcG y el fenotipo tumoral El posible papel de proteínas PcG en el origen y desarrollo del fenotipo tumoral se está estudiando sistemáticamente mediante el análisis de su expresión utilizando matrices de tejidos. Este estudio forma parte de un proyecto coordinado con la Dra. Sánchez Beato, del CNIO. Functional analysis of RYBP (Ring1 and YY1 binding protein) To study RYBP function during mouse development we have generated (in collaboration with Dr. H. Koseki, Yokohama) a mouse mutant line in which coding sequences of the RYBP gene have been deleted. We have seen that the deficiency of RYBP results in embryonic lethality due, at least in part, to placentation defects. Mice with half dosage of RYBP showed moderate alterations in the axial skeleton which are modified in the absence of Ring1A. These results, together with the binding of RYBP to Hox gene chromatin, show that RYBP also acts as a PcG gene. PcG proteins and the tumoral phenotype The possible role of PcG genes in the cellular transformation processes associated to tumoral phenotypes, is being studied by analyzing PcG expression patterns in tissue arrays of both normal and tumoral tissues using our antibodies to PcG proteins. This subproject is part of a coordinated effort with Dr. Sánchez Beato at the CNIO in Madrid. Organismos Financiadores/Funding Agencies MCYT, SAF C02-01 ( ) Tesis Doctoral/Doctoral Thesis María del Mar Lorente. Función del gen Ring1A de ratón: un nuevo miembro del grupo Polycomb. Universidad Complutense de Madrid, Director: M.A. Vidal. 20

32 El sistema Polycomb de Regulación Epigenética / Epigenetic Control by the Polycomb Group of Genes Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Miyagishima, H., Isono, K., Fujimura, Y., Iyo, M., Takihara, Y., Masumoto, H. Vidal, M., and Koseki, H. (2003). Dissociation of mammalian Polycomb-group proteins, Ring1B and Rae28/ph1, from the chromatin correlates with configuration changes of the chromatin in mitotic and meiotic prophase. Histochem. Cell Biol. 120, De Napoles, M., Mermoud, J.E., Wakao, R., Tang, Y.A., Endoh, M., Appanah, R., Nesterova, T. B., Silva, J., Otte, A.P., Vidal, M., Koseki, H., and Brockdorff, N. (2004). Polycomb group proteins Ring1A/B link ubiquitylation of histone H2A to heritable gene silencing and X inactivation. Dev. Cell 7, Gorfinkiel, N., Fanti, L., Melgar, T., García, E., Pimpinelli, S., Guerrero, I., and Vidal, M. (2004). The Drosophila Polycomb group gene Sex combs extra encodes the ortholog of mammalian Ring1 proteins. Mech. Dev. 121, 5, Ramirez, A., Page, A., Gandarillas, A., Zanet, J., Pibre, S., Vidal, M., Tusell, L., Genesca, A., Whitaker, D.A., Melton, D.W., and Jorcano, J.L. (2004). Keratin K5Cre transgenic line appropriate for sissue-specific or generalized Cre-mediated recombination. Genesis 39, Sánchez-Beato, M., Sánchez, E., García, J.F., Pérez-Rosado, A., Montoya, M.C., Fraga, M., Artiga, J., Navarrete, M., Abraira, V., Morente, M., Esteller, M., Koseki, H., Vidal, M., and Piris, M.A. (2004). Abnormal PcG protein expression in Hodgkin s lymphoma. Relation with E2F6 and NFkappaB transcription factors. J. Pathol. 204, Wang, H., Wang, L., Erdjument-Bromage, H., Vidal, M., Tempst, P., Jones, R.S. and Zhang, Y. (2004). Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature 431,

33 Eliminación de Cromosomas en Insectos Chromosome Elimination in Insects CLARA GODAY BAYLINA Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist PATRICIA GONZÁLEZ GRECIANO B. Predoctoral / Predoctoral Fellow Palabras clave: Sciara, Eliminación de cromosomas, Impronta genómica Eliminación de cromosomas en Sciara La eliminación programada de cromosomas de origen paterno en diferentes estadíos del desarrollo del insecto Sciara (Díptera, Sciaridae) constituye un ejemplo clásico de fenómeno sometido a imprinting o impronta genómica. En los Ciáridos ocurren tres tipos de eliminación de cromosomas: (1) durante la separación de la línea somática en la embriogénesis temprana (eliminación de un cromosoma X o dos cromosomas X de origen paterno según el sexo del embrión); (2) en las células germinales embrionarias (eliminación de un cromosoma X paterno); y (3) durante la espermatogénesis (eliminación de todo el complemento cromosómico paterno). La impronta a la que están sometidos los cromosomas paternos/maternos de Sciara es de naturaleza reversible dado que se elimina y se restablece de una generación a la siguiente. Estamos investigando cuales son los mecanismos moleculares involucrados en el marcaje diferencial de cromosomas durante los procesos de eliminación. Hemos analizado la acetilación de las histonas H3 y H4 en células de la línea germinal de S. ocellaris y S. coprophila y, hemos demostrado que el nivel de acetilación de histonas difiere entre los cromosomas dependiendo de su origen parental. Estos resultados nos permitieron concluir que esta modificación histónica contribuye a especificar el marcaje de los cromosomas durante el fenómeno de eliminación de los mismos. Actualmente, estamos investigando si otras modificaciones epigenéticas, como la metilación de histonas y del DNA, están relacionadas con el proceso de eliminación programada de cromosomas en Sciara. Los datos hasta ahora obtenidos, sugieren que dichas modificaciones también difieren entre cromosomas maternos/paternos durante el Keywords: Sciara, Chromosome elimination, Imprinting Chromosome elimination in sciarid flies The programmed elimination of paternally-derived chromosomes in different stages of development that occurs in sciarid flies (Díptera, Sciaridae) constitutes a classic example of an imprinted phenomenon. Three types of tissue-specific chromosome elimination events occur in sciarids: (1) during embryonic somatic line separation (loss of one X chromosome or two X chromosomes depending on the embryo sex); (2) in embryonic germ cells (loss on one paternal X chromosome); and (3) during gametogenesis (discarding of the whole paternal chromosomal set). The imprinting that affects paternal/maternal chromosomes in sciarids is reversible since it is erased and re-established at each new generation. We investigated histone acetylation modifications in germline in Sciara ocellaris and S. coprophila and found that histone acetylation levels differ between chromosomes depending on their parental origin. The results indicate that histone acetylation contributes towards specifying the imprinted behaviour of chromosomes during the process of chromosome elimination. We are currently analysing whether other epigenetic modifications, such as histone methylation and DNA methylation, might be involved in the programmed elimination of chromosomes in Sciara. The programmed elimination chromosomes is considered to be an extreme mechanism of genomic inactivation, functionally comparable to chromatin inactivation by heterochromatinization. HP1 is a highly conserved protein that is involved in the assembly and maintenance of heterochromatin. in S. coprophila, during the process of paternal chromosomes elimination, anti-hp1 Drosophila antibodies recognize exclusively the paternal group of chromosomes. This observation, suggests the existence in Sciara of het- 22

34 Eliminación de Cromosomas en Insectos / Chromosome Elimination in Insects proceso de eliminación del complemento paterno en la espermatogénesis. La eliminación programada de material genético se considera una forma drástica de inactivación geníca, equiparable funcionalmente a los fenómenos de inactivación de cromatina por heterocromatinización. La proteina HP1 está altamente conservada desde las levaduras al hombre y participa activamente en el ensamblaje y mantenimiento de la heterocromatina. En S. coprophila, hemos detectado que el anticuerpo anti- HP1 de Drosophila, reconoce únicamente al grupo de cromosomas paternos, desde la profase meiótica y durante todo el proceso de eliminación de los mismos. Esta observación, sugiere que, en Sciara, existen proteínas específicas de heterocromatina que exhiben una fuerte correlación temporal y espacial con el fenómeno de eliminación de cromosomas. En S. coprophila, hemos identificado dos nuevos genes cuyas proteinas putativas contienen cromodominios y muestran una alta homología con HP1. Actualmente estamos caracterizando la expresión de estos genes durante el desarrollo y generando anticuerpos específicos para analizar la distribución celular de las proteínas correspondientes. Este trabajo ha sido realizado en colaboración con Maria Fernanda Ruiz del grupo de L. Sánchez (CIB, CSIC). erochromatic-like proteins that exhibit a strong temporal and spatial correlation with chromosome elimination process. In S. coprophila, we identified two new genes that codify for proteins containing chromodomains and showing high homology with HP1. We are currently characterizing the expression patterns of these genes during development and generating antibodies to study the cellular distribution of the corresponding proteins. This work was done in collaboration with M.F. Ruiz (CIB, CSIC). Organismos Financiadores/Funding Agencies DGYCYT, BMC ( ) DGYCYT, PB ( ) CAM, 08.6/0044/2001 ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Gorab, E., Ruiz, M.F., Goday, C., Eirin-López, J.M., and Sánchez, L. (2003). The Gene Sex- lethal of the Sciaridae Family (Order Diptera, Suborder Nematocera) and its Phylogeny in Dipteran Insects. Genetics 168, Ruiz, M.F., Goday, C., González, P., and Sánchez, L. (2003). Molecular analysis and developmental expression of the Sex-lethal gene of Sciara ocellaris (Diptera Order, Nematocera Suborder). Mech. Dev. 3, Contribuciones a Libros/Contributions to books Goday, C., and Ruiz, M.F. (2004). Mechanisms of epigenetic loss of chromosomes in insects. In Genetics, Genomics, Proteomics and Bioinformatics Online. John Wiley & Sons Ltd. 23

35 Citogenética Molecular Molecular Cytogenetics JOSÉ LUIS DÍEZ CORTES Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist GLORIA MORCILLO ORTEGA Doctora Vinculada / Associated Scientist CRISTINA IGLESIAS GUISASOLA AMELIA PARTEARROYO LACABA Personal Técnico/ Technicians Palabras clave: Chironomus, Cromosomas politénicos, Telómeros, Cromatina Mantenimiento de los teloméros en Chironomus: Un posible mecanismo alternativo al basado en telomerasa La organización telomérica en Dípteros difiere de la que se ha encontrado en la mayoría de los eucariontes analizados hasta ahora. En los insectos pertenecientes a este Orden los telómeros están formados por bloques de secuencias complejas repetidas de bp en vez de las secuencias cortas de 6-25 bp, muy conservadas, que se encuentran en la mayoría de los organismos en los que la reposición de las secuencias teloméricas se lleva a cabo vía telomerasa. La cuestión fundamental que se plantea en esta investigación es conocer si estas diferencias en organización se corresponden con mecanismos diferentes en cuanto al mantenimiento de la integridad de los telómeros. En el sistema telomerasa el complejo enzimático RNA/proteína es capaz de añadir secuencias cortas repetidas a los extremos de los cromosomas mediante un proceso de retrotransposición en el que el RNA intermediario forma parte del propio complejo enzimático. En Chironomus, la elongación de los telómeros mediada por secuencias complejas es desconocido. Pudiera tratarse de una variante evolutiva del sistema telomerasa que afectaría a un grupo de organismos formado por mas de especies. En el periodo considerado en la presente memoria se han continua- Keywords: Chironomus, Polytene chromosomes, Telomeres, Chromatin Telomeric maintenance in Chironomus: A possible alternative mechanism to that based on telomerase. Telomeric organization in Dipteran differs from those found in most of eucaryotes studied so far. Dipteran telomeres are formed by blocks of repeated complex sequences of bp instead of the short well conserved 6-25 bp present in the majority of the organisms. The main goal of this research is to know if the observed differences in organization correlate with differences in the mechanisms of maintenance of telomeric integrity. In the telomerase system the enzymatic complex RNA/protein is able to add short repeated sequences to the chromosomes ends. In this retrotransposition process the RNA template form part of the enzymatic complex itself. In Chironomus, the elongation of telomeres mediated by complex sequences is not known. It could be an evolutive variant of the telomerase system affecting a group of organisms formed by more than species. During the two-year period here considered, we have focused this research on the nuclear localization of a reverse transcriptase potentially involved in the maintenance of the telomeres.te results we have obtained support the hypothesis that the reposition of telomeric sequences would be achieved through a retrotransposition mechanism in which the RNA tem- 24

36 Citogenética Molecular / Molecular Cytogenetics do estos estudios centrándose principalmente en la localización nuclear de una retrotranscriptasa potencialmente implicada en el mantenimiento de los telómeros. Los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de que la reposición de las secuencias teloméricas se realizaría mediante un mecanismo de retrotransposición en el cual el RNA intermediario, a diferencia del modelo telomerasa, sería un producto de transcripción de las propias secuencias teloméricas. Cambios de la estructura de la cromatina asociados a la transcripción Se ha continuado el trabajo en este proyecto cuyo objetivo global consiste en analizar las modificaciones de la estructura de la cromatina asociadas a la transcripción por RNA pol I y RNA pol II mediante el Psoralen Gel Retardation Assay en el modelo Chironomus. Se han completado dos manuscritos, uno de los cuales se encuentra en fase de publicación y el segundo será enviado próximamente. Con la experiencia adquirida, se ha iniciado el estudio de la cromatina ribosomal en Sciara coprophila. En este organismo los genes ribosómicos están situados el cromosoma X por lo que en los machos (XO) aparece un proceso de compensación de dosis génica respecto a las hembras (XX). La cuestión que se investiga es si en la compensación de dosis de genes multicopia el mecanismo de compensación implica o no un incremento del número de genes activos. Este estudio se está desarrollando en colaboración con Patricia González del laboratorio de la Dra. Clara Goday. Organización nucleolar Chironomus en células politenizadas de plate, unlike telomerase system, would be delivered by the transcription of the telomeric sequences themselves. Changes of the chromatin structure associated to transcription We have continued working on this research whose main goal is to study the modifications of the chromatin structure associated to RNA pol I and RNA pol II transcription in the model Chironomus by the Psoralen Gel retardation Assay.Two articles have been prepared, the first one is subjected to revision for publication and de second one will be sent to the journal near future, We have initiated the study of ribosomal chromatin in Sciara cophrophila. In this organism ribosomal genes are located in X chromosome, thus subjected to dosage compensation in the males (XO). The question under research is to know if the dosage compensation of multicopy genes involves or not an increase of the number of active genes. This research is being carried out in collaboration with Patricia Gonzalez from Dr. Clara Goday s laboratory. Nucleolar organization in Chironomus polytene cells This research has been carried out in collaboration with Dr. F.J. Medina s group. In the last two years the goal of the project has been achieved at reasonably high extent. The results of the study have been included in the V. Rodriguez Vilariño s doctoral Thesis recently defended at UCM. More information can be found in the report corresponding to Dr. J. Medina s laboratory. Este proyecto se ha desarrollado en colaboración con el grupo del Dr. F.J. Medina. En los últimos dos años se han cubierto en gran medida los objetivos propuestos. Los resultados obtenidos se integran en la tesis doctoral de Victoria Rodriguez Vilariño presentada para su defensa en la UCM. Los aspectos concretos del mismo se exponen en esta memoria en el apartado correspondiente al citado grupo. En la actualidad se trabaja en la elaboración de los resultados con miras a su publicación. 25

37 Citogenética Molecular / Molecular Cytogenetics Organismos financiadores/founding Agencies BMC-1141 ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Martinez-Guitarte, J.L., Diez, J.L., and Morcillo, G. (2004). Complex repetitive sequences in Chironomus telomeres: Its role in telomeric function and inthe cellular stress response. Recent Devel. Nucleic Acid Res. 1,

38 Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos Evolution of Sex Determining Mechanisms in Insects LUCAS SÁNCHEZ RODRÍGUEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist Mª FERNANDA RUIZ LORENZO Investigador Contratado / Research Associate SERGIO CASAS TINTÓ AITOR LARRINAGA GONZÁLEZ (IX-XII-2003, X-XII 2004) ESTHER SERNA SANZ (Hasta VI-2004) B. Predoctorales / Graduate Students DOLORES MATEOS MOYA Personal Técnico / Technician MERCEDES ALVAREZ GARCÍA (Desde X-2003) IKER MARTÍN SÁNCHEZ (Desde X-2004) Estudiantes / Students Palabras clave: Evolución, Determinación sexual, Compensación de dosis, Análisis teórico de sistemas genéticos de desarrollo, MNF (Fork head), Drosophila Hemos clonado y caracterizado en los ciáridos Sciara ocellaris, Sciara coprophila, Rhynchosciara americana y Trichosia pubescens (Orden Díptera, Suborden Nematocera) el homólogo del gen Sex-lethal (Sxl) de Drosophila melanogaster. Este gen juega el papel clave en el control de la determinación sexual y compensación de dosis en los drosophilidos (Orden Diptera, Suborden Brachycera). El gen Sxl de los ciáridos produce un único transcrito que codifica para una única proteína en ambos sexos. La comparación de las proteínas Sxl de los insectos Nematocera y de los Brachycera mostró un alto grado de conservación en los dominios RBDs de unión de Sxl al ARN, mientras que existe una variación significativa en los dominios amino- y carboxilo-terminales. La gran mayoría de los cambios en los RBDs son sinónimos, indicando que la selección purificadora está actuando sobre ellos. En ambos sexos, la proteína Keywords: Evolution, Sex determination, Dosage compensation, Theoretical analysis of developmental gene systems, MNF (Fork head), Drosophila We have cloned and characterised in the sciarids (order Diptera, suborder Nematocera) Sciara ocellaris, Sciara coprophila, Rhynchosciara americana and Trichosia pubescens the gene homologous to Sex-lethal (Sxl) of Drosophila melanogaster. This gene plays the key role controlling sex determination and dosage compensation in the latter species. The Sxl gene of the four species studied produces a single transcript encoding a single protein in both males and females. Comparison of the Sxl proteins of these Nematocera insects with those of the Brachycera showed their two RNA-binding domains (RBD) to be highly conserved, whereas significant variation was observed in both the N- and C-terminal domains. The great majority of nucleotide changes in the RBDs were synonymous, indicating that purifying selection is acting on them. In both sexes of the three Nematocera insects, the Sxl protein co- 27

39 Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos / Evolution of Sex Determining Mechanisms in Insects Sxl en los ciáridos se localiza en los sitios activos en transcripción, co-localizando con la ARN polimerasa II pero no con la ARN polimerasa I. Todos estos resultados indican que Sxl no juega el papel clave en la control de la determinación sexual y la compensación de dosis génica en los ciáridos. Por lo tanto, durante el linaje filogenético que dió lugar a los drosophilidos, el gen Sxl fue reclutado, modificado, y convertido en el gen clave que controla dichos procesos. Ciertas propiedades del gen Sxl ancestral han sido beneficiosas y se han mantenido en el gen Sxl evolucionado. Este trabajo se ha llevado a cabo con la colaboración de E. Gorab, del Departamento de Biología, Universidad de Sao Paulo, Brasil; y de J. M. Eirín-López del Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad A Coruña. Hemos desarrollado un modelo teórico para la regulación específica de sexo del gen Sxl de Drosophila melanogaster. El modelo está basado en datos moleculares bién conocidos y utiliza una formulación estocástica de la transcripción. El modelo da lugar a una revisión del papel de los diferentes mecanismos de regulación que determinan una decisión robusta sobre el estado transcripcional de Sxl; en particular, la idea establecida de una transcripción total (en hembras) o ausente (en machos) a partir del promotor temprano de Sxl por la señal X/A (razón de cromosomas X a grupos de autosomas). Demostramos que la autorregulación implicada en el procesamiento alternativo del transcrito primario de Sxl genera una respuesta bi-estable ( todo o nada ) que constituye un mecanismo de memorización eficiente. El modelo muestra que una poca producción de proteína Sxl temprana en los machos deja la autorregulación positiva en su estado off. Este trabajo ha sido llevado a cabo en colaboración con M. Louis y L. Holm del European Bioinformatics Institute, EMBL Outstation, Cambridge, Reino Unido; y M. Kaufman del Centre for Non-limear Phenomena and Complex Systems, Université Libre de Bruxelles, Bélgica. En ambos sexos, el disco genital de Drosophila está formado por tres primordios de distinto origen segmental: el primordio genital de hembra derivado del segmento A8, el primordio genital de macho derivado del segmento A9, y el primordio anal derivado de los segmentos A Cada primordio está formado por un compartimento anterior (A) y un compartimento posterior (P). Demostramos que Hedgehog (Hh) expresado en el compartimento P señaliza diferencialmente a las células del compartimento A adyacentes al borde A/P de los compartimenlocalised with transcription-active regions dependent on RNA polymerase II but not on RNA polymerase I. Together, these results indicate that Sxl does not appear to play a discriminatory role in the control of sex determination and dosage compensation in nematocerans. Thus, in the phylogenetic lineage that gave rise to the drosophilids, evolution co-opted for the Sxl gene, modified it, and converted it into the key gene controlling sex determination and dosage compensation. At the same time, however, certain properties of the recruited ancestral Sxl gene were beneficial, and these are maintained in the evolved Sxl gene, allowing it to exert its sex determining and dosage compensation functions in Drosophila. This work has been done in collaboration with E. Gorab,from Department of Biology, University of Sao Paulo, Brazil; and J. M. Eirín-López from Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad A Coruña. We have developed a theoretical model for the sex-specific regulation of Sxl expression in Drosophila melanogaster. The model is based on the well-documented molecular details of the system and uses a stochastic formulation of transcription. The model leads to a revision of the role of different regulatory mechanisms in achieving a robust switch. In particular, they lead to reappraise the prevailing idea of an all-or-none transcriptional control of the early Sxl promoter by the X/A signal (molecular signal communicating the X chromosomes to autosdome sets ratio). We demonstrated that the autoregulatory loop involved in the alternative splicing of Sxl primary transcript generates all-or-none bistable behaviour and constitutes an efficient memorisation device. The model indicates that little production of early Sxl protein leaves the autoregulatory loop in its off state. This work has been done in collaboration with M. Louis and L. Holm from the European Bioinformatics Institute, EMBL Outstation, Cambridge, United Kingdom; and M. Kaufman from the Centre for Non-limear Phenomena and Complex Systems, Université Libre de Bruxelles, Belgium. In both sexes, the Drosophila genital disc is comprised of three segmental primordia: the female genital primordium derived from segment A8, the male genital primordium derived from segment A9, and the anal primordium derived from segments A Each segmental primordium has an anterior (A) and a posterior (P) compartment, the P cells of the three segments being contiguous at the lateral edges of the disc. We have shown that Hedgehog (Hh) expressed in the P compartment dif- 28

40 Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos / Evolution of Sex Determining Mechanisms in Insects tos y a las células A adyacentes al borde entre segmentos. Al igual que ocurre en el disco imaginal del ala, en el disco genital la restricción clonal establecida por el borde A/P está determinada por Hh. Los bordes segmentales, también, actúan como una barrera clonal, a pesar de que los compartimentos P de los tres primordios convergen en las regiones laterales del disco genital. La restricción clonal debida a los bordes segmentales no depende de Hh, En o los genes Hox. Los bordes segmentales, sin embargo, son permeables a algunas señales morfogenéticas. Experimentos de ablación celular mostraron que la presencia de los tres primordios es necesaria durante el desarrollo para que el disco genital prolifere normalmente. Todos estos resultados indican que existe una interacción entre los tres primordios que forman el disco genital, la cual es necesaria para su desarrollo normal. Este trabajo ha sido realizado en colaboración con N. Gorfinkiel e I. Guerrero del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC-Universidad Autónoma, Madrid. Hemos caracterizado la unidad repetitiva de los genes de las histonas conteniendo el gen de la histona H1 en cinco especies de Mytilus (mejillones). Dicha unidad está formada por H4- H2B-H2A-H3-H1 con dos genes del ARNr 5S con las correspondientes regiones espaciadoras. La región 3 UTR de los genes de las histonas poseen dos señales de terminación de la transcripción diferentes, estando ambas relacionadas con la dinámica del patrón de expresión de las histonas durante el ciclo celular. Las histonas H1 caracterizadas comparten características con los genes H1 huérfanos, sugiriendo un origen evolutivo común para ambos subtipos de histonas. Este trabajo ha sido realizado en colaboración con J.M. Eirín-López, A.M. González-Tizón, A. Martínez y J. Méndez del Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad de A Coruña. Hemos llevado a cabo el análisis formal del sistema genético formado por los genes pair-rule involucrados en controlar la segmentación en Drosophila. Proponemos un modelo lógico que da cuenta de la capacidad de estos genes para determinar la yuxtaposición de células que expresan engrailed con células que expresan wingless, las cuales forman los bordes (para)segmentales. El módulo pair-rule tiene la capcidad intrínseca de generar cuatro estados estables diferentes, cada uno caracterizado por la expresión de una combinación particular de genes pair-rule. La selección de estos estados viene determinada por la combinación particular de productos Gap y productos maternos, y de las interacciones cruzadas entre los genes pair-rule. Estas últiferentially signals A cells at the A/P compartment border and A cells at the segmental border. As in the wing imaginal disc, cell lineage restriction of the A/P compartment border is defined by Hh signalling. There is also a lineage restriction barrier at the segmental borders, even though the P compartment cells of the three segments converge in the lateral areas of the disc. Lineage restriction between segments A9 and A10-11 depends on factors other than the hh, en and Hox genes. The segmental borders, however, can be permeable to some morphogenetic signals. Furthermore, cell ablation experiments show that the presence of all primordia (either the anal or the genital primordium) during development are required for normal development of genital disc. Collectively, these findings suggest that interaction between segmental primordia is required for the normal development of the genital disc. This work has been done in collaboration with N. Gorfinkiel, and I. Guerrero from Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid. We have characterised the clustered histone repetitive unit containing an H1 gene in five mussel Mytilus species. The quintet H4-H2B-H2A-H3-H1 is the major organisation unit in Mytilus galloprovincialis with two 5SD rrna genes with intgerspersed non-transcribed spacer segments linked to the unit. The 3 UTR regions of histone genes show two different mrna termination signals, a stem-loop and a polyadenylation signal, both related to the evolution of histone gene expression patterns throughout the cell cycle. The clustered H1 histones characterised share essential features with orphon H1 genes, suggesting a common evolutionary origin for both histone subtypes. This work has been done in collaboration with J.M. eirín-lópez, A.M. González-Tizón, A. Martínez y J. Méndez from Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad de ACoruña. We have performed a dynamical analysis of the pair-rule cross-regulatory module controlling segmentation in Drosophila melanogaster. We proposed a logical model accounting for the ability of the pair-rule module to determine the formation of alternate juxtaposed Engrailed- and Wingless-expressing cells that form the (para)segmental boundaries. This module has the intrinsic capacity to generate four distinct expression states, each characterised by the expression of a particular combination of pair-rule genes or expression mode. The selection of one of these expression modes depends on the maternal and gap 29

41 Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos / Evolution of Sex Determining Mechanisms in Insects mas interacciones son clave para la interpretación del pre-patrón formado por los productos maternos y los productos Gap. El modelo reproduce los patrones de expresión de los genes pairrule correspondientes a la situación normal del desarrollo, y a las situaciones mutantes para mutaciones de pérdida de función, de expresión ectópica y de mutaciones en secuencias reguladoras en cis de los genes pair-rule. El modelo proporciona una explicación formal para el papel morfogenético de la expresión inicial espacial en forma de distribución normal del gen even-skipped; esto es, los distintos efectos que diferentes concentraciones del producto Even-skipped tiene sobre sus genes diana pairrule. También da una explicación formal del requerimiento de even-skipped para la formación de todas las bandas de expresión del gen engrailed. Finalmente, da una explicación formal al papel y a los orígenes evolutivos de las aparentes redundancias en la estructura de la red genética que forman los genes pairrule. Este trabajo ha sido llevado a cabo en colaboración con D. Thieffry del Laboratoire de Génétique et Physiologie du Développement, de la Université de la Méditerranée, Marseille, Francia. Factores de trascripción de la familia fork head en Drosophila Esta línea de investigación pretendemos abordar el estudio de un grupo de factores de transcripción que pueden jugar un papel muy importante a lo largo del desarrollo embrionario de Drosophila. MNF (miocyte nuclear factor) es un nuevo factor de transcripción de la familia fork head, implicado en el desarrollo embrionario del tubo digestivo y del sistema nervioso de Drosophila: los embriones mutantes para MNF presentan aberraciones en la formación de las constricciones del tubo digestivo medio y en el desarrollo del sistema nervioso. El desarrollo embrionario de estos embriones mutantes se detiene en el estadio 15. El dominio de unión al ADN (dominio fork head) de esta proteína presenta una similaridad del 70% con el dominio fork head de los factores MNF (Foxk1) e ILF (FOXK1) de vertebrados. El gen MNF de Drosophila codifica para dos isoformas, MNF-S y MNF-L, de 654 y 740 aminoácidos, respectivamente. MNF tiene una expresión restringida a lo largo del desarrollo embrionario (el patrón de expresión de la proteína MNF, coincide con el del mrna a lo largo del desarrollo embrionario.) El mrna se detecta por primera vez en el blastodermo sincitial. En inputs, but also crucially on cross-regulations among pair-rule genes. The latter are instrumental in the interpretation of the maternal-gap pre-pattern. Our logical model allows the qualitative reproduction of the patterns of pair-rule gene expressions corresponding to the wild type situation, to loss-of-function and cis-regulatory mutations, and to ectopic pair-rule expressions. Furthermore, this model provides a formal explanation for the morphogenetic role of the initial bell-shaped expression of the gene even-skipped, i.e. for the distinct effects of different levels of the Even-skipped protein on its target pair-rule genes. It also accounts for the requirement of Even-skipped for the formation of all Engrailed-stripes. Finally, it provides new insights into the roles and evolutionary origins of the apparent redundancies in the regulatory architecture of the pair-rule module. This work has been done in collaboration with D. Thieffry from Laboratoire de Génétique et Physiologie du Développement, Université de la Méditerranée, Marseille, France. Transcription factors of the Fork head family in Drosophila In this project is being studied MNF (miocyte nuclear factor), a new transcription factor that belongs to the fork head family of D. melanogaster. It is involved in the development of the gut and nervous systems of this species: embryos lacking MNF fucntion show aberrant development of the gut and nerveous systems. The development of these mutant embryos is halt at stage 15. The DNA binding domain (Fork head domain) of MNF shows a similarity of 70% with the fork head domain of the MNF factors Foxk1 and ILF (FOXK1) of vertebrates. The Drosophila MNF encodes two proteins of 654 (MNF-S) and 740 (MNF-L) amino acids. MNF has a restricted expression throughout development the distribution of the MNF protein coincides with that of its mrna. This is first detected at the syncytial blastoderm. At latter embryonic stages, MNF is expressed in the endoderm of parasegments 3 and 7 of the gut and in the nerve cord. The diffusible molecule Dpp (Decapentaplegic), which belongs to the family of TGF-β, is expressed in the parasegments 3 and 7 of the adyacent visceral mesoderm. Ectopic Dpp expression in the whole embryonic visceral mesoderm (through the UAS/Gal4 sytem) causes expansion of MNF expression in the whole adyacent endoderm. On the other hand, embryos lacking dpp function do not show expression of MNF. These results suggest that dpp regulates MNF expression. 30

42 Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos / Evolution of Sex Determining Mechanisms in Insects estadios embrionarios mas tardíos, el gen se expresa en el endodermo de los parasegmentos 3 y 7 del tubo digestivo y a lo largo de la cuerda nerviosa embrionaria. En los parasegmentos 3 y 7 del mesodermo visceral adyacente se expresa dpp (decapentaplegic), una molécula difusible de la familia TGF-β. Al sobreexpresar dpp a lo largo de todo el mesodermo visceral embrionario (sistema UAS/Gal4), la expresión de MNF se expande por todo el endodermo. Por otro lado, los embriones mutantes deficientes para dpp no expresan MNF en el endodermo adyacente. Estos datos sugieren que dpp regula la expresión de MNF en el desarrollo embrionario. Análisis genéticos apoyan estos resultados. Con esta línea de trabajo queremos estudiar como MNF está implicado en el desarrollo embrionario del tubo digestivo y del sistema nervioso en Drosophila y la posible interacción con genes como dpp y labial en el desarrollo embrionario. Genetic analyses support this contention. It is intended to establish the relationship between dpp, labial and MNF in the development of gut and nerveous systems in Drosophila embryo. Organismos Financiadores/Funding Agencies DGICYT, BMC ( ) CAM, 08.6/0044/ ( ) Convenio CSIC-CNPq (Brasil) ( ) DGICYT, BMC ( ) Tesis doctorales/doctoral Thesis Esther Serna Sanz. El gen Sex-lethal de la familia Sciaridae. Universidad Autónoma de Madrid, Mayo, Director: L. Sánchez Rodríguez. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Gorfinkiel, N., Sánchez, L., and Guerrero, I. (2003). Development of the Drosophila genital disc requires interactions between its segmental primordia. Development 130, Louis, M., Holm, L., Sánchez, L. and Kaufman, M. (2003). A theoretical model for the regulation of Sex-lethal, a gene that controls sex determination and dosage compensation in Drosophila melanogaster. Genetics 165, Ortega, A., Niksic, M., Bacchi, A., Wilm, M., Sánchez, L., Hastie, N and Valcárcel, J. (2003). Biochemical function of Female- Lethal (2)D/Wilms Tumor Suppressor-1 associated proteins in alternative pre-mrna splicing. J. Biol. Chem. 278,

43 Evolución de los Mecanismos de Determinación Sexual en Insectos / Evolution of Sex Determining Mechanisms in Insects Penalva, L.O.F., and Sánchez, L. (2003). The RNA binding protein Sex-lethal (Sxl) and the control of Drosophila sex determination and dosage compensation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, Ruiz, M.F., Goday, C., González, P., and Sánchez, L. (2003). Molecular analysis and developmental expression of the Sex-lethal gene of Sciara ocellaris (Diptera Order, Nematocera Suborder). Gene Expression Patterns (Mech. Dev.) 3, Thieffry, D., and Sánchez, L. (2003). Dynamical modelling of pattern formation during embryonic development. Curr Opin Genet Dev 13, Sánchez, L., and Thieffry, D. (2003). Segmenting the fly embryo: a logical analysis of the pair-rule cross-regulatory module. J. Theor. Biol. 224, Eirín-López, J.M., Ruiz, M.F., González-Tizón, A.M., Martínez, A., Sánchez, L., and Méndez, J. (2004). Molecular evolutionary characterization of mussel Mytilus histone multigene family: First record of a tandemly repeated unit of five histone genes containing an H1 subtype with orphon features. J. Mol. Evol. 58, Serna, E., Gorab, E., Ruiz, M.F., Goday, C., Eirín-López, J.M., and Sánchez, L. (2004). The gene Sex-lethal of the Sciaridae Family (Order Diptera, Suborder Nematocera) and its phylogeny in dipteran insects. Genetics 168, Contribuciones a Libros/Contributions to books Thieffry, D., and Sánchez, L. (2004). Qualitative analysis of gene networks: Towards the delineation of trans-regulatory modules. In Modularity in Development and Evolution (G. Schlosser and G. Wagner, eds.). University of Chicago Press, Chicago, USA. pp Próximos Artículos/Forthcoming Articles Lagos, D., Ruiz, M.F., Sánchez, L., and Komitopoulou, K. (2005). Isolation and characterization of the Bactrocera oleae genes orthologous to the sex determining Sex-lethal and doublesex genes of Drosophila melanogaster. Gene (en prensa/in press). Sánchez, L., Gorfinkiel, N., and Guerrero, I. (2005). Sex determination and the development of the genital disc. In: Comprehensive Molecular Insect Science. Gilbert, L.I., Latrou, K., and Gill, S.S. (eds.) Volumen: 1, Elsevier BV, UK., pp

44 Biología Molecular de la Gametogénesis Molecular Biology of Gametogenesis JESÚS DEL MAZO MARTÍNEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist NIEVES VALENTÍN RODRIGO (Hasta IV-2003) Doctora Vinculada / Associated Scientist MARCO JARA GONZALEZ (X-2004) MARIO PÁRRAGA SAN ROMÁN (XI-2004) Investigadores Visitantes / Visiting Scientist PEDRO PABLO LÓPEZ CASAS MARÍA PAZ FERNANDEZ-ESPAÑA Contratados Postdoctoral / Postdoctoral Fellows EMILIO GONZÁLEZ GONZÁLEZ RAQUEL MARRERO DÍAZ (Hasta IX-2004) JUAN C. ORTEGA LÁZARO (Hasta IX-2003) TERESA SANZ PIÑAR (Hasta IV-2003) B. Predoctorales / Graduate Students FERNANDO ESCOLAR ANTUNEZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Gametogénesis, Expresión Génica, Infertilidad, Disruptores Endocrinos, Reprotoxicidad Expresión y regulación génica en la gametogénesis de mamíferos La gametogénesis es un proceso de diferenciación terminal de células especializadas que finaliza en la formación de gametos. La viabilidad de las células germinales requiere múltiples mecanismos de control y regulación génica. Nuestro laboratorio ha estado enfocado en los últimos años en la caracterización y regulación específica de genes que expresándose en las gónadas de mamíferos participan en el desarrollo de la gametogénesis. Keywords: Gametogenesis, Gene Expression, Infertility, Endocrine Disruptors, Reprotoxicity Gene expression and regulation in mammalian gametogenesis Gametogenesis is a process of terminal differentiation of specialised cells ending in the formation of gameta. The viability of germ cells requires multiple mechanisms of control and gene regulation. The focus of our laboratory has been in last years in the characterisation and specific regulation of genes that expressing in mammalian gonads participates in gametogenesis. 33

45 Biología Molecular de la Gametogénesis / Molecular Biology of Gametogenesis Izda. Expresión diferencial de genes expresados testículo de ratón expuestos a phtalatos como disruptor endocrinos. Microarray de DNA. Dcha. Patrón de proteínas mediante electroforesis 2D de testículos de ratones expuestos a Lindano como agente disruptor endocrino. Replicas: A) exposición de madres previa a la concepción. B) incluyendo exposición prenatal de los descendientes C) incluyendo exposición puberal. Rojo: proteínas que incrementan su presencia. Verde: proteínas que disminuyen su presencia. Left. Differential gene expression in mouse testis from animals exposed to phthalate as endocrine disrupter. DNA microarray. Right. Pattern of proteins by 2D electrophoresis from mouse testis from animals exposed to Lindane as endocrine disrupter. Replicates A) exposure to premating mothers B) including prenatal exposure of the offspring C) including puberal exposure. Red proteins that increase accumulation. Green Proteins decreasing. Para este objetivo, hemos usado diferentes abordajes experimentales incluyendo: producción de genotecas de cdna a partir de células gametogénicas específicas; análisis molecular de genes clonados; análisis de la expresión génica por microarrays y métodos citológicos; perfiles proteómicos y generación de ratones transgénicos. Recientemente, también hemos iniciado nuevos modelos experimentales de estudio de la regulación de la expresión génica en ratón basados en silenciamiento génico por interferencia de RNA (irna), tanto in vitro como in vivo en células del epitelio seminífero. Hemos progresado en la caracterización del papel en espermatogénesis de una proteína previamente identificada por nosotros: Rnf19 (XYbp) como una E3 ligasa implicada en el sistema de ubiquitinización y procesamiento por el proteosoma. Asimismo, hemos identificado el papel de una proteína, flotilina-1, asociada a dominios de lipid rafts de la membrana plasmática en las interacciones célula-célula. Actualmente estamos explorando el papel de esta proteína en células germinales junto con otras proteínas asociadas relacionadas con la adhesión y comunicación celular tales como vinexina y vinculina To this aim, we are using different experimental approaches including: production of cdna libraries from specific gametogenic cells; subtractive cdna libraries, molecular analysis of cloned genes; analysis of gene expression by cytological and microarray methodology; proteomic profiles and generation of transgenic mice. Recently, we have also initiated new experimental models to study the regulation of gene expression in mouse based on RNA knockdown by interference of RNA (RNAi) both in vivo and in vitro in cells of seminiferous epithelium. We are progressing in the characterisation of the role in spermatogenesis of a protein previously identify by us: Rnf19 (XYbp) as a E3 ligase involved in the ubiquination system and proteosoma processing. We have also identified the role of a protein, flotillin-1, associated to lipid rafts domains of plasma membrane in cell-cell interactions. At present, we are exploring the role of this protein in germ cells along with other associated proteins related to cell adhesion and cell communications such as vinexin and vinculin. 34

46 Biología Molecular de la Gametogénesis / Molecular Biology of Gametogenesis Reprotoxicidad, desregulación génica e infertilidad masculina Numerosos informes indican una disminución de la calidad y cantidad del esperma tanto en humanos como en animales silvestres. Ello esta también asociado con un incremento de la tasa de cáncer testicular y de disfunciones gonadales. El origen de una alta proporción de casos de infertilidad masculina idiopática, podría estar relacionada con estos sucesos. Contaminantes medioambientales tales como los denominados disruptores endocrinos han sido señalados como los mayores causantes de tales disfunciones. Los disruptores endocrinos son un grupo de compuestos que, actuando como desreguladores endocrinos, pueden generar desregulación génica, dependiente del fondo genético de los organismos. El sistema reproductivo ha sido considerado como una diana crucial para el impacto de estas sustancias. Nosotros hemos estado interesados en la valoración de la desregulación génica en células de testículo en desarrollo de animales expuestos a disruptores endocrinos. Para este objetivo, hemos llevado a cabo diferentes aproximaciones incluyendo genómica funcional y proteómica. En estudios previos habíamos aislado y clonado mas de 200 cdnas diferentes correspondientes a genes expresados en células gaméticas y potenciales dianas de desregulación por el efecto de reprotóxicos, incluidos disruptores endocrinos. Esta ha sido la base para generar un prototipo de microarray con oligonucleótidos correspondientes a 300 genes específicos (GENDISRUPT-1). Hemos usado asimismo microarrays de DNA, que incluyen el transcriptoma de ratón (33000 genes), con el fin de analizar los patrones de expresión génica y obtener marcadores génicos en células testiculares expuestas tanto in vitro como in vivo a compuestos disruptores endocrinos. El análisis esta siendo ampliado mediante el uso de geles de electroforesis de 2D, e identificación proteica, en células y gónadas de ratones expuestos a estos reprotóxicos (figuras) Entre nuestros objetivos esta la asociación de estos estudios con el origen de muchos casos de infertilidad masculina. Aplicaciones de tecnología genómica a la identificación de procariotas y eucariotas inferiores Reprotoxicity, gene deregulation, and male infertility Numerous reports indicate a decrease in the quality and quantity of sperm both in humans and wild animals. This is also associate to an increase of testicular cancer rate and gonadal disfunctions. The origin of a high proportion of cases of idiophatic male infertility could be related with these events. Environmental contaminants such as the so called endocrine disrupters are being pointed out as a main cause of such disfunctions. Endocrine disrupters are a wide group of compounds, which acting as endocrine deregulators, could generate gene deregulation depending of the genetic background of the organisms. The reproductive systems have been considered a crucial target of the impact of these compounds. We have been most interested in the assessment of gene deregulation in developing testis in animals and cells exposed to endocrine disrupters. To this aim, different approaches are being carried out including functional genomics and proteomics. In previous studies, we have isolate and cloned more than 200 different cdnas corresponding to genes expressed in gametic cells potentially targets to be deregulated by reprotoxicants including endocrine disrupters. This has been the base to generate a prototype of microarray with oligos from 300 specific genes (GENDIS- RUPT-1). DNA microarrays that include the mouse transcriptome (33000 genes) are also being using to analyse patterns of gene expression in testicular cells exposed both in vitro and in vivo to endocrine disrupters compounds. The analysis are being enhanced by the use of 2D electrophoretic gels and protein identification in cells and gonads from mice exposed to these reprotoxicants (figures). Association of these studies to male infertility are also one of our objectives. Application of genomic technologies to molecular identification of prokaryotes and lower eukaryotes We continue offering methodological support and collaborations to other projects involved in molecular and genetic characterisation of biodegrading organisms and parasitic protozoa. Nuestro grupo continua ofreciendo apoyo metodológico y colaboración a otros proyectos implicados en la caracterización genética de organismos biodegradantes y protozoos parásitos. 35

47 Biología Molecular de la Gametogénesis / Molecular Biology of Gametogenesis Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, BMC ( ) EC, EVK4-CT ( ) McyT, (SAF E) ( ) McyT, (BMC ) (2004) PROFIT, (FIT ) (FIT ) ( ) CE, (QLK4-CT ) ( ) MEC, (BFU /BFI) ( ) Publicaciones/Publications Bonilla, E., and del Mazo, J. (2003). Deregulation of gene expression in fetal oocytes exposed to doxorubicin. Biochem. Pharmacol. 65, López-Casas, P.P., and del Mazo, J. (2003). Regulation of Flotillin-1 participates in the establishment of NIH-3T3 cell-cell interactions. FEBS Lett. 555, López-Casas, P.P., López-Fernández, L.A., Párraga, M., Krimer, D.B., and del Mazo, J. (2003). Developmental regulation of expression of Ran/M1 and Ran/M2 isoforms of Ran-GTPase in mouse testis. Int. J. Dev. Biol. 47, Ortega-Lázaro, J.C., and del Mazo, J. (2003). Gene expression of B56 subunits of protein phosphatase 2A and Mea-1 in mouse spermatogenesis. Characterization of a new B56 subunit (B56γ4) especifically expressed in testis. Cytogenet. Gen. Res. 103, Vanegas, N., García-Sacristán, A., López-Fernández, L.A., Párraga, M., del Mazo J., Hernández P., Schvartzman, J.B., and Krimer, D.B. (2003). Differential expression of Ran GTPase during HMBA-induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Leukemia Res. 27, Articulos de Divulgación/Press articles: Del Mazo, J. Testicular development CREDO Newsletter (Cluster of Research into Endocrine Disruption). Issue 3 (2004). ISSN

48 Biología de la Reproducción Biology of Reproduction PEDRO ESPONDA FERNÁNDEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera/Staff Scientist ARIELLE ARENA (Desde VI a XI, 2004) HUGO DÍAZ MURILLO (Hasta VI-2003) IRIS MANOSALVA (Desde X-2004) B. Predoctorales / Graduate Students ASCENSIÓN GONZÁLEZ DÍAZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Apoptosis, Envejecimiento, Oocito, Tracto reproductivo, Transfección Transfección de células epiteliales del tracto reproductor de mamíferos. Basándose en los resultados obtenidos al realizar transfecciones in vivo del tracto reproductor masculino y femenino del ratón, se aplicaron métodos similares para transfectar in vitro el vaso deferente humano. Para ello se utilizaron tejidos obtenidos de vasostomías o epididimovasostomías. Se observó que un alto porcentaje de las células epiteliales de los vasos tratados aparecían transfectadas. Asimismo, luego de un breve cultivo de estos tejidos, se constató que el transgen utilizado (Proteína Verde Fluorescente. GFP) se expresaba en estas células. Esto ocurría especialmente cuando se utilizaba el lípido Gene-PORTER como vector de los genes. Por otra parte, varios métodos moleculares corroboraron el éxito de la transfección. Estos resultados mostraron la posibilidad de alterar en el futuro las funciones de este órgano, que controla en parte la viabilidad del espermatozoide en los mamíferos. Factores que producen apoptosis en el tracto genital masculino de mamíferos. La mayoría de los estudios realizados sobre la inducción y/o aparición del fenómeno apoptótico en el aparato genital mascu- Key words: Ageing, Apoptosis, Oocyte, Reproductive tract, Transfection Transfection of the epithelial cells from the mammalian reproductive tract. In last years we have developed methods to transfect in vivo the male and female reproductive tract of the mouse. Now we have applied similar procedures in order to transfect in vitro the human vas deferens. The human vas deferens was collected from vasostomies or from epididimovasostomies. Numerous epithelial cells of the treated vasa appeared transfected. The transgen used (Green Fluorescent Protein. GFP) was expressed when the lipid GenePORTER was employed as a gene vector. Furthermore, molecular methods used also showed the success of transfection. These results indicate the possibility to transfect in the future the vas deferens which partially controls the mammalian sperm fertilizing ability. Factors related to apoptosis in the mammalian genital tract Studies devoted to analyze apoptosis in the male genital tract have been mainly done in the testis. Nevertheless, other regions of the male tract as the epididymis, the prostate and seminal vesicles which have important roles for the success of reproduction, have been scarcely studied. For this reason we analyzed the development and causes of the apoptotic phenomenon in the 37

49 Biología de la Reproducción / Biology of Reproduction Las figuras muestran los cambios provocados por la vejez en la región cortical del oocito de ratón. Observaciones realizadas mediante los métodos convencionales para microscopía electrónica de transmisión (Díaz y Esponda (2004)). Figura A. Oocito ovulado por una hembra de 3 meses de edad. Se observan los gránulos corticales (flechas) como estructuras densas y compactas dispuestas ordenadamente muy cerca del plasmalema, el cual presenta numerosas microvellosidades (mv) en su superficie. Figura B. Oocito ovulado por una hembra de 12 meses de edad. Los gránulos corticales (flechas) aparecen desordenados, vacuolizados y fragmentados. Además, se han interiorizado en el citoplasma y no aparecen cerca del plasmalema, el cual no presenta microvellosidades. Figures show the changes induced by ageing in the cortical region of the mouse oocyte. Conventional procedures for electron microscopy (Díaz and Esponda, 2004). Figure A. Oocyte collected from a 3 months old female. The cortical granules (arrows) appear as dense and compact structures which are lineary disposed close to the plasmalema. This membrane show numerous mcrovilli (mv). Figure B. Oocyte from a 12 months old female. Cortical granules (arrows) are vacuolized and fragmented. Furthermore, they are interiorized into the cytoplasm and have lost their proximity with the plasmalema. In the plasmalema no microvilli are recognizable. lino se han desarrollado sobre el testículo. Sin embargo otras regiones del tracto, de no poca importancia fisiológica, como el epidídimo, la próstata o las vesículas seminales, han sido escasamente analizadas. Por este motivo hemos emprendido un análisis para conocer los cambios apoptóticos en estos órganos y muy especialmente en el epidídimo de diversos roedores. Hemos apreciado que existen cuatro grandes factores que inducen apoptosis: la deficiencia en andrógenos, la alta temperatura, el envejecimiento y el fotoperiodo no reproductivo. Diferentes métodos celulares y moleculares mostraron el desarrollo y el aumento de apoptosis causado por estos factores, apreciándose que las regiones más sensibles eran fundamentalmente la cabeza del epidídimo y el lóbulo ventral de la próstata. En el caso de la edad avanzada, así como en la deficiencia de andrógenos, los tejidos se recuperaron rápidamente gracias al empleo de testosterona, apareciendo esta molécula como un verdadero factor de rejuvenecimiento. male genital tract of the mouse with a particular interest in the epididymis. There are four principal factors which appear as inductors of apoptosis: androgen deficience, high temperatures, ageing and shorth photoperiod. Different cellular and molecular methods have shown the development and increase of apoptosis when these factors occurred. In general, the more sensible regions were the caput epididymis and the ventral prostate. When ageing was analyzed we founded that apoptotic tissues were rapidily recovered after testosterone treatment. Then, this molecule appeared as a true recovering factor for these aged reproductive tissues. Effects of ageing on mammalian oocytes Ageing is an important factor in the control of the reproductive mechanism. Ageing induce fertility periods in a species-spe- 38

50 Biología de la Reproducción / Biology of Reproduction Efectos del envejecimiento en el oocito de mamíferos. El factor envejecimiento es extraordinariamente importante en el control del mecanismo reproductivo ya que condiciona los periodos de fertilidad de forma especie-específica. En la hembra de mamíferos el envejecimiento es crucial para el control del periodo fértil y hay una célula sobre la que actúa de forma preferente: el oocito. Muchas investigaciones se han realizado sobre el envejecimiento post-ovulatorio, mientras que el envejecimiento preovulatorio, es decir el generado por la edad de la hembra, ha sido menos analizado. Nosotros hemos estudiado diferentes detalles ocasionados por este proceso en el ratón y constatamos que existen una serie de cambios que evidentemente se relacionan con la baja fertilidad que poseen estos gametos. Se reconocieron numerosas alteraciones ocurridas en los gránulos corticales (estructuras que controlan la poliespermia), así como también en la zona pelúcida. Esta cubierta del oocito, que controla en parte la fecundación y la especie-especificidad de este fenómeno, aparece generalmente alterada en los oocitos ovulados por hembras viejas. Otros cambios, como la aparición de apoptosis y un aumento en las proteinas de stress (HSPs), completan las características anómalas de estos oocitos envejecidos. Transfección de espermatozoides de Moluscos Bivalvos Se han aplicado métodos de transfección a espermatozoides de diversos Moluscos Bivalvos de interés alimentario. Las especies empleadas se colectaron en de Chile y en España. Se observó que un 70% de los espermatozoides se transfectaba al utilizar ADN desnudo, y que la transfección ocurría especialmente en el núcleo y en las grandes mitocondrias que aparecen en la base del flagelo del espermatozoide. Los resultados plantean la posibilidad de utilizar este procedimiento para desarrollar larvas transgénicas. Asimismo, sugieren interesantes posibilidades a fin de conocer mejor los papeles de las mitocondrias paternas durante la embriogénesis temprana. cific way and its action is predominantly observed in the mammalian female. The oocyte is particularly affected by ageing conditions. Numerous studies have been done on aged oocytes and particularly they were devoted to post-ovulatory ageing. Nevertheless, preovulatory ageing (which occurs in the aged ovary) has been poorly analyzed. We have search for different details produced by this type of ageing in the mouse and we founded several changes. The cortical granules which controls the poliespermia during fertilization, appeared clearly damaged in aged oocytes. As well as, the zona pellucida, a oocyte cover which controls the specie-specificity of fertilization, was also affected. Other changes, as the development of apoptosis and the increase of stress (HSPs) proteins, show that ageing produces numerous morfo-physiological changes on the female gamete. Transfection of Bivalbe Mollusks spermatozoa Transfection methods have been applied to the spermatozoa of Bivalbe Mollusks of alimentary interest. Species were collected in Chile and Spain. We observed that the 70% of spermatozoa were transfected when naked DNA was employed. Transfection occurred in the nucleus and in the large mitochondria which are located in the basis of the flagellum of the gamete. Results suggest the possibility to employ these spermatozoa for the generation of transgenic larvae. As well as, they indicate the possibility to analyze the role of mitochondria during early embryogenesis. 39

51 Biología de la Reproducción / Biology of Reproduction Proyectos Financiados/Funding Agencies DGICYT, BCM ( ) DGICYT, BCM ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Thesis Hugo Díaz Murillo. Alteraciones inducidas por la vejez en oocitos de ratón: efectos sobre la fertilidad. Universidad Autónoma de Madrid. Junio, Director: P. Esponda. Publicaciones/Publications Bustos Obregón, E., and Esponda, P (2004). Ageing induces apoptosis and increases HSP70 stress protein in the epididymis of Octodon degus. Int. J. Morphol. 22, Díaz,H., and Esponda, P. (2004). Ageing induce changes in the cortical granules of mouse eggs. Zygote 12, Díaz, H., and Esponda, P. (2004). Postovulatory ageing induces structural changes in the mouse zona pellucida. J. Submicros. Cytol. Pathol. 36, Esponda, P. (2003) Aspectos biológicos de los animales clónicos. Ciencia al Día Internacional 5, 1-9. Esponda, P., Goldstein, M., and Witkin, S.S. (2004). In vitro transfection of the human vas deferens using DNA-Liposome complexes. Fertility & Sterility 81, Jara, M., Carballada, M.R., and Esponda, P (2004). Age induced apoptosis in the male genital tract of the mouse. Reproduction 127, Próximos artículos/forthcoming Articles Guerra, R., Carballada, M.R., and Esponda, P. (2005). Transfection of Bivalve Mollusk spermatozoa using naked DNA. Cell Biol. Int. (en prensa/in press). 40

52 Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados Growth Factors in Vertebrate Development FLORA DE PABLO DÁVILA Jefa de Grupo / Group Leader ENRIQUE J. DE LA ROSA CANO CARLOS VICARIO ABEJÓN (Hasta X-2004) Investigadores de Carrera/Staff Scientists PATRICIA BOYA TREMOLEDA (Desde XI-2004) CATALINA HERNÁNDEZ SÁNCHEZ Investigadoras Contratadas Programa Ramón y Cajal /Ramón y Cajal Contract Scientists ANA VALENCIANO GONZÁLEZ (Hasta VII-2004) B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow JIMENA BALERIOLA GÓMEZ DE PABLOS (Desde I-2004) OSCAR BÁRTULOS ENCINAS (Desde II-2004) TERESA CHAVARRÍA GIMÉNEZ SILVIA CORROCHANO SÁNCHEZ ALICIA MANSILLA APARICIO HÉCTOR MÉNDEZ GÓMEZ (IX a XII, 2004) GAIZKA OTAEGI GARCÍA EVA VERGAÑO VERA Mª JOSÉ YUSTA BOYO (Hasta XI-2003) B. Predoctorales/Graduate Students ISABEL ALVÁREZ GONZÁLEZ (Hasta VIII-2004) ANA MARÍA ROBLES LOBO (Desde IX-2003) Personal Técnico/Technicians Palabras clave: Gen proinsulina, Traducción, Apoptosis, Neurogénesis, Células madre, Desarrollo Keywords: Proinsulin gene, Translation, Neurogenesis, Stem cells, Development Apoptosis, Regulación transcripcional y postranscripcional del gen de la proinsulina y su papel en el embrión temprano Transcriptional and postranscriptional regulation of the proinsulin gene and its role in early embryos La insulina, en su forma precursora de proinsulina, se expresa en etapas muy tempranas del desarrollo, antes de que aparezca el páncreas. Nuestro grupo está caracterizando sus efectos como factor de crecimiento. En el embrión de pollo prepancreá- Insulin, in its precursor form proinsulin, is expressed in very early stages of development, before the differentiation of the pancreas. Our group has focused in characterizing proinsulin/insulin effects as a growth factor. In the prepancreatic 41

53 Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados / Growth Factors in Vertebrate Development tico, durante la neurulación, y en la retina de ratón, la insulina ejerce una función antiapoptótica (ver apartado siguiente). Dada esta función, distinta de su función hormonal clásica, y la falta de respuesta del mrna de la proinsulina prepancreática al estímulo de la glucosa, estudiamos su regulación génica, diferente a la regulación de la expresión pancreática. Los transcritos prepancreáticos presentan al menos 3 secuencias 5 no traducidas alternativas a la del mrna pancreático. Una de estas formas de mrna tiene dos AUGs adicionales que regulan la traducción. Actualmente estamos estudiando el procesamiento alternativo de una forma que retiene un intrón de manera regulada en el desarrollo (Figura). Caracterización de la muerte celular programada durante el desarrollo del sistema nervioso y en modelos neurodegenerativos de retina La muerte celular programada es un proceso clave tanto en el desarrollo como en numerosas patologías. Hemos caracterichick embryo, during neurulation, insulin exerts an antiapoptotic function (see next paragraph). In view of this function as a growth/survival factor in embryogenesis, distinct from its classic hormonal function, we approached the study of proinsulin gene regulation in the early embryo, different from the pancreatic. The prepancreatic transcripts contain al least three different 5 UTR sequences, alternative to the pancreatic insulin mrna.one of these forms contains two aditional AUGs that modulate translation. Presently, we are studying the alternative splicing of a proinsulin mrna that retains an intron in a developmentally regulated manner (Figure). Characterization of programmed cell death during neurogenesis and in retinal degeneration models Programmed cell death is a key process in organisms physiology and pathology. We have characterized the incidence and regulation of apoptosis in early stages of nervous system development in vertebrates, the chicken and the mouse. Apoptosis, a 42

54 Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados / Growth Factors in Vertebrate Development zando la incidencia y regulación de la apoptosis en etapas tempranas del desarrollo del sistema nervioso en vertebrados, pollo y ratón. La apoptosis, proceso natural durante la neurulación y la neurogénesis temprana de la retina, está atenuada por factores de crecimento extracelulares, la proinsulina entre otros, y balanceada por TGF-beta que la aumenta. Estamos abordando las causas que a nivel celular determinan la susceptibilidad al proceso de muerte de ciertas poblaciones de precursores neurales y el papel de caspasas y catepsinas. Al haber resultado que la proinsulina es un potente factor antiapoptótico durante el desarrollo, capaz de activar varias vías paralelas de supervivencia, hemos iniciado el estudio de su posible aplicación terapéutica en patologías neurodegenerativas, en concreto en los ratones rd que sufren una distrofia hereditaria de la retina equivalente a la enfermedad humana de la retinosis pigmentaria. Células madre neurales y su modulación por factores de crecimiento y la fosfatasa PTEN Las células madre neurales tienen capacidad de autorrenovación y mantienen su potencial de diferenciación a múltiples, sino a todos, los fenotipos celulares presentes en el tejido adulto. El potencial uso en terapia celular requerirá un profundo conocimiento de su biología en condiciones de desarrollo normal. Nuestro grupo ha aislado y caracterizado células madre neurales procedentes del bulbo olfatorio de ratón con alta capacidad de proliferación y que se diferencian a los principales tipos celulares presentes en el sistema nervioso, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El ratón knockout para IGF-I tiene disminuída la formación de las tres poblaciones y este factor promueve la diferenciación de células madre en cultivo a neuronas y glía. Actualmente estamos estudiando la activación de la ruta de señalización PI3K/Akt y el papel de la fosfatasa PTEN en estos procesos, siendo aparentemente importantes para una diferenciación neural normal. Cooperación funcional de la citokina LIF y el IGF en el desarrollo Hemos abordado la posible cooperación funcional de IGF-I y LIF (Leukemia Inhibibitory Factor) en ratones doble mutantes nulos. Los animales mueren perinatalmente, lo que no pasa con los mutantes sencillos, poniendo en evidencia un sinergismo natural process during neurulation and early neurogenesis in retina, is attenuated by extracellular growth factors, such as proinsulin, and balanced by TGF-beta that increases it. Presently, we are focused on the physiological causes that determine apoptosis susceptibility at the cell level in some neural precursors and the role of caspases and cathepsins. Since proinsulin turned to be a potent antiapoptotic factor during development, capable of activating several parallel survival pathways, we have started exploring its possible therapeutical application in neurodegenerative diseases, in particular in the rd mice, a model system for retinitis pigmentosa. Neural Stem cells and their modulation by growth factors and the phosphatase PTEN Stem cells have the ability to self-renewal and the potential to differentiate in the multiple cell phenotypes present in an adult tissue. Research on stem cells has a great relevance due to the potential therapeutic applications of these cells. However, their therapeutic use will first require a deep knowledge of stem cell biology during normal development. Our group has isolated and characterized highly proliferative stem cells from the mouse olfactory bulb that differentiate into the three types of neural cells, neurones, astrocytes and oligodendrocytes. The knockout mice for IGF-I has diminished the formation of neurones, astrocytes and oligodendrocytes derived from olfactory bulb stem cells and this factor promotes the differentiation of stem cells in culture to neurons and glia. Now we are studying the activation of thepi3k/akt pathway and the role of the phosphatase PTEN in these processes. Apparently normal levels of PTEN are needed for normal neural differentiation. Functional cooperation of the cytokine LIF and IGF-I in development We have analyzed the possible functional cooperation of IGF-I and LIF in a model of double null mutants. These mice die perinatally, in contrast with the single gene mutants, unraveling a synergism between both factors for the control of vital functions. The histopathological phenotype in the lung and bone was more marked in the double mutants with delayed development also found in the muscle and skin.the transcription factors implicated in the lung are Sp3 and TTF1. The vast majority of 43

55 Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados / Growth Factors in Vertebrate Development entre ambos factores en el control de funciones vitales. La histopatología del pulmón y el hueso de los mutantes nulos para IGF-I se encontró exacerbada en los dobles mutantes, con retrasos del desarrollo también apreciables en el músculo y la piel. Los factores de transcripción implicados en pulmón son TTF-1 y Sp3, ambos disminuídos en el doble mutante. La mayor parte del sistema nervioso central no presentaba defectos evidentes en los mutantes sencillos o dobles, con la excepción del bulbo olfatorio en los mutantes de IGF-I, que mostraba una severa pérdida de células mitrales, moderada de interneuronas y alteración de la glía radial. Asi mismo existía un déficit de motoneuronas en núcleos específicos del tronco del encéfalo en los ratones mutantes dobles y sencillos. central nervous system areas had no phenotype in the single or double mutants, with the exception of the olfactory bulb in the IGF-I mutants, in which a severe loss of mitral cells,a moderate loss of interneurons and disorganization of radial glia was evident. A deficit of motorneurons in specific nuclei of the brainstem was found in double, as well as single mutant mice. Organismos Financiadores/Funding Agencies MEC, PM ( ) FIS, 01/0952 ( ) CAM 08.5/0019.1/2001 ( ) Red de Grupos Carlos III, RGDM G03/212 ( ) MCyT, SAF ( ) MCyT, BMC ( ) MCyT, BMC ( ) La Caixa NEO 3/72-02 ( ) FIV Madrid, S.L. (2004) Asociación Retina Madrid (2004) MEC, BFU ( ) MEC, SAF ( ) Tesis Doctoral/Doctoral Thesis María José Yusta Boyo. Células multipotentes y progenitoras en el Sistema Nervioso Central: señales de supervivencia y diferenciación durante el desarrollo. Universidad Autónoma de Madrid. Septiembre, Directores: C. Vicario Abejón y F. de Pablo. 44

56 Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados / Growth Factors in Vertebrate Development Publicaciones/Publications Camarero, G., Leon, Y., Gorospe, I., De Pablo, F., Alsina, B., Giráldez, F., and Varela-Nieto, I. (2003). Insulin-like growth factor 1 is required for survival of transit-amplifying neuroblasts and differentiation of otic neurons. Develop. Biol. 262, Frago, L.M., Cañón, S., de la Rosa, E.J., León, Y., and Varela-Nieto, I. (2003). Programmed cell death in the developing inner ear is balanced by NGF and IGF-I. J. Cell Sci. 116, Hernández-Sánchez, C., Mansilla, A., de la Rosa, E.J., Pollerberg, E., Martínez-Salas, E., and De Pablo, F. (2003). Upstream AUGs in embryonic proinsulin mrna control its low translation level. EMBO J. 22, Mayordomo, R., Valenciano, A.I., de la Rosa, E.J. and Hallböök, F. (2003). Generation of retinal ganglion cells is modulated by caspase-dependent programmed cell death. Eur. J. Neurosci. 18, Pichel, J.G., Fernández-Moreno, C., Vicario-Abejón, C., Testillano, P.S., Patterson, P.H., and De Pablo, F. (2003). Developmental cooperation of leukemia inhibitory factor and insulin-like growth factor I in mice is tissue-specific and essential for lung maturation involving Sp3 and TTF-1. Mech. Develop. 120, Varela, C., Igartua, I., de la Rosa E.J., and de la Villa, P. (2003). Functional modifications in rod bipolar cells in a mouse model of retinitis pigmentosa. Vision Res. 43, Varela-Nieto, I., de la Rosa, E.J., Valenciano, A.I., and León, Y. (2003). Cell death in the nervous system: Lessons from insulin and insulin-like growth factors. Mol. Neurobiol. 28, Vicario-Abejón, C., Yusta-Boyo, M.J., Fernández-Moreno, C., and De Pablo, F. (2003). Locally-born olfactory bulb stem cells proliferate in response to insulin-related growth factors and require endogenous IGF-I for differentiation into neurons and glia. J. Neurosci. 23, Fernández-Moreno, C., Pichel, J.G., Chesnokova, V., and De Pablo, F. (2004). Increased leptin and white adipose tissue hypoplasia are sexually dimorphic in Lif null/igf-i haploinsufficient mice. FEBS Letters 557, Yusta-Boyo, M.J., González, M.A., Pavón, N., Martín, A.B., De la Fuente, R., García-Castro, J., De Pablo, F., Moratalla, R., Bernad, A., and Vicario-Abejón, C. (2004). Absence of hematopoiesis from transplanted olfactory bulb neural stem cells. Eur. J. Neurosci. 19, De la Fuente, R., Abad, J.L., García-Castro, J., Fernández-Miguel, G., Petriz, J., Rubio, D., Vicario-Abejón, C., Guillén, P., González, M.A., and Bernad, A. (2004). Dedifferentiated adult articular chondrocytes: A population of human multipotent primitive cells. Exp. Cell Res. 297, Héron-Milhavet, L, Xue-jun, Y, Vannucci, S.J., Wood, T.L., Willing, L.B., Stannard, B., Hernández-Sánchez, C., Mobbs, C., Virsolvy, A., and LeRoith, D. (2004). Protection against hypoxic-ischemic injury in transgenic mice overexpressing Kir6.2 channel pore in forebrain. Mol. Cell. Neurosci. 25, Vicario-Abejón, C., and Yusta-Boyo, M.J. (2004). Generation and differentiation of astrocytes during Central Nervous System development and injury. In Brain damage and repair. From molecular research to clinical therapy. T. Herdegen, J.M. Delgado- García, Eds. (Dordrecht: Klüver Academic Publishers), pp

57 Factores de Crecimiento en el Desarrollo de Vertebrados / Growth Factors in Vertebrate Development Vicario-Abejón, C. (2004). Long-term culture of hippocampal neurons. In Current Protocols in Neuroscience. J.N. Crawley, C. Gerfen, R. McKay, M.A. Rogawski, D.R. Sibley, P. Skolnick, S. Wray. Eds. (John Wiley & Sons, New York), pp Vicario-Abejón, C., Fernández-Moreno, C., Pichel, J.G., and De Pablo, F. (2004). Mice lacking leukemia inhibitory factor and insulin-like growth factor-i show motorneuron deficits in brain stem nuclei. Neuroreport 15, Artículos de divulgación/press articles De Pablo, F. (2003). Nosotras también investigamos. La Vanguardia, Febrero (Debate). De Pablo, F. (2003). La espera activa de las biocientíficas. Boletín de la SEBBM, Diciembre, De la Rosa, E.J. (2003). De gusanos y premios Nobel: El proceso de muerte celular programada. El Observador Médico. Febrero. De la Rosa, E.J. (2003). Lo que un gusano puede hacer por nuestra salud. Caleruega 8, 5-6. Miras Portugal, T., y De Pablo, F. (2004). Mujeres Científicas en la SEB/SEBBM. En: Cuarenta años de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular ( ). Emilio Muñoz (Coord.), Madrid. De Pablo, F. (2004). En la ciencia todavía no existe el tanto monta-monta tanto. Torre de los Lujanes, 53,

58 Departamento de Biología de Plantas Department of Plant Biology Jefe de Departamento Department Head DIONISIO LÓPEZ ABELLA (Hasta V-2003) JOSÉ RAMÓN DÍAZ-RUÍZ ALBA (Desde V-2003) Profesores de Investigación PEDRO CASTAÑERA DOMÍNGUEZ JOSÉ RAMÓN DÍAZ-RUÍZ ALBA DIONISIO LÓPEZ ABELLA Mª CARMEN RISUEÑO ALMEIDA Investigadores Científicos FCO. JAVIER MEDINA DÍAZ SUSANA MORENO DÍAZ DE LA ESPINA FÉLIX ORTEGO ALONSO Científicos Titulares ISABEL GARCÍA LUQUE PEDRO HERNÁNDEZ CRESPO JUAN JOSÉ LÓPEZ-MOYA GÓMEZ CÉSAR LLAVE CORREAS PILAR SÁNCHEZ TESTILLANO Mª TERESA SERRA YOLDI FRANCISCO TENLLADO PERALO Personal Técnico CARLOS ALMARZA SANZ MERCEDES CARNOTA ROMERO SONIA CASTILLO LLUVA MONSERRAT LLORENTE DE MINGO Mª LUISA RUIZ SERRA Secretaria Mª VICTORIA LAFITA TOGORES

59 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organisation and Function SUSANA MORENO DÍAZ DE LA ESPINA Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist OLGA ECHEVERRÍA MARTÍNEZ (Desde IX-2003/Hasta II-2004) GERARDO VÁZQUEZ NIN (Desde IX-2003/Hasta II-2004) Investigadores en Sabático/ Sabatical Scientists ELSA ALVERCA (Hasta XI-2004) ADRIANA CERNA (Hasta X-2004) JOSÉ RAMÓN CRUZ GARCÍA (Desde X-2004) RAFAEL SAMANIEGO GARCÍA (Hasta V-2004) B. Predoctorales / Graduate Students TAMARA MONDÉJAR TÉVAR (Desde X-2004) Estudiante / Student MERCEDES CARNOTA ROMERO Personal Técnico / Technician Palabras clave: Matriz nuclear, Proteínas, Plantas, Dinoflagelados, Organización cromosómica, Núcleoesqueleto, Transcripción y splicing Proteínas del Núcleoesqueleto de Plantas La línea de investigación principal del laboratorio es el análisis del núcleoesqueleto de plantas, centrado en la caracterización de su proteoma y el ensamblaje de sus estructuras básicas y los complejos nucleares asociados. Está constituído por una red anastomosada de filamentos de estructura periódica, que forman el núcleoesqueleto básico, y agregados multiproteicos de tamaño variable correspondientes a los complejos multiméricos asociados. Hemos caracterizado el homólogo en plantas de NuMA, una proteína estructural de tipo coiled coil del nucleoesqueleto y citoesqueleto de vertebrados, que sirve de puente entre los complejos de splicing y el núcleoesqueleto, y contribuye a la estabi- Keywords: Nuclear matrix, Proteins, Plants, Dinoflagellates, Chromosome organization, Nucleoskeleton, Transcription and splicing Protein components of the plant nucleoskeleton The main research interest of the laboratory is the analysis of the plant nucleoskeleton mainly focussed in the characterization of its proteome and the assembly of its basic structures and the associated complexes. The plant nuclear matrix (NM) consists of a branched network of filaments with periodic structure, which forms the basic nucleoskeleton and multiprotein aggregates of variable sizes corresponding to the attached multimeric complexes. We have characterized in plants the homolog of NuMA, a structural coiled coil protein of both the nucleoskeleton and cytoskeleton in vertebrates, which anchors the splicing com- 48

60 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear / Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organisation and Function Figura 1.- Distribución subcelular de los dos homólogos de AcMFP1 en células meristemáticas de raíz y cloroplastos de hoja madura detectados con los sueros 91 (producido contra el fragmento coiled coil de AtMFP1) y 288 (contra el dominio central del coiled coil de LsMFP1). El suero 91 detecta específicamente la proteína de 78 KDa con una distribución nuclear reticulada y en los cloroplastos. El suero 288 reconoce ambas proteínas en el núcleo, con una intensidad muy alta en cuerpos nucleares específicos. En las matrices nucleares, que contienen exclusivamente la proteína de 90 KDa, se observa específicamente su distribución y acumulación en cuerpos nucleares. Figure 1.- Sub-cellular distribution of the two AcMFP1 homologs in meristematic root cells and chloroplast from mature leaves detected by sera 91 (against the whole coiled coil fragment of AtMFP1) and 288 (against the central part of the coiled coil domain of LsMFP1). Serum 91 detects specifically the 78KDa protein with a reticulated nuclear distribution and also in chloroplasts. 288 serum recognizes both proteins in nuclei with a high concentration in specific nuclear bodies. In nuclear matrices containing only the 90KDa protein, its specific distribution and accumulation in nuclear bodies is clearly observed. lización del huso mitótico a través de sus interacciones con el complejo multiproteico dineína/dinactina. AcNuMA presenta tres isoformas de 210, 220 y 230 kd con diferente solubilidad, localizadas en los filamentos del núcleoesqueleto interfásico y en la matriz del huso mitótico. Aunque el gen NuMA no está secuenciado en Allium, un ortólogo de NuMA, y la proteína asociada a NuMA GAS41 se han encontrado en Arabidopsis, demostrando la conservación evolutiva de los principales componentes del nucleoesqueleto y citoesqueleto Recientemente se han caracterizado en el laboratorio los homólogos de AcMFP1, una proteína de tipo coiled coil con capacidad de asociación a DNA, conservada en plantas. Existen dos homólogos en células proliferantes que difieren en su movilidad electroforética, pi, solubilidad y distribución nuclear. AcMFP1-78 KDa es una proteína constitutiva, con un pi experimental ligeramente ácido (5,5) con una distribución nuclear plexes to the nucleoskeleton and also contributes to the mitotic spindle stabilization, through interaction with the multiprotein dynein/dynactin complex. AcNuMA has three isoforms of 210, 220 and 230 kd with different solubilities, that localize in the filaments of the nucleoskeleton in interphase, and in the matrix of the mitotic spindle. NuMA gene is not yet sequenced in onion, but a NuMA ortholog and a NuMA-associated protein GAS-41 are conserved in Arabidopsis, demonstrating the evolutive conservation of the main nucleoskeletal and cytoskeletal components. Recently we have characterized the homologues of MFP1, another coiled coil protein of the nuclear matrix with DNAbinding activity, conserved in plants. There are two AcMFP1 homologs in root proliferating cells, differing in electrophoretic mobility, pi, solubility and cell distribution. AcMFP1 is a constitutive protein with a slightly acid pi (5.5) whose nuclear distribution depends on cell type and tissue. It localizes to both 49

61 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear / Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organisation and Function Figure 2.- (1) Alexandrium fundyense. The nucleus is observed in vivo without contrast between the numerous cytoplasmic organelles, the interphasic chromosomes stand out due to their contrast. (2) DAPI staining of the interphasic chromosomes filling the nuclear volume. (3):Distribution of snrnps detected by the anti Sm (Y12) serum. Co-transcriptional splicing occurs at the chromosomal peripheries and maturation of snrnps in brilliant Cajal s bodies following the eukaryotic pattern. Figura 2.- (1) Alexandrium fundyense. In vivo el núcleo aparece sin contrastar entre los numerosos orgánulos citoplásmicos, distinguiéndose por su diferente contraste los cromosomas interfásicos. (2) Visualización mediante DAPI de los cromosomas interfásicos que ocupan prácticamente todo el volumen nuclear a excepción del nucleolo, (3): Localización de las snrnps con un anticuerpo anti-sm (Y12). El splicing co-transcripcional se produce en la periferia cromosómica y la maduración de los snrnps en numerosos cuerpos de Cajal brillantes, siguiendo el modelo eucariota. dependiente del tipo celular y tejido. Presenta una doble localización nuclear y cloroplástica, con un patrón de distribución similar al de MFP1 en Arabidopsis y tabaco. El análisis de microscopía electrónica ha demostrado su presencia en la periferia de las masas de heterocromatina asociada al DNA descondensado. AcMFP1-90 kda es la mayoritaria y está asociada a matriz nuclear. Tiene un pi muy básico (8,2-9,7) y 13 estados diferentes de fosforilación con diferentes solubilidades. Su asociación a la matriz nuclear está regulada por caseína kinasa II. AcMFP1-90 kd es una proteína constitutiva. Se expresa preferencialmente en células proliferantes, disminuyendo su presencia a medida que las células abandonan el meristemo y entran en las zonas de elongación y diferenciación de la raíz, de acuerdo con los datos de citometría de flujo biparamétrica y westernblot. AcMFP1-90 KDa se acumula en cuerpos nucleares mas abundantes durante proliferación celular y en presencia de luz, y también se asocia a los filamentos del nucleoesqueleto (Fig. 1). Las distintas características y patrones de distribución y expresión de ambas proteínas sugieren funciones diferentes. AcMFP1-78 KDa podría ejercer un papel en la organización de los genomas nucleus and chloroplast in a similar way to Arabidopsis and tobacco MFP1. Electron microscopy demonstrates its localization at the periphery of heterochromatin masses associated to de-condensed DNA fibres. 90 kd-mfp1 is the most abundant. It is bound to the matrix, has a basic pi (8,2-9,7) and 13 different phosphorylation states, with different solubilities. Its association to nuclear matrix is regulated by casein kinase II. 90 kd-mfp1 is a constitutive protein, preferentially expressed in cycling cells, but its levels go down when cells start elongation and differentiation. It accumulates in nuclear bodies, more abundant during proliferation and under illumination. It associates also to the nucleoskeletal filaments (Fig.1). Their characteristics, distribution and expression patterns suggest different functions for both proteins. AcMFP1-78 could be involved in the organization of nuclear and chloroplastic genomes, while AcMFP1-90 Kda would have a structural role in the nuclear matrix. 50

62 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear / Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organisation and Function del cloroplasto y el núcleo, mientras que AcMFP1-90 KDa tendría una función estructural en la matriz nuclear. Organización y expresión del genoma en Dinoflagelados Los Dinoflagelados son algas unicelulares carentes de histonas y nucleosomas que presentan una organización única del genoma y cromosomas, siendo considerados los únicos knockouts vivos de histonas. Su estructura celular básica, bioquímica y filogenia molecular son eucariotas. Tienen ciclos celulares con períodos G1-S-G2, secuencias repetitivas, genes ribosómicos en tandem, matriz nuclear, snrnas y citoplasma eucariótico. Su genoma es distinto a todos los niveles. Son haploides con grandes cantidades de DNA (hasta 400 pg/n), alto contenido en G+C y bases metiladas y raras (HOMeU y Me-C ) repartidas de forma no aleatoria por el genoma. Sus genes no tienen TATA boxes y sus cromosomas interfásicos están estabilizados por cationes metálicos e híbridos DNA/RNA. Sin histonas y con una relación proteína:dna 1:10 inferior a la de procariotas, han desarrollado un mecanismo diferente para regular y empaquetar su DNA en una cromatina funcional, basado en cromosomas interfásicos atípicos cuyo DNA se organiza como un cristal líquido. Poseen una baja proporción de proteínas básicas (HLP) sin homología con las histonas eucariotas, que se asocian al DNA transcripcionalmente activo. Aunque se han postulado varios modelos de organización para estos cromosomas, el conocimiento sobre su estructura y bioquímica no ha avanzado sustancialmente. Nuestros resultados han confirmado que el DNA de Dinoflagelados posee una organización en dominios discretos asociados a la matriz nuclear y que la organización de la transcripción y splicing es de tipo eucariota y ocurre en los dominios pericromosómicos, con maduración de los snrnas en los cuerpos de Cajal (Fig. 2). Esto sugiere que a pesar de las diferencias de organización supramolecular, los dinocromosomas podrían tener una organización funcional interfásica semejante a la de eucariotas, con dominios de heterocromatina estructural actuando como organizadores de los lazos eucromáticos Nuestro interés se centra actualmente en la estructura supramolecular del dinocromosoma. Estamos analizando sus mecanismos de estabilización como la existencia y naturaleza de híbridos DNA/RNA y la presencia de telómeros. Nuestros resultados han confirmado la naturaleza lineal de su DNA y la con- Organization and expression of the Dinoflagellate Genome. Dinoflagellates are microalgae that lack histones and nucleosomes and present a unique genome and chromosome organisation, been considered the only living knockouts of histones. Basic cell structure, biochemistry and molecular phylogeny place them firmly within the eukaryotes. They have G1-S-G2-M cell cycles, repetitive sequences, ribosomal genes in tandem, nuclear matrix, snrnas and eukaryotic cytoplasm. Their nuclear DNA is different from base composition to chromosome organization. They have a high G+C content, highly methylated and rare bases (HOMeU and Me-C), no TATA boxes, and form distinct interphasic dinochromosomes with a liquid crystalline organization of DNA, stabilized by metal cations and DNA/RNA hybrids. Without histones and with a protein: DNA mass ratio (1:10) lower than prokaryotes, they need a different way of packing their huge amounts of DNA into a functional chromatin. They have a low proportion of basic proteins (HLP) without homology with histones associated to the transcriptionaly active DNA. Although several models of dinochromosome organization have been postulated the knowledge about their structural organization, and biochemistry are rudimentary. Our results confirmed that the dinoflagellate DNA is organized in discrete domains associated to the nuclear matrix and also that the topological organization of transcription and splicing in them is eukaryote and occurs in the perichromosomal domains with snrna maturation taking place in Cajal s bodies (Fig. 2). These results suggest that in spite of the differences in supramolecular organization of dinochromomes their functional organization during interphase would be eukaryote with structural heterochromatin domains organizing the euchromatic DNA loops. Our current interest focuss in the supramolecular organization of dinochromosomes. We are analyzing the nature and distribution of the DNA/RNA hybrids and the presence and characterization of telomeres in them. The preliminary results confirm the lineal nature of the Dinoflagellate DNA, the conservation of the consensus sequence TTAGGG of Arabidopsis thaliana in telomeres at chromosome ends and other eukaryotic differentiations in dinochromosomes. The recent discovery of a eukaryotic structural and functional differentiation in the dinochromosomes and of their organization of gene expression, demonstrate that in spite of the secondary loss of histones, that produces a 51

63 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear / Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organisation and Function servación de la secuencia consenso TTAGGG de Arabidopsis thaliana y la presencia de telómeros y otras diferenciaciones del cromosoma eucariótico en los dinocromosomas. El descubrimiento de diferenciaciones estructurales y funcionales en el núcleo y cromosomas de dinoflagelados y la organización topológica de la expresión del genoma en ellos demuestran que a pesar de la pérdida de histonas que llevó a a la carencia de organización nucleosómica y supranucleosómica en su DNA, conservan una organización funcional del núcleo mas típica de eucariotas que de procariotas. lack of nucleosomal and supranucleosomal chromatin organization, they keep a functional nuclear organization closer to eukaryotes than to prokaryotes. Organismos Financiadores/Funding Agencies MAPA, SC C3-3 ( ) DGI-MICYT, BMC ( ) PN I+D+I, (BMC ) ( ) GRICES/CSIC, 2004PT0001 (2004) PIE CSIC, E007 ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Rafael Samaniego García. Análisis de los homólogos nucleares de MFP1 en A. cepa: caracterización, presencia en distintos tipos celulares y posible funcionalidad. Universidad Complutense de Madrid. Septiembre, Directora: S. Moreno Díaz de la Espina. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Cui, P., and Moreno Díaz de la Espina, S. (2003). Sm and U2B proteins redistribute to different nuclear domains in dormant and proliferating onion cells. Planta 217, Del Campo, A., Samaniego, R., Giménez Abián, J.F., Giménez-Martín, G., López-Sáez, J.F., Moreno Díaz de la Espina, S., and De la Torre, C. (2003). G2 checkpoint targets late replicating DNA. Biol. Cell 95, Moreno Díaz de la Espina, S., Samaniego, R., Yu, W., and De la Torre, C. (2003). Intermediate filament proteins with nuclear function: NuMA, lamin-like proteins and MFP1. Cell Biol. Int. 27, Cerna, A., Cuadrado, A., Moreno Díaz de la Espina, S., and De la Torre, C. ( 2004). Z-DNA a new in situ marker for transcription. Eur. J. Histochem. 48,

64 Matriz Nuclear y Regulación de la Organización y Funcionalidad Nuclear / Nuclear Matrix and Regulation of the Nuclear Organisation and Function Cuadrado, A., Acevedo, R., Moreno Díaz de la Espina, S., Jouve, N., and De la Torre, C. (2004). Genome remodelling in three modern S. officinarum x S. spontaneum sugarcane cultivars. J. Exp. Bot. 55, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Moreno Díaz de la Espina, S, Alverca, E., Cuadrado, A., and Franca, S. (2005). Organization of the genome and gene expression in a nuclear environment lacking histones and nucleosomes: The amazing Dinoflagellates. A review. Eur. J. Cell Biol. 84, Alverca, E., Jouve, N., Franca, S., Moreno Díaz de la Espina, S., and Cuadrado, A. (2005). Telomeric DNA localization on dinoflagellate chromosomes: Structural and evolutionary implications. Biol. Cel (en prensa/in press). 53

65 Nucleolo de Células Vegetales Plant Cell Nucleolus FRANCISCO JAVIER MEDINA DÍAZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist DAVID LÓPEZ GONZÁLEZ (Hasta XI-2003) Investigador Contratado / Contract Scientist FERNANDO GONZÁLEZ CAMACHO (Hasta VII-2004) ISABEL MATÍA JURADO VICTORIA RODRÍGUEZ VILARIÑO MARGARITA A. SOBOL (X-XII, 2003) Becarios Predoctorales / Graduate Students ANTONIO MANRIQUE CAMPAÑA (Desde IX-2004) Estudiante / Student MERCEDES CARNOTA ROMERO Personal Técnico / Technician Figura 1.- Los astronautas Michael Foale (izq.) y Pedro Duque (dcha.) en la Estación Espacial Internacional, durante la Misión Cervantes, cuyo logo se muestra en el ángulo superior derecho. Pedro Duque sostiene biocontenedores de los experimentos españoles. Uno de estos biocontenedores, de nuestro experimento Root, aparece en el recuadro a, junto con un berlingot (doble bolsa de plástico sellada) conteniendo las semillas de Arabidopsis. ESA. Figure 1.- Astronauts Michael Foale (left) and Pedro Duque (right) in the International Space station, during the Cervantes Mission, whose logo is shown in the upper right corner. Pedro Duque holds biocontainers of the Spanish experiments. One of these biocontainers, from our Root experiment, is shown in the inset a, besides a berlingot (sealed double-wall plastic bag) containing Arabidopsis seeds. ESA. 54

66 Nucleolo de Células Vegetales / Plant Cell Nucleolus Palabras clave: Nucleolo, Proteínas nucleolares, Ciclo celular, Biología espacial, Microgravedad Efectos de la microgravedad sobre la biogénesis de los ribosomas y el ciclo celular en células proliferantes de plantas La biogénesis de los ribosomas y el ciclo celular son dos procesos celulares mutuamente interrelacionados. Su estudio en células vegetales, tanto en condiciones fisiológicas como alteradas por la acción de diversos factores, permite adquirir conocimientos sobre la funcionalidad celular imprescindibles para abordar todo tipo de problemas relacionados con la interacción de las plantas con el ser humano. La alteración de las condiciones gravitatorias es una de las más interesantes para estudiar las modificaciones de estos procesos celulares. Se trataría de conocer si la ausencia de la gravedad, un factor físico básico y permanente en nuestro planeta, constante en la evolución biológica, daría lugar a cambios celulares que pudieran ser la causa de alteraciones en el desarrollo de los organismos. El estudio de las consecuencias de estas alteraciones es necesario para conseguir la supervivencia de organismos terrestres en condiciones distintas de las de la Tierra, uno de los grandes objetivos movilizadores de las iniciativas de exploración espacial actualmente en curso, como la Estación Espacial Internacional (ISS) o los proyectos de exploración de Marte. Nuestro interés científico concreto es el nucleolo, una estructura celular identificada por su asociación con la expresión de un conjunto específico de genes, los genes ribosómicos o genes de los rrnas. La organización del nucleolo es muy dependiente del estado fisiológico de la célula, de la actividad proliferativa y de los períodos del ciclo celular. Los agentes moleculares de esta interdependencia son proteínas nucleolares fosforiladas que intervienen en la regulación de diferentes pasos de la síntesis y el procesamiento de los precursores de los rrnas y a la vez son diana de quinasas de proteínas reguladoras de la proliferación celular (Medina y González-Camacho, 2003; Volkov et al., 2004). Hemos estudiado las proteínas nucleolares NopA100 y NopA64, mayoritarias en la fracción ribonucleoproteica soluble de los núcleos de células en proliferación, y también presentes en la matriz nuclear. Su localización in situ mostró una distribución nucleolar preferente en los componentes fibrilares, donde Keywords: Nucleolus, Nucleolar proteins, Cell cycle, Space biology, Microgravity. Effects of microgravity on ribosome biogenesis and cell cycle in proliferating plant cells Ribosome biogenesis and the cell cycle are two fundamental cellular processes related one another. Their study in plant cells, in physiological conditions as well as in modified conditions, under the action of different factors, enhances the knowledge on cellular functionality which is necessary for approaching a great variety of problems related to the interaction of plants with human beings. The alteration of gravitational conditions is one of the most interesting for studying the modifications of these cellular processes. The problem would be to know if the absence of gravity, a basic and permanent physical factor in our planet, constant through biological evolution, would produce cellular changes that could be the cause of developmental alterations in the organisms. It is necessary to know the consequences of these alterations to get the survival of terrestrial organisms in conditions different from those of the Earth, which is one of the main objectives mobilizing the current space exploration initiatives, such as the International Space Station (ISS) or the projects for exploring Mars. Our scientific interest, in particular, is the nucleolus, a cell structure identified by its association with the expression of a specific set of genes, namely the ribosomal genes, or rrna genes. The organization of the nucleolus is highly dependent on the physiological state of the cell, on the proliferating activity, and on the cell cycle periods. The molecular agents of this interdependence are phosphorylated nucleolar proteins, which take a part in the regulation of different steps in the synthesis and processing of rrna precursors and, at the same time, are targets of protein kinases, regulators of cell proliferation (Medina and González-Camacho, 2003; Volkov et al., 2004). We have studied the nucleolar proteins NopA100 and NopA64, two major proteins of the ribonucleoprotein soluble fraction extracted from nuclei of proliferating cells, although they are also present in the nuclear matrix. Their in situ localization showed a preferential nucleolar location in the fibrillar components, where the early pre-rrna processing takes place. NopA100 undergoes a physiological process of proteolytic mat- 55

67 Nucleolo de Células Vegetales / Plant Cell Nucleolus Figura 2.- A: Plántulas de Arabidopsis crecidas durante cuatro días a 22ºC en la ISS (Flight) o en condiciones control en Tierra (Ground). Se observa una notable diferencia de longitud. B: Corte semifino a microscopía óptica (B1) y corte ultrafino a microscopía electrónica (B2) de la zona meristemática de la raíz de Arabidopsis. Las dos regiones laterales, cortex y estela (stele) se aprecian con claridad, diferenciándose en la forma y tamaño de sus células. El tamaño y la estructura del nucleolo son también claramente distintos en las dos regiones. Figure 2.- A: Arabidopsis seedlings grown for four days at 22ºC in the ISS (Flight) or in control conditions, on Earth (Ground). A marked difference in length is observed. B: Semithin section, at light microscopy (B1) and ultrathin section at electron microscopy (B2) of the meristematic zone of the Arabidopsis root. The two lateral regions, cortex and stele, are clearly appreciated, showing differences in the shape and size of their cells. The size and the structure of the nucleolus are clearly distinct in the two regions. ocurre el procesamiento temprano del pre-rrna. La NopA100 sufre un proceso fisiológico de maduración proteolítica asociado al incremento de la funcionalidad nucleolar y, consiguientemente, a la propia actividad de la proteína. Esta actividad es máxima en la fase G2 del ciclo celular, la de mayor actividad transcripcional de los genes ribosómicos. En general, se observó una correlación entre el incremento de la actividad del nucleolo, el progreso del ciclo celular, el nivel y la actividad de la NopA100, la maduración de la proteína y su nivel de fosforilación (González-Camacho y Medina, 2004a). La NopA100 es una proteína homóloga a la nucleolina de mamíferos y la NopA64 es un fragmento estable de la NopA100. El análisis detallado de las secuencias de aminoácidos de estas y otras proteínas semejantes a nucleolina en otros organismos confirma la alta conservación evolutiva de la nucleolina, como consecuencia del papel funcional muy relevante de esta proteína en la regulauration, associated to the increase of nucleolar functioning and, consequently, to the activity of the protein itself. This activity is the upmost in the G2 phase of the cell cycle, when ribosomal genes reach their highest transcriptional rate. In general, a correlation was observed between the increase of nucleolar activity, the cell cycle progress, the level and activity of NopA100, the maturation of this protein and its phosphorylation level (González-Camacho and Medina, 2004a). NopA100 is a protein homologous to mammalian nucleolin and NopA64 is a stable fragment of NopA100. The detailed analysis of aminoacid sequences in these and other nucleolin-like proteins in other organisms, confirms the high phylogenetic conservation of nucleolin, as a consequence of the relevant functional role played by this protein in the cell cycle and ribosome biogenesis regulation and in the co-ordination of the two processes (González-Camacho and Medina, 2004b). 56

68 Nucleolo de Células Vegetales / Plant Cell Nucleolus ción del ciclo celular y de la biogénesis de los ribosomas y en la coordinación de ambos procesos (González-Camacho y Medina, 2004b). A partir de estos datos, hemos investigado a microscopía electrónica la localización del DNA nucleolar y de las proteínas nucleolares NopA100, NopA64 y fibrilarina en células meristemáticas crecidas bajo clinorrotación, un procedimiento de microgravedad simulada, basado en la continua modificación de la orientación gravitatoria de la muestra que crece en el clinostato. La alteración de la gravedad produjo la redistribución del rdna y de las tres proteínas nucleolares en las muestras clinorrotadas respecto a los controles. Esta redistribución hacia los centros fibrilares en detrimento del componente fibrilar denso, acompañada de un descenso en los niveles de las proteínas en las muestras crecidas en microgravedad, sugiere que la clinorrotación induce la disminución de la actividad del nucleolo en la síntesis y el procesamiento de los precursores ribosómicos (Sobol et al., 2005). Con todo este bagaje, hemos tenido la oportunidad de realizar un experimento en condiciones de microgravedad real mediante nuestra participación en la Misión Cervantes, realizada en octubre de 2.003, en la que el astronauta español de la Agencia Espacial Europea (ESA) Pedro Duque voló a la ISS a bordo de una nave rusa Soyuz y realizó experimentos científicos durante 10 días. Uno de estos experimentos, denominado Root, que incluía la germinación de semillas de Arabidopsis en el espacio, y la fijación de las plántulas para el análisis posterior de las células meristemáticas de la raíz, fue diseñado y preparado en nuestro laboratorio. Las semillas fueron enviadas al espacio en biocontenedores experimentales, montadas sobre papel de filtro y encerradas en bolsas de plástico selladas de doble pared, denominadas berlingots, junto con ampollas de vidrio conteniendo medio de cultivo o solución de paraformaldehído (PFA). La germinación fue activada por la liberación del medio de cultivo al berlingot y la fijación por la liberación del PFA cuatro días más tarde. Todas las operaciones se realizaron mediante un sistema motorizado, sin necesidad de abrir, ni el biocontenedor ni los berlingots, condición exigida por las condiciones de seguridad a bordo de la ISS (Figura 1). Los resultados obtenidos hasta el momento del experimento Root han permitido demostrar que el cultivo en microgravedad produce alteraciones en la proliferación de las células meristemáticas de la raíz de Arabidopsis. Incluso macroscópicamente From these data, we have investigated by electron microscopy the localization of nucleolar DNA and the nucleolar proteins NopA100, NopA64 and fibrillarin in meristematic cells grown under clinorotation, a procedure of simulated microgravity based on the continuous modification of the gravitational orientation of the sample growing in the clinostat. Alteration of gravity produced redistribution of DNA and of the three nucleolar proteins in the clinorotated samples with regards to the controls. This redistribution towards fibrillar centers in detriment of the dense fibrillar component, accompanied by a drop in the levels of proteins in the samples grown in microgravity, suggests that clinorotation induces the decrease in nucleolar activities of preribosomal precursor synthesis and processing (Sobol et al., 2005). With all this background, we have had the opportunity of performing an experiment in conditions of real microgravity, by participating in the Cervantes Mission, carried out in October 2003, in which the Spanish astronaut of the European Space Agency (ESA) Pedro Duque flew to the ISS on board of a Russian Soyuz spacecraft and performed scientific experiments for ten days. One of these experiments, named Root, which involved seed germination in space and seedling fixation for further analysis of the root meristematic cells, was designed and prepared in our laboratory. Seeds were sent to space within experiment biocontainers, mounted on filter paper and enclosed in double-wall sealed plastic bags called berlingots, together with glass ampules containing either culture medium or paraformaldehyde (PFA) fixative solution. Seed germination was activated by the release of culture medium inside the berlingot and fixation was induced by release of PFA, four days later. All operations were carried out using a motorized system, avoiding the opening of either the biocontainer or the berlingots. This condition was imposed by the safety regulations on board of the ISS (Figure 1). The results obtained up till now from the Root experiment have demonstrated that the culture in microgravity produces alterations in the proliferation of Arabidopsis root meristematic cells. Even at the macroscopical level it can be observed that roots grown in microgravity are longer than control roots, but at the microscopical level we have observed that the consequences of this higher length are different in the two lateral regions of the root meristem, namely cortex and stele (Figure 2). Stele cells grow in length in the longer roots of space samples, but cortical 57

69 Nucleolo de Células Vegetales / Plant Cell Nucleolus se observa que las raíces crecidas en microgravedad son más largas que las de muestras control, pero a nivel microscópico hemos observado que las consecuencias de esta mayor longitud son distintas en las dos regiones del meristemo de la raíz, córtex y estela (Figura 2). Las células de la estela crecen en longitud en las raíces más largas de las muestras espaciales, pero las células corticales incrementan fuertemente su tasa de proliferación, de modo que la mayor longitud de la raíz se obtiene a base de muchas más células, individualmente más cortas. El análisis del nucleolo indica una menor actividad en la biogénesis de ribosomas en las células de la muestra experimental respecto a la muestra control. La hipótesis que puede explicar este comportamiento es un ciclo celular acelerado y desequilibrado, que probablemente es la razón de desajustes en el desarrollo posterior de la planta. Además, en una exploración preliminar, mediante un abordaje proteómico, hemos observado cambios en la expresión génica inducidos por la gravedad alterada en células proliferantes (Matía et al., 2005). Esta línea de trabajo se desarrolla en colaboración con el Prof. Roberto Marco, del Departamento de Bioquímica de la UAM, e incluye también nuestra participación en experimentos sobre la alteración del desarrollo embrionario y del envejecimiento de Drosophila en condiciones de microgravedad, algunos de los cuales formaron parte también de la Misión Cervantes (Marco et al., 2003; Husson et al., 2005). Asimismo, estamos implicados en la mejora de las condiciones de fijación y preservación de las muestras biológicas en experimentos espaciales (Lería et al., 2004), coordinando un proyecto conjunto de la Agencia Espacial Europea. Otras Líneas de Trabajo desarrolladas En el período de tiempo recogido en la presente Memoria, nuestro grupo de investigación ha participado en otros dos proyectos. El primero de ellos, realizado en colaboración con el Dr. José Luis Díez, de este mismo Centro, ha consistido en el análisis del nucleolo en células politenizadas de las glándulas salivares de larvas del díptero Chironomus. Los resultados de este proyecto han comprendido la definición de la organización del rdna y de la transcripción nucleolar, la identificación de dominios nucleolares asociados a las distintas etapas de la biogénesis de los ribosomas, la caracterización de estructuras de origen nucleolar coinsiguientes a la inhibición de la transcripción y la cells conspicuously increase their proliferating rate, in such a way that the longer root is the result of much more cells, individually shorter. The analysis of the nucleolus indicates a lower ribosome synthesizing activity in the cells of the space sample than in the control sample. A hypothesis for interpreting this behavior is that the cell cycle is accelerated and unbiased in microgravity, which may be the reason for perturbations described in more advanced developmental stages of the plant. Furthermore, in a preliminary exploration, using a proteomic approach, we have observed changes in gene expression induced by altered gravity in proliferating cells (Matía et al., 2005). This research line is developed in co-operation with Prof. Roberto Marco, from the Departamento de Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, and also includes our participation in experiments on alterations of the embryo development and the ageing process in Drosophila in conditions of microgravity, some of which were carried out in the Cervantes Mission (Marco et al., 2003; Husson et al., 2005). In addition, we are involved in the improvement of fixation and preservation of biological samples in space experiments (Lería et al., 2004), by means of the co-ordination of a joint project supported by the European Space Agency. Other Research Lines developed In the period of time covered by the present Memory, our research group has participated in two additional projects. The first of them, performed in co-operation with Dr. José Luis Díez, from this Center, has consisted of the analysis of the nucleolus in polytene cells of salivary glands from larvae of the Dipteran Chironomus. The results of this project comprise the definition of the organization of rdna and the nucleolar transcription, the identification of nucleolar domains associated with the different steps in ribosome biogenesis, the characterization of structures of nucleolar origin consequent to transcription inhibition, and the evidence of nucleolar functions not related to ribosomal genes, such as telomere replication, at least in a part of the whole process. The objective of the second project, supported by the Spanish pharmaceutical company Pharmamar S.A. was the characterization of cell types in the tunicate Ecteinascidia turbinata, and the identification of cells containing potentially symbiotic 58

70 Nucleolo de Células Vegetales / Plant Cell Nucleolus evidencia de funciones nucleolares no relacionadas con los genes ribosómicos, tales como la replicación de los telómeros, al menos en alguna de las etapas del proceso. El objetivo del segundo proyecto, financiado por la empresa farmacéutica Pharmamar S.A., fue la caracterización de tipos celulares en el tunicado Ecteinascidia turbinata y la identificación de células conteniendo microorganismos potencialmente simbiontes, todo ello en relación con los mecanismos de producción natural de las sustancias antitumorales en las que está implicada la actividad de esta empresa. microorganisms, all of this in relation to the mechanisms of natural production of antitumoral substances in which the activity of this company is involved. Organismos Financiadores/Funding Agencies PNPGC, BMC ( ) ESA, AO-LS-99-LSS-011-TT ( ) PNIS, ESP PE, ESP E, ESP E, ESP C02-02 ( ) Contrato CSIC-Empresa Pharma-Mar S.A. ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Margarita A. Sobol. Structural-functional organization of the plant cell nucleolus under the conditions of altered gravity.tutoría de la Tesis Doctoral mediante la dirección de trabajos de investigación realizados en Madrid, que formaron parte sustancial de la misma. Universidad de Kiev (Ucrania), Tutor: F.J. Medina Díaz. Fernando González Camacho. Análisis de las Proteínas Nucleolares NopA100 y NopA64 en relación con la Proliferación Celular en Allium cepa L.. Universidad Autónoma de Madrid, Director: F.J. Medina Díaz. Victoria Rodríguez Vilariño. Caracterización de dominios funcionales en el nucleolo de células politenizadas de Chironomus. Universidad Complutense de Madrid. Presentada y aceptada en Defensa Pública en enero de Director: F.J. Medina Díaz. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Marco, R., Husson, D., Herranz, R., Mateos, J., and Medina, F.J. (2003). Drosophila melanogaster and the future of Evo-Devo Biology in space. Challenges and problems in the path of an eventual colonization project outside the Earth. Adv. Space Biol. Med. 9,

71 Nucleolo de Células Vegetales / Plant Cell Nucleolus Medina, F.J., and González-Camacho, F. (2003). Nucleolar proteins and cell proliferation in plant cells. Recent Res. Develop. Plant Biol. 3, González-Camacho, F., and Medina, F.J. (2004). Identification of specific plant nucleolar phosphoproteins in a functional proteomic analysis. Proteomics 4, González-Camacho, F., and Medina, F.J. (2004). Nucleolins from different model organisms have conserved sequences reflecting the conservation of key cellular functions through evolution. J. Applied Biomed. 2, Lería, F., Marco, R., and Medina, F.J. (2004). Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Microscopy Res. Techn. 65, Contribuciones a Libros/Contributions to Books Volkov, R.A., Medina, F.J., Zentgraf, U., and Hemleben, V. (2004). Organization and Molecular Evolution of rdna, Nucleolar Dominance, and Nucleolus Structure. In Progress in Botany, vol. 65. Esser, K.; Lüttge, U.; Beyschlag, W.; Murata, J. eds. Heidelberg: Springer Verlag, pp ISBN: Artículos de Divulgación/Press Articles Medina, F.J. Entender la Ciencia. ABC, 24 de octubre de Próximos Artículos/Forthcoming Articles Husson, D., Herranz, R., Villa, A., Díaz, C., Mateos, J., Pastor, M., Medina, F.J., and Marco, R. (2005). Design and development of hardware for long term cultivation of Drosophila melanogaster in the International Space Station. Drosophila Information Service. (en prensa/in press). Matía, I., González-Camacho, F., Marco, R., Kiss, J.Z., Gasset, G., and Medina, F.J. (2005). Nucleolar Structure and Proliferation Activity of Arabidopsis Root Cells from Seedlings germinated in the International Space Station. Adv. Space Res. (en prensa/in press). Sobol, M.A., González-Camacho, F., Rodríguez-Vilariño, V., Kordyum, E.L., and Medina F.J. (2005). Clinorotation Influences rdna and NopA100 Localization in Nucleoli. Adv. Space Res. (en prensa/in press). 60

72 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization MARÍA-CARMEN RISUEÑO ALMEIDA Jefe de Grupo / Group Leader PILAR SÁNCHEZ TESTILLANO Investigadoras de Carrera / Staff Scientists PABLO GONZÁLEZ-MELENDI DE LEÓN Investigador Contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist MÓNICA GONZÁLEZ SÁNCHEZ Investigadora Contratada/Contract Scientist BEGOÑA FADÓN SALAZAR Doctor Vinculado / Associated Scientist JOSEFINA CORTÉS ESLAVA (Desde IX-2004) GYANESH KUMAR SATPUTE (Hasta XII-2004) HONG LONG (Desde X-2004) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows IVETT BARANY REBECA SUÁREZ GONZÁLEZ (Desde VII-2003) B. Predoctorales / Graduate Students PILAR DOMINGO (Desde IX- 2004) MARIA TERESA SOLÍS (VII a XII, 2004) Estudiantes / Students IDIOLEYDIS ÁLVAREZ (V a VII, 2004) CATIA BARBETA (V y VI-2003) MARÍA BERDASCO (III a VI, 2004) BENEDETTA CHIANCONE (V-2004) CECILIA DÍAZ JIDY (Hasta V-2003) NATALY LEVY (V-2004) OFELIA SAM MOREJÓN (XI y XII, 2004) Investigadoras Visitantes / Visiting Scientists CARLOS ALMARZA SANZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Polen, Embriogénesis, Estrés, MAP quinasas, Señalización, Desarrollo in vitro, Microscopía confocal, Microscopía electrónica Embriogénesis de polen inducida por estrés en especies de interés agroalimentario, herramienta en mejora vegetal para producción de embriones haploides y regeneración de plantas doble-haploides Las plantas dihaploides son utilizadas hoy en día ampliamente en la obtención de líneas isogénicas y nuevas variedades, Keywords: Pollen, Embryogenesis, Stress, MAP kinase, Signaling,In vitro development, Confocal microscopy, Electron microscopy Stress-induced pollen embryogenesis in species of food and agronomic interest as a tool for plant breeding by the production of haploid embryos and the regeneration of double-haploid plants Double-haploid plants are biotechnological tools in plant breeding for the generation of isogenic lines and new varieties 61

73 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization Figura 1.- a-d) Reconstrucción tridimensional confocal de un proembrión derivado de microsporas de cebada. Tinción con DAPI. La exina muestra autofluorescencia. a-c) Proyeciones de la serie confocal rotada a diferentes ángulos; d) Corte transversal. (González- Melendi et al. Planta, en prensa). Con esta técnica hemos determinado que la diploidización espontánea de estos embriones ocurre en estadios muy tempranos (los núcleos 1, 2, 3 y el que está en metafase son diploides). e, f) Expresión del gen ZmEsr, específico de endospermo, en un embrión derivado de polen de maíz mediante FISH y análisis confocal. La expresión de ZmEsr aparece en regiones concretas del embrión sugiriendo su posible funcionalidad tipo-endospermo durante el desarrollo in vitro de los embriones derivados de polen, f: Tinción con DAPI para DNA de la misma región del embrión. Barra en a-d: 10 µm, en e-f: 500 µm. (Massonneau et al. 2005, Eur. J. Cell Biol. En prensa). Figure 1.- a-d) 3D confocal reconstruction of a barley microspore-derived pro-embryo. DAPI staining. The exine shows autofluorescence. Images a-c are projections of the confocal stack rotated at different angles; d is a cross section. (González-Melendi et al. Planta, in press). Using this method we have determined that the spontaneous diploidisation of these embryos occurs at very early stages (nuclei 1, 2, 3 and the one in metaphase are diploid). e, f) Expression of ZmEsr gene, endosperm-specific, in a maize pollen-derived embryo, by FISH and confocal analysis. The expression of ZmEsr appears in discrete regions of the embryo, suggesting their possible endosperm like functionality during the in vitro development of pollen-derived embryos. f: DAPI staining for DNA of the same embryo region. Bar in a-d = 10 µm, in e- f: 500 µm (Massonneau et al. 2005, Eur. J. Cell Biol. In press.) Figura 2. Plántula haploide de pimiento (d) obtenida por embriogénesis de polen en cultivo in vitro de anteras. a) Microspora vacuolada al inicio del cultivo. b) Proembrión multicelular derivado de microspora. c) Espectro de carga de DNA de la plántula obtenida en el cultivo de anteras mediante citometría de flujo, el perfil indica que la planta es haploide (Barany et al. 2005, Biol. Cell. En prensa). Figure 2. Haploid plantlet of pepper (d) obtained by pollen embryogenesis in anther culture in vitro. a) Vacuolate microspore at the begining of the in vitro culture. b) Microspore-derived multicellular proembryo. c) Espectrum showing the DNA amount corresponding to a plant regenerated from the in vitro anther culture, the profile reveals that the plant is haploid. (Barany et al. 2005, Biol. Cell. In press). 62

74 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization así como importantes herramientas biotecnológicas en mejora vegetal, además de su utilidad en estudios genéticos y de mutagénesis. La regeneración de estas plantas se realiza fundamentalmente a partir de la inducción de embriogénesis in vitro en microsporas y granos de polen. La microspora cultivada in vitro, por la aplicación de un tratamiento de estrés (choque térmico, ayuno, etc) abandona su programa de desarrollo gametofítico para multiplicarse y originar un embrión y, posteriormente, una planta haploide. Aunque se ha conseguido inducir en numerosas especies, el porcentaje de respuesta es en general muy bajo. Estudiamos diferentes aspectos del proceso a nivel celular, comparándolo en diversos sistemas de mono y dicotiledóneas. Abordamos la caracterización celular, por un lado, del desarrollo gametofítico normal y de la fase de desarrollo que es capaz de responder al estrés, la microspora vacuolada, y por otro la progresión del cultivo antes y después de la inducción. Concretamente se estudian: a) Cambios ultraestructurales en los dominios funcionales del núcleo, en relación a la actividad, así como la dinámica de compartimentos citoplásmicos y formación de paredes celulares ; b) Localización in situ y traslocaciones subcelulares de antígenos implicados en la función nuclear; c) Expresión in situ de genes característicos de la embriogénesis, que se están aislando e identificando muy recientemente en diferentes especies; d) Progresión del ciclo celular en ambos programas de desarrollo, estudiando la dinámica de sus fases y presencia y distribución de elementos reguladores del mismo. Mecanismos de diploidización en embriones derivados de microsporas La tasa de diploidización es un factor importante en el proceso de producción de doble haploides. En algunas especies, especialmente en monocotiledóneas (maíz y cebada), existe una alta tasa de diploidización espontánea. El conocimiento de la dinámica y mecanismos de diploidización puede ser potencialmente utilizado para influir en este proceso para el diseño de futuras estrategias de transformación en la obtención de embriones transformados homocigotos para un gen de interés en una sola generación. Recientemente hemos desarrollado un método citomorfométrico en reconstrucciones tridimensionales en microscopía confocal para estimar el nivel de ploidía de núcleos individualizados en proembriones multinucleados. La identiand also for genetic and mutagenesis studies. These plants are regenerated from microspore and immature-pollen induced embryogenesis by stress. In vitro-cultured microspores after a stress treatment (heat shock, starvation ) abandon their gametophytic developmental programme to proliferate and then give rise to embryos, which further regenerate haploid plants. This process has been induced in many species but the percentage of regenerants, apart from model species, is low. We study different aspects of the cellular events associated with this process in mono and dicot species. Our study is focused on the cellular characterisation of the normal gametophytic development, in particular the stage of vacuolated microspore, which better responds to the stress treatment, and also on the progression of the cultures after induction. Our approach involves: a) ultrastructural characterisation of the functional domains of the cell nucleus in relation to cell activity, the dynamics of cytoplasmic compartments and the formation of cell walls; b) in situ localisations and subcellular translocations of antigens involved in nuclear functions; c) in situ expression of specific genes of pollen embryogenesis, some of which have been recently identified in different species; d) progression of the cell cycle in both developmental programmes by studying the dynamics of their phases and the presence and distribution of their regulatory elements. Mechanisms of diploidisation in microspore-derived embryos Diploidisation of the embryos favours the regeneration of double-haploid plants. In some species, specially in monocots (maize and barley), there is a high rate of spontaneous diploidisation. The know-how of the dynamics and mechanisms of diploidisation can be potentially explored to influence this process and to plan future strategies of transformation to generate homozygous transformants for a particular gene in a single generation. We have developed a cytomorphometric method in 3D confocal reconstructions to estimate the ploidy level of single nuclei within multinuclear pro-embryos. The identification of haploid and diploid nuclei enabled us to determine the timing of diploidisation at early stages throughout embryogenesis. We found that diploidisation is an ongoing process that can start after the first embyogenic division and continues in multinuclear pro-embryos. Reconstruction of 3D-images of entire pro- 63

75 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization ficación de núcleos haploides y diploides ha permitido determinar que la diploidización es un proceso continuo que puede ocurrir tras la primera división embriogénica o en las siguientes. El análisis de series confocales mediante la obtención de cortes ópticos ortogonales así como la correlación de microscopía confocal y electrónica nos ha permitido definir que la diploidización tiene lugar por fusión nuclear. Proteínas de señalización y estrés durante procesos de desarrollo, embriogénesis y proliferación en plantas: Análisis de la expresión e identificación molecular in situ En muchos eucariotas se han identificado numerosos elementos de rutas de transducción de señales implicadas en la entrada en proliferación o en cambios de programas de desarrollo. En plantas, se han encontrado elementos homólogos, aunque se conoce poco sobre su función. Los datos moleculares apuntan que durante la inducción de embriogénesis en la microspora operan rutas de transducción de señales homólogas a las encontradas en otros eucariotas, en las que están involucrados módulos de MAPK ( Mitogen Activated Protein quinasas). Estudios del grupo han revelado por primera vez la localización ultraestructural de la proteína y los transcritos de un gen homólogo a MAPK aislado en tabaco, y los cambios de expresión y localización en células vegetales quiescentes y en proliferación. Asimismo, hemos determinado la expresión diferencial y entrada en el núcleo celular de MAPKs homólogas de Erk1/Erk2 durante procesos de diferenciación y proliferación en plantas. Por otra parte, las proteínas de choque térmico ( Heat shock proteins, HSPs) son una de las clases más abundantes de proteínas de estrés en plantas, cuya expresión además se ha relacionado también con procesos de desarrollo. Algunos de los tratamientos de estrés más efectivos para inducir la embriogénesis de microsporas consisten en un choque térmico. Aunque los tratamientos inductores difieren según las especies, los datos hasta ahora obtenidos indican que la expresión de genes de estrés está involucrada en todas ellas. En el grupo analizamos la presencia, distribución subcelular, expresión in vitro y traslocación de elementos relacionados con la respuesta a estrés y transducción de señales, como las proteínas de choque térmico (HSPs), las MAP quinasas y elementos de sus cascadas. Los primeros resultados obtenidos en el grano de polen durante su desarrollo gametofítico y embriogénesis in vitro revelan cambios en la expresión y embryos and the observation of cross and longitudinal sections across stacks of optical sections, together with correlative light and electron microscopy, provided evidences of nuclear fusion as the main mechanism of diploidisation. Signalling and stress proteins during plant development, embryogenesis and proliferation: analysis of expression and in situ molecular identification In many eukaryotes, numerous elements of signal transduction pathways involved in the entry in proliferation and changes in developmental programs have been identified. Homologous elements have been found in plants, but their functions are largely unknown. Molecular studies suggest that during the induction of microspore embryogenesis, signal transduction pathways, homologous to those found in other eukaryotes, are operating. In these pathways, mitogen activated protein kinases, MAPKs, are involved. Studies of the group have revealed for the first time the ultrastructural localization of the protein and transcripts of a MAPK-homologous gene in tobacco, and its changes in expression and localization in quiescent and proliferating plant cells. We have also determined the differential expression of homologues of Erk1/2 MAPKs and their entry into the cell nucleus during plant proliferation and differentiation. On the other hand, the heat-shock proteins, HSPs, are one of the most abundant class of stress proteins in plants, their expression has been also related to developmental processes. Some of the more efficient treatments for microspore embyogenesis induction are heat-shocks. Inductive treatments vary among species, but different data indicate that stress gene expression is involved in all of them. The presence, subcellular distribution, in situ expression and translocations of elements related to stress response and signal transduction, as HSPs and MAPKs, being analyzed by our group. The first results of the pollen grain during its gametophytic development and embryogenesis induction in vitro show changes in the expression and localization of various elements belonging to these groups of proteins, suggesting that HSPs are playing a key role in those developmental processes. MAPKs modules are also operating in them. 64

76 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization Figura 3.- Doble inmunomarcado con oro de la MAPK-Ntf6 y la proteína bcop, marcadora de Golgi, en polen de tabaco. Muestra criosustituída y crioincluída en Lowicryl K4M. La MAPK-Ntf6 (partículas de 10 nm, flechas largas) se localiza en los márgenes del aparato de Golgi (G), junto a la proteína bcop (partículas de 5 nm, cabezas de flecha) que marca algunas vesículas y estructuras del mismo. El insert muestra la inmunofluorescencia de la MAPK-Ntf6 con un patrón de localización citoplásmico en pequeños spots. V: vacuola. Los resultados sugieren la implicación de la proteína Ntf6 en la ruta secretora. Barra: 0.5 mm, en insert: 10 mm. Figure 3.- Double immunogold labelling of Ntf6-MAPK and bcop protein, Golgi marker, in tobacco pollen. The sample was prcessed by freeze-substitution and cryoembedding in Lowicryl K4M. Ntf6-MAPK (10 nm particles, arrows) is localized in Golgi (G) margins, near bcop protein (5 nm particles, arrowheads) which labels some Golgi vesicles and structures. Inset: Ntf6-MAPK immunofluorescence showing a pattern of cytoplasmica spots. Results suggest the involvement of Ntf6 protein in the secretory pathway. V: vacuole. Bar: 0.5 mm, in inset: 10 mm. localización de varios elementos de estos grupos de proteínas, indicando que las HSPs juegan un papel clave en estos procesos durante los cuales, además operan módulos de MAP quinasas. Dominios funcionales del núcleo celular relacionados con rutas de señalización en plantas La dinámica de los dominios funcionales y estructurales del núcleo en células vegetales (cromatina condensada, región intercromatínica y nucleolo) está relacionada con las funciones de replicación, transcripción, procesamiento y transporte de RNAs, variando su organización estructural en relación a esta actividad Nuclear functional domains related to signalling pathways in plants Dynamics of the functional and structural domains of plant cell nucleus (condensed chromatin, interchromatin region, and nucleolus) is related to replication, transcription, and RNA processing and transport activities. Their structural organization varies in relation to these activities and during different stages of gametophytic and embryogenic development, as well as during cell cycle phases. For years, our group has studied the changes, at subcellular and ultrastructural levels, in the localization patterns of different macromolecules involved in DNA, hnrna and rrna synthesis and processing, by using markers of 65

77 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization y en las diferentes etapas del desarrollo gametofítico y embriogénico, así como durante las distintas fases del ciclo celular. El grupo ha estudiado durante años los cambios a nivel subcelular y ultraestructural en los patrones de localización de diferentes macromoléculas implicadas en la síntesis y procesamiento de DNA y RNA heterogéneo y ribosómico, empleando marcadores de estos procesos. Más recientemente se han localizado elementos de diferentes rutas de señalización en el núcleo de células animales. Nuestros estudios han revelado que en plantas se producen cambios en la localización nuclear y citoplásmica de MAPKs y otras proteínas de señalización durante procesos de respuesta a estrés o cambios de programa de desarrollo. Estudios de doble inmunomarcado en combinación con citoquímicas ultraestructurales indican la asociación de factores de señalización a diversos elementos de la maquinaria nuclear, definiendo nuevos dominios estructurales y funcionales en el núcleo asociados a rutas de señalización. Recientemente, el grupo ha determinado la asociación de las MAPKs Erk1/2 y de MAPKs en estado activo con estructuras RNP de la región intercromatínica durante procesos de diferenciación y proliferación en plantas. Desarrollo y optimización de técnicas para estudios de identificación molecular in situ para microscopía correlativa La microscopía correlativa implica el empleo de abordajes experimentales que permitan visualizar la misma región de la muestra a dos niveles de observación: microscopía óptica y electrónica. En el grupo se desarrollan técnicas y abordajes para relacionar la información complementaria que se obtiene con el uso de diferentes microscopías, DIC, contraste de fase, láser confocal (CLSM) y electrónica de transmisión. Esta línea de trabajo implica varios estudios: a) Optimización de técnicas de procesamiento en frío (criotécnicas) de muestras biológicas, imprescindibles para localizaciones in situ (inmunomarcados, hibridaciones in situ, etc). Estas metodologías conservan la reactividad química y antigénica de la muestra, preservando la estructura más cerca del estado in vivo y minimizando la pérdida de componentes. El grupo es pionero en el desarrollo de estas técnicas en plantas, particularmente la criofijación, crioultramicrotomía, criosustitución y crioinclusión en resinas tipo Lowicryl. b) Desarrollo de métodos que combinan técnicas citoquímicas específicas para ácidos nucleicos y proteínas con inmunomarcados y otras técnicas de localización in situ; la comthese processes. Recently, elements of signal transduction pathways have been localized in the nucleus of animal cells. Our studies have revealed that in plants, changes in the nuclear and cytoplasmic localization of MAPKs and other signalling molecules occurr during stress response and developmental program changes. Double labelling studies in combination with ultrastructural cytochemistry point out the association of various signalling factors to elements of the nuclear machinery, these findings define new structural and functional domains associated with signalling pathways in the nucleus. Recently, the group has determined the association of Erk1/2 MAPKs and active MAPKs with RNP structures of the interchromatin region during plant proliferation and differentiation. Development and set up of techniques for in situ molecular identification and correlative microscopy Correlative microscopy involves the use of experimental approaches for the visualization of the same region of the sample at two levels of observation: light and electron microscopy levels. In the group, approaches and techniques to reveal the complementary information gained by the use of different microscopies, DIC, phase contrast, confocal (CLSM) and transmission electron microscopy, are developed. This topic involves various research subjects: a) Optimization of low temperature methods for processing biological samples (cryotechniques), which are neccessary for in situ localizations (immunolabelling, in situ hybridization, etc). These low temperature techniques keep the chemical and antigenic reactivity of the sample, maintain the structure nearer the in vivo state, and minimize the loss of components. The group is a pioneer in the development of these techniques in plants, specifically cryofixation, cryoultramicrotomy, freeze-substitution, and cryo-embedding in Lowicryl resins. b) Development of methods which combine specific cytochemical techniques for nucleic acids and proteins with immunolabelling and other in situ localization techniques. The combination of both procedures in the same sample provides double information: the chemical nature of the structure specifically stained, and the precise localization of the antigen by the gold particle. c) In situ localization techniques of high sensitivity, using probes and antibodies for detecting low amounts of moleclular targets in the cellular compartments. We studied the combination of different detection methods using fluorochromes, 66

78 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization binación de ambos procedimientos en la misma muestra proporciona una doble información: la naturaleza química de la estructura y la localización precisa del antígeno por la partícula de oro coloidal. c) Técnicas de localización in situ empleando sondas y anticuerpos con alta sensibilidad, que permiten detectar con mucha precisión pequeñas cantidades de dianas moleculares en los compartimentos celulares, combinando distintos métodos de visualización con fluorocromos, nano-oro y métodos de amplificación de señales, correlacionando el resultado obtenido en distintos microscopías: óptica (campo claro y contraste de fase) láser confocal, de fluorescencia con cámara CCD, y microscopía electrónica de transmisión. Además, estudios de colocalización múltiple y de rotación de imágenes tridimensionales permitirán analizar la asociación entre antígenos y la distribución espacila de los mismos. ultrasmall colloidal gold particles, and methods to amplify signals, and evaluate the results. Moreover, studies on multiple colocalization and 3D image rotation will permit the analysis of the association between antigens and their espacial distribution. Organismos Financiadores/Funding Agencies AECI ( ) CSIC- Acad. Checa de Ciencias, 03CZ0001 ( ) UE, Cost Action 843 ( ) y Cost Action 851 ( ) CSIC-Acad. Eslovaca de Ciencias, 2002SK0001 ( ) MEC-DAAD (Alemania), HA ( ) MEC-CNRS (Francia), HF ( ) MEC, Red de Genómica Funcional en Especies de Interés Forestal ( ). MEC, Red de Desarrollo Vegetal ( ). CICYT, BOS ( ) CAM, 07G/0026/2003 ( ) MEC-Univ. Palermo (Italia), HP ( ) MEC-CRUP (Portugal), HP ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Bueno, M.A., Gómez, A., Sepúlveda, F., Seguí, J.M., Testillano, P.S., Manzanera, J.A., and Risueño, M.C. (2003). Microsporederived embryos from Quercus suber anthers mimic zygotic embryos and mantain haploidy in long-term anther culture. J. Plant Physiol.160,

79 Desarrollo de Plantas y Organización Nuclear / Plant Development and Nuclear Organization Ramírez, C., Chiancone, B., Testillano, P.S., García-Fojeda, B., Germana, A., and Risueño, M.C. (2003). First embryogenic stages of Citrus microspore-derived embryos. Acta Biol. Cracov. Bot. 45, Seguí-Simarro, J.M., Testillano, P.S., Risueño, M.C. (2003). Hsp70 and Hsp90 change their expression and in situ localization after microspore embryogenesis induction in Brassica napus cv. Topas. J. Struct. Biol. 142, Trentani, A., Testillano, P.S., Risueño, M.C., and Biggiogera, M. (2003). Visualization of transcription sites at the electron microscope. Eur. J. Histochem. 47, Ciamporová, M., Dekánková, K., Coronado, M.J., Ovecka, M., Testillano, P.S., Baluska, F., and Risueño, M.C. (2004). Structural aspects of cell wall modifications during root hair initiation in Vicia sativa. Biologia Bratislava 59. Suppl. 13, Díaz-Jidy, C., Coronado, M.J., Testillano, P.S., and Risueño, M.C. (2004). High temperature stress induces differential expression and localization of HSPs in roots of thermotolerant tomato cuban varieties. Biologia Bratislava 59, Suppl. 13, Fortes, A.M, Coronado, M.J., Testillano, P.S., Risueño, M.C., and Pais, M.S. (2004). Expresion of LOX during organogenic nodule formation from hoop internodes (Humulus lupulus var. Nugget) J. Histochem. Cytochem. 52, Ramírez, C., Testillano, P.S., Pintos, B., Moreno, M.A., Bueno, M.A., and Risueño, M.C. (2004). Changes in pectins and MAPKs related to cell development during early microspore embryogenesis in Quercus suber L. Eur. J. Cell Biol. 83, Sam, O., Ramírez, C., Coronado, M.J., Testillano, P.S., and Risueño, M.C. (2004). Changes in tomato leaves induced by NaCl stress: tissular organization and cellular ultrastructure. Biol. Plantarum. 47, Silva, M.S., Fortes, A.M., Testillano, P.S., Risueño, M.C., and Pais, S. (2004). Differential expression and cellular localization of ERKs during organogenic nodule formation from internodes of Humulus lupulus var. Nugget. Eur. J. Cell Biol. 83, Testillano, P.S., Georgiev, S., Mogensen, L., Coronado, M.J., Dumas, C., Risueño, M.C., and Matthys-Rochon, E. (2004). Spontaneous chromosome doubling results from nuclear fusion during in vitro maize induced microspore embryogenesis. Chromosoma 112, Voronin, V., Aionesei, T., Barinova, I., Touraev, A., Lauriére, C., Coronado, M.J., Testillano, P.S., Risueño, M.C., Heberle-Bors, E., and Wilson, C. (2004). The MAP Kinase Kinase NtMEK2 is involved in tobacco pollen germination. FEBS Letters 560, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Barany, I., González-Melendi, P., Mityko, J., Risueño, M.C., and Testillano, P.S. (2005). Microspore-derived embryogenesis in Capsicum annuum: subcellular rearrangements through development. Biol. Cell. (en prensa/in press). Fraschin, A., Bottone, M.G., Scovassi, A.I., Denegri, M., Risueño, M.C., Testillano, P.S., Martin, T.E., Biggiogera, M., Pellicciari, M. (2005). Changes in extranucleolar transcription during acitnomycin D-induced apoptosis. Histol. Histopathol. 20, González-Melendi, P., Ramírez, C., Testillano, P.S., Kumlehn, J., and Risueño, M.C. (2005). 3D confocal and electron microscopy imaging define the dynamics and mechanisms of diploidization at early stages of barley microspore-derived embryogenesis. Planta. (en prensa/in press). Massonneau, A., Coronado, M.J., Pudran, A., Bagniewska-Zadworna, A., Mol, R., Testillano, P.S., Goralski, G., Dumas, C., Risueño, M.C., Matthys-Rochon, E. (2005). Multicellular structures that develop during in vitro maize pollen embryogenesis express both endosperm- and embryo-specific genes: which is which? Eur. J. Cell Biol. Aceptado, (en prensa/in press). Seguí-Simarro, J.M., Testillano, P.S., and Risueño, M.C. (2005). MAP kinases are developmentally regulated during stressinduced microspore embryogenesis in Brassica napus. Histochem. Cell Biol. (en prensa/in press). Testillano, P.S., González-Melendi, P., Coronado, M.J., Seguí, J.M., Moreno, M.A., and Risueño, M.C. (2005). Differentiating plant cells switched to proliferation remodel the functional organization of nuclear domains. Cytogen. Genome Res, 109, (Invited contribution to the Special Issue on Plant Cytogenetics). 68

80 Patogénesis de Virus de Plantas y Mecanismos de Resistencia en Plantas Plant Viral Pathogenesis and Plant Defense Mechanisms ISABEL GARCÍA LUQUE Mª TERESA SERRA YOLDI Jefes de Grupo / Group Leaders Investigadoras de Carrera / Staff Scientists Mª ÁNGELES GUEVARA MORATO (Hasta II-2003) MERCEDES MONTÓN PECO (Hasta X-2004) Mª LUISA PÉREZ BUENO (Hasta XII-2004) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows ALFONSO BONILLA MARTÍNEZ ANTONIO CERQUEIRA ECED (Hasta II-2004) MYRIAM MOLINA GALDEANO ISRAEL PAGÁN MUÑOZ (Hasta II-2003) MARGARITA RUÍZ DEL PINO (Hasta XII-2003) JOSÉ MANUEL SILVÁN JIMÉNEZ (Desde IV-2004) GEMA VILA CAMBRA (Hasta IX-2004) B. Predoctorales / Graduate Students NURIA DE MARÍA DE LAS HERAS (XI-2002 a VII-2003) MÓNICA PINEDA DORADO Investigadoras Visitantes/ Visiting Scientists CAROLINA BENÍTEZ BALEATO (Desde IV-2004) Personal Técnico / Technician Palabras clave: Patogénesis viral, Resistencia vegetal Las líneas de trabajo que venimos desarrollando en nuestro grupo cubren diversos aspectos de los procesos que concurren en el establecimiento de la infección viral, de los efectos de la infección sobre el metabolismo celular, así como de los mecanismos de defensa que la planta desarrolla para impedir su invasión por el agente patógeno. Mecanismos de patogénesis viral Para que se produzca una infección generalizada de las plantas se han de llevar a cabo los procesos de replicación a nivel celular, movimiento célula a célula y movimiento a larga distancia del virus. Dichos procesos requieren el concurso de factores virales y de la planta, cuya naturaleza y función son en gran Keywords: Plant virus pathogenesis, Plant resistance mechanisms Ongoing research in our working group covers different aspects of the processes required for the viral infection to take place, the effect of the infection upon the host metabolism as well as the defence mechanism(s) that the host have developed to counteract its invasion by the pathogen. Plant virus pathogenesis Successful viral infections of plants imply viral replication at cellular level, transport of viruses from one cell to another and long distance spread of infection. Both viral and host factors are required to attain viral systemic infection of the plant. Our current knowledge about their identities and functioning are limit- 69

81 Patogénesis de Virus de Plantas y Mecanismos de Resistencia en Plantas / Plant Viral Pathogenesis and Plant Defense Mechanisms parte desconocidas. En este contexto estamos analizando los mecanismos y elementos virales involucrados en la gama de huéspedes de los virus del moteado suave de la paprika y del pimiento en diversas Solanáceas, habiendo establecido que PaMMV se replica a nivel celular en plantas de Lycopersicon esculentum, si bien la infección queda restringida a las hojas inoculadas y a los tallos. Experimentos de coinoculación con virus heterólogos y superinfecciones con PaMMV son indicativos de que la restricción de la infección es debida a la inhibición del movimiento sistémico viral. Por otro lado, y en colaboración con el grupo de la Dra. Barón Ayala, de la EEZ.CSIC, estamos analizando las alteraciones que sufre el aparato fotosintético como consecuencia de la infección viral. Usando como sistema huésped-patógeno modelo Nicotiana-tobamovirus, hemos establecido que la infección viral produce una inhibición selectiva de las isoformas de las proteínas extrínsecas del Fotosistema II (Fot II), implicadas en el sistema de oxidación/fotolisis del agua. La tasa de inhibición es dependiente de la cepa viral y ocurre transcripcionalmente. Este efecto se traduce en la reducción de la eficiencia fotoquímica del Fot II. Mecanismos de resistencia vegetal frente a las infecciones virales El interés de nuestro trabajo se centra en el estudio de los mecanismos de defensa de las plantas, que conllevan a la restricción del agente patógeno a los lugares de entrada, evitando su diseminación al resto de la planta. Para ello, utilizamos como sistema modelo plantas del género Capsicum portadoras de distintos genes de resistencia frente a los tobamovirus, ubicados en el locus L, donde llevamos a cabo la identificación de los factores virales responsables de la inducción de la respuesta de defensa, así como la caracterización de la misma. Esta resistencia (reacción hipersensible, HR) resulta en la restricción de la invasión viral a los lugares de infección primaria, y hemos establecido que la proteína de cubierta viral es el elicitor de dichos genes de resistencia. Su expresión en las plantas con el correspondiente gen L de resistencia, activa la muerte celular y los genes de defensa de la planta, características ambas que definen la HR. En este sistema, hemos identificado diversas proteínas y mrnas cuya expresión se modifica durante la activación de la HR, y cuya participación en la respuesta de defensa del huésped está siendo analizada en la actualidad. ed. In this context, the aim of our work is to get insight into the molecular mechanisms involved in the host range of both paprika and pepper mottle tobamoviruses in Solanaceae plants. We have established that PaMMV is able to infect and replicate in tomato protoplast, whereas the infection was restricted to the inoculated leaves and to the stems of tomato plants. This invasion pattern is a result of the deficient long-distance movement of PaMMV in this host. On the other hand, in collaboration with Dr. Barón Ayala (EEZ. CSIC. Granada), we are studying the viral pathogenesis mechanisms, focused towards the elucidation of the effect upon photosynthesis. Using as plant-pathogen model system Nicotiana-tobamoviruses, we have established that viral infection leads to a selective inhibition of certain isoforms of photosystem II extrinsic proteins, involved in water-splitting. The inhibition rate is dependent upon the viral strain and it takes place at the transcriptional level. This effect leads to a reduction in the photochemical efficiency of the infected plants. Plant defence mechanisms against virus infection The general aim of our work is to study plant defence mechanism(s) against virus infection, that lead to the restriction of the pathogen to the entry sites, limiting the further viral spread to other parts of the plant. As model system, we use tobamoviruses-resistant Capsicum spp. In this system, we carry out, from the pathogen side the identification of the viral factors required for eliciting the host response; and from the host side, the characterization of the response during the activation of the resistance mechanism(s). We have established that the tobamoviral coat protein acts as the viral elicitor of the Capsicum L 2 -L 4 gene-mediated defences. This resistance (HR, hypersensitive reaction) is characterized by the activation of the programmed cell death and defence-related genes. It results in the restriction of the viral infection to the primary infection sites and the development of necrotic local lesions. In this model system we are studying changes in protein and mrna patterns, induced upon PMMoV infection in C. chinense plants. We are currently analysing their contribution to the host defence response. 70

82 Patogénesis de Virus de Plantas y Mecanismos de Resistencia en Plantas / Plant Viral Pathogenesis and Plant Defense Mechanisms Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, BIO C02-01 ( ) CICYT, BIO C02-01 ( ) CAM, 07B/0030/2002 ( ) CAM/CSIC ( ) Western Seed España, S.A. ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Mª Luisa Pérez Bueno. Fotosistema II e infección viral: análisis de fluorescencia de imagen y regulación de la biosíntesis de las proteínas OEC durante la patogénesis. Universidad de Granada, Codirectora: I. García Luque. Margarita Ruiz del Pino. Análisis funcional de formas mutadas de la proteína de movimiento del virus del mosaico del pepino expresadas transgénicamente en plantas de Nicotiana tabacum. Universidad Complutense de Madrid, Directora: I. García Luque. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Ruiz Del Pino, M., Moreno, A., García De Lacoba, M., Castillo-Lluva, S., Gilardi, P., Serra, M.T., and García-Luque, I. (2003). Biological and molecular characterization of P101 isolate, a tobamoviral pepper strain from Bulgaria. Arch. Virol. 148, Gilardi, P., García-Luque, I., and Serra, M.T. (2004). The coat protein of tobamovirus acts as elicitor of both L 2 and L 4 gene-mediated resistance in Capsicum. J. Gen. Virol. 85, Martínez-García, B., Fernández-Marco, C., Goytia, E., López-Abella, D., Serra, M.T., Aranda, M., and López-Moya, J.J. (2004). Development and use of detection methods specific for Cucumber vein yellowing virus (CVYV). Eur. J. Plant Pathol. 110, Pérez-Bueno, M.L., Rahoutei, J., Sajnani, C., García- Luque, I., and Barón, M. (2004). Proteomic analysis of the oxygen-evolving-complex of photosystem II under biotic stress. Studies on Nicotiana benthamiana infected with tobamoviruses. Proteomics 4,

83 Virología Molecular de Plantas Plant Molecular Virology JOSÉ RAMÓN DÍAZ-RUÍZ ALBA DIONISIO LÓPEZ ABELLA (Hasta VII-2003) Investigador Emérito / Emeritus Scientist (Desde VII-2003) Jefes de Grupo / Group Leaders CÉSAR LLAVE CORREAS (Desde VI-2004) JUAN JOSÉ LÓPEZ-MOYA GÓMEZ (Hasta VII-2004) FRANCISCO TENLLADO PERALO (Desde VI-2003) Investigadores de Carrera / Staff Scientists BELÉN MARTÍNEZ GARCÍA Investigadora Contratada / Contract Scientist JUSTO MARTIAÑEZ RODRÍGUEZ (Desde II-2004) VIRGINIA RUÍZ FERRER (Hasta IX 2003) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows DANIEL BARAJAS RAMÍREZ LIVIA DONAIRE SEGARRA (Desde X-2004) LOURDES FERNÁNDEZ CALVINO ELISA GOYTIA PASQUÍN LLÚCIA MARTÍNEZ PRIEGO (Desde IX-2004) LOIC REVUELTA LUIS (Desde V-2004) YOLANDA MARISOL VARGAS CONCHA B. Predoctorales / Graduate Students FÉLIX ALEJANDRO ATENCIO GABRIEL MORILLA (VI-2004) NÉSTOR SANTIAGO (IX a XII-2003) Investigadores Visitantes / Visiting Scientists DIEGO DÍAZ IZQUIERDO MONSERRAT LLORENTE DE MINGO Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Virus vegetales, Resistencia transgénica, Regulación génica, Silenciamiento génico, RNA interferencia, Micro RNA, RNA bicatenario, Transmisión por insectos, Pulgones, Control de enfermedades Control de enfermedades virales en plantas: mecanismos de silenciamiento génico y resistencia transgénica a virus Numerosas secuencias de genes derivadas de muchos virus de plantas diferentes, se han introducido en una gran variedad de especies para producir plantas transgénicas protegidas frente a la infección por estos virus, una estrategia conocida como resistencia transgénica derivada del patógeno. En muchos casos, se Keywords: Plant viruses, Transgenic resistance, Gene regulation, Gene silencing, RNA interference, Micro RNA, Doublestranded RNA, Insect transmission, Aphids, Disease control Plant virus disease control: mechanisms of gene silencing and transgenic resistance to viruses Gene sequences derived from many different plant viruses have been introduced into a wide variety of plant species to produce transgenic plants protected against virus infection, a strategy known as pathogen-derived transgenic resistance. In many cases, it is known that the mechanism of the resistance is a posttranscriptional, RNA-mediated process that targets both the 72

84 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology sabe que el mecanismo de la resistencia es un proceso posttranscripcional mediado por RNA, que señaliza, de una forma específica de secuencia, tanto al RNA viral como al mrna del transgén para su degradación. Esta resistencia a virus mediada por RNA es una manifestación del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), un potente mecanismo de degradación intracelular de RNA que probablemente ha evolucionado como una defensa de las plantas frente a infecciones virales. El PTGS tiene lugar también en plantas no transgénicas, pero los virus contraatacan esta respuesta de defensa natural codificando en sus genomas supresores de PTGS. Por tanto, el descubrimiento de que los virus pueden ser inductores, dianas y portar supresores de PTGS apoya la idea de que los procesos de silenciamiento constituyen un mecanismo de defensa innato frente a infecciones virales. Un cuerpo creciente de datos bioquímicos y genéticos demuestran que plantas y animales comparten mecanismos relacionados de degradación de RNA (PTGS en plantas, RNAi en animales), en donde la forma bicatenaria del RNA (dsrna) constituye la molécula iniciadora del proceso. En plantas, el dsrna, o estructuras en lazo-horquilla de RNA que son transcritas a partir de repeticiones invertidas artificiales, constituyen potentes inductores de la respuesta de silenciamiento génico dirigida frente a virus. Estos datos sugieren que la administración exógena de dsrna pudiera constituir la base para el desarrollo de una nueva herramienta biotecnológica dirigida a la protección de cultivos frente a las infecciones virales. En el estado actual, la tecnología antiviral basada en dsrna se ha demostrado efectiva en nuestro laboratorio frente a enfermedades virales transmitidas mecánicamente. Sin embargo, la protección frente a enfermedades transmitidas por vectores requiere un mayor esfuerzo investigador y tecnológico, conducente a la introducción y dispersión adecuada del dsrna a través de la planta. En esta línea, nuestro grupo mantiene, durante los últimos años, un programa de investigación orientado hacia el control de enfermedades virales en plantas. Recientemente, el énfasis se ha puesto en: 1) el análisis de estrategias de resistencia transgénica, derivada del patógeno, a virus en plantas, y la elucidación de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la resistencia; 2) el análisis del mecanismo de defensa antiviral en plantas mediado por silenciamiento génico y el estudio de los supresores virales de silenciamiento génico y 3) el análisis del mecanismo de interferencia con las infecciones virales en plantas inducido por dsrna. viral RNA and the transgene mrna for degradation in a sequence-specific manner. This RNA-mediated virus resistance is a manifestation of post-transcriptional gene silencing (PTGS), a powerful, intracellular RNA-degradation mechanism, which has probably evolved as a plant defense against virus infection. PTGS also takes place in non-transgenic plants but viruses counteract the natural host defense response by encoding suppressors of PTGS in their genomes. Thus, the discovery that viruses are inducers, targets and may carry suppressors of PTGS adds further support to the involvement of silencing processes as an innate defense mechanism against virus infection. Agrowing body of biochemical and genetic data has demonstrated that plants and animals share related mechanisms of specific degradation of RNA (PTGS in plants, RNAi in animals), in which double-stranded forms of RNA (dsrna) are initiator molecules. In plants, dsrna or self-complementary hairpin RNA that are transcribed from engineered inverted repeats are potent inducers of a gene silencing response when directed against viruses. These findings suggest that exogenously supplied dsrna could form the basis for the development of a new biotechnological tool aimed at protecting crops against virus diseases. At present, dsrna antiviral technology has been so far demonstrated effective against mechanically transmitted viral diseases in our laboratory. Protection against vector-transmitted diseases will require further research and technologies pertaining to the successful incorporation and spread of dsrna through the plant. Along this line, our group maintains a research program, over the last years, focused toward the plant virus disease control. Recently, the emphasis has been on: l) the analysis of pathogenderived, transgenic resistance strategies to viruses in plants and the elucidation of the cellular and molecular mechanisms controlling resistance; 2) the analysis of the gene silencing-mediated antiviral defense mechanism in plants and the study of viral suppressors of gene silencing and 3) the analysis of the dsrnainduced interference mechanism with plant virus infections. Gene regulation and micrornas in the frame of virus infections in plants MicroRNAs (mirnas) are naturally occurring, endogenous nucleotide (nt) RNAs derived from transcriptionally 73

85 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology Figura 1.- Esquema ilustrativo del mecanismo de interferencia por RNA como medio para bloquear la replicación del virus en la célula vegetal. La molécula inductora de RNA bicatenario (dsrna) o el precursor del micro RNA (mirna) son procesados por una enzima RNasa-III para generar pequeños RNAs interferentes (sirnas) y mirnas respectivamente. Estas moléculas se incorporan dentro del complejo enzimático RISC desde donde dirigen el reconocimiento de los RNA virales diana conduciendo a su degradación o a la inhibición de su traducción. Este esquema recoge diferentes métodos para la producción y administración de ambos tipos de inductores de RNA interferente (RNAi). RNA estructurados o precursores de mirnas se pueden generar directamente a partir de genes nucleares (transgenes). También pueden ser suministrados exógenamente usando técnicas diversas como la expresión mediada por Agrobacterium tumefaciens, bombardeo de micropartículas, el uso de vectores virales o la aplicación directa de los productos interferentes en el interior de la célula. Figure 1.- A schematic diagram of induction of RNA interference as a means to interfere with virus replication in the plant cell. Long doublestranded RNAs (dsrnas) and micro RNA (mirna) precursors are processed to small interfering RNAs (sirnas) and mirnas, respectively, by a RNase III-like enzyme. These molecules serve as a guide for sequence-specific recognition of target viral RNAs by a RISC complex, eventually resulting in translational arrest and/or RNA degradation. This model compiles different methods for production and delivery of both types of interfering RNA (RNAi) inducers. Hairpin RNAs and mirna precursors can be directly generated from nuclear transgenes. Additionally, they can be exogenously supplied using a number of approaches that include Agrobacterium-mediated expression, microprojectile bombardment, viral vectors and direct application of interfering products into the plant tissue. Regulación génica y micrornas en el marco de las infecciones virales en plantas Los micro RNAs (mirnas) son moléculas de RNA de 21 a 24 nucleótidos de longitud que están codificados por genes nucleares que se expresan a través de transcritos con el potencial de formar estructuras apareadas estables. Los mirnas son elementos claves de control genético en organismos tan distanciaautonomous genomic units through precursor transcripts with the potential to form self-complementary fold-back structures. They are regulatory elements involved in a wide variety of processes related to gene down-regulation during cell growth and development in eukaryotes. As negative regulators, they act on their target mrnas to trigger either mrna cleavage or inhibition of protein synthesis. Plant mirnas generally interact with internal regions of target mrnas through perfect or near perfect 74

86 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology dos evolutivamente como plantas y mamíferos y están implicados en diversos procesos de vigilancia génica durante el crecimiento celular y el desarrollo en eucariotas. Los mirnas son capaces de dirigir el reconocimiento de sus RNA mensajeros diana e inducir su procesamiento o inhibir su traducción. Los mirna de las plantas generalmente interaccionan con la región de secuencia complementaria de los RNA mensajeros diana provocando un corte específico en dicha región. El papel como reguladores génicos de los mirna tiene importantes repercusiones en el crecimiento y desarrollo normal de las plantas. Mutaciones que provocan la pérdida de función de genes relacionados con el metabolismo de los mirnas conducen a la aparición de importantes deficiencias y anormalidades en el desarrollo de los órganos vegetativos, reproductores y embrionarios en Arabidopsis. Algunos mirnas se acumulan preferentemente en determinados estados del desarrollo y en ciertos tipos de tejidos o células. Pero la implicación más directa del papel de los mirnas en el desarrollo es el hecho de que controlan la expresión de diversas familias génicas que codifican factores transcripcionales relacionados con importantes eventos del desarrollo en plantas. Nuestro interés principal se centra en el estudio del papel y la relevancia biológica de los mirnas como elementos reguladores durante las infecciones virales en las plantas. El reciente descubrimiento de que diversos virus pertenecientes a distintas familias de virus RNA son capaces de modular la expresión de los genes de la planta huésped al interferir con los procesos de regulación génica dirigidos por mirna hace sospechar una importante relación entre la actividad de los mirna y el curso de la infección viral. Es factible pensar que los virus impidan deliberadamente la función reguladora de los mirnas y ajusten el patrón de expresión génica del huésped de modo que se facilite el desarrollo de la infección sistémica. La pregunta que surge de esta hipótesis es si la interferencia viral sobre la actividad de los mirna afecta a otros genes diana y no exclusivamente a aquellos relacionados con el desarrollo de la planta. En este sentido, nos interesa particularmente conocer otros genes diana controlados por mirnas con funciones como factores de susceptibilidad que favorezcan el establecimiento de la infección. Nuestro grupo está además interesado en estudiar el posible papel de los mirnas como anticuerpos naturales frente a parásitos celulares. Las plantas podrían utilizar sus mirnas no soló para regular la expresión de sus propios genes sino también para base-pairing to trigger mrna cleavage within the region of complementarity. mirna regulatory activity in plants has immediate implications in normal growth and development. This is true because i) loss-of-function mutations in several mirnarelated genes such as ago1, hen1, hyl1 and dcl1 lead to a range of developmental abnormalities in vegetative, reproductive and embryonic tissues in Arabidopsis, ii) some mirnas appear to accumulate at specific developmental stages and in certain tissues or cell types, iii) mirna negatively regulates the expression of RNA targets that encode transcription factor families controlling important events in Arabidopsis development. Our major interest focuses toward the study of the role and functional significance of mirnas as regulatory elements during virus infections in plants using a functional genomic approach. The linking between mirna activity and virus infection has been well substantiated by the fact that members of several families of plant RNA viruses are able to modulate gene expression of the host cell by interfering with mirna-guided cleavage of multiple regulatory targets in plants. It is imaginable that viruses deliberately impede mirna regulatory function and therefore adjust the normal pattern of gene expression in a way that ultimately facilitates systemic infection. The question that arises from this hypothesis is whether mirna-suppression activity only targets mrnas implicated in controlling development in plants. Conversely, virus activity might be expanded to a more diverse pool of mrnas with distinct functions in cell metabolism including susceptibility factors that eventually enable systemic infection of the host plant. Additionally, our group is particularly interested in studying the putative role of mirnas as natural antobodies against allien genomes such as cellular parasites. By using mirna-related processes plant might be able to silence genes of the pathogen and limit the extent of virus infection. We have found a number of plant mirna sequences complementary with a variety of plant virus genomes. We are currently investigating the expression pattern of these mirnas and the biological significance and fucntionality of mirna:target recognition in the frame of compatible and incompatible interactions between plants and viruses. 75

87 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology Figura 2.- Estructura tridimensional de los agregados de la proteína HC-Pro de TEV. Se muestran dos vistas de cada uno de los tres volúmenes (A, B y C) reconstruidos a partir de imágenes de microscopía electrónica mediante tinción negativa de muestras de HC-Pro purificado, junto a una colección de pares de imágenes (paneles de la derecha) correspondientes a las proyecciones de los volúmenes finales (líneas superiores) y a las medias de las imágenes seleccionadas (líneas inferiores). Se incluyen vistas de los posibles dímeros (A), tetrámeros (B) y hexámeros (C). El panel inferior (D) muestra una representación esquemática de las interacciones necesarias entre dos monómeros (dibujado como una forma alargada con dominios estructurales diferentes en cada extremo) en orientación antiparalela para formar un dímero, y del modelo propuesto de formación de tetrámeros y hexámeros a partir de las uniones de dímeros. Figure 2.- Three-dimensional structure of TEV HC-Pro protein aggregates. Two views of the three volumes (A, B, and C) were reconstructed from electron microscopy images of negatively stained samples of purified HC-Pro, besides a collection of pairs of images (right panels) corresponding to projections of the final volumes (upper row) and to the average of selected images (lower row). Views of putative dimer (A), tetramer (B) and hexamer (C) are shown. Schematic representation (D) of the interactions required between two monomers (symbolized by an elongated shape with different structural domains at each end) in anti-parallel orientation to form a dimer, and the proposed model of formation of tetramers and hexamers from dimers as building blocks. silenciar genes del patógeno y limitar así la extensión de la infección. En nuestro laboratorio hemos encontrado un buen número de secuencias de mirnas con un alto grado de complementariedad de bases con diversos genomas virales. Estamos actualmente investigando los patrones de expresión de estos mirnas y el significado biológico de la interacción funcional entre los mirnas de la planta y los genomas virales en el marco de las interacciones compatibles y de defensa entre las plantas y los virus. Mechanisms of insect transmission and control of plant viruses Most plant viruses spread in nature with the help of vector organisms, mainly phytophagous insects. For several years our laboratory has been dedicated to improve the knowledge of the transmission process, with the final purpose of developping efficient viral control systems, a need in the present situation. The strategy that we propose is based on the possibility to interfere during virus transmission, and thus to avoid the inadequate use of pesticides, which nowadays is considered environmentally undesirable. 76

88 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology Mecanismos de transmisión por insectos vectores y control de virus de plantas La difusión en la naturaleza de la mayor parte de virus vegetales es dependiente de organismos vectores, entre los que destacan los insectos fitófagos. Desde hace años, una de las principales líneas de trabajo de nuestro laboratorio se ha dedicado a mejorar el conocimiento de los mecanismos de transmisión, con el objetivo final de atender a la creciente demanda de sistemas de control de virosis que resulten eficaces. La estrategia que proponemos se basa en la posibilidad de interferir en el proceso de transmisión, evitando de esa forma el uso inadecuado de los tratamientos insecticidas, una práctica que hoy en día se considera medioambientalmente inaceptable. Investigaciones previas sobre la transmisión de potyvirus por pulgones han permitido demostrar la intervención de dos productos de origen viral durante el proceso: la proteína de la capsida (CP), y el factor de transmisión o componente ayudante, conocido como HC-Pro ya que también presenta actividad proteolítica. De hecho el factor HC-Pro es una proteína multifuncional que interviene en la mayoría de los procesos esenciales durante el ciclo viral, y recientemente se ha demostrado además su capacidad de alterar procesos celulares mediados por pequeños RNAs, interfiriendo de esa forma con mecanismos de defensa endógenos de las plantas. El papel en transmisión del HC-Pro se ha tratado de explicar mediante la hipótesis denominada de puente. Esta hipótesis supone que la proteína sirve de puente de unión transitorio en la retención de las partículas virales en el aparato bucal del pulgón, permitiendo su liberación posterior para dar lugar a la inoculación del virus en otra planta. Nuestro laboratorio está llevando a cabo un análisis en profundidad de la proteína HC-Pro, atendiendo principalmente a su función durante el proceso de transmisión, incluyendo en el estudio sus propiedades estructurales y de agregación. En colaboración con grupos del Departamento de Estructura y Función de Proteínas ha sido posible la caracterización estructural de agregados (homodímeros, tetrámeros y hexámeros) en preparaciones purificadas del HC-Pro de TEV. A partir de estos datos estructurales, se abre por primera vez la posibilidad de correlacionar la estructura del componente HC-Pro con su función, ya que las preparaciones utilizadas pueden ser analizadas en bioensayos de transmisión. Previous studies on potyvirus aphid transmission demonstrated the involvement during the process of two viral products: the coat protein (CP) that forms virus particles, and an accessory transmission factor or helper component, denominated HC-Pro due to its proteolytic activity. In fact, the HC-Pro is a multifunctional protein involved in most of the essential processes during the virus life cycle, and recently it was shown that it can act as a suppressor of gene silencing, interfering with endogenous plant defence mechanisms. Regarding the role of HC-Pro during transmission, it was described through the bridge hypothesis, a theory claiming that HC-Pro serves to transiently bind the virus particles to the aphid mouthparts, and later allowing their release during inoculation of another plant. Our laboratory is preforming an in depth analysis of the HC-Pro protein, centered on its activity during transmission, and including examination of its structure and aggregation properties. In collaboration with groups of the Departamento de Estructura y Función de Proteínas, it has been possible the structural characterization of TEV HC-Pro aggregates (homodimers, tetramers and hexamers) present in purified preparations. This information could be used for the first time to correlate structure and function of HC-Pro, and indeed our preparations can be used in transmission bioassays. Different heterologous expression systems are being used to analyze the HC-Pro protein independently of the virus infection, allowing to perform mutational studies on transmission, as well as on other functions of the protein. Other lines of research include less known aspects of the transmission process, such as the identification of putative retention sites inside the insect, which should be able to interact with HC-Pro. A proteomic approach is being pursued to select candidate products in aphid extracts and characterize them. Finally, our results would be generalized to other viruses in the Potyviridae family, including CVYV, an ipomovirus for which it is not known if a helper factor is acting during whitefly transmission, to design HC-Pro variants with the power to interfere in transmission, and to evaluate their use in virus control strategies. 77

89 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology Para facilitar el análisis de la proteína HC-Pro se han desarrollado sistemas de expresión independientes de las infecciones virales, con el objetivo de realizar mutaciones y estudiar sus efectos sobre la función de transmisión, así como en otras de las actividades descritas para esta proteína. Otras líneas de trabajo incluyen facetas poco conocidas del proceso de transmisión, como por ejemplo la identificación de los posibles lugares de retención de virus en el insecto vector, y que de acuerdo con la hipótesis de puente deberían interaccionar con la proteína HC-Pro. Se está llevando a cabo un abordaje proteómico para seleccionar productos candidatos en extractos obtenidos de pulgones vectores y proceder a su caracterización. Por último, se buscará la generalización de los resultados obtenidos a diferentes virus de la familia Potyviridae, incluyendo el ipomovirus CVYV, para el que se desconoce hasta el momento la posible implicación de sus productos génicos en la transmisión por mosca blanca, y se ignora si precisan también un factor ayudante durante el proceso, para el diseño de variantes de la proteína HC-Pro con capacidad de interferencia en los procesos de transmisión, y la evaluación de su aplicación en estrategias de control de virus. Organismos Financiadores/Funding Agencies PN I+D, BIO ( ) PN I+D, AGL ( ) CAM, 07G/0043/2003 (2003) CMA, 07M/0072/2002 ( ) PN I+D, BIO ( ) CICYT, GEN C02-01/ NTER ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Virginia Ruiz Ferrer. Estudio de las propiedades estructurales de proteínas virales implicadas en la transmisión de potyvirus por pulgones. Universidad Complutense de Madrid, Directores: D. López Abella y J.J. López-Moya. 78

90 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Kasschau, K.D., Xie, Z., Allen, E., Llave, C., Chapman, E.J., Krizan, K.A., and Carrington, J.C. (2003). P1/HC-Pro, a viral suppressor of RNA silencing, interferes with Arabidopsis development and mirna function. Devel. Cell 4, Tenllado, F., Barajas, D., Vargas, M., Atencio, F.A., González-Jara, P., and Díaz-Ruíz, J.R. (2003). Transient expression of homologous hairpin RNA causes interference with plant virus infection and is overcome by a virus encoded suppressor of gene silencing. Mol. Plant-Microbe Inter. 16, Tenllado, F., Martínez-García, B., Vargas, M., and Díaz-Ruíz, J.R. (2003). Crude extracts of bacterially expressed dsrna can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 3, 3. González-Jara, P., Tenllado, F., Martínez-García, B., Atencio, F.A., Barajas, D., Vargas, M., Díaz-Ruiz, J., and Díaz-Ruíz, J.R. (2004). Host-dependent differences during synergistic infection by Potyviruses with potato virus X. Mol. Plant Pathol. 5, Barajas, D., Tenllado, F., González-Jara, P., Martínez-García, B., Atencio, F.A., and Díaz-Ruíz, J.R. (2004). Resistance to Plum pox virus (PPV) in Nicotiana benthamiana plants transformed with the PPV HC-Pro silencing suppressor gene. J. Plant Pathol. 86, Llave, C. (2004). MicroRNAs: more than a role in plant development? Mol. Plant Pathol. 5, Martínez-García, B., Marco, C.F., Goytia, E., López-Abella, D., Serra, M.T., Aranda, M.A., and López-Moya, J.J. (2004). Development and use of detection methods specific for Cucumber vein yellowing virus (CVYV). European J. Plant Pathol. 110, Ruíz Ferrer, V., Goytia, E., López-Abella, D., and López-Moya, J.J. (2004). Expresión of functionally active helper component protein of Tobacco etch potyvirus in the yeast Pichia pastoris. J. Gen. Virol. 85, Tenllado, F., Llave, C., and Díaz-Ruíz, J.R. (2004). RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants. Virus Res. 102, Contribuciones a Libros/Contributions to Books Carrington, J.C., Kasschau, K.D., Lellis, A.D., Llave, C., Johansen, L.K., and Xie, Z. (2003). Host compatibility functions during virus infection. En: Biology of Plant-Microbe Interactions Vol. 3. ISPMB, S.A. Leong, C. Allen, and E.W. Triplett Eds. St. Paul. USA. pp Llave, C., Tenllado, F., and Díaz-Ruíz, J.R. (2004). RNA silencing and other small RNA-related processes as innovative molecular tools for control of virus diseases in plants. In: Emerging Concepts in Plant Health Management. R.T. Lartely and A. Caesar Eds. (Sign Post Research) pp Artículos de Divulgación/Press Articles Llave, C. (2003). Micro-RNAs como reguladores génicos en plantas. Biopress 7, Mayo. Llave, C. (2004). Micro-ARN. Investigación y Ciencia, 7,

91 Virología Molecular de Plantas / Plant Molecular Virology Próximos Artículos/Forthcoming Articles González-Jara, P., Atencio, F.A., Martínez-García, B., Barajas, D., Tenllado, F., and Díaz-Ruíz, J.R. (2005). A single aminoacid mutation in the Plum pox virus HC-Pro gene abolishes both synergistic and RNA silencing suppression activities. Phytopathology, (en prensa/in press). Ruiz-Ferrer, V., Boskovic, J., Alfonso, C., Rivas. G., Llorca, O., López-Abella, D., and López-Moya, J.J. (2005). Structural análisis of Tobacco Etch Potyvirus HC-Pro oligomers involved in aphids transmission. J. Virol. (en presa/in press). Patentes/Patents Tenllado, F., and Díaz-Ruíz, J.R. (2004). Un método para interferir con la infección de virus en plantas. Número de solicitud Nacional: , Número de solicitud Internacional: PCT/ES02/ Licencia de Patente 2004 CSIC-Bio-Oz Biotechnologies Ltd. 80

92 Interacciones Planta-Insecto Insect-Plant Interactions PEDRO CASTAÑERA DOMÍNGUEZ Jefe de Grupo / Group Leader FÉLIX ORTEGO ALONSO PEDRO HERNÁNDEZ CRESPO (Desde X-2003) Investigadores de Carrera / Staff Scientists GEMA PÉREZ FARINÓS ISMAEL SÁNCHEZ RAMOS Investigadores Contratados / Contract Scientists FERNANDO ÁLVAREZ ALFAGEME CRISTINA CABALLERO GARCÍA (Hasta IX-2004) Mª MERCEDES DÍAZ MENDOZA CRISTINA MAGAÑA DE LARRIVA MARTA DE LA POZA GÓMEZ LOÏC REVUELTA LUIS (Desde VI-2004) B. Predoctorales / Graduate Students SARA PASCUAL RUIZ (Desde X-2004) Estudiante / Student Mª LUISA RUIZ SERRA BEATRIZ BEROIZ RAMÍREZ (Desde IX-2003) ÁNGEL LUIS GARVÍA RODRÍGUEZ (Desde XI-2004) Mª TERESA MOÑIVAS RAMOS CAROLINA NAVAS JIMÉNEZ (Desde XI-2004) Personal Técnico / Technicians Figura 1.- El chinche depredador, Podisus maculiventris (Hemíptera: Pentatomidae), alimentándose de una larva de Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). Figure 1.- The predatory bug, Podisus maculiventris (Hemíptera: Pentatomidae), attacking a larva of Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae). 81

93 Interacciones Planta-Insecto / Insect-Plant Interactions Palabras clave: Terpenoides, Inhibidores de proteasas, Ácaro del queso, Maíz-Bt, Taladro del maíz, Mosca Mediterránea de la fruta, dsarn. El trabajo del grupo está orientado al desarrollo de métodos de control respetuosos con el medio ambiente y que prevengan o minimicen las pérdidas causadas por plagas agrícolas y de productos almacenados. La actividad principal se centra en estudios del efecto de terpenoides naturales o hemisintéticos y de proteínas insecticidas contra plagas. Asimismo, se estudian los impactos potenciales derivados de la utilización de plantas transgénicas. Desarrollo de estrategias para el control de plagas La abundancia en plantas de metabolitos secundarios de las más variadas estructuras con actividad insecticida ofrece excelentes perspectivas para su extracción, identificación estructural y evaluación como plaguicidas. Nuestros estudios se han centrado en determinar la actividad antialimentaria de tres grupos de terpenoides (diterpenos neo-clerodánicos, sesquiterpenos y limonoides) naturales y hemisintéticos frente a dos especies modelo: un coleóptero oligófago, el escarabajo de la patata, Leptinotarsa decemlineata, y un lepidóptero polífago, la gardama, Spodoptera exigua. Uno de los objetivos prioritarios es dilucidar la relación estructura química-actividad biológica para facilitar el diseño de moléculas activas más simples, ampliando así su potencialidad como insecticidas biorracionales. El objetivo de otro de nuestros proyectos, ligado al sector lácteo, es facilitar un sistema de control de una especie de ácaros, Acarus farris, que produce pérdidas significativas en al queso Asturiano de Cabrales. La ausencia de acaricidas comerciales autorizados hace especialmente relevante el desarrollo de estrategias preventivas y de control. Se ha determinado el potencial de tres modelos fenológicos para predecir la dinámica poblacional de esta especie de ácaro. Asimismo, se han ensayado métodos de control preventivos (barreras físicas y esterilización de contenedores) y físicos (combinaciones de temperatura y humedad relativa) que impiden o limitan las infestaciones de los quesos. Por otra parte, se ha evaluado la actividad de monoterpenos naturales e inhibidores de proteasas digestivas de ácaros, que han mostrado alta actividad acaricida por inhalación, contacto o ingestión, contra especies de ácaros de productos alimenticios. Keywords: Terpenoids, Protease inhibitors, Bt-maize, Corn borer, Cheese mite, Bt-maize. Mediterranean fruit fly, dsrna Our work is focused on the development of environmentally safe control strategies that will prevent or minimize the losses caused by agricultural and stored product pests. Specifically, we are investigating the effects of natural and semisynthetic terpenoids and insecticidal proteins on pests. Additionally, we are assessing the potential environmental impacts of transgenic plants. Development of pest control strategies The abundance and variety of plant secondary metabolites with insecticidal activity offers excellent prospects for their extraction, identification and evaluation as pesticides. We have studied the antialimentary activity of three groups of naturally occurring terpenoids (neo-clerodane diterpenoids, sesquiterpenoids and limonoids) and semisynthetic derivatives on two model species: an oligophagous coleopteran, the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata, and a polyphagous lepidopteran, the beet armyworm, Spodoptera exigua. Our aim is to establish the structure-activity relationship that will allow the design of more active and selective molecules, with potential as biorrational insecticides. The objective of other of our projects, linked to the cheese sector, is the development of a control strategy for the mite, Acarus farris, that is causing serious problems in the production of the traditional cheese Cabrales. The lack of approved acaricidas in cheese makes specially relevant the development of control strategies. We have determined the potential of three phenological models for predicting mite development. Moreover, we have tested preventive (physical barrier, and the sterilization of containers) and physical (combinations of temperature and relative humidity) control methods that reduce cheese infestations. Additionally, we have evaluated the activity of monoterpenes derived from essential oils of plants and digestive protease inhibitors, which have shown high miticidal activity both by contact or ingestion, against some mite pests. The Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, has a serious negative economic impact on citrus crops in Spain due to direct damage to fruits and to quarantine restrictions. Current control practices are mainly based on field monitoring and aerial and 82

94 Interacciones Planta-Insecto / Insect-Plant Interactions La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata, es responsable de serios problemas socio-económicos en la citricultura española debido a las pérdidas de rendimiento y a las pérdidas derivadas de la imposición de periodos de cuarentena por parte de países importadores de cítricos. El control de esta plaga se basa en la monitorización de las poblaciones de campo y en tratamientos aéreos y terrestres mediante insecticidas organofosforados, especialmente malatión. El objetivo de nuestro grupo es determinar la susceptibilidad de poblaciones españolas de C. capitata al insecticida malatión, así como dilucidar la variabilidad genética de las poblaciones españolas y el flujo génico entre ellas. Estos estudios pretenden sentar las bases para el desarrollo de técnicas bioquímicas o moleculares de detección precoz de la resistencia que permitan orientar la decisión de tratamiento en campo y la selección del insecticida más apropiado. Recientemente, hemos iniciado estudios con ARN de interferencia para el desarrollo de nuevos bioplaguicidas basados en silenciamiento génico. Se pretende desarrollar una nueva estrategia para el control de plagas en cultivos de interés agrícola basada en el silenciamiento específico de genes diana que participen en procesos biológicos esenciales en insectos, tales como transmisión del impulso nervioso, digestión y control hormonal del desarrollo. Nuestro objetivo es inducir silenciamiento génico mediante la ingestión por el insecto de moléculas de ARN bicatenario homólogo a los genes diana, bien pulverizados sobre plantas o bien expresados mediante transformación genética. Evaluación de proteínas insecticidas La expresión en plantas de proteínas insecticidas, tanto de origen vegetal como bacteriano, abre nuevas vías en el control de plagas. Para que esta estrategia pueda ser utilizada, es necesario un conocimiento detallado a nivel bioquímico y fisiológico del proceso digestivo de la plaga a combatir, así como de su interacción con las proteínas insecticidas objeto de estudio. En este contexto, hemos caracterizado las enzimas proteolíticas de varias plagas de importancia económica, y hemos analizado el efecto de la sobre-expresión en plantas de inhibidores de proteasas en insectos. Además, hemos realizado estudios de laboratorio para determinar la especificidad de estas proteínas y obtener información acerca del impacto de estos inhibidores sobre artrópodos no diana. terrestrial treatments with organophosphate insecticides, specially malathion. The objectives of the ongoing research are to establish the susceptibility of Spanish field populations of C. capitata to malathion, and the characterization of genetically different populations and the gene flow between them. The aim of this study is to establish the basis for the development of biochemical or molecular techniques for early detection of insecticide resistance that may allow oriented decisions in field treatments and the selection of the most useful insecticides. Recently, we have initiated studies with interference RNA for the development of new biopesticides based on gene silencing. We intend to develop a new molecular strategy for the control of agricultural pests based on the selective silencing of genes implicated in fundamental biological processes in insects, such as nerve impulse conduction, digestion, and hormonal control of development. The induction of the gene silencing phenomena will be attempted by the ingestion of double-stranded RNA derived from insect target genes, applied on plants by fumigation or expressed in transgenic plants. Evaluation of insecticidal proteins The development of insect-resistant transgenic plants open new ways for pest control. Most of the insecticidal proteins expressed in plants are from bacterial or plant origin and target the digestive system of insects. However, it is necessary to gain a comprehensive knowledge of the digestive process of a particular species and on how they interact with the appropriate inhibitors, before this approach can be adopted. We have characterized the digestive proteases of several important pests in Spain, and examined the effect of the over-expression in plants of protease inhibitors on insects. In additon, we have performed laboratory studies to determine the specificity of these proteins and to asses their potential impact on natural enemies. The naturally occuring bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) produces a variety of toxins with specificity for insects. Genetically engineered maize plants expressing an insecticidal protein from B. thuringiensis (Bt-maize) is commercially grown in Spain since 1998 and provides an effective control of two key lepidopteran pests in the Mediterranean area, the corn borers, Sesamia nonagrioides, and Ostrinia nubilalis. An environmental monitoring programme sponsored by the Spanish Ministry of Environment and the Consejo Superior de Investigaciones 83

95 Interacciones Planta-Insecto / Insect-Plant Interactions La bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) ha sido la fuente por excelencia de toxinas específicas para insectos, que expresadas en la planta de maíz ha dado lugar a lo que se conoce genéricamente como maíz Bt. En el año 1998 se inició la comercialización en España de maíz Bt, que controla de forma efectiva dos plagas claves del maíz en el área Mediterránea, los taladros Sesamia nonagrioides y Ostrinia nubilalis. Ese mismo año, se estableció un convenio de colaboración entre el Ministerio de Medio Ambiente y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) para evaluar los potenciales riesgos ecológicos derivados del cultivo del maíz Bt en España. Los objetivos principales son la detección temprana de la génesis de resistencia en poblaciones de taladros y la evaluación del impacto potencial del cultivo a gran escala del maíz Bt sobre artrópodos depredadores. Los cambios en la susceptibilidad a la toxina se han evaluado mediante el muestreo anual de poblaciones de ambas especies de taladro en campos de maíz transgénico localizados en las principales zonas maiceras. Hasta la fecha no se ha observado un aumento significativo de la tolerancia a la toxina Cry1Ab en ninguna de las zonas muestreadas. Por otra parte, se está procediendo a determinar la variabilidad genética de las poblaciones españolas de S. nonagrioides, así como la frecuencia de alelos de resistencia en esta especie. Desde el año 2000, se ha procedido a la evaluación, en parcelas comerciales, de la diversidad y abundancia de los depredadores asociados al cultivo del maíz Bt en España. Los ensayos en curso, en condiciones de campo y laboratorio, pretenden establecer el nivel de riesgo (directo o indirecto a través de las presas) al que están sometidos los depredadores más representativos. Científicas (CSIC) has been operating for the last six years to monitor the potential ecological risks of Bt-maize cultivation in Spain. The main objectives of this programme being: a) the implementation of an effective resistance monitoring program capable of early detection of corn borers resistance; and b) the assessment of the potential impact of Bt-maize cultivation on non-target arthropods. Changes in susceptibility have been examined by annual monitoring of both species on Bt maize fields located in the most important maize growing areas. So far, no consistent shifts in tolerance to the Cry1Ab toxin have been observed. Moreover, we are studying the genetic variability of Spanish populations of S. nonagrioides, and estimating the initial frequency of resistance alleles in in this species. Experiments in commercial fields were initiated in 2000 to assess the diversity and abundance of beneficial arthropods on Bt maize. Ongoing field and laboratory experiments will allow to establish the level of risk (directly or indirectly via their prey) imposed by Bt-maize on the most representative predators. 84

96 Interacciones Planta-Insecto / Insect-Plant Interactions Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, AGL C02-01 ( ) PETRI, PTR OP ( ) INIA, RTA C3-2 ( ) EU, QLK3-CT ( ) CAM, 07M/0051/2002 ( ) INIA, RTA C6-2 ( ) CICYT, BIO ( ) Plataforma Empresarial de Empresas Productoras de Maíz-Bt en España ( ) Pioneer Hi-Bred International INC. y Agrigenetics INC. D/B/A Mycogen Seeds ( ) MMA, ( ) EU, FP ( ) CICYT, AGL ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Cristina Caballero García. Efectos de terpenoides naturales y hemisintéticos sobre Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae) y Spodoptera exigua (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae). Universidad Complutense de Madrid, Directores: P. Castañera Domínguez y F. Ortego Alonso. Marta de la Poza. Maíz Bt: seguimiento de la resistencia de Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) y Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) y efectos en artrópodos depredadores. Universidad Politécnica de Madrid, Director: P. Castañera Domínguez. Arturo Huerta de la Peña. Compatibilidad de la lucha química y biológica. Evaluación en laboratorio de modernos insecticidas que ofrecen interés para su uso en sistemas productivos sostenilbles en el depredador cosmopolita Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera: Chrysopidae). Universidad Politécnica de Madrid, Co-director: P. Castañera Domínguez. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Alfonso-Rubí, J., Ortego, F., Castañera, P., Carbonero, P., and Díaz, I. (2003). Transgenic expression of trypsin inhibitor CMe from barley in indica and japonica rice, confers resistance to the rice weevil Sitophilus oryzae. Trans. Res. 12, Hernández, C.A., Pujol, M., Alfonso-Rubí, J., Armas, R., Coll, Y., Pérez, M., González, A., Ruiz, M., Castañera, P., and Ortego, F. (2003). Characterization of digestive endoproteases from the rice water weevil, Lissorhoptrus brevirostris Suffrian (Coleoptera: Curculionidae). Arch. Insect Biochem. Physiol. 53,

97 Interacciones Planta-Insecto / Insect-Plant Interactions Rodríguez, B., Caballero, C., Ortego, F., and Castañera, P. (2003). A new tetranortriterpenoid from Trichilia havanensis. J. Nat. Prod. 66, Sánchez-Ramos, I., and Castañera, P. (2003). Laboratory evaluation of selective pesticides against the storage mite Tyrophagus putrescentiae (Acari: Acaridae). J. Med. Entomol. 40, Farinós, G.P., De la Poza, M., Hernández-Crespo, P., Ortego, F., and Castañera, P. (2004). Resistance monitoring of field populations of the corn borers Sesamia nonagrioides and Ostrinia nubilalis after five years of Bt maize cultivation in Spain. Ent. Exp. Appl. 110, Sánchez-Ramos, I., Hernández, C.A., Castañera, P., and Ortego, F. (2004) Proteolytic activities in body and faecal extracts of the storage mite, Acarus farris. Med. Vet. Entomol. 18, Artículos de divulgación/press Articles Castañera, P. (2003). Plantas transgénicas en el control de insectos. Phytoma-España 152, Huerta, A., Medina, P., Castañera, P., and Viñuela, E. (2003). Residual effects of some modern pesticides on Chrysoperla carnea (Stephens) adults under laboratory conditions. IOBC wprs Bull. 26, Castañera, P., Ortego, F., Pérez-Farinos, G., Hernández-Crespo, P., and de la Poza, M. (2004). Métodos de evaluación de los efectos potenciales del cultivo del maíz transgénico en insectos diana y en artropodos depredadores. Phytoma 164, Farinós, G.P., de La Poza, M., González-Núñez, M., Hernández-Crespo, P., Ortego, F. and Castañera, P. (2004). Research programme to monitor corn borers resistance to Bt-maize in Spain. OILB/wprs Bulletin 27, Castañera, P. (2004). Nuevas Técnicas en el control de plagas. Horticultura, Extra 04 Sanidad Vegetal, Urbaneja, A., Dembilio, O., Tortosa, D., Castañera, P., and Viñuela, E. (2004). Efectos secundarios de tratamientos cebo usados para el control de Ceratitis capitata, sobre fauna útil. Phytoma-España 160, Próximos Artículos/Forthcoming Articles De la Poza, M., Pons, X., Farinós, G.P., López, C., Ortego, F., Eizaguirre, M., Castañera, P., and Albajes, R. (2005). Impact of farm-scale Bt maize on abundance of predatory arthropods in Spain. Crop Protection (en prensa/in press). Sánchez-Ramos, I., and Castañera, P. (2005). Effect of temperature on reproductive parameters and longevity of Tyrophagus putrescentiae (Acari: Acaridae). Experimental and Applied Acarology. (en prensa/in press). 86

98 Departamento de Estructura y Función de Proteínas Department of Protein, Structure and Function Jefe de Departamento Department Head Profesores de Investigación Investigadores Científicos Científicos Titulares Personal Técnico Secretaria PEDRO J. APARICIO ALONSO (Desde XI-2004) GERMÁN RIVAS CABALLERO (Desde VI-2003/Hasta X-2004) PALOMA LÓPEZ GARCÍA (Hasta V-2003) J. MANUEL ANDREU MORALES PEDRO J. APARICIO ALONSO MANUEL ESPINOSA PADRÓN GUILLERMO GIMÉNEZ-GALLEGO JESÚS JIMÉNEZ BARBERO SANTIAGO LAMAS PELÁEZ VICENTE LARRAGA RODRÍGUEZ DE VERA JUAN M. RAMÍREZ DE VERGER LOBO JAVIER CAÑADA VICINAY PALOMA LÓPEZ GARCÍA EDUARDO RIAL ZUECO ANTONIO ROMERO GARRIDO MARÍA COLMENARES BRUNET GLORIA DEL SOLAR DONGIL JOSÉ F. DÍAZ PEREIRA Mª ROSA LOZANO PUERTO OSCAR LLORCA BLANCO Mª DOLORES PÉREZ-SALA GOZALO LUIS I. RIVAS LÓPEZ MARÍA TERESA ALDA LÓPEZ Mª JESÚS CARRASCO SOTO Mª ÁNGELES CORRALES GONZÁLEZ CONCEPCIÓN FERNÁNDEZ-CABRERA BAZÁN MERCEDES JIMÉNEZ SARMIENTO LUCAS OYA TARDÍO PILAR ZARAGOZA JIMÉNEZ MERCEDES ZAZO GUÍO CARMEN PARTEARROYO LACABA

99 Fisiopatología Molecular de la Pared Vascular Molecular Pathophisiology of the Vascular Wall SANTIAGO LAMAS PELÁEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist MARÍA MONSALVE PÉREZ Investigadora contratada Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist ANTONIO MARTÍNEZ RUIZ FERNANDO RODRÍGUEZ PASCUAL CARLOS ZARAGOZA SÁNCHEZ Investigadores Contratados / Contract Scientists SARA BORNIQUEL GISBERT (Desde XI-2003) CRISTINA CASTAÑARES (Desde XII-2003) EVA M. CERNUDA MOROLLÓN (Hasta IX-2003) CECILIA GONZÁLEZ DE ORDUÑA (Desde I-2004) TANIA RODRÍGUEZ LIZARBE (Desde X-2003) ESTHER LÓPEZ RIVERA FRANCISCO M. REIMUNDE LÓPEZ (Desde II 2003 ) INMACULADA VALLE ASENCIO LAURA VILLANUEVA Becarios Predoctorales / Graduate Students MARIA JESÚS CARRASCO SOTO (Hasta IX-2003) Mª ÁNGELES HIGUERAS (Desde VI-2004) MARIANO REDONDO HORCAJO ESTRELLA SORIA LÓPEZ Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Endotelio, Óxido nítrico, Endotelina-1, Metaloproteasas, Estrés oxidativo, PGC-1, S-nitrosilación Nuestro laboratorio está orientado a comprender los mecanismos moleculares, bioquímicos y celulares que subyacen a la fisiopatología de la pared vascular. En estados patológicos tan prevalentes como la arteriosclerosis, la hipertensión o las complicaciones vasculares de la diabetes es posible encontrar un nexo fisiopatológico común: la disfunción endotelial. Este fenómeno se manifiesta como una inadecuada capacidad del endotelio para promover la relajación vascular o la inhibición de la agregación plaquetaria. La alteración en el balance de factores vasoconstrictores y relajantes junto al estrés oxidativo y nitrosativo es uno de los mecanismos centrales de disfunción endotelial. Dada la importancia del óxido nítrico (NO) y la endotelina1 (ET1) como moléculas capaces de regular el tono vascular hemos profundizado en su papel en modelos de células endoteliales en cultivo. En particular, hemos obtenido resultados consistentes con un papel del NO en la migración de células endoteliales a través de dianas específicas como la colagenasa 3 (MMP-13). La relación entre NO y metaloproteasas trasciende probablemente al endotelio ya que en tejido óseo es capaz de regular la osteogénesis. También hemos estudiado los Keywords: Endothelium, Nitric oxide, Endothelin-1, Metalloproteinases, Oxidative stress, PGC-1, S-nitrosylation. Our laboratory is directed at gaining understanding of the molecular, biochemical, and cellular mechanisms that underlie the pathology of the vascular wall. A shared pathophysiological connection can be detected among prevalent pathological states such as arteriosclerosis, hypertension, and vascular complications associated with diabetes: endothelial dysfunction. This phenomenon presents as an impaired endothelial capacity to promote vascular relaxation and inhibit platelet aggregation. Disturbances in the balance of vasoconstrictive and relaxant factors plus oxidative and nitrosative stress together form one of the central mechanisms of endothelial dysfunction. Given the importance of nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1) as molecular regulators of vascular tone, we have made an in-depth investigation of their role in cell culture models of endothelium. We have obtained results consistent with a role for NO in the migration of endothelial cells towards specific targets such as collagenase 3 (MMP-13). The interaction between NO and metalloproteases, can be probably extended to other instances such as the regulation of osteogenesis in bone, a field on which we are also working actively. We have also dissected the mecha- 88

100 Fisiopatología Molecular de la Pared Vascular / Molecular Pathophisiology of the Vascular Wall mecanismos por los que actúa el factor de transformación del crecimiento-beta (TGF-β) como regulador transcripcional por excelencia de la síntesis de ET-1 endotelial, y estamos desarrollando modelos de animales transgénicos para corroborar estos resultados in vivo. Además estamos interesados en conocer la ruta de señalización precisa de TGF-β para ET-1 en el endotelio vascular. Las especies reactivas derivadas del oxígeno (ROS) son una fuente bien establecida de daño celular endotelial. Hemos comprobado que el coactivador transcripcional PGC-1 es capaz de favorecer respuestas protectoras a través del aumento de la expresión de proteínas antioxidantes y actualmente estamos estudiando la relación entre el NO y PGC-1 in vivo y en animales transgénicos deficientes en óxido nítrico sintasa endotelial (enos). Aunque el efector fisiológico por excelencia del NO es la guanilato ciclasa soluble, recientemente ha cobrado importancia la capacidad de este radical para modificar la función proteica mediante modificaciones postraduccionales. Entre ellas, la S-nitrosilación de cisteínas y la nitración de tirosinas parecen revelarse como mecanismos bioquímicos de estrés nitrosativo y, en el caso de la S-nitrosilación, se ha propuesto que puede representar un nuevo paradigma de transducción de señales. Por ello hemos identificado en células endoteliales mediante abordajes proteómicos un conjunto de proteínas que sufren S-nitrosilación. En el momento actual estamos intentando conocer el significado fisiopatológico de esta modificación postraduccional a través de modelos celulares de daño endotelial y de isquemia-reperfusión. nisms by which the pre-eminent transcriptional regulator of ET- 1 synthesis transforming growth factor-beta (TGF-β) operates, and we are developing transgenic animal models to confirm these results in vivo. In addition we are interested in gaining insight into the specific pathways of TGF-β signal transduction for ET-1 in endothelial cells. Reactive oxygen species (ROS) are well established as a source of endothelial cell damage. We have shown that the transcriptional coactivator PGC-1 is able to favour protective responses through the increased expression of antioxidant proteins, and we are now studying the relation between NO and PGC-1 in vivo in transgenic animals lacking endothelial nitric oxide synthase (enos). Although the pre-eminent physiological NO effector is soluble guanylate cyclase, recently the ability of the NO radical to modify protein function through several posttranslational modifications. Among these, S-nitrosylation of cysteines and nitration of tyrosines appear to be biochemical mechanisms of the response to nitrosative stress. In this regard, through the application of proteomic techniques we have identified a group of proteins that undergo S-nitrosylation in endothelial cells. At present we are trying to understand the physiopathological significance of this post-translational modification in cellular models of endothelial damage and ischaemiareperfusion. Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, SAF ( ) Soc. Española Nefrología ( ) CICYT, SAF ( ) FIS, RED RECAVA (2003) Fund. Ramón Areces (2003) CAM, /0030.1/2003 ( ) CAM, /0027.1/2003 ( ) CAM, /0023.1/2003 ( ) 89

101 Fisiopatología Molecular de la Pared Vascular / Molecular Pathophisiology of the Vascular Wall Fund. Renal Iñigo Álvarez de Toledo ( ) CICYT, SAF ( ) CICYT, SAF ( ) FIS, RED RECAVA (2004) Fund. CNIC Carlos III (CNIC) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Eva María Cernuda Morollón. Efecto de agentes inductores de la proliferación peroxisomal sobre la respuesta celular a estímulos inflamatorios: Regulación de la óxido nítrico inducible y del factor de transcripción NF-kB. Universidad Autónoma de Madrid, Mayo Directores: S. Lamas y D. Pérez Sala. Octavio Hernández Perera. Mecanismos moleculares de la acción de inhibidores de la HMG-CoA reductasa sobre la función endotelial: Factores Vasoactivos y Proteinas Rho. Universidad Autónoma de Madrid, Septiembre Director: S. Lamas. Belén González Timón. Efecto de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) sobre proliferación, supervivencia y vías de señalización inducidas por IGF-I en células musculares lisas vasculares. Modulación por óxido nítrico. Universidad Complutense de Madrid, Mayo Directores: S. Lamas y E. Melián. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Fernández-Tornero, C., Lozano, R.M., Redondo-Horcajo, M., Gómez, A.M., López, J.C., Quesada, E., Uriel, C., Valverde, S., Cuevas, P., Romero, A., and Giménez-Gallego, G. (2003). Leads for development of new naphthalenesulfonate derivatives with enhanced antiangiogenic activity: crystal structure of acidic fibroblast growth factor in complex with 5-amino-2-naphthalene sulfonate. J. Biol. Chem. 278, Rodríguez-Pascual, F., Redondo-Horcajo, M., and Lamas, S. (2003). Functional cooperation between Smad proteins and AP-1 regulates transforming growth factor-β-mediated induction of endothelin-1 expression. Circ. Res. 92, Agudo, D., Mendoza, M.T., Castañares, C., Nombela, C., and Rotger, R. (2004). A proteomic approach to study Salmonella typhi periplasmic proteins altered by a lack of the DsbA thiol: disulfide isomerase. Proteomics 4, Angulo, J., Ojeda, R., de Paz, J.L., Lucas, R., Nieto, P.M., Lozano, R.M., Redondo-Horcajo, M., Giménez-Gallego, G., and Martín- Lomas, M. (2004). The activation of fibroblast growth factors (FGFs) by glycosaminoglycans: influence of the sulfation pattern on the biological activity of FGF-1. Chembiochemistry 5, González-Timón, B., González-Muñoz, M., Zaragoza, C., Lamas, S., and Melián, E. (2004). Native and oxidized low density lipoproteins oppositely modulate the effects of insulin-like growth factor I on VSMC. Cardiovascular. Res. 61, López, E., Lamas, S., and Zaragoza, C. (2004). Oxido Nítrico y deterioro de la matriz extracelular. Un papel en aterosclerosis. Nefrología Volumen XXIV, Suplemento 4,

102 Fisiopatología Molecular de la Pared Vascular / Molecular Pathophisiology of the Vascular Wall Martínez-Ruiz, A., and Lamas, S. (2004). S-nitrosylation: a potential new paradigm in signal transduction. Cardiov. Res. 62, Martínez-Ruiz, A., and Lamas, S. (2004). Detection and proteomic identification of S-nitrosylated proteins in endothelial cells. Arch. Biochem. Bioph. 423, Obreo, J., Díez-Marques, L., Lamas, S., Duwell, A., Eleno, N., Bernabéu, C., Pandiella, A., López-Novoa, J.M., and Rodríguez- Barbero, A. (2004). Endoglin expression regulates basal and TGF-beta1-induced extracellular matrix synthesis in cultured L6E9 myoblasts. Cell Physiol. Biochem. 14, Rodríguez-Pascual, F., Reimunde, F.M., Redondo-Horcajo, M., and Lamas, S. (2004). Transforming Growth Factor-B Induces Endothelin-1 Expression Through Activation of the Smad Signaling Pathway. J. Cardiovascular. Pharmacol. 44, supplement 1, S39-S42. Contribuciones a Libros/Contributions to Books Lamas, S., y Caramelo, C. (2003). Alteraciones cardiovasculares en la insuficiencia renal crónica. En Nefrología Clínica 2ª Edición. (Ed. Panamericana), pp Lamas, S., y Caramelo, C. (2003). Biopatología de la pared vascular. En Nefrología Clínica 2ª Edición. (Ed. Panamericana), pp Lamas, S., y Coto, E. (2003). La biología molecular en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades renales. En Nefrología Clínica 2ª Edición. (Ed. Panamericana), pp Próximos Artículos/Forthcoming Articles López-Rivera, E., Rodríguez Lizarbe, T., López-Novoa, J.M., Rodríguez-Barbero, A., Rodrigo, J., Fernández, A.P., Álvarez- Barrientos, A., Lamas, S., and Zaragoza, C. (2004). MMP-13 mediates nitric oxide activation of endothelial cell migration. Proceeding National Academy Science USA. (en prensa/in press). Reimunde, F.M., Castañares, C., Redondo-Horcajo, M., Lamas, S., and Rodríguez-Pascual, F. (2004). Endothelin-1 expression is strongly repressed by AU-rich elements in the 3-untranslated region of the gene. Biochemical Journal. (en prensa/in press). 91

103 Modificación postraduccional de proteínas Posttranslational modification of proteins Mª DOLORES PÉREZ-SALA GOZALO Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist EVA Mª CERNUDA MOROLLÓN (Hasta VIII-2003) JAVIER GAYARRE NAVARRO (Desde VII-2004) FRANCISCO JAVIER SÁNCHEZ GÓMEZ (Desde IX-2003) KONSTANTINOS STAMATAKIS Becarios Predoctorales / Graduate Students Mª LAURA GARCÍA BERMEJO (I-X, 2004) Investigadora Visitante/ Visiting Scientist Mª JESÚS CARRASCO SOTO Personal Técnico / Technician Palabras clave: Isoprenilación, Prostaglandinas ciclopentenonas, Inflamación, Estatinas, Biología vascular La modificación postraduccional de proteínas supone un mecanismo fundamental de regulación de su actividad biológica. Numerosos mediadores biológicos, entre los que se incluyen compuestos lipídicos y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, así como fármacos y toxinas, actúan modificando las proteínas. En nuestro grupo estamos interesados en los procesos de modificación postraduccional de proteínas, tanto desde el punto de vista de su importancia fisiológica, como de su papel en el mecanismo de acción de fármacos. El óxido nítrico (NO) y las prostaglandinas son mediadores biológicos multifuncionales cuya generación se encuentra incrementada durante la inflamación. Ambos tipos de mediadores pueden modular procesos celulares básicos, como la proliferación, la apoptosis y la respuesta inflamatoria, mediante múltiples mecanismos que incluyen la regulación de la expresión génica y la modificación postraduccional de proteínas. La estructura de ciertas prostaglandinas presenta un grupo carbonilo insaturado en el anillo de ciclopentano (ciclopentenona), que Keywords: Isoprenylation, Cyclopentenone prostaglandins, Inflammation, Statins, Vascular biology The posttranslational modification of proteins is a key mechanism for the regulation of their biological activity. Various biological mediators, including lipids and reactive oxygen and nitrogen species, and also some drugs and toxins, can modify proteins posttranslationally. We are interested in the study of the importance of these processes in molecular pathophysiology and in the mechanisms of drug action. Nitric oxide and prostaglandins are multifunctional biological mediators, the generation of which is increased in inflammatory situations. These molecules can modulate basic cellular functions, including proliferation, apoptosis and the inflammatory response, through multiple mechanisms which include the regulation of gene expression and the posttranslational modification of proteins. Some prostaglandins possess an unsaturated carbonyl group in the cyclopentane ring (cyclopentenone), which is responsible for the high reactivity of these compounds that may form covalent adducts with thiol groups by a reaction called Michael addition. We have observed that the ability of 92

104 Modificación postraduccional de proteínas / Posttranslational modification of proteins Posibles modificaciones postraduccionales de H-Ras Some of the potential posttranslational modifications of H-Ras proteins les confiere la capacidad de formar aductos covalentes con grupos tioles en una reacción que se denomina adición de Michael. Hemos comprobado que las prostaglandinas ciclopentenonas ejercen efectos antiinflamatorios para los que es esencial su capacidad de unirse a residuos de cisteína de ciertas proteínas, en un proceso que denominamos prostanilación. Las prostaglandinas ciclopentenonas pueden modificar residuos de cisteína críticos situados en el dominio de unión a DNA de los factores de transcripción NF-κB y AP-1, que son claves en la respuesta inflamatoria y en la expresión de genes como la inos, la COX- 2 e ICAM-1. La interacción de las ciclopentenonas con estos factores resulta en la inhibición de su unión al DNA y de su actividad transcripcional. También hemos comprobado que las prostaglandinas ciclopentenonas pueden unirse a la proteína H-Ras y dar lugar a su activación, lo cual se asocia con un incremento de proliferación y una protección frente a la apoptosis, procesos que podrían estar implicados en la transformación oncogénica. Nuestro objetivo actual es la identificación de nuevas dianas proteicas de prostanilación mediante abordajes proteómicos y el estudio de la repercusión funcional y de la importancia fisiopatológica de esta modificación. Las estatinas son los fármacos más ampliamente usados para reducir la hipercolesterolemia que subyace a numerosas enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o la arteriosclecyclopentenone prostaglandins to covalently modify cysteine residues in proteins, a process that we call prostanylation, is essential for the anti-inflammatory effects of these compounds. Cyclopentenone prostaglandins can modify critical cysteine residues located in the DNA binding domain of transcription factors NF-κB and AP-1, which are key for the inflammatory response and direct the expression of pro-inflammatory genes such as inos, COX-2 and ICAM-1. This interaction results in the inhibition of the DNA binding and transcriptional activity of these transcription factors. We have also shown that cyclopentenone prostaglandins can bind to and activate H-Ras proteins, and this is associated with an increase in cell proliferation and a reduced susceptibility to apoptosis. This mechanism could be involved in oncogenic transformation. We are interested in the identification of novel protein targets for prostanylation through proteomic approaches, and in the study of the pathophysiological implications of this modification. Statins are the most widely used drugs in the treatment of hypercholesterolemia associated with cardiovascular diseases, such as atherosclerosis and hypertension. Statins inhibit the synthesis of cholesterol and of the isoprenoid lipids involved in the posttranslational modification of proteins. Our group and others have shown that the inhibition of the isoprenylation of defined proteins can contribute to the beneficial effects of statins on car- 93

105 Modificación postraduccional de proteínas / Posttranslational modification of proteins rosis. Las estatinas inhiben la síntesis de colesterol y de los isoprenoides que intervienen en la modificación prostraduccional de proteínas. Nuestro grupo y otros han comprobado que la inhibición de la isoprenilación de ciertas proteínas contribuye a los efectos beneficiosos de las estatinas sobre la función vascular. Aunque es muy poco frecuente, estos fármacos también pueden causar algunos efectos adversos graves, como la rabdomiolisis, en particular cuando se asocian con ligandos de los factores de transcripción PP.AR (receptores activados por inductores de la proliferación peroxisomal). Por ello estamos interesados en explorar nuevas implicaciones de la isoprenilación de proteínas y las posibles interacciones entre las vías moduladas por las estatinas y por PPAR. diovascular function. In rare ocasions, these drugs can cause severe adverse effects such as rabdomyolysis, in some cases when they are used in association with PP.AR (peroxisome proliferator activated receptors) ligands. For these reasons we are interested in the study of novel implications of protein isoprenylation and in the interactions between statins and PPAR-modulated pathways. Tesis Doctorales/Doctoral Theses Eva Mª Cernuda Morollón. Efecto de agentes inductores de la proliferación peroxisomal sobre la respuesta celular a estímulos inflamatorios: regulación de la óxido nítrico sintasa inducible y del factor de transcripción NF-κB. Universidad Autónoma de Madrid, Directores: M.D. Pérez-Sala Gozalo y S. Lamas. Organismos Financiadores/Funding Agencies CAM, 08.4/0025.1/2003 ( ) Merck, Sharp & Dohme, S-SPA PER ( ) MCYT, SAF ( ) Fundación La Caixa ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Oliva, J.L., Pérez-Sala, D., Castrillo, A., Martínez, N., Cañada, F.J., Boscá, L., and Rojas, J.M. (2003). The cyclopentenone 15- deoxy- 12,14 -prostaglandin J 2 binds to and activates H-Ras. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100,

106 Modificación postraduccional de proteínas / Posttranslational modification of proteins Pérez-Sala, D., Cernuda-Morollón, E., and Cañada, F.J. (2003). Molecular basis for the direct inhibition of AP-1 DNA binding by 15-deoxy- 12,14 -prostaglandin J 2. J. Biol. Chem. 278, Sánchez-Gómez, F.J., Cernuda-Morollón, E., Stamatakis, K., and Pérez-Sala, D. (2004). Protein thiol modification by 15-deoxy- 12,14 -prostaglandin J 2 addition in mesangial cells: role in the inhibition of proinflammatory genes. Mol. Pharmacol. 66, Stamatakis, K., Sánchez-Gómez, F.J., and Pérez-Sala, D. (2004). Protein modification by cyclopentenone prostaglandin addition: biological actions and therapeutic implications. Gene Ther. Mol. Biol. 8,

107 Bioenergética Mitocondrial Mitochondrial Bioenergetics EDUARDO RIAL ZUECO Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist MARÍA DEL MAR GONZÁLEZ BARROSO (Desde III-2004) AMALIA LEDESMA FERNÁNDEZ (Hasta X-2003) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows JESÚS JIMÉNEZ JIMÉNEZ (Hasta VI-2004) SIMONE MAREN LEPPER (Desde IX-2003 a IV-2004) ELISA PÉREZ MAGÁN (Desde X-2004) PAULA TOMÁS GARCÍA (Hasta VII-2004) B. Predoctorales / Graduate Students PILAR ZARAGOZA JIMÉNEZ Personal Técnico / Technician 96

108 Bioenergética Mitocondrial / Mitochondrial Bioenergetics Palabras clave: Mitocondria, Bioenergética, Proteína desacoplante, Estrés oxidativo, Obesidad La fosforilación oxidativa mitocondrial engloba las reacciones que llevan a la síntesis de ATP utilizando la energía disponible tras la oxidación de sustratos en la cadena respiratoria. El acoplamiento de los dos procesos se realiza a través del gradiente de protones que es generado por la cadena respiratoria. Nuestro grupo investiga mecanismos que permiten modificar este acoplamiento de modo que parte de la energía pueda disiparse en forma de calor. Las proteínas desacoplantes modulan la eficiencia energética Las proteínas desacoplantes (abreviado UCP, del inglés uncoupling protein ) son proteínas de la membrana interna mitocondrial que forman parte de la superfamilia de proteínas en la que se incluyen los transportadores mitocondriales de metabolitos. La función biológica de las proteínas desacoplantes es la disipación controlada del gradiente de protones. Existe un gran número de procesos que parecen requerir de la participación de las UCPs. Así, este mecanismo disipador de energía es utilizado por los mamíferos para mantener la temperatura corporal cuando están expuestos al frío e incluso para quemar el exceso de calorías ingeridas en la dieta. De modo más reciente se ha descrito que las UCPs pueden jugar un papel importante en el control de la secreción de insulina o que su actividad reduce la producción de especies reactivas del oxígeno siendo, por tanto, un mecanismo de defensa frente al estrés oxidativo. Durante estos últimos años se ha puesto de manifiesto que los genes que codifican proteínas desacoplantes tienen una distribución muy amplia, habiéndose encontrado no sólo en animales sino también en plantas e incluso en organismos unicelulares. Esta amplia presencia sugiere que el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa es una estrategia adoptada de modo general por los seres vivos para regular la eficiencia energética. La proteína desacoplante UCP1 base del mecanismo de producción de calor del tejido adiposo pardo Nuestro grupo lleva más de veinte años centrado en el estudio del mecanismo molecular de transporte y regulación de la Keywords: Mitochondria, Bioenergetics, Uncoupling protein, Oxidative stress, Obesity. The mitochondrial oxidative phosphorylation embraces the reactions that allow ATP synthesis using the energy made available from substrate oxidation at the respiratory chain. The two processes are coupled through the proton gradient generated during the transfer of electrons from the substrates to oxygen. Our group investigates mechanisms that allow the modification of the coupling so that part of the energy can be dissipated as heat. The uncoupling proteins modulate the energetic efficiency The uncoupling proteins (abbreviated UCP) are carriers of the mitochondrial inner membrane that belong to a protein superfamily formed by the mitochondrial metabolite transporters. Their biological function is to allow a regulated discharge of the proton gradient. There are a growing number of processes that appear to involve the UCPs. Thus, this energy dissipatory mechanism is used by mammals to maintain body temperature when cold exposed or to burn excess calories ingested with the diet. More recently it has been shown that UCPs play an important role in the control of insulin secretion or that its activity reduces the production of reactive oxygen species and therefore contribute to the protection against oxidative stress. Over the past few years, genes coding for uncoupling proteins have been described not only in animals but also in plants and even in unicellular organisms. The ubiquitous presence of the uncoupling proteins suggests that physiological uncoupling of oxidative phosphorylation maybe a general strategy adopted by living organisms to modulate the energetic efficiency. The uncoupling protein UCP1 provides the molecular basis for the heat generating capacity of brown adipose tissue Our group has been involved for more than twenty years in the study of the molecular mechanism of transport and regulation of the first known UCP, the protein from brown adipose tissue. This tissue is a thermogenic organ present in mammals and the key to the mechanism of heat generation lies in the uncoupling protein UCP1. Noradrenergic stimulation of the brown 97

109 Bioenergética Mitocondrial / Mitochondrial Bioenergetics primera UCP descrita, la del tejido adiposo pardo. Este tejido es un órgano termogénico presente en los mamíferos y la clave del mecanismo de producción de calor se encuentra en la proteína desacoplante UCP1. El adipocito marrón recibe la señal de inicio de la termogénesis del hipotálamo mediante la noradrenalina y la unión de ésta a un receptor b-adrenérgico desencadena una cascada lipolítica. Los ácidos grasos liberados juegan un doble papel, son el sustrato que va a oxidar la mitocondria pero, además, actúan como segundos mensajeros activando el transporte de protones a través de la UCP1. Recientemente hemos descrito que el ácido todo-trans retinoico es también un activador de la proteína, mostrando una afinidad mucho mayor que la de los ácidos grasos. Nuestro trabajo trata de esclarecer cómo estos reguladores facilitan el paso de los protones y así descifrar el mecanismo molecular de transporte. Éste es un área de un intenso debate científico. El estudio de los dominios de la proteína implicados en la unión del activador así como las bases moleculares de la especificidad son también objeto de nuestro trabajo. La UCP2, una diana farmacológica El tejido adiposo pardo es prácticamente inexistente en el hombre adulto por lo que la UCP1 no es considerada una diana farmacológica. La UCP2, sin embargo, se encuentra en muchos tejidos y órganos (adiposo pardo y blanco, músculo esquelético, células β-pancreáticas, etc.) jugando un importante papel en la protección frente al estrés oxidativo, secreción de insulina, caquexia, etc. La modulación mediante fármacos de la actividad de la proteína podría servir de base para tratar enfermedades como la diabetes o minimizar el daño producido tras la isquemia. Tras el descubrimiento de la UCP2 en 1997, nuestro grupo también ha dirigido sus esfuerzos al estudio de la regulación de su actividad ya que esta proteína no es activada por ácidos grasos como lo es la UCP1. En 1999 demostramos que el ácido todo-trans retinoico activaba la respiración en mitocondrias de levaduras que expresaban UCP2 de modo recombinante. En contra con lo que ocurre con la UCP1, la UCP2 muestra una alta especificidad por el activador y sólo un estrecho grupo de retinoides han demostrado ser activos. Nuestro grupo trabaja en la actualidad en el estudio de las bases estructurales que determinan esta especificidad. Para estos estudios hemos desarrollado y patentado un método de screening de alto rendimiento que ya se adipocyte leads to an increased lipolysis and the fatty acids released play a dual role. They are substrate for oxidation but also the cytosolic second messengers of noradrenaline that will activate proton transport through UCP1. We have recently shown that retinoic acid is also a powerful activator of UCP1, with an affinity higher than that for fatty acids. Our research tries to establish how these regulators facilitate proton transport and thus help to unravel the molecular mechanism of transport. This is currently an area of intense scientific debate. We are also investigating the protein domains involved in the binding of the regulatory ligands and the molecular basis of the specificity. UCP2, a drug target Brown adipose tissue is almost inexistent in the adult human and therefore UCP1 cannot be considered as a target for drug development. In contrast, UCP2 is found in many tissues and organs (white and brown adipose tissue, skeletal muscle, pancreatic β-cells, etc.) and play an important role in the protection against oxidative stress, insulin secretion, cachexia, etc. After the discovery of UCP2 in 1997, our group set up to investigate the regulation of its activity because ti was apparent that UCP2 was not activated by fatty acids like UCP1. In 1999, we showed that all-trans retinoic acid was activating mitochondrial respiration in yeasts that express recombinantly UCP2. In contrast to UCP1, UCP2 displays a high specificity towards the activating ligand and thus only a narrow group of retinoids has been shown to be active. Our group is currently working on the structural basis of this specificity. We have developed and patented a high throughput screening protocol that has already been applied for these studies and in collaboration with the pharmaceutical company Allergan Sales Inc. (Irvine, USA). 98

110 Bioenergética Mitocondrial / Mitochondrial Bioenergetics ha utilizado de modo satisfactorio en colaboración con la empresa Allergan Sales Inc. (Irvine, EE.UU). Tesis Doctorales/Doctoral Theses Jesús Jiménez Jiménez. Bases Moleculares de la Especificidad de la Proteína Desacoplante UCP1 por su Ligando Regulador. Universidad Complutense de Madrid, Julio Director: E. Rial. Organismos Financiadores/Funding Agencies Allergan Sales Inc. (Irvine, EEUU) ( ) MCyT, BIO ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Abelenda, A., Ledesma, A., Rial, E., and Puerta, M. (2003). Leptin administration to cold-acclimated rats reduces both food intake and brown adipose tissue thermogenesis. J. Therm. Biol. 28, Ledesma, A., and Rial, E. (2004). Carrier and channel properties of mitochondrial transporters: Physiology and pathology? Toxicol. Mechanisms Methods 14, Rial, E., Aguirregoitia, E., Jiménez-Jiménez, J., and Ledesma, A. (2004). Alkylsulfonates activate the uncoupling protein UCP1. Implications for the transport mechanism. Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 1608, Tomás, P., Jiménez-Jiménez, J., Zaragoza, P., Vuligonda, V., Chandraratna, R.A.S., and Rial, E. (2004). Activation by retinoids of the uncoupling protein UCP1. Biochim. Biophys. Acta Bioenerg. 1658, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Teruel, T., Hernández, R., Rial, E., Martín-Hidalgo, A., and Lorenzo, M. (2005). Rosiglitazone modulates lipid metabolism in fetal primary brown adipocytes increasing respiration rate and favoring fatty acid utilization versus synthesis. Diabetología. (en prensa/in press). 99

111 Biología Estructural de Proteínas Structural Biology of Proteins GUILLERMO GIMÉNEZ GALLEGO Jefe de Grupo / Group Leader FRANCISCO JAVIER CAÑADA VICINAY JESÚS JIMÉNEZ BARBERO ROSA LOZANO PUERTO JUAN MANUEL RAMÍREZ DE VERGER ANTONIO ROMERO GARRIDO Investigadores de Carrera / Staff Scientists DOLORES DÍAZ HERNÁNDEZ (Desde IX-2004) PATRICK D. GROVES (Desde XI-2004) Investigadores Contratados / Contract Scientists CONTRATADOS RAMÓN Y CAJAL NURIA ABOITIZ CANTALAPIEDRA MATTEO POLITI JOSUÉ ALVARO BLANCO (Desde IV-2004) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows MARÍA DE LOS ÁNGELES CANALES MAYORDOMO M. ISABEL CHÁVEZ URIBE MARÍA DEL CARMEN FERNÁNDEZ ALONSO MARÍA FERNÁNDEZ LÓPEZ LUCENDO VÍCTOR GARCÍA APARICIO JUAN JOSÉ HERNÁNDEZ GAY (Desde V-2004) SILVIA MARI ÁLVARO RAMÓN GONZÁLEZ (Hasta II-2003) ISRAEL SÁNCHEZ FERNÁNDEZ ELENA SANTILLANA HERAS B. Predoctorales / Graduate Students CONCEPCIÓN FERNÁNDEZ CABRERA MERCEDES ZAZO GUÍO Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Biología estructural, Resonancia magnética nuclear de proteínas, Cristalografía de proteínas, Ingeniería de de proteínas, Diseño de fármacos Las investigaciones del grupo Biología Estructural de Proteínas están dirigidas fundamentalmente a tratar de determinar las bases estructurales de las actividades biológicas de las proteínas, con el objetivo último de ofrecer pistas para futuras aplicaciones industriales, fundamentalmente en el campo farmacéutico. En la mayor parte de los casos, el trabajo del grupo comienza por el diseño de procedimientos de síntesis de las proteínas a estudiar, para que resulten aptas para llevar a cabo estu- Keywords: Structural biology, Nuclear magnetic resonance of proteins, Protein crystallography, Protein engineering, Drug design The research of the group Structural Biology of Proteins is mainly focused in the study of the structural basis of the biological properties of proteins, with the goal of affording leads for future industrial developments. Once a research goal is established the work of the group normally begins with the design and development of systems for production of the targeted protein with the quality required for high resolution studies. Optimization of protein synthesis can be quite adequately 100

112 Biología Estructural de Proteínas / Structural Biology of Proteins dios estructurales de alta resolución. A largo de estos desarrollos no es extraño que haya que acudir a la ingeniería de proteínas y a los estudios estructurales de baja/media resolución para los que tanto los laboratorios del grupo como el Centro están suficientemente equipados (centrifugación analítica, espectroscopia visible/ultravioleta de transmisión y fluorescencia, dicroísmo circular, espectrografía de masas, cromatografía de exclusión de alta eficiencia etc.). El grupo dispone también, o tiene libre acceso al equipamiento clásico de química de proteínas (secuenciador de proteínas, analizador de aminoácidos, sintetizador de proteínas) y de purificación de proteínas (cromatógrafos de medio y alto rendimiento). El grupo tiene a su disposición un difractómetro de rayos X y un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de 500 MHz, instalados en el Centro. El grupo es usuario regular de las instalaciones de sincrotrón europeas, y tiene derecho al uso de los espectrómetros de resonancia magnética nuclear de 600 y 800 MHz del equipamiento de espectroscopía de alto campo del CSIC, así como acceso al de la Universidad de Santiago de Compostela (750 MHz). El grupo tiene también capacidad de proceder a la síntesis de compuestos orgánicos sencillos. El grupo de resonancia magnética nuclear, liderado por el Prof. Jiménez Barbero, está interesado en el desarrollo de los aspectos metodológicos en general de la resonancia magnética nuclear (RMN) y, más en particular, a sus aplicaciones al estudio de la conformación y dinámica de procesos de reconocimiento molecular y determinación de la estructura 3D de proteínas, oligosacáridos y otras biomoléculas en disolución. Durante los últimos años, ha determinado la estructura tridimensional en disolución de distintas proteínas usando un protocolo basado en espectroscopía de RMN asistida mediante cálculos de mecánica y dinámica molecular. Esta metodología se ha aplicado a distintos complejos moleculares de carbohidratos con lectinas, glicosidasas y a la elucidación de la estructura de otros receptores de interés biomédico. Ha investigado los complejos de proteínas nativas y mutantes, tanto con ligandos naturales como con análogos sintéticamente modificados. También ha estudiado las características estructurales desde el punto de vista conformacional y dinámico de distintos oligo y polisacáridos de interés biológico usando RMN y métodos de modelización molecular. En particular, ha prestado atención al origen físico-químico de la interacción entre carbohidratos y proteínas, haciendo especial énfasis en el papel relativo de las interacciones de apilamiento addressed with the equipment available in either their laboratories or at the Center (analytical ultracentrifugation, visible/uv transmission and fluorescence spectroscopy, circular dichroism, mass spectrography, high performance exclusion chromatography etc.). The groups are also equipped (or have free access) to typical protein chemistry instruments (protein sequencer, amino acid analyzer, protein synthesizer) and protein purification equipments (medium and high performance liquid chromatography).the group has X-ray diffraction and nuclear magnetic resonance (500 MHz) facilities. It has also regular access to the European synchrotron services and the 600 and 800 MHz spectrometers of the high field spectroscopy equipment of the CSIC. The group is also a regular user of the 750 MHZ spectrometer of the Universidad de Santiago de Compostela (750 MHz). The nuclear magnetic resonance (NMR) group, under leadership of Prof. Jiménez Barbero is interested in the development of general methodological aspects of the NMR techniques and, particularly, in their applications to the study of the conformation and dynamics of the molecular recognition processes. During the last few years they have determined the solution 3D structure of different proteins using a protocol based on NMR spectroscopy, assisted by molecular mechanics and dynamics calculations. This methodology has been applied to different carbohydrate molecular complexes of wild type and mutant lectins, glycosidases, and to the elucidation of the structure of other protein receptors of biomedical interest. They have investigated protein complexes with natural ligands and with synthetically modified analogues. They have also investigated the structural characteristics, both from the conformational and dynamical point of view of different biologically relevant oligo and polysaccharides also using NMR and molecular dynamics. In particular, they have paid attention to the physic-chemical origin of the interaction between carbohydrates and proteins, with special emphasis in the relative role of sugar-aromatic stacking interactions. Natural abundance as well as labeled ligands and proteins ( 13 C, 15 N) have been used for these studies. Thanks to the collaboration with several research groups throughout the world, some studied systems include galectins, hevein domains, ricin-b, viscumin, lactase, E. coli beta-galactosidase, Streptomyces Sp. beta-glucosidase, ribonuclease B, DC-SIGN, acidic fibroblast growth factor, cholera toxin B, HexS1 homeodomain, glycomimetics, C-and S-glycosyl compounds, aminoglycosides, carbohydrate antigens, bacterial and 101

113 Biología Estructural de Proteínas / Structural Biology of Proteins entre carbohidratos y anillos aromáticos. Para todos estos estudiados ha empleado ligandos y proteínas naturales y otros etiquetados con isótopos estables de 15 N y 13 C. Merced a la colaboración con distintos grupos de investigación de todo el mundo, algunos sistemas estudiados incluyen galectinas, dominios de heveína, ricina-b, viscumina, lactasa, beta-galactosidasa de E. coli, beta-glucosidasa de Streptomyces Sp., ribonucleasa B, DC-SIGN, factor de crecimiento de fibroblastos ácido, toxina del cólera B, el homeodominio HexS1, glicomimeticos, compuestos C-and S-glicosídicos, aminoglicósidos, antígenos basados en carbohidratos, polisacáridos de hongos y bacterias, etc. Estos últimos estudios conectan de forma bastante directa con una línea de investigación de larga tradición del grupo, y que todavía se mantiene viva, centrada en el establecimiento de las bases estructurales de la inhibición/activación del factor de crecimiento para fibroblastos, una proteína implicada en un alto número de patologías importantes (Prof. Giménez-Gallego, Dra Lozano), estudios que se llevan a cabo mediante RMN y difracción de rayos X. Estos estudios implican llevar a cabo también estudios sencillos de biología celular. El grupo está interesado también en caracterizar la estructura tridimensional de determinados factores de virulencia de Streptococcus pneumoniae y en el diseño, en base a estos estudios, de inhibidores de su actividad biológica (Dr. Romero, Prof. Giménez-Gallego). Resuelta la estructura del dominio de unión a colina de la autolisina del neumococo, mediante difracción de rayosx, el grupo ha pasado ya a la etapa del diseño de inhibidores de esta proteína, basados en la estructura de este dominio. El laboratorio del Dr. Romero estudia en estos momentos también el enzima UDP-glucosa pirofosforilasa, un componente clave en la síntesis de la cápsula celular de todos los tipos capsulares del neumococo caracterizados hasta el momento. Las proteínas transportadoras de los factores de crecimiento análogos a la insulina son otro de los objetos de estudio del grupo. Se trata de una familia de polipéptidos involucrada también en numerosas patologías importantes. El grupo colabora con un número considerable de laboratorios españoles y extranjeros en proyectos a veces muy diversos no siempre relacionados con los objetivos de investigación del grupo. fungal polysaccharides, etc. This last research line overlaps with a, still alive, old one of the group, aimed at establishing the structural basis of the inhibition/activation of fibroblast growth factor, a protein deeply involved in important pathologies, and at designing inhibitors of its mitogenic activity (Prof. Giménez- Gallego and Dr. Lozano).These studies require relatively simple studies of cell biology sometimes. The group is also interested in establishing the structural basis of the biological activities of certain virulence factors of Streptococcus pneumoniae and in designing inhibitors against bacterial virulence (Prof. Giménez- Gallego, Dr. Romero). Once the three-dimensional structure of the choline-binding domain of the pneumococcal autolysin LytA has been solved by X-ray diffraction by the group, they have proceeded to identify low molecular-mass compounds which may lead the design of inhibitors of this enzyme. Dr. Romero s laboratory is also interested in the determination of the enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase, a key component of the pneumococcal cell capsule in all the known strains of this bacterium. The group is also undertaking now the structural characterization of the insulin growth factor binding proteins, a family of polypeptides involved in numerous crucial physiological functions and pathologies. The group collaborates with numerous Spanish and foreign research laboratories in numerous other projects not directly related with its main research goals. 102

114 Biología Estructural de Proteínas / Structural Biology of Proteins Organismos Financiadores/Funding Agencies DGES, BQU C02-01 ( ) PN-Biotecnología, BIO ( ) CAM, 07B/0042/2002 ( ) PN-Biotecnología, BIO ( ) EU, HPRN-CT ( ) EU, HPRN-CT ( ) DGICYT, BQU C03-01 ( ) CAM, GR/MAT/0711/2004 (2005) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Ahrazem, O., Prieto, A., Leal, J.A., Jiménez-Barbero, J., and Bernabé, M. (2003). Structure of a Cell Wall Rhamnogalactomannan Isolated from Cubonia bulbifera. J. Carbohydr. Chem. 22, Bernardi, A., Arosio, D., Manzoni, L., Monti, D., Posteri, H., Potenza, D., Mari, S., and Jiménez-Barbero, J. (2003). Mimics of ganglioside GM1 as Cholera Toxin ligands: replacement of the GalNAc residue. Organic Biomol. Chem. 1, Fernández Alonso, C., Asensio, J.L., Cañada, F.J., Jiménez-Barbero, J., and Cuevas G. (2003). Towards the understanding of the geometrical and energy requirements of pyranose chair distortion by carbohydrate-processing enzymes., MP2-and DFTbased characterization of the Ring Inversion Process of Oxane and Thiane. Chem. Phys. Chem. 4, Fernández-Tornero, C., Lozano, R.M., Redondo-Horcajo, M., Gómez, A.M., López, J.C., Quesada, E., Uriel, C., Valverde, S., Cuevas, P., Romero A., and Giménez-Gallego. (2003). Leads for development of new naphthalenesulfonate derivatives with enhanced antiangiogenic activity: crystal structure of acidic fibroblast growth factor in complex with 5-amino-2-naphthalenesulfonate. J. Biol. Chem. 278, Giraldo, R., Fernández-Tornero, C., Evans, P.R., Díaz-Orejas, R., and Romero, A. (2003). Conformational switch between transcriptional repression and replication initiation in RepA dimerization domain. Nature Struc. Biol. 10, Jiménez-Barbero, J. (2003). Aplicaciones de la RMN al estudio de interacciones entre moléculas. An. Química 99, Kogelberg, H., Solis, D., and Jiménez-Barbero, J. (2003). New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 13, Lostao, A., Daoudi, F., Irun, M.P., Ramón, A., Fernández-Cabrera, C., Romero, A., and Sancho, J. (2003). How FMN binds to Anabaena apoflavodoxin: a hydrophobic encounter at an open binding site. J. Biol. Chem. 278, Martín-Pastor, M., Canales, M.A., and Jiménez-Barbero, J. (2003). NMR experiments for the measurement of H-H and C-C RDCs in uniformly labeled oligosaccharides. J. Biomol. NMR 26, Moreno-Vargas, J., Jiménez-Barbero, J., and Robina, I. (2003). Hetarylene-aminopolyols and Hetarylene-carbopeptoids. A new type of glyco-and peptido-mimetics. Synthesis and Studies on solution conformation and dynamics. J. Org. Chem. 68,

115 Biología Estructural de Proteínas / Structural Biology of Proteins Pantoja-Uceda, D., Bruix, M., Giménez-Gallego, G., Rico, M., and Santoro, J. (2003). Solution structure of RICC3, A 2S albumin storage protein from Ricinus communis. Biochemistry 42, Prieto, A., Ahrazem, O., San Blas, G., Leal, J.A., Jiménez-Barbero, J., and Bernabé, M. (2003). Structural differences between the alkali-extracted water-soluble cell wall polysaccharides from mycelial yeast and yeast phases of the pathogenic dimorfic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Glycobiology 13, Siebert, H.C., André, S., Lü, S., Frank, M., Kaltner, H., van Kuik, J., Korchagina, E.Y., Bovin, N., Tajkhorshid, E., Kaptein, R., Vliegenthart, J., von der Lieth, C., Jiménez-Barbero, J., Kopitz, J., and Gabius, H.-J. (2003). Target-site and conformer selection during the interaction between the natural tumor cell ligand ganglioside GM1 and the growth-regulatory lectin galectin-1 in solution and the difference to cholera toxin. Biochemistry 42, Siebert, H.C., Jiménez-Barbero, J., and Gabius, H.J. (2003). Conformational and structural aspects of the interactions of carbohydrates with lectins. Methods Enzymol. 362, Sierra, M.A., Fernández, I., Mancheño, M.J., Gómez-Gallego, M., Torres, M.R., Cossío, F.P., Arrieta, A., Lecea, B., Poveda, A., and Jiménez-Barbero J. (2003). Light Induced Amino-Carbene to Imine Dyotropic Rearrangement in a Chromium (0) Center: An Inedited Reaction Pathway. J. Am. Chem. Soc. 125, Watts, J., Jiménez-Barbero, J., Poveda, A., and Grindley, T.B. (2003). Control of Disaccharide Conformation by p-stacking. Can. J. Chem. 81, Aboitiz, N., Cañada, F., Jiménez-Barbero, J., Kuzma, J.M., Husáková, L., and Kren, V. (2004). Enzymatic synthesis of complex glycosaminotrioses and study of their molecular recognition by hevein domains. Org. Biomol. Chem. 2, Aboitiz, N., Vila-Perelló, M., Groves, P., Asensio, J.L., Andreu, D., Cañada, F.J., and Jiménez-Barbero, J. (2004). NMR Investigations of Protein-Carbohydrate Interactions: Towards the minimum hevein domain with measurable affinity for chitooligosaccharides., NMR and Modelling studies on the three dimensional Structure and binding affinity of the complex between a C-terminus truncated hevein and chitooligosaccharides. ChemBioChem 5, Angulo, J., Ojeda, R., De Paz, J.L., Lucas, R., Nieto, P.M., Lozano, R.M., Redondo-Horcajo, M., Giménez-Gallego G., and Martín- Lomas, M. (2004). The activation of fibroblasts growth factors (fgfs) by glycosaminoglycans: influence of the sulfation pattern on the biological activity of FGF-1. ChemBioChem 5, Bello, P., Heaton, N.J., Chana, A., Jiménez-Barbero, J., Riande, E., and Herradón, B. (2004). Influence of arene-arene interactions on the conformation of acyclic molecules., NMR and dipole moment experimental results. J. Phys. Org. Chem. 17, Bernardi, A., Arosio, D., Potenza, D., Sánchez-Medina, I., Mari S., Cañada, F.J., and Jiménez-Barbero, J. (2004). Mimics of ganglioside GM1 as Cholera Toxin ligands: The importance of carbohydrate-aromatic interactions in molecular recognition processes. Chem. Eur. J. 10, Bikfalvi, A., and Giménez-Gallego, G. (2004). The control of angiogenesis and tumor invasion by platelet factor-4 and platelet factor-4-derived molecules. Semin. Thromb. Hemost. 30, Colombo, G., Asensio, J.L., Cañada, J., and Jiménez-Barbero, J. (2004). Towards the understanding of the structure and dynamics of Protein-Carbohydrate interactions: Molecular Dynamics studies of the complexes between hevein and oligosaccharidic ligands. Carboh. Res. 339, Fernández-Alonso, M.C., Cañada, F.J., Jiménez-Barbero, J., Solís, D., Gabius, H.-J., and Mootoo, D.R. (2004). The conformation of carba and C-glycosyl mimetics of lactose in the free state and when bound to viscumin, a toxic galactose binding protein. Eur. J. Org. Chem

116 Biología Estructural de Proteínas / Structural Biology of Proteins Gabius, H.J., Siebert, H.C., Andre, S., Jiménez-Barbero, J., and Rudiger, H. (2004). Chemical biology of the sugar code., ChemBioChem 5, Gómez-Miranda, B., Prieto, A., Ahrazem, O., Leal, J.A., Jiménez-Barbero, J., and Bernabé, M. (2004). Differences among the cell wall galactomannans from A., Wentii and Chaesartorya chrysella and that of Aspergillus Fumigatus. Glycoconjugate J. 20, Groves, P., Palczewska, M., Molero, M.D., Batta, G., Cañada, F.J., and Jiménez-Barbero, J. (2004). Protein Molecular weight standards can compensate systematic errors in Diffusion Ordered Spectroscopy. Anal. Biochem. 331, Groves, P., Rasmussen, M., Molero, M.D., Samain, E., Cañada, F.J., Driguez, H., and Jiménez-Barbero, J. (2004). Diffusion Ordered Spectroscopy as a Complement to Size Exclusion Chromatography in Oligosaccharide. Analysis Glycobiol. 14, Li, H., Blériot, Y., Chantereau, C., Mallet, J.-M., Sollogoub, M., Zhang, Y., Rodríguez-García, E., Vogel, P., Jiménez-Barbero, J., and Sinäy, P. (2004). The first synthesis of substituted azepanes mimicking monosaccharides: a new class of potent glycosidase inhibitors. Org. Biomol. Chem. 2, López-Lucendo, M.F., Giménez-Gallego, G., Cooper, N.W., Gabius, H.J., and Romero, A. (2004). Gene design, expression, crystallization and preliminary diffraction analysis of two isolectins from the fungus Coprinus cinereus: a model for studying functional diversification of galectins in the same organism and their evolutionary pathways. Acta Cryst. D60, López-Lucendo, M.F., Solís, D., André, S., Hirabayashi, J., Kasai, K., Kaltner, H., Gabius, H.-J., and Romero, A. (2004). Growthregulatory Human Galectin-1: Crystallographic Characterisation of the Structural Changes Induced by Single-site Mutations and their Impact on the Thermodynamics of Ligand Binding. J. Mol. Biol. 343, Mari, S., Posteri, H., Marcou, G., Potenza, D., Micheli, F., Cañada, F.J., Jiménez-Barbero, J., and Bernardi, A. (2004). Synthesis Conformational Studies and Mannosidase stability of a Mimic of 1,2-Mannobioside. Eur. J. Org. Chem Martínez, K., Medina, J.L., Mari, S., Cañada, F., Vogel, P., Li, H., Bleriot, Y., Sinäy, P., and Jiménez-Barbero, J. (2004). The conformational behavior of novel glycosidase inhibitors with substituted azepan structures., A NMR and modeling study. Eur. J. Org. Chem Medina-Franco, J.L., Rodríguez, C., Juárez, S., Hernández, A., Jiménez-Barbero, J., and Castillo, R. (2004). Flexible Docking of Pyridinone Derivatives into the Non-Nucleoside Inhibitor Binding Site of HIV-1 Reverse Transcriptase. Bioorg. Med. Chem. 12, Peri, F., Jiménez-Barbero, J., García-Aparicio, V., Tvaroska, I., and Nicotra, F. (2004). Synthesis and conformational analysis of novel N(OCH3)-disaccharide analogues. Chem. Eur. J. 10, Reyes-Grajeda, J.P., Moreno, A., and Romero, A. (2004). Crystal Structure of Ovocleidin-17, a Major Protein of the Calcified Gallus gallus Eggshell: Implications in the calcite mineral growth pattern. J. Biol. Chem. 279, Vargas, R., Mateu, L., and Romero, A. (2004). The effect of increasing concentrations of precipitating salts used to crystallize proteins on the structure of the lipidic Q224 cubic phase. Chem. Phys. Lipids. 127, Vicente, V., Martín, J., Jiménez-Barbero, J., Chiara, J.L., and Vicent, C. (2004). Hydrogen bonding Cooperativity: On the use of an intramolecular hydrogen bond to design a carbohydrate derivative with a cooperative H-bond donor centre. Chem. Eur. J. 10,

117 Biología Molecular de Bacterias Gram-positivas Molecular Biology of Gram-positive Bacteria PALOMA LÓPEZ GARCÍA Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist JESÚS NAVAS MÉNDEZ Investigador Asociado/Associated Researcher ALICIA DE LA FUENTE HERCE NIEVES GARCÍA QUINTANS MAURICIO MARTÍN B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows Mª DE LA LUZ MOHEDANO BONILLO Mª LAURA WERNING B. Predoctorales / Graduate Students Mª ANGELES CORRALES GONZÁLEZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Bacterias ácido lácticas, Streptococcus pneumoniae, Regulación de la expresión génica, Sistemas de dos componentes, Producción de compuestos volátiles Mejora metabólica de bacterias ácido lácticas Las bacterias ácido lácticas (BAL) son importantes por sus propiedades acidificantes y probióticas, sus metabolismos, y su capacidad para interferir con el crecimiento de bacterias patógenas. Las BAL han sido tradicionalmente utilizadas para mejorar el aroma y textura de alimentos fermentados, así como para prevenir su deterioro y más recientemente para producir alimentos funcionales. En colaboración con los grupos de las Dras. Carmen Peláez (Instituto del Frio, CSIC), Helena Santos y Cecilia Arraiano del Instituto de Tecnología Química y Biológica (Portugal) hemos explorado diversas estrategias para mejorar la producción de compuestos volátiles en el queso a partir de aminoácidos, glucosa y citrato. Hemos construido un L. lactis productor de la lactacina 3147 marcado fluorescentemen- Keywords: Lactic acid bacteria, Streptococcus pneumoniae, Regulation of gene expression, Two component systems, Volatile compounds production Metabolic improvement of lactic acid bacteria Lactic acid bacteria (LAB) are important for the food industry due to its acidifying and probiotic properties, their metabolisms and their interference capability against pathogenic bacterial growth. LABs have been traditionally used to improve the aroma and texture of fermented food as well as to prevent deterioration of that products and recently to produce functional food. In collaboration with the groups of Drs. Carmen Peláez (Instituto del Frio, CSIC), Helena Santos and Cecilia Arraiano from Instituto de Tecnología Química y Biológica (Portugal) we have explored various strategies to improve the aroma compound production in cheese from amino acids, glucose and citrate. We have GFP-tagged a Lactococcus lactis lactacin 3147 producer strain. This bacteria was used as starter for cheese- 106

118 Biología Molecular de Bacterias Gram-positivas / Molecular Biology of Gram-positive Bacteria te con GFP. Esta bacteria ha sido utilizada como estirpe iniciadora para fabricar quesos en combinación con dos estirpes adyuvantes sensibles a la bacteriocina y que poseen respectivamente actividades aminoácido aminotransferasa y α-cetoácido descarboxilasa. Así, se ha analizado el efecto de la bacteriocina en la transaminación de la isoleucina y posterior formación del compuesto volátil 2-metilbutanal. Los resultados obtenidos han revelado, que la presencia de la estirpe productora de bacteriocina provoca un incremento del compuesto volátil y conlleva un aumento del aroma de los quesos. Hemos construido un Lactococcus lactis sobreproductor de la piruvato kinasa para estudiar su influencia en el metabolismo de la glucosa. El análisis in vivo de este metabolismo por RMN ha revelado que en atmósfera de oxígeno y no en anaerobiosis dicha estirpe no presenta un metabolismo homoláctico típico, sino que disminuye su producción de ácido láctico incrementando la producción de acetoína, que podría conllevar un incremento de compuestos volátiles. Hemos sobreexpresado y determinado la especificidad de sustrato de la RNasa III lactocócica en L. lactis. Previamente hemos demostrado que esta endoribonucleasa regula a nivel posttranscripcional la expresión del sistema de transporte de citrato. Así, la sobreproducción de RNasa III nos permitirá estudiar su contribución en la producción de compuestos volátiles en L. lactis. También, estamos caracterizando a nivel molecular la producción de exopolisacáridos (EPS) del tipo β-glucano por BALs en colaboración con los grupos de la Dra. Ana Irastorza (Universidad del País Vasco) y del Dr. Jesús Navas (Universidad de Cantabria). La industria alimenticia utiliza BALs productoras de EPS y sus EPSs como agentes estabilizadores, viscosificadores, gelificadores y emulsivos. Además, los β-glucanos poseen efectos beneficiosos para la salud humana como estimuladores del sistema inmunitario y por ello estirpes productoras pueden utilizarse para obtener alimentos funcionales. Hemos clonado y caracterizado el gen gtf de Pediococcus damnosus productor de β-glucano, que codifica la glicosiltransferasa GTF. La proteína ha sido sobreproducida y detectado su actividad enzimática. Estudios de complementación indican que es la única proteína requerida para la biosíntesis de β-glucano. Hemos establecido un método de detección molecular basado en el gen gtf, que nos ha permitido identificar Lactobacillus y Oenococcus productores de β-glucano. Los métodos de detección de gtf y de sobreproducción de GTF han sido patentados para proteger su utilimaking in conjunction with two adjuvant lactococcal bacteriocin sensitive strains. These adjuvants possess respectively amino acid transferase and α-cetoacid decarboxylase activities. Therefore, the influence of the bacteriocin in transamination and further synthesis of the volatile compound 2-metilbutanal has been analysed. The results revealed that utilisation of the bacteriocin producer strain provokes an increase of the volatile compound and results in an enhancement of the cheese aroma. We have constructed a L. lactis pyruvate kinase overproducer strain to evaluate the influence of this enzyme in glucose metabolism. The in vivo NMR analysis of this metabolism revealed that in oxygen atmosphere and not in anaerobiosis the strain did not show a typical homolactic metabolism. There was a detriment of lactic acid production and an increase of acetoin synthesis, which could produce an increase of volatile compounds. The lactococcal RNase III has been overexpresed in L. lactis and its substrate specificity studied. We have previously shown that this endoribonuclease regulates the expression of the lactococcal citrate transport system at the posttranscriptional level. Therefore, the overproduction of RNase III should allow us to investigate its contribution in production of volatile compounds in L. lactis. We are also characterising at the molecular level the production of β-glucan type exopolysacharides (EPS) by LABs in collaboration with the groups of Drs. Ana Irastorza (Universidad del Pais Vasco) and Jesús Navas (Universidad de Cantabria). The food industries use EPS producer bacterial strains and their EPSs as stabilizing, viscosifiers and texture enhancers. Moreover, β-glucans have beneficial effects for human health, since they stimulate the immunological system. For this reason, producer strains can be used for production of functional food. We have cloned and characterised the gtf gene of a Pediococcus damnosus β-glucan producer strain, which encodes the GTF glycosyltransferase. The protein has been overproduced and its activity detected. Complementation studies indicate that it is the only enzyme required for the synthesis of the EPS. We have established a molecular method based on gtf, which has allowed to detect Lactobacillus and Oenococcus β-glucan producer strains. Uttilisation of the gtf detection and GTF over production methods for identification of EPS producer bacteria and production of β-glucan have been protected by patent applications. 107

119 Biología Molecular de Bacterias Gram-positivas / Molecular Biology of Gram-positive Bacteria zación para la obtención de bacterias productoras de EPS y para la producción de β-glucano. Caracterización del regulón del sistema de dos componentes YycFG de Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae es un patógeno humano implicado en infecciones respiratorias y responsable de las altas tasas de morbilidad y mortalidad en pacientes inmunodeprimidos y en las poblaciones infantil y anciana. El uso indiscriminado de antibióticos ha originado la aparición de cepas neumocócicas resistentes, dificultando el tratamiento de las infecciones causadas por este microorganismo. Este contexto pone de relieve la necesidad de identificar nuevas dianas neumocócicas para desarrollar nuevos antiinfectivos contra este patógeno. Los sistemas de dos componentes (SDC) bacterianos, inexistentes en células humanas, están constituidos por un regulador de respuesta y una histidina quinasa sensora. En bacterias Gram-positivas el SDC YycFG es esencial, siendo consecuentemente una potencial diana terapeútica. En colaboración con los grupos de los Drs. Jerry Wells (Institute of Food Research, Reino Unido) y Diego de Mendoza (Universidad de Rosario, Argentina) estamos realizando una caracterización del mecanismo de regulación de YycFG sobre la expresión génica, usando S. pneumoniae como sistema modelo. Hemos establecido un sistema de sobreexpresión controlada para analizar la función de YycFG in vivo y hemos realizado un análisis global genómico y proteómico de neumococos sobreproductores del regulador YycF. El análisis de su transcriptoma mostró que la expresión de genes implicados en división y metabolismo de la pared celular está afectada por los niveles de YycF. Entre ellos: lytb, que codifica una endo-β- N-acetylglucosaminidase implicada en la septación de S. pneumoniae; dos genes cuyos productos contienen el dominio LysM, módulo de unión a peptidoglicano presente en enzimas que degradan la pared celular; mrec, gen esencial de Bacillus subtilis y cuyo producto está implicado en la biosíntesis de peptidoglicano y pcsb, que también está regulado por YycF en otros Streptococcos y puede ser la diana esencial del regulador en S. pneumoniae, ya que su expresión constitutiva suprime la esencialidad de YycF. El análisis del transcriptosoma y del proteoma neumocócico reveló que la inducción de YycF conlleva a una alteración de la expresión de los enzimas implicados en la biosíntesis de ácidos grasos (BAG) de membrana. Este estudio, Characterisation of the YycF two component system regulon of Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae is a human pathogen involved in respiratory infections and responsible for high morbility and mortality in immunodepressed patients and in infant and old populations. The abusive use of antibiotics has resulted in the increase of antibiotic resistant pneumococcal strains. This context reveals the need for new pneumococcal targets in order to develop new antiinfectives against this pathogen. The bacterial two component systems (TCS), absent in human cell, include a response regulator and a sensor histidine kinase. The YycFG is a potential antiinfective target, since it is the only TCS essential for Gram-positive bacteria. Our group is characterizing the mechanism of gene regulation mediated by YycF using S. pneumoniae as model system. A system for controlled expression of YycF has been developed for in vivo analysis of YycFG function. A global genomic and proteomic study of pneumococcal YycF cell has been performed. The transcriptosome analysis revealed that alteration of YycF levels affect expression of genes involved in cell division and cell wall metabolism. Among these genes: lytb, encoding an endo-β-n-acetylglucosaminidase involved in S. pneumoniae septation; two genes, whose products carry the LysM domain, a binding peptidoglycan module originally discovered in cell wall hydrolytic enzymes; mrec, an essential gene in Bacillus subtilis and whose product is involved in peptidoglycan biosynthesis and pscb, which is also regulated by other streptococcal YycF and it could be the essential target of this regulator, since its constitutive expression overcomes essentiality of YycF in S. pneumoniae. The transcriptomic and proteomic analysis of pneumococcal cells showed that induction of YycF provokes an alteration of the levels of the enzymes required for fatty acid biosynthesis (FAB). This study also indicates the existence of two operons synchronically and divergently regulated as a response to increased levels of YycF. The first operon expression is repressed, whereas transcription of the second one is induced. The first operon encodes the enzyme involved in initiation of FAB and FabR (a putative regulator of MarR family), and the second one encodes enzymes required for fatty acid elongation. Analysis of fatty acid membrane composition confirmed an increase of fatty acid length chain in the S. pneumoniae YycF overproducer strain. Concerning to the mechanism of regula- 108

120 Biología Molecular de Bacterias Gram-positivas / Molecular Biology of Gram-positive Bacteria también, indica la existencia de dos operones regulados independientemente como respuesta al incremento de YycF. La expresión del primer operón, que incluye los genes codificantes de los enzimas implicados en la iniciación de la BAG y el gen fabr, se reprime; mientras que se induce la transcripción del segundo operón, cuyos productos están implicados en la elongación de los ácidos grasos. El análisis de la composición de membrana de S. pneumoniae confirmó que en la estirpe sobreproductora existe un aumento en la longitud de las cadenas de AG. Respecto al mecanismo de regulación, se han identificado los promotores P1 y P2 del primer y del segundo operón. Superpuesto a P1 existen dos repeticiones directas similares a las secuencias operadoras de los reguladores YycFs de B. subtilis y Staphylococcus aureus. Corriente arriba de P2 existe una repetición invertida, que podría ser el operador de FabR (regulador putativo). En consecuencia, el modelo de regulación que pretendemos validar mediante estudios de interacción proteína-dna es que FabR regula la elongación de los AG por represión de la expresión desde P2 y YycF reprime la transcripción desde P1, controlando así la expresión de FabR y la iniciación de la BAG. tion, the promoters P1 and P2 of the first and second operon have been identified. Overlapping P1 exist two direct repeats similar to the operators of the YycF regulators of B. subtilis and Staphylococcus aureus. Upstream of P2 is located an inverted repeat that could be the operator of FabR. Consequently, the current model that we intend to validate is that FabR regulates elongation of the fatty acids by repression of expression from P2 and that YycF represses transcription from P1 controlling expression of FabR and initiation of the FAB. Tesis Doctorales/Doctoral Theses Nieves García Quintáns. Caracterización de la regulación molecular del sistema de transporte de citrato de Lactococcus lactis. Universidad Complutense de Madrid, Directora: P. López García. Organismos Financiadores/Funding Agencies UE, QLRT ( ) CICYT, AGL C02 ( ) CAM, 08.2/0051/2001 ( ) UE, QLK1-CT ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Amblar, M., Viegas, S.C., López, P., and Arraiano, C.M. (2004). Homologous and heterologous expression of RNase III from Lactococcus lactis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323,

121 Biología Molecular de Bacterias Gram-positivas / Molecular Biology of Gram-positive Bacteria Fernández de Palencia, P., De la Plaza, M., Mohedano, M.A., Martínez-Cuesta, M.C., Requena, T. López, P., and Peláez, C. (2004). Enhancement of 2-methylbutanal formation in cheese by using a fluorescently tagged lacticin 3147 producing Lactococcus lactis strain. Int. J. Food Microbiol. 93, Ramos, A., Neves, R., Ventura, R., Maycock, C., López, P., and Santos, H. (2004). Effect of pyruvate kinase overproduction on glucose metabolism of Lactococcus lactis. Microbiology 150, Viegas, S.C., Fernández de Palencia, P., Amblar, M., Arraiano, C.M., and López, P. (2004). Development of an inducible system to control and easily monitor gene expression in Lactococcus lactis. Plasmid 51, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Mohedano, M.L., Overweg, K., De la Fuente, A., Reuter, M., Altabe, S., Mulholland, F., De Mendoza, D., López, P., and Wells, J. (2005). Inducible expression of the essential response regulator YycF in S. pneumoniae modulates expression of genes involved in fatty acid biosynthesis and affects membrane composition. J. Bacteriol. (en prensa/in press). Patentes/Patents López, P., Werning, M.L., Irastorza, A., Dueñas, M.T., Ibarburu, I., y Navas, J. (2004). Secuencias, vectores y células GTF y sus aplicaciones en el sector alimentario. Pat. española Nº López, P., Werning, M.L., Irastorza, A., Dueñas, M.T., Ibarburu, I., y Navas, J. (2004). Procedimiento de detección molecular de bacterias ácido lácticas productoras de β-glucanos. Pat. española Nº

122 Péptidos antibióticos eucarióticos Eukaryotic antibiotic peptides LUIS IGNACIO RIVAS LÓPEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist MARIA I. COLMENARES BRUNET (Hasta XI-2003) ESTHER GUERRERO POZUELO (2003) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows JUAN ROMÁN LUQUE-ORTEGA JOSÉ MARÍA SAUGAR CRUZ B. Predoctorales / Graduate Students ELENA SIERRRA FILARDI (2003) Personal Técnico / Technician Palabras Clave: Péptidos antimicrobianos, Resistencia a antibiótico, Leishmania, Acinetobacter El desarrollo de resistencias a los antibióticos en uso es un fenómeno común a la práctica totalidad de los patógenos. La línea principal de nuestro grupo es el diseño, ensayo, y elucidación del mecanismo de acción de nuevas moléculas que puedan revertir esta situación alarmante, especialmente de aquellas que actúan mediante permeabilización de membrana o alteración del metabolismo bioenergético del patógeno. Péptidos antibióticos eucarióticos (PAEs) Son componentes de la inmunidad innata, que actúan como una primera barrera de defensa frente a la invasión por patógenos. Existe una evidencia creciente de la modulación del sistema inmune por determinados péptidos. Su interés farmacológico reside en la baja inducción de resistencias frente a los mismos. 1.a.-Actuación de PAEs sobre Leishmania. Se han continuado los estudios sobre el efecto leishmanicida de péptidos híbridos cecropina A-melitina, en colaboración con Keywords: Antimicrobial peptides, Antibiotic resistance, Leishmania, Acinetobacter The growing incidence of antibiotic-resistant pathogens is a world wide spread problem, raising a deep concern in the treatment of infectious diseases. Our group is involved in the assay, design and elucidation of the mechanism of action of new leads that may contribute to solve this alarming situation, with higher interest in those targeting the permeabilization of the plasma membrane or impairment of the bioenergetic metabolisms of the pathogens. Eukaryotic antibiotic peptides (EAPs) They are components of the innate immunity, acting as a first barrier against the invading pathogen; aside from this major role, some of them are also capable of modulating the immune system. Their pharmacological application is based on the extremely low rate of resistance induction, together with their lethal activity on a broad range of susceptible pathogens. 1a.-Leishmanicidal activity of EAPs. We have continued our work on the leishmanicidal effect of 111

123 Péptidos antibióticos eucarióticos / Eukaryotic antibiotic peptides Figura 1.- Microscopía confocal de promastigotes de Leishmania marcados con: A.-Mitotracker red( marcador de mitocondria). B-15 mm Histatina 5 fluoresceinada. C.-Sobreposición de las fotos A+B. Figure 1.- Confocal microscopy of Leishmania promastigotes labelled with: A.-Mitotracker Red (mitochondrial marker). B.- Parasites incubated with 15 mm fluoresceinated Histatin 5. C.- Superposition of A+B. el Prof. David Andreu (U. Pompeu Fabra). Las conclusiones obtenidas son: i).-hay un efecto letal directo medido por permeabilización de la membrana plasmática, incluso con análogos activos de tan sólo 11 residuos. ii).-en macrófagos infectados, el mecanismo letal se basa en la inducción de la óxido nítrico sintasa. Mediante patch-clamp (Dra. C. Valenzuela Instituto de Farmacología UCM-CSIC) y sondas fluorescentes dependientes del potencial, se ha demostrado la permeabilización transitoria de la membrana del macrófago, con liberación de ATP y señalización a través de receptores purinérgicos, validado con macrófagos de ratones knock-out en NOS2 y extendido a PAEs propios del ratón, como nuevo mecanismo de señalización con relevancia fisiológica (Prof. M. Fresno, CBM, Prof. Mª Teresa Miras, UCM). iii).-la administración de dichos péptidos en perros con infección natural de Leishmania disminuye la tasa de parásitos circulantes, demostrando su aplicación farmacológica (Dr. J. Alberola, UAB). Otros péptidos cuyo diseño y mecanismo de acción leishmanicida han sido estudiados son magaininas y temporinas de anfibios. La histatina, un PAE de la saliva, actúa mediante un mecathe synthetic cecropin A-melittin hybrid peptides, in collaboration with Prof. David Andreu (U. Pompeu Fabra). The main conclusions are as follows: i).-these peptides cause a lethal hit on the parasite through plasma membrane permeabilization, even with shortened analogues of only 11 residues. ii) They also eliminate intracellular parasites by induction of the expression of nitric oxide synthase in the macrophage, their host cell. According to the results obtained with potential-sensitive fluorescent dyes, and patch-clamp experiments (Dra. Carmen Valenzuela Institute of Pharmacology, CSIC), the peptides induce a transitory permabilization of the plasma membrane of the macrophage, with ATP release, and subsequent signalling through purinergic receptors. The physiological relevance of these results were extended to other EAPs, including those from mouse and validated on macrophages from NOS2 knock-out mice. iii).-the intravenous administration of these peptides in naturally Leishmania infected dogs caused a decrease in the rate of circulating parasites (Dr. Jordi Alberola, UAB). The design and mechanism of leishmanicidal activity of other PAEs, such as temporins and magainins, both isolated from Amphibia, were also studied. Histatin 5, a EAP isolated from saliva, showed an alternative leishmanicidal mechanism, acting by interference with the bioenergetic metabolism of the parasite. 1.b.-Activity of PAE on Gram-negative bacteria with a relevant clinical incidence. 112

124 Péptidos antibióticos eucarióticos / Eukaryotic antibiotic peptides nismo alternativo, basado en la interferencia en la bioenergética del parásito. 1.b.-Actividad de péptidos antibióticos sobre bacterias gram negativas de interés clínico Acinetobacter baumannii actúa como patógeno oportunista, y de alta peligrosidad en pacientes inmunodeprimidos por su alta capacidad de inducción de resistencias, incluyendo polimixina, el último fármaco universalmente eficaz contra Acinetobacter. Polimixina y los péptidos antibióticos cecropina A-melitina muestran pequeñas diferencias en sus respectivos mecanismos de acción sobre Acinetobacter. Se ha demostrado la efectividad de dichos péptidos sobre aislados clínicos de Acinetobacter resistentes a polimixina, causada por la modificación del lipopolisacárido (colaboración con Dr. J. Pachón H.U. Virgen del Rocío, Sevilla). Se ha iniciado una colaboración con el Dr. F. Larcher (CIE- MAT) para la posible aplicación clínica de péptidos antibióticos naturales mediante terapia génica. Mecanismo de acción de nuevos fármacos leishmanicidas La musalonona, una fitoalexina inducida por hongos en el platanero (Prof. Javier Luis Universidad de la Laguna) actúa en Leishmania mediante inhibición del complejo II de la mitocondria. Se ha iniciado el estudio de las vías de actuación de alquilfosfolípidos sobre Leishmania mediante análogos fluorescentes desarrollados por los Profs. A.Ulises (IQFR-CSIC) y Francisco Amat (IQO-CSIC), con el fin de definir las vías de incorporación y localización de dichos fármacos en el parásito y en el macrófago infectado. Acinetobacter baumannii is a Gram negative bacteria that acts as an opportunistic pathogen, with high incidence on immunodepressed patients. It is endowed with an outstanding capacity to develop resistance against the common antibiotics, including polymyxins, the last universal active antibiotic against this pathogen. According to our previous results, cecropin A-melittin peptides and polymyxin showed slight differences in their respective bactericidal mechanism on Acinetobacter; in fact, the cecropin A-melittin peptides are active on polymyxin resistant clinical isolates of Acinetobacter, regardless of the lypopolysaccharide modification, responsible for polymyxin resistance (collaboration with Dr. Jerónimo Pachón HU Virgen del Rocío Sevilla). There is an ongoing collaboration with Dr. Fernando Larcher (CIEMAT, Madrid) on the putative application of these peptides on clinics using gene therapy. Mechanisms of action of new leishamnicidal drugs Musalonone is a phytoalexin produced by the banana-tree under fungal elicitation (Prof. Javier Luis, La Laguna University). Its leishmanicidal activity is based on the inhibition of the mitochondrial complex II of the parasite. In order to seek the uptake and accumulation pathways in parasites and infected macrophages of alkylphospholipids, as oral leishmanicidal agents, we are currently using some of their fluorescent analogues synthesized by Profs. A.Ulises (IQFR-and IQO-CSIC)and Francisco Amat (IQO-CSIC). Organismos Financiadores/Funding Agencies CAM, programa de grupos estratégicos ( ) UE, QLK2-CT ( ) CAM, 08.2/0054/ ( ) FIS, Redes temáticas de investigación cooperativa F03/C14 ( ) DGCYT, BIO CO2-O2 ( ) 113

125 Péptidos antibióticos eucarióticos / Eukaryotic antibiotic peptides Tesis Doctorales/Doctoral Theses Esther Guerrero Pozuelo. Nuevas alternativas terapéuticas mediante utilización de péptidos antibióticos de origen eucariótico en infecciones producidas por Leishmania. Universidad Complutense de Madrid, Abril Director: L.I. Rivas. José María Saugar Cruz. La membrana plasmática como blanco terapéutico de nuevos fármacos leishmanicidas. Universidad Complutense de Madrid, Marzo Director: L.I. Rivas. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Bayo, N., Jiménez, J.C., Rivas, L., Nicolás, E., and Albericio, F. (2003). Solid-phase synthesis of the cyclic lipononadepsipeptide [N-Mst(Ser1), d-ser4, L-Thr6, L-Asp8, L-Thr9]syringotoxin. Chemistry. 9, Luque-Ortega, J.R., Saugar, J.M., Chiva, C., Andreu, D., and Rivas, L. (2003). Identification of new leishmanicidal peptide lead structures by automated real-time monitoring of changes in intracellular ATP. Biochem. J. 375, Rivas, L., and Andreu, D. (2003). Péptidos antibióticos eucarióticos, una alternativa en la práctica clínica. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 21, Alberola, J., Rodríguez, A., Francino, O., Roura, X., Rivas, L., and Andreu, D. (2004). Safety and efficacy of antimicrobial peptides against naturally acquired leishmaniasis. Antimicrob. Agents Chemother. 48, Carretero, M., Del Río, M., García, M., Escámez, M.J., Mirones, I., Rivas, L., Balagué, C., Jorcano, J.L., and Larcher, F. (2004). A cutaneous gene therapy approach to treat infection through keratinocyte-targeted overexpression of antimicrobial peptides. FASEB J. 18, Colmenares, M., Corbí, A.L., Turco, S.J., and Rivas, L. (2004). The dendritic cell receptor DC-SIGN discriminates among species and life cycle forms of Leishmania. J. Immunol. 172, Guerrero, E., Saugar, J.M., Matsuzaki, K., and Rivas, L. (2004). Role of positional hydrophobicity in the leishmanicidal activity of magainin 2. Antimicrob. Agents Chemother. 48, Luque-Ortega, J.R., Martínez, S., Saugar, J.M., Izquierdo, L.R., Abad, T., Luis, J.G., Piñero, J., Valladares, B., and Rivas, L. (2004). Fungus-elicited metabolites from plants as an enriched source for new leishmanicidal agents: antifungal phenylphenalenone phytoalexins from the banana plant (Musa acuminata) target mitochondria of Leishmania donovani promastigotes. Antimicrob. Agents Chemother. 48, Plasencia, I., Rivas, L., Keough, K.M., Marsh, D., and Pérez-Gil, J. (2004). The N-terminal segment of pulmonary surfactant lipopeptide SP-C has intrinsic propensity to interact with and perturb phospholipid bilayers. Biochem J. 377, Puig-Kröger, A., Serrano-Gómez, D., Caparrós, E., Domínguez-Soto, A., Relloso, M., Colmenares, M., Martínez-Muñoz, L., Longo, N., Sánchez-Sánchez, N., Rincón, M., Rivas, L., Sánchez-Mateos, P., Fernández-Ruiz, E., and Corbí, A.L. (2004). Regulated expression of the pathogen receptor dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3)-grabbing nonintegrin in THP-1 human leukemic cells, monocytes, and macrophages. J. Biol. Chem. 279,

126 Péptidos antibióticos eucarióticos / Eukaryotic antibiotic peptides Rivas, L., Moreno, J., Cañavate, C., and Alvar, J. (2004). Virulence and disease in leishmaniasis: what is relevant for the patient? Trends Parasitol. 20, Contribuciones a Libros/Contributions to Books Rivas, L., and Andreu, D. (2003). Cecropin-melittin hybrid peptides as versatile templates in the development of membrane active antibiotics agents. In: Pore-forming peptides and protein toxins. G. Menestrina and M. Dalla Serra eds. (Reading Berkshire, Harwood Academic Publishers), pp Próximos Artículos/Forthcoming Articles Mangoni, M.L., Saugar, J.M., Dellisanti, M., Barra, D., Simmaco, M., and Rivas L. (2005). Temporins, small antimicrobial peptides with leishmanicidal activity. J. Biol. Chem. 280,

127 FtsZ, Tubulina y Bioinformática FtsZ, Tubulin and Bioinformatics JOSÉ MANUEL ANDREU MORALES Jefe de Grupo / Group Leader JOSÉ FERNANDO DÍAZ PEREIRA Investigadores de Carrera / Staff Scientists PABLO CHACÓN MONTES (Desde VI-2003) Investigadora contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist ANA MARIA GARCIA CARRIL SONIA HUECAS GAYO B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows WANIUS GARCÍA DA SILVA (IX a XII, 2004) JOSÉ IGNACIO GARZÓN CAÑAS (Desde III-2004) VANESSA HERVES GÓMEZ (Desde III-2004) JOSÉ RAMÓN LÓPEZ BLANCO (Desde X-2004) RUBEN MARTINEZ BUEY MARÍA ANGELA OLIVA BLANCO B. Predoctoral / Graduate Student HUGO YÉBENES REVUELTO Estudiante / Student MARTÍN ALBA SÁNCHEZ (Desde I-2002) Personal Técnico / Technician Palabras clave: Proteínas, Citoesqueleto, División celular, Complejos macromoleculares, Bioinformática Tanto las células eucarióticas como las procarióticas utilizan proteínas y complejos macromoleculares que ensamblan para realizar funciones esenciales para la segregación de DNA, la división, la forma y la polaridad celulares. La familia de proteínas de la tubulina está constituida por GTPasas atípicas que ensamblan dinámicamente formando diversas estructuras subcelulares. Nuestro trabajo consiste en determinar las interacciones funcionales de FtsZ y tubulina, empleando para ello diversos métodos bioquímicos y biofísicos, así como en el desarrollo de nuevos métodos computacionales para el análisis y modelado de estructuras macromoleculares. Keywords: Proteins, Cytoskeleton, Cell division, Macromolecular complexes, Bioinformatics Both eukaryotic and prokaryotic cells use dynamic protein assemblies and macromolecular complexes to perform central roles in DNA segregation, cell division, cell shape and polarity. The tubulin family of proteins is constituted by atypical GTPases which self-assemble forming different subcellular structures. Our work focuses, on one hand, on the functional interactions of FtsZ and tubulin, employing diverse biochemical and biophysical approaches, and on the other, on the development of innovative computational techniques for the analysis and modeling of macromolecular structures. 116

128 FtsZ, Tubulina y Bioinformática / FtsZ, Tubulin and Bioinformatics Figura.- La localización del sitio de unión del taxol en los microtúbulos es objeto de controversia. A pesar de que en el modelo de estructura de alta resolución del microtúbulo (Nogales et al., (1999) Cell, 96, 79-88) el sitio está situado en la cavidad luminal de éste, siendo por tanto de difícil acceso una vez el microtúbulo está formado, la cinética de asociación del ligando a microtúbulos preformados indica un sitio accesible (Díaz et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, ). Más aun taxoles fluoresceínados unidos al sitio de unión son accesibles a anticuerpos (Díaz et al., (2005) J. Biol. Chem. en prensa). La figura muestra (A) Modelo de una molécula de 7- Hexaflutax, un taxol fluoresceinado unida al sitio en el modelo de microtúbulo de Nogales et al. (B) Modelo de un complejo Fab-Hexaflutaxmicrotúbulo en la configuración de mínimo conflicto estérico, obsérvese como el anticuerpo tendría que interpenetrar la proteína para poder unirse al epítopo de fluoresceina. Figure.- The location of taxol binding site in microtubules is controversial. While in the high resolution model structure of microtubules (Nogales et al., (1999) Cell, 96, 79-88) the binding site is in the luminal cavity so with a restricted accesibility in preformed microtubule, the fast association kinetic rate of taxoids to assembled microtubules indicates an accesible site (Díaz et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, ). Moreover fluoresceinated taxoids bound to microtubules are accesible to antibodies (Díaz et al., (2005) J. Biol. Chem. in press). The figure shows (A) Model of a molecule of 7-Hexaflutax, a fluoresceinated taxoid bound to the site in the model of Nogales et al. (B) Model of a Fab-Hexafluax-microtubule complex in the minimal steric conflict configuration,note that the antibody would have to interpenetrate the protein to reach the fluorescein epitope. Ensamblaje de FtsZ y de tubulina bacteriana La proteína de división celular procariótica FtsZ ensambla formando el anillo citoquinético, y es una diana para el desarrollo de nuevos antibióticos. FtsZ es estructuralmente homóloga de la alfabeta-tubulina eucariótica, que ensambla formando, entre otros, los microtúbulos del huso mitótico, diana de conocidos antitumorales. Hemos determinado aspectos bioquímicos básicos de FtsZ, incluyendo su desplegamiento reversible, el posible mecanismo de activación por GTP, el papel de la hidrólisis del nucleótido, y la estructura de sus polímeros. El ensamblaje de FtsZ es reversible como el de tubulina, pero a diferen- Assembly of FtsZ and bacterial tubulin The bacterial cell division protein FtsZ assembles forming the cytokinetic ring, whose structure has resisted electron microscopy, and is a target for the development of new antibiotics. FtsZ is structurally homologous to eukatryotic alphabetatubulin, which assembles forming microtubules and the mitotic spindle, a target of known antitumor compounds. We have determined basic biochemical aspects of FtsZ, including its reversible unfolding, a possible mechanism of activation by GTP, the destabilizing role of nucleotide hydrolysis and the structure of its polymers. FtsZ assembly is reversible, but at dif- 117

129 FtsZ, Tubulina y Bioinformática / FtsZ, Tubulin and Bioinformatics cia de los microtúbulos, no se conocen los mecanismos dinámicos de sus polímeros, que estamos investigando. Las tubulinas bacterianas A y B (BtubA y BtubB), cuyos genes han sido descubiertos en Prosthecobacter, son mucho más cercanas que FtsZ a la tubulina eucariótica, y su función se desconoce. Disponemos de los sistemas de expresión en E. coli y purificación de BtubA + BtubB, que une nucleotido, es estable, y ensambla formando polímeros grandes constituidos por protofilamentos semejantes a los de los microtúbulos. La determinación de la capacidad de plegamiento y dimerización de Btub, de su actividad GTPasa, y de la estructura y dinámica de sus polímeros nos facilitará la comprensión de sus posibles funciones celulares, y puede permitir experimentos difícilmente realizables con la tubulina eucariótica, como la utilización de subunidades aisladas o la producción efectiva y cristalización de proteínas mutantes, y una mejor comprensión de los mecanismos funcionales de la familia de proteínas de la tubulina. Interacción de los sitios regulatorios de tubulina con sus ligandos activadores Estudiamos el modo en el que los sitios regulatorios de tubulina eucariótica modulan su estado de activación. En su estado activado esta proteína ensambla para formar los microtúbulos que son en último extremo responsables de la segregación cromosómica. La modulación farmacológica de esta activación y por tanto de la dinámica de los microtúbulos constituye un método evidente de quimioterapia antitumoral. Hasta el descubrimiento del taxol, un compuesto con capacidad estabilizadora de microtúbulos, los antimitóticos que ejercían su acción modulando la tubulina eran todos desactivantes (vinblastina, vincristina, colchicina) y por tanto bloqueaban su capacidad de formar microtúbulos impidiendo la formación del huso mitótico o reduciendo su dinámica. El taxol tiene el efecto contrario, se une a los microtúbulos impidiendo su desensamblaje y estabilizando el huso. En los últimos años hemos asistido a la aparición de nuevos ligandos con capacidad estabilizadora de microtúbulos (Epotilonas, sarcodictinas, laulimalida, discodermolida, eleuterobinas,.). Hemos reunido una amplia colección de estos compuestos debido a colaboraciones con los grupos que los han purificado y/o sintetizado y se está realizando un estudio completo de la interacción de estos ligandos con sus sitios en la tubulina o los microtúbulos clasificándolos de acuerdo a su sitio de unión ference with tubulin microtubules, the dynamic mechanisms of its polymers are not well known and constitutes a subject of our research. Bacterial tubulins A and B (BtubA and BtubB), whose genes have been discovered in the genome of the poorly studied bacterium Prosthecobacter, are much closer to eucaryotic tubulin than FtsZ, and their function is unknown. We have systems for expression in E. coli and purification of BtubA + BtubB, which bind nucleotide and assemble, with GTP and magnesium, forming large polymers made of microtubule-like protofilaments. The determination of the folding and dimerization ability of Btub, its GTPase activity, and the structuture and dynamics of its polymers will facilitate a better understanding of their possible cellular functions, and will permit experiments hardly feasible before with eukaryotic tubulin, such as studying isolated A and B subunits, or the preparation and crystallization of mutants, leading of a better knowledge of the functional mechanisms of the tubulin family of proteins. Interaction of tubulin regulatory sites with their activating ligands We study the way in which the tubulin regulatory sites modulate the tubulin activation state. In its activated state this protein assembles to form microtubules, which participate in the segregation of the chromosomes during cell division. The pharmacological modulation of these cycles and subsequently of microtubule dynamics, is a current approach in antitumour chemotherapy. Before the discovery of taxol, a compound with the capacity of stabilize microtubules, the tubulin-interacting antimitotic compounds were microtubule destabilizers (vinblastine, vincristine, colchicine) which blocked tubulin in the inactive state, avoiding the formation of the mitotic spindle. Taxol has the opposite effect; it binds microtubules, stabilizing the mitotic spindle. In recent years a large set of new ligands with microtubule stabilizing capacity has shown up (epothilones, sarcodyctin, laulimalide, discodermolide, eleutherobin,.). During the course of collaborations with the groups that have purified or synthesized those ligands we have collected many of them, and we are addressing a complete study of the interaction of these ligands with their tubulin or microtubule binding sites, classifying them according to their binding sites, studying the structure/activity relationship of the tubulin activating ligands 118

130 FtsZ, Tubulina y Bioinformática / FtsZ, Tubulin and Bioinformatics y obteniendo parámetros de la relación estructura actividad dichos ligandos activadores de tubulina. Se está trabajando en la determinación de las conformaciones unidas y libres de los ligandos y de sus epítopos de interaccíón, en la caracterización estructural de los sitios y en el desarrollo de ensayos de cribaje para ligandos de sitios de unión distintos del de taxol. Bioinformática Estructural La visión multidisciplinar del grupo se completa con una sección dedicada exclusivamente a Bioinformática, que trabaja en el desarrollo de nuevos métodos computacionales. Esta línea de investigación comprende: Integración de datos estructurales a diferentes resoluciones. La combinación datos estructurales a resolución atómica con estructuras a media-baja resolución permite obtener información relevante de aspectos funcionales de los sistemas biológicos. Estamos inmersos en el desarrollo de herramientas bioinformáticas para ajustar estructuras atómicas en mapas a media-baja resolución de microscopía electrónica. En concreto, nuestras investigaciones se centran en alcanzar los límites de eficiencia y aplicabilidad de las actuales implementaciones. Estudio de la dinámica de grandes complejos macromoleculares. Conocer o predecir cómo se mueve una proteína nos permite relacionar directamente su estructura con la función biológica que realiza. Nuestros esfuerzos en este campo se centran en la predicción de la flexibilidad de grandes complejos macromoleculares usando análisis modal (NMA). Modelado de datos de dispersión de Rayos X en solución (SAXS). La determinación de la forma y tamaño de proteínas a partir de datos de SAXS mediante modelado computacional es una alternativa muy interesante y altamente complementaria a otras técnicas experimentales como EM. El grupo, pionero en este campo, continúa su labor en el desarrollo y uso de nuevas herramientas bioinformáticas para el modelado de SAXS. and determining the free and bound conformation of the ligands and of their binding epitopes. We continue working in the structural location of the binding sites on microtubules and the development of screening assays for ligands with binding sites different from the taxol binding site. Structural Bioinformatics To complete a multidisciplinary view of our structural studies, a section of the lab, entirely dedicated to Bioinformatics, works on the development of new computational techniques comprising the following: The integration of structural data at different resolution. Bridging the resolution gap between atomic structures with lowmedium resolution structures obtained with different biophysical techniques will offer a directly understanding of functional aspects of biological systems. We are developing bioinformatics tools for rigid-body docking of atomic resolution structures with low-medium resolution densities from electron microscopy (EM) maps. Our research is centered on achieving the efficiency limits and expand the flexibility/applicability of the current docking tools implementations. Study of the structural dynamics of large complexes. The protein motion often provides an essential linkage between structure and function. We focus our attention on recent efforts to predict flexibility of large systems using Normal Mode Analysis. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) modeling. Shape and size ab initio determination with solution scattering using computational modeling emerges as a powerful low-resolution approach, very complementary to other structural techniques (e.g. EM). The group made pioneering contributions in this field and continues to develop and use of new computational tools for SAXS modeling. 119

131 FtsZ, Tubulina y Bioinformática / FtsZ, Tubulin and Bioinformatics Organismos Financiadores/Funding Agencies CAM, Programa de Grupos Estratégicos ( ) MCyT, BIO ( ) Programas FPI, FPU ( ) MCyT, BIO ( ) Programa i3p CSIC (2003) CAM, 07B/0026/2002 ( ) Fund. BBVA ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Abal, M, Andreu, J.M., and Barasoaín, I. (2003). Taxanes: microtubule and centrosome targets and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr. Cancer Drug Targets 3, Boskovic J., Rivera-Calzada, A., Maman, J.D., Chacón, P., Willison, K.R., Pearl, L.H., and Llorca, O. (2003). Visualisation of DNAinduced conformational changes in the DNA repair kinase DNA-PKcs. EMBO J. 22, Diaz, J.F., Barasoaín, I., and Andreu, J.M. (2003). Fast kinetics of taxol binding to microtubules. Effects of solution variables and microtubule-associated proteins. J. Biol. Chem. 278, González, J.M., Jiménez, M., Vélez, M., Mingorance, J., Andreu, J.M., Vicente, M., and Rivas, G. (2003). Essential cell division protein FtsZ assembles into one monomer-thick ribbons under conditions resembling the crowded intracellular environment. J. Biol. Chem. 278, Huecas, S., and Andreu, J.M. (2003). Energetics of the cooperative assembly of cell division protein FtsZ and the nucleotide hydrolysis switch. J. Biol. Chem. 278, Oliva, M.A., Huecas, S., Palacios, J.M., Martín-Benito, J., Valpuesta, J.M., and Andreu, J.M. (2003). Assembly of archaeal cell division protein FtsZ and a GTPase inactive mutant into double-stranded filaments. J. Biol. Chem. 278, Santos-Sierra, S., Lemmonier, M., Nuñez, B., Hargreaves, D., Raftery, J., Giraldo, R., Andreu, J.M., and Díaz-Orejas, R. (2003). Non-cytotoxic variants of the Kid regulatory protein that retain their auto-regulatory activity. Plasmid 50, Balsera, M., Menéndez, M., Saiz, J.L., de las Rivas, J., Andreu, J.M., and Arellano, J.B. (2004). Structural stability of the PsbQ protein of higher plant photosystem. II. Biochemistry 43, Devred, F., Barbier, P., Douillard, S., Monasterio, O., Andreu, J.M., and Peyrot,V. (2004). Tau induces ring and microtubule formation from alpha-beta tubulin dimers under non-assembly conditions. Biochemistry 43, Gaitanos, T.N., Buey, R.M., Díaz, J.F., Northcote, P.T., Teesdale, S.P., Andreu, J.M., and Miller, J.H. (2004). Peloruside A does not bind to the taxoid site on beta-tubulin and retains its activity in multidrug resistant cell lines. Cancer Res. 64,

132 FtsZ, Tubulina y Bioinformática / FtsZ, Tubulin and Bioinformatics Huecas, S., and Andreu, J.M. (2004). Polymerization of nucleotide-free, GDP- and GTP-bound cell divison protein FtsZ: GDP makes the difference. FEBS Lett. 569, Kovacs, J., Chacón, P., and Abagyan, R. (2004). Predictions of Protein Flexibility: First Order Measures. Proteins: Struct. Funct. Bioinf. 56, Martínez-Buey, R., Díaz, J.F., Andreu, J.M., O Brate, A., Giannakakou, P., Nicolaou, K.C., Sasmai, P.K., Ritzen, A., and Namoto, K. (2004). Interaction of epothilone analogs with the paclitaxel binding site. Relationship between binding affinity, microtubule stabilization and cytotoxicity. Chem. Biol. 11, Comentado por Kingston, D.G.I. What makes epothilones stick? Chem. Biol. 11, Contribuciones a Libros/Contributions to Books Andreu, J.M., Oliva, M.A., and Huecas, S. (2004). FtsZ folding, self-association, activation and assembly, in Molecules in time and space: bacterial shape, division and phylogeny (Eds. Vicente, M., Valencia, A., Tamames, J., Mingorance, J.), Kluwer Academic Publishers, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Bertrand, S., Barthelemy, I., Oliva, M.A., Carrascosa, J.L., Andreu, J.M., and Valpuesta, J.M. (2004). Folding, stability and polymerization properties of FtsZ chimeras with inserted tubulin loops involved in the interaction with the cytosolic chaperonin CCT and in microtubule formation. J. Mol. Biol. (en prensa/in press). Díaz, J.F-, Barasoain, I., Souto, A.A., Amat-Guerr, I.F., and Andreu, J.M. (2004). Macromolecular accessibility of fluorescent taxoids bound at a paclitaxel binding site in the microtubule surface. J. Biol. Chem. (en prensa/in press). 121

133 Parasitología Molecular Molecular Parasitology VICENTE LARRAGA RODRÍGUEZ DE VERA Jefe de Grupo / Group Leader MARÍA COLMENARES BRUNET (Desde X-2004) Investigadores de Carrera / Staff Scientists ANA MARÍA ALONSO AYALA B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow PEDRO ALCOLEA ALCOLEA (Desde I-2004) TOBÍAS HANKE SCHAFFER (Hasta XII-2003) Mª JESÚS RAMIRO IBAÑEZ (Hasta XII-2003) IRENE RAMOS LÓPEZ (Desde I-2004) B. Predoctorales / Graduate Students Palabras clave: Vacuna, Leishmania, Presentación de antígeno, Mecanismo de respuesta inmune La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria producida por protozoos del género Leishmania perteneciente a la familia de los Tripanosomátidos. Se presenta en forma cutánea o mucocutánea que puede curar espontáneamente o no, dependiendo de la respuesta inmune del huésped. La forma visceral de la enfermedad es mortal sin tratamiento. Es una enfermedad endémica que afecta a 15 millones de personas, con 2 millones de nuevos casos al año, en 88 países de las zonas tropicales y templadas (el 88% de ellos en vías de desarrollo) constituyendo, debido a sus síntomas generales, un obstáculo importante para la realización de proyectos de desarrollo. En Europa es también endémica y ha tenido un incremento importante en los últimos años, fundamentalmente en personas inmunodeprimidas. En España el huésped intermediario es el perro con unos porcentajes de infestación que varían entre el 10 y el 25 por ciento, con zonas de incidencia más elevada. La mayor parte de los estudios sobre la respuesta del sistema inmune frente a la infección se han llevado a cabo en el modelo murino (Balb/C). Estos estudios han permitido determinar qué mutantes defectivos en las moléculas de clase II del MHC son incapaces de controlar la infección por el parásito y su multiplicación, sugiriendo que las células T res- Keywords: Vaccine, Leishmania, Antigen presentation, Immune response mechanism Leishmaniasis is a parasitic disease caused by protozoa of the genus Leishmania, included in the Trypanosomatid family. Clinical manifestations include cutaneous and mucocutaneous forms that can be self-limiting or not, depending on the host immune response, and the most severe visceral form that is deadly if untreated. Leishmaniasis is endemic in 88 countries from tropical and subtropical areas (88% of them under-developing countries), and affect 15 million people, with 2 millions new cases per year, causing worldwide public-health problem that affect course of development projects. Leishmaniasis is also endemic in Europe, with an important increase in the last years, mainly due to its association with immunosupression processes. In Spain, dogs are the intermediate host, with variations in the percent of infection that range between 10 and 25%, although there are some areas with higher incidence. The majority of the studies related with the immune response produced against the infection have been done in mice (BALB/C). These studies have shown that mutants lacking the expression of MHC-I and MHC- II molecules are unable to control the parasite infection and its proliferation, suggesting that T lymphocytes restricted to MHC- I and MHC-II are essential for parasite resistance. It seems 122

134 Parasitología Molecular / Molecular Parasitology tringidas para las moléculas de clase II del MHC son esenciales para la resistencia frente al parásito. Parece claro que el balance entre las dos subpoblaciones de células CD4+, (Th1/Th2) determinan el proceso de desarrollo o contención que seguirá la infección, con una participación efectiva de las células CD 8 +. Una vez instaurada la enfermedad, sólo el tratamiento farmacológico se muestra, hasta el momento, efectivo. A pesar del esfuerzo realizado en los últimos años para avanzar en el conocimiento de la biología molecular del parásito, el tratamiento de la enfermedad sigue basado en el uso de los antimoniales pentavalentes, con una segunda línea de actuación basada en drogas como la Anfotericina B, las pentamidinas o el nuevo agente Miltefosina que ven mermada su eficacia en la clínica debido a la variabilidad del parásito. Éste, es capaz de modificar sus vías metabólicas bloqueadas por el fármaco evitando su acción, lo que unido a la toxicidad que producen en el paciente lleva a una pérdida en efectividad del tratamiento y a la aparición de recidivas. Así pues, resulta necesario el desarrollo de nuevas aproximaciones basadas en el conocimiento de mecanismos específicos del parásito que permitan el desarrollo de nuevas drogas de acción más específica y con menos efectos secundarios. En este contexto, estudios previos en Tripanosomátidos y en eucariotas superiores muestran que enzimas como la DNA polimerasa beta y la topoisomerasa II de Leishmania aparecen como un excelente blanco para el desarrollo de moléculas inhibidoras específicas. Por otra parte el desarrollo de vacunas efectivas aparece como una necesidad para combatir la enfermedad. En el laboratorio de Parasitología Molecular una de las líneas del laboratorio se ha centrado en la caracterización de estas proteínas susceptibles de convertirse en una diana especifica de fármacos efectivos frente a la enfermedad. Se ha caracterizado y clonado el gen de la Topoisomerasa II de L. infantum y se ha conseguido que sea funcional en experimentos de complementación en levaduras defectivas en el enzima. Se ha procedido a continuar con los estudios de la proteína ADN polimerasa beta implicada en el proceso de reparación de roturas de una sola base en el ADN (BER) que se ha obtenido en forma recombinante, se ha solubilizado y conseguido replegar en forma activa libre de detergentes. La proteína se ha caracterizado enzimáticamente y se ha visto que es diferente en sus requerimientos de las estudiadas hasta ahora en los tripanosoclear that the balance between the two subtypes of CD4+ T cells (Th1/Th2) determine the process of progression or resistance following infection, with an effective participation of CD8+ T cells. When the disease has been installed, at the present time, only pharmacological treatment seems to be effective. Beside the effort made in the last years in order to increase parasite molecular biology knowledge, the treatment of the disease still relies on the use of pentavalent antimonium compounds, with a second line of treatments based on other drugs such as Amphotericin B, Pentamidine or the new Miltefosine, which clinical efficiency is restricted by the parasite variability. The parasite is able to modify the methabolic pathways blocked by the drug, avoiding its action, that together with the toxicity produced in the patient, altogether causes the loss of treatment efficiency and the appearance of clinical relapses. Consequently, the design of new strategies based in the knowledge of parasite specific mechanisms that allow the development of new drugs with a more specific action and with less side effects, is necessary. In this context, previous studies in Trypanosomatids and in higher eukaryotes have shown that Leishmania enzymes such as the DNA beta polymerase and the topoisomerase II could be excellent targets for the development of specific inhibitory molecules. On the other side, the development of effective vaccines has emerged as a real need in order to defeat the disease. In the Molecular Parasitology Laboratory, one of the research projects has focused in the characterization of these proteins susceptible of being targets for effective drugs against leishmaniasis. The L. infantum topoisomerase II has been characterized, its gene cloned and moreover, we have been able to do functional complementation experiments in yeasts lacking the enzyme. We have also pursued with the study of the DNA betapolymerase implicated in one base excision DNA repair (BER), that has been obtained as recombinant, solubilized and refolded without detergents. The protein has been enzymatically characterized and we found that its requirements differed from other trypanosomatids similar enzymes, showing a more similar behaviour with higher eukaryotic cells as it also occusr with its cellular localization. In the research project oriented toward the development of an active recombinant vaccine against the infection by Leishmania, based on the LACK protein (analogue to the reac- 123

135 Parasitología Molecular / Molecular Parasitology mátidos mostrando un comportamiento similar al de las células de eucariotas superiores al igual que sucede en su localización celular. En la línea de trabajo del desarrollo de una vacuna recombinante activa frente a la infección por leishmaniosis mediante el uso del gen de la proteína LACK (análogo del receptor de proteína quinasa C activada) se han llevado a cabo experimentos que han mostrado que es activa e induce memoria frente a la infección por L. amazonensis. Por otra parte se ha continuado con los experimentos de protección que muestran que la vacuna LACK protege al menos en un 60% frente a la infección por L. infantum responsable de la leishmaniosis canina y un 80% frente a los síntomas clínicos de la enfermedad. En estos momentos, se está procediendo a realizar un estudio de campo para verificar la viabilidad de la vacuna. Dentro del estudio de los procesos que inducen protección se está comenzando a estudiar la implicación de los mecanismos de presentación de antígeno a través de la población de células dendríticas de los perros. Dentro de esta línea se procederá a generar células dendríticas in vitro a partir de monocitos de sangre periférica, mediante tratamiento con factores de crecimiento y citoquinas, para posteriormente estudiar su modo de interacción con promastigotes y amastigotes de L. infantum, y su capacidad de activar tanto la respuesta inmune innata como adquirida frente al parásito. Simultáneamente se determinará el grado de activación-maduración de dichas células en tejidos linfoides de perros con leishmaniosis con el objetivo de caracterizar el papel de las células dendríticas in vivo. Así mismo se estan estudiando los genes implicados en la sensibilidad o resistencia de L. infantum a la lisis por complemento, primer mecanismo utilizado por el huésped mamífero para defenderse de la infección. Este estudio se está llevando a cabo mediante la utilización de micro arrays. tive protein kinase C receptor) we have done experiments that have shown that is active and it induces memory against L. amazonensis infection. In addition, protection experiments in dogs challenged with L. infantum have shown a good level of protection with a minimum of 60% against the presence of the parasite (infection) and 80% for the clinical signs of the disease when infected with an inoculum one million times higher than the natural one. At present, a field trial is being carried out to determine the efficacy of the vaccine against the natural infection. The basic mechanism of defence against Leishmania infantum elicited by the vaccine is one of the topics studied by the Molecular Parasitology group. In this field we have focused our interest towards the antigen presentation process by dendritic cells (DC), one of the professional cells of the immune system, and likely related with protective mechanism in infected host. We are generating DC from peripheral monocytes by using growing factors and cytokines, in order to study the interaction with the two forms of the parasite, the extracellular promastigote and the intracellular amastigote. We also are interested in determining their ability to activate the innate and the acquired immune responses against Leishmania infection. At the same time, the maturation degree of DC present in sick dogs lymphoid tissues will be determined to know the role of DC in vivo. In addition the genes involved in the sensitivity or resistance to the complement attack, the first line of defence of the mammalian host against parasite, are being studied. This study is being carried out by using microarrays to detect activated or suppressed genes in a population of parasites resistant to the complement attack. Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, BIO P4-04 ( ) PN, AGL C02-01 ( ) Pfizer-CSIC ( ) 124

136 Parasitología Molecular / Molecular Parasitology Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Gómez Ochoa, P., Gascón, F.M, Lucientes, J., Larraga, V., and Castillo, J. (2003). Lactating females Syrian Hamster (Mesocricetus auratus) show protection against experimental Leishmania infantum infection. Vet. Parasitol. 10, Gómez-Ochoa, P., Castillo, J.A., Lucientes, J., and Larraga, V. (2003). EasyDat Leishmania: A direct agglutination test modification, that simplifies the serologic diagnosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology (ASM publication): CDLI# Hanke, T., Ramiro, M., Trigueros, S., Roca, J., and Larraga, V. (2003). Cloning, functional analysis and post-transcriptional regulation of a type II DNA Topoisomerase from Leishmania infantum. A new potential target for anti parasite drugs. Nucleic Acids Res. 31, Larraga, V. (2003). La biotecnología aplicada a la veterinaria. Vacunas recombinantes frente a leishmaniosis. Encontros Veterinarios pp Larraga, V. (2003). La pérdida de talentos científicos en España. Fundación Alternativas. Laboratorio de Alternativas Doc 22. Ramiro, M.J., and Larraga, V. (2003). Vacunas recombinantes contra la leishmaniosis. Historia natural, 2, noviembre. Ramiro, M.J., Zárate, J.J., Hanke, T., Rodriguez, D., Rodríguez, J.J., Esteban, M., Lucientes, J., Castillo, J.A., and Larraga, V. (2003). Protection in dogs against visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum is achieved by immunization with a heterologous prime-boost regime using DNA and vaccinia recombinant vectors expressing LACK. Vaccine 21, 19-20, Fonseca Pinto, E., Olmo Pinheiro, R., Rayol, A., Larraga, V., and Rossi-Bergman, B. (2004). Intradermal vaccination against cotaneous leishmaniasis using a particulated leishmanial antigen and LACK-DNA. Infect. Immun. 72, Larraga, V. (2004). La fuga de cerebros científicos. Una barrera para el desarrollo económico. Apuntes de Ciencia y Tecnología. 10, marzo pp

137 Replicación y Expresión del DNA en Bacterias Gram-positivas Replication and Expression of DNA in Gram-positive Bacteria Grupo I / Group I GLORIA DEL SOLAR DONGIL Jefe de Grupo / Group leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist LARISA CYBUSLKI (VI-VII, 2003) Investigadora Visitante / Visiting Scientist ANA MARIA HERNÁNDEZ ARRIAGA JOSÉ ANGEL RUIZ MASÓ B. Predoctorales / Graduate Students PATRICIA BURÓN MEDIAVILLA Personal Técnico / Technician Grupo II/ Group II MANUEL ESPINOSA PADRÓN Jefe de grupo / Group leader Investigador de Carrera / Staff Scientist CONCEPCIÓN NIETO MAZARRÓN Investigadora Contratada / Research Associate ANGELES PÉREZ OSEGUERA (IV-V, 2003) Investigadora Visitante / Visiting Scientist CARMEN DE ANTONIO PÉREZ (Hasta I-2004) B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow LUIS FABIÁN LORENZO DÍAZ (Desde I-2004) B. Predoctoral / Graduate Student Mª TERESA ALDA LÓPEZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Plásmidos, Replicación, Represión transcripcional, Sistemas toxina-antitoxina Replicación de pmv158 pmv158 replica por el mecanismo de círculo rodante, proceso iniciado por la proteína RepB en el origen de cadena doble, dso. Estudiamos algunas características físico-químicas de RepB y su interacción con el dso, así como los contactos de RepB con su DNA diana y la estabilidad de los complejos RepB- DNA. La helicasa PcrA de S. pneumoniae El gen pcra de Streptococcus pneumoniae codifica la proteína PcrA, una helicasa necesaria para la replicación de pmv158. Se ha clonado, secuenciado y caracterizado el gen pcra de pneumococos y su región promotora en S. pneumoniae y Escherichia Keywords: Plasmids, Replication, Transcriptional repression, Toxin-antitoxin systems Replication of pmv158 pmv158 replicates by the rolling circle mechanism, a process initiated by the plasmid-encoded RepB protein at the double-stranded origin, dso. We have studied some physicochemical features of RepB as well as the interactions RepB-dso by determining: i) RepB-DNA contacts, and ii) stability of the RepB-DNA complexes. The PcrA helicase of S. pneumoniae Gene pcra of S. pneumoniae encodes protein PcrA, a helicase involved in replication of pmv158. Gene pcra, together with its promoter region, has been cloned, sequenced and characterized both in S. pneumoniae and in Escherichia coli. We 126

138 Replicación y Expresión del DNA en Bacterias Gram-positivas / Replication and Expression of DNA in Gram-positive Bacteria coli. Se han realizado ensayos de actividad y de complementación entre proteínas PcrA de pneumococos y estafilococos. El represor CopG CopG controla la replicación de pmv158 mediante represión de la transcripción del gen repb. CopG se une a una región de DNA que contiene el promotor Pcr, desde donde se co-transcriben los genes copg y repb. CopG, prototipo de una familia de represores transcripcionales codificados por plásmidos, es un homodímero esférico de 45 residuos. Cuatro dímeros de CopG se unen al DNA diana, de unos 50 pares de bases. CopG tiene una organización ribbon-helix-helix, similar a los represores Arc, Mnt y MetJ. Se ha estudiado también el mecanismo de represión mediada por CopG en el promotor Pcr, así como los requerimientos de secuencia de la diana de la proteína. El plásmido pt38 de S. thermophilus Se ha secuenciado y caracterizado este plásmido, de interés en bacterias lácticas. Replica por el mecanismo de círculo rodante y presenta una región de DNA homóloga al dso de pc194. Se ha mostrado la existencia de un RNA contratranscrito que controlaría su replicación. Movilización de pmv158 pmv158 es movilizable mediante funciones aportadas por el propio plásmido (proteína MobM) y por plásmidos auxiliares. MobM introduce un corte específico en el origen de transferencia, orit. Se ha trabajado en: i) optimización de la purificación de MobM; ii) caracterización estructural de la proteína mediante análisis de dicroismo circular y fluorescencia; iii) asociación de MobM a las membranas celulares; iv) modelado molecular de una región de la proteína. Se han desarrollado vectores con el replicón de pmv158 que son movilizables y que expresan la proteína fluorescente verde en diferentes bacterias Gram-positivas. El regulón mal de S. pneumoniae La proteína MalR pertenece a la familia de represores LacI/GalR y está implicada en el control de la expresión del have performed assays of activity and complementation between the pneumococcal and the staphylococcal PcrA protein. CopG repressor CopG controls replication of pmv158 by repressing transcription of gene repb. CopG binds to a DNA region that harbours promoter Pcr, from which genes copg and repb are cotranscribed. CopG, which is the prototype of a family of plasmid-encoded transcriptional repressors, is a 45-residues spherical homodimer. Four CopG dimers bind to its 50-bp long target DNA. CopG has a ribbon-helix-helix structure similar to those of repressors Arc, Mnt and MetJ. We have also studied the mechanism by which CopG represses transcription from promoter Pcr, as well as the sequence requirements of the CopG DNA target. Plasmid pt38 from S. thermophilus We have sequenced and characterized this plasmid, which is of interest for lactic acid bacteria. It replicates by the rolling circle mechanism and contains a DNA region which is homologous to pc194 dso. The existence of a countertranscribed RNA controlling pt38 replication has been shown. Mobilisation of pmv158 pmv158 can be mobilised by functions encoded both by itself (protein MobM) and by auxiliary plasmids. MobM cleaves its target DNA at the origin of transfer, orit. We have worked in: i) optimisation of MobM production; ii) structural aspects of the protein by circular dichroism and fluorescence analyses; iii) association of MobM to the cell membrane; iv) molecular modelling of a MobM region. We have constructed vectors based on the pmv158 replicon that are mobilisable and that express the Green Fluorescent Protein in several Gram-positive bacteria. The mal regulon in S. pneumoniae Protein MalR belongs to the LacI/GalR family of transcriptional repressors. It regulates expression of the pneumococcal mal regulon by binding to two operator sequences, O M and O X. 127

139 Replicación y Expresión del DNA en Bacterias Gram-positivas / Replication and Expression of DNA in Gram-positive Bacteria regulón mal mediante unión a dos regiones operadoras, O M y O X. Se han caracterizado una colección de mutantes en el gen malr y se han purificado algunas de las proteínas mutantes. Los sistemas toxina-antitoxina (T-A) de S. pneumoniae Se han clonado, secuenciado y caracterizado tres sistemas T- A codificados por el cromosoma de pneumococos. Mientras que uno de ellos, Spn relbe1, no parece ser funcional, los otros dos, Spn relbe2 y Spn yefm-yoeb, sí lo son. La sobre-expresión de los genes que codifican las toxinas de estos sistemas (Spn RelE2 y Spn YoeB) detiene el crecimiento y reduce la viabilidad de cultivos de pneumococos. We have characterized a collection of mutants in gene malr and we have purified some of the mutant proteins. Pneumococcal toxin-antitoxin (T-A) systems We have cloned, sequenced, and characterized three T-A systems encoded by the pneumococcal chromosome. One of them, termed Spn relbe1, does not seem to have a T-A funcion. However, the other two, namely Spn relbe2 and Spn yefmyoeb, are bona fide T-A systems. Over-expression of the genes encoding the toxins (Spn RelE2 and Spn YoeB) results in inhibition of cell growth and in reduction of the cell viability. Organismos Financiadores/Funding Agencies MCyT, BMC ( ) UE, QLK2-CT ( ) Instituto de Salud Carlos III, FISS01/0956 ( ) CAM, Programa de Grupos Estratégicos ( ) UE, QLK3-CT ( ) CICyT, Acción Especial BMC E ( ) Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI; FIS-CO3/14) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Ana María Hernández Arriaga. Mecanismo de regulación transcripcional mediada por CopG en el promotor Pcr del plásmido pmv158. Universidad Complutense de Madrid, Directores: G. Del Solar Dongil y M. Espinosa Padrón. Publicaciones / Publications Artículos en Revistas / Journal Articles Grohmann, E., Muth, G., and Espinosa, M. (2003). Conjugative plasmid transfer in Gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67, Nieto, C., and Espinosa, M. (2003). Construction of the mobilizable plasmid pmv158gfp, a derivative of pmv158 that carries the gene encoding the green fluorescent protein. Plasmid 49,

140 Replicación y Expresión del DNA en Bacterias Gram-positivas / Replication and Expression of DNA in Gram-positive Bacteria Petrova, P., Miteva, V., Ruiz-Masó, J.A., and del Solar, G. (2003). Structural and functional analysis of pt38, a 2.9 kb plasmid of Streptococcus thermophilus yogurt strain. Plasmid 50, Cybulski, L.E., del Solar, G., Craig, P.O., Espinosa, M., and de Mendoza, D. (2004). Bacillus subtilis DesR functions as a phosphorylation-activated switch to control membrane lipid fluidity. J. Biol. Chem. 279, De Antonio, C., Farías, M.E., García de Lacoba, M., and Espinosa, M. (2004). Features of the plasmid pmv158-encoded MobM, a protein involved in its mobilization. J. Mol. Biol. 335, Ruiz-Masó, J.A., Zumel, C., Menéndez, M., Espinosa, M., and del Solar, G. (2004). Structural features of the initiator of replication protein RepB encoded by the promiscuous plasmid pmv158. Biochem. Biophys. Acta (Proteins and Proteomics) 1696, Capítulos de libro / Book chapters Alonso, J.C., Balsa, D. Cherny, I., Espinosa, M., Francuski, D., Gazit, E., Gerdes, K., Hitchin, E., Martín, M.T., Nieto, C., Overweg, K., Pellicer, T., Saenger, W., Welfle, W. Welfle, and Wells, J. (2004). Bacterial Toxin-Antitoxin Systems as Targets for the Development of Novel Antibiotics. In: M.E. Tomalsky and R.A. Bonomo, eds, Resistance to antibiotics: enzyme-mediated mechanisms and prospects for inhibition. ASM Press. 129

141 Interacciones Macromoleculares en Procesos Celulares Esenciales: Organización Estructural, Energética y Dinámica Macromolecular Interactions in Essential Cellular Processes: Structural Organization, Energetics and Dynamics GERMÁN RIVAS CABALLERO Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist ALLEN P. MINTON (VII-IX, 2003/X-2004) Investigador Visitante / Visiting Scientist JOSÉ MANUEL GONZÁLEZ IZQUIERDO PILAR LÓPEZ NAVAJAS B. Predoctorales / Graduate Students MERCEDES JIMÉNEZ SARMIENTO Personal Técnico / Technician Palabras clave: Bioquímica física, Ultracentrifugación analítica, Aglomeración macromolecular, Ciencia de proteínas, División celular bacteriana Implicaciones biológicas de la aglomeración macromolecular Nuestro grupo está interesado en la caracterización cuantitativa (organización estructural, estequiometría, afinidad y reversibilidad) de interacciones macromoleculares reversibles en procesos celulares esenciales (división celular bacteriana). Estos parámetros, que son importantes para entender la función de estos complejos macromoleculares, pueden obtenerse mediante métodos avanzados de centrifugación analítica, combinados con otras aproximaciones bioquímicas, biofísicas y estructurales. Estas reacciones y procesos de asociación tienen lugar in vivo en ambientes muy aglomerados, caracterizados por una alta fracción de volumen ocupado por macromoléculas (del orden de cientos de mg/ml). Las consecuencias energéticas de la aglome- Keywords: Physical biochemistry, analytical ultracentrifugation, macromolecular crowding, protein science, bacterial cell division Biological implications of macromolecular crowding Our group is interested in the quantitative characterization (structural organization, stoichiometry, affinity and reversivility) of macromolecular interactions in essential cellular processes (bacterial cell division). These parameters that are important to understand the function of these macromolecular complexes, can be obtained by advanced methods of analytical centrifugation, combined with other biochemical, biophysical and structural approaches. These association reactions and processes take place in vivo in very crowded environments, characterized by a high fractional volume occupancy by macromolecules (of the order of hundreds of mg/ml). The energetics consequences of macromolecular crowding on association processes can modify, both qualitatively and quantitatively, a number of conclusions 130

142 Interacciones Macromoleculares en Procesos Celulares Esenciales: Organización Estructural, Energética y Dinámica / Macromolecular Interactions in Essential Cellular Processes: Structural Organization, Energetics and Dynamics Figura 1.- Esquema que resume el efecto de la aglomeración macromolecular sobre los procesos de oligomerización y ensamblaje de FtsZ. Fuera del recuadro se muestran imágenes de polímeros de FtsZ en medios diluidos y aglomerados, obtenidas mediante microscopía de fuerzas atómicas. [Figura adaptada de González et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: ]. Figure 1.- Scheme that summarizes the effect of macromolecular crowding on the processes of oligomerization and assembly of FtsZ. Outside the frame Atomic Force Microscopy images of FtsZ polymers formed in dilute and crowded solutions are shown. [Figure adapted from González et al. (2003) J. Biol. Chem. 278: ]. ración macromolecular sobre procesos de asociación pueden modificar, cualitativa y cuantitativamente, parte de las conclusiones derivadas de estudios realizados in vitro, que normalmente son realizados en condiciones ideales (concentración total de solutos < 1 mg/ml). Por esta razón, estudiamos la influencia que sobre los mencionados parámetros de asociación tiene la exclusión de volumen en medios aglomerados. Interacciones macromoleculares en división celular bacteriana Nos centramos en estudiar los procesos de oligomerización y ensamblaje de FtsZ (de E. coli), componente mayoritario y esencial de la maquinaria de división celular bacteriana, en medios diluidos y fisiológicamente aglomerados. Con anterioridad habíamos estudiado mediante centrifugación analítica la oliderived from in vitro studies that normally are performed under ideal (total solute concentration < 1 mg/ml) conditions. Because of these reasons, we study the influence that volume exclusion in physiologically crowded media might have on the above mentioned association parameters. Macromolecular interactions in bacterial cell division We focus in the study of the processes of oligomerization and assembly of the essential cell division protein FtsZ (from E. coli), both in dilute and crowded solutions. We have previously studied by means of analytical ultracentrifugation the oligomerization of FtsZ in its GDP bound state, which is a magnesiumlinked non-cooperative process, unfavoured by ionic strength, and facilitated by crowding. During this biennial, we have mainly characterized the assembly of FtsZ under physiologically 131

143 Interacciones Macromoleculares en Procesos Celulares Esenciales: Organización Estructural, Energética y Dinámica / Macromolecular Interactions in Essential Cellular Processes: Structural Organization, Energetics and Dynamics gomerización de FtsZ en su forma unida a GDP, que es proceso no-cooperativo, dependiente de magnesio, desfavorecido al incrementar la fuerza iónica, y facilitado en medios aglomerados. Durante este bienio principalmente hemos caracterizado el ensamblaje de FtsZ en presencia de GTP en medios aglomerados (Fig. 1). Hemos demostrado que la aglomeración macromolecular favorece el ensamblaje cooperativo de FtsZ para formar cintas bidimensionales dinámicas que desensamblan al consumirse el GTP. Estas cintas, cuando se comparan con los filamentos de FtsZ observados in vitro en disoluciones diluídas, muestran un retardo en la actividad GTPásica, un descenso en la velocidad de hidrólisis del GTP, así como en la velocidad de intercambio de GTP dentro del polímero. Dado que estas cintas tienden a formarse de manera espontánea en medios aglomerados, proponemos que, en el citoplasma bacteriano, estas estructuras forman parte del anillo de FtsZ en división, por lo que serían fisiológicamente más relevantes que los polímeros de FtsZ formados en disoluciones diluidas in vitro. En paralelo, estamos caracterizando el ensamblaje de FtsZ mediante velocidad de sedimentación, y la interacción de FtsZ con la proteína del septosoma ZipA, tanto en disolución como reconstituida en sistemas de membrana. [Proyecto en colaboración con los grupos de los Drs. José M. Andreu (CIB-CSIC), Marisela Vélez (Inst. Nicolás Cabrera, UAM) y Miguel Vicente (CNB-CSIC)]. Métodos de bioquímica física Continuamos desarrollando y aplicando métodos teóricos, analíticos y experimentales de equilibrio de sedimentación (con el grupo del Dr. Allen Minton, NIH) que son únicos para la detección y la caracterización de interacciones macromoleculares en medios diluídos y aglomerados. En paralelo, colaboramos con el grupo de la Dra. Pilar Lillo, IQF-CSIC en la aplicación de métodos de anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo para la caracterización de propiedades dinámicas, conformacionales y de asociación de proteínas en medios aglomerados. Por último, colaboramos con varios grupos en la caracterización, mediante centrifugación analítica, de interacciones proteínaproteína y proteína-dna implicadas en otros procesos celulares esenciales. Mencionaremos, porque ya están siendo explorados en medios aglomerados, los sistemas implicados en la organización del genoma (Drs. José M. Hermoso y Margarita Salas, crowded solutions (Fig. 1). Macromolecular crowding favours the cooperative assembly of FtsZ to form bidimensional ribbons that are dynamic and disassemble upon GTP consumption. These ribbons, when compared with the FtsZ filaments observed in vitro under dilute solutions, show a retard in the GTPase activity, a reduced rate of GTP hydrolysis and the GTP exchange within the polymers. Because these ribbons tend to form spontaneously in crowded solutions, we propose that in the bacterial cytoplasm these structures may form part of the FtsZ ring at division, and therefore would be more physiologically relevant than the FtsZ polymers formed in vitro under dilute solutions. In parallel, we are working on the sedimentation velocity analysis of FtsZ assembly and on the quantitative characterization of the interaction of FtsZ with the septosome protein ZipA, both in solution and in reconstituted onto membrane structures. [Projects in collaboration with the groups of Drs. José M. Andreu (CIB-CSIC), Marisela Vélez (Inst. Nicolás Cabrera, UAM, Madrid) and Miguel Vicente (CNB-CSIC, Madrid)]. Physical biochemistry methods We continue with the development and the application of theoretical, analytical, and experimental methods of sedimentation equilibrium (with the group of Dr. Allen Minton, NIH, Bethesda) that are unique to detect and characterize macromolecular interactions in crowded solutions. In parallel, we collaborate with the group of Dr. Pilar Lillo (Inst. Quim. Fis., CSIC, Madrid) in the application of time-resolved fluorescence anisotropy methods to characterize the dynamic, conformational, and association properties of proteins in crowded solutions. Finally, we collaborate with several groups in the characterization, by means of analytical ultracentrifugation methods, of protein-protein and protein-dna interactions in other essential cellular processes. Because these systems are currently being explored under crowded solutions, we will mention those involved in genome organization (Drs. José M. Hermoso and Margarita Salas, CBMSO-CSIC/UAM), DNA replication (Dr. Rafael Giraldo, CIB-CSIC), and the interactions of blood plasma proteins involved in cell proliferation (Dr. Guillermo Giménez-Gallego, CIB-CSIC). 132

144 Interacciones Macromoleculares en Procesos Celulares Esenciales: Organización Estructural, Energética y Dinámica / Macromolecular Interactions in Essential Cellular Processes: Structural Organization, Energetics and Dynamics CBMSO-CSIC/UAM), la replicación del DNA (Dr. Rafael Giraldo, CIB-CSIC), y las interacciones funcionales de proteínas del plasma sanguíneo implicadas en procesos de proliferación celular (Dr. G. Giménez-Gallego, CIB-CSIC). Organismos Financiadores/Funding Agencies CAM, Programa de Grupos Estratégicos ( ) MCYT, BMC C02 ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses José Manuel González Izquierdo. Ensamblaje de FtsZ de E. coli, proteína esencial en la división bacteriana: Efecto de la aglomeración macromolecular. Universidad Complutense de Madrid, Octubre, Director: G. Rivas. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Caston, J.R., Ghabrial, S. A., Jiang, D., Rivas, G., Alfonso, C., Roca, P., Luque, D., and Carrascosa, J.L. (2003). Three-dimensional structure of Penicillium chrysogenum virus: A double stranded RNA virus with a genuine T-1 capsid. J. Mol. Biol. 331, Díaz-López, T., Lages-Gonzalo, M., Serrano-López, A., Alfonso, C., Rivas, G., Díaz-Orejas, R., and Giraldo, R. (2003). Structural changes in RepA, a plasmid replication initiator, upon binding to origin DNA. J. Biol. Chem. 278, González, J.M., Jiménez, M., Vélez, M., Mingorance, J., Andreu, J.M., Vicente, M., and Rivas, G. (2003). Essential cell division protein FtsZ assembles into one monomer-thick ribbons under conditions resembling the crowded intracellular environment. J. Biol. Chem. 278, González, J.M., Rivas, G., and Minton, A.P. (2003). The effect of large refractive index gradients upon the performance of absorption optics in the Beckman XL-A/I analytical ultracentrifuge: An experimental study. Anal. Biochem. 313, Pessela, B.C., Mateo, C., Carrascosa, A.V., Vián, A., García, J.L., Rivas, G., Alfonso, C., Guisán, J.M., and Fernández-Lafuente, R. (2003). One step purification, covalent immobilization and additional stabilization of a thermophilic poly-his-tagged beta-galactosidase from Thermus sp. strain T2 by using novel heterofunctional chelate-epoxy sepabeads. Biomacromolecules 4, Rivas, G., and Minton, A.P. (2003). Tracer sedimentation equilibrium: A powerful tool for the quantitative characterization of macromolecular self- and hetero-associations in solution. Biochem. Soc. Trans. 31, Ellis, J.R., Minton, A. P., and Rivas, G. (2004). Biological implications of macromolecular crowding. A foreword. J. Mol. Recog. 17,

145 Interacciones Macromoleculares en Procesos Celulares Esenciales: Organización Estructural, Energética y Dinámica / Macromolecular Interactions in Essential Cellular Processes: Structural Organization, Energetics and Dynamics Rivas, G., and Minton, A.P. (2004). Non-ideal tracer sedimentation equilibrium: A powerful tool for the characterization of macromolecular interactions in crowded solutions. J. Mol. Recog. 17, Rivas, G., Ferrone, F., and Herzfeld, J. (2004). Life in a crowded world. EMBO reports 5, Zorrilla, S., Jiménez, M., Lillo, P., Rivas, G., and Minton, A.P. (2004). Sedimentation equilibrium in a solution containing an arbitrary number of solute species at arbitrary concentrations: theory and application to concentrated solutions of ribonuclease. Biophys. Chem. 108, Zorrilla, S., Rivas, G., Acuña, A.U., and Lillo, M.P. (2004). Protein self-association in crowded protein solutions: a time-resolved fluorescence polarization study. Protein Sci. 13, Zorrilla, S., Rivas, G., and Lillo, M.P. (2004). Structure and dynamics of proteins in crowded media studied by time-resolved fluorescence polarization. J. Mol. Recog. 17,

146 Microscopía Electrónica y Reconstrucción Tridimensional de Macromoléculas Electron Microscopy and Three Dimensional Reconstruction of Macromolecules ÓSCAR A. LLORCA BLANCO Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist ANGEL RIVERA CALZADA ERNESTO ARIAS PALOMO B. Predoctorales / Graduate Students JASMINKA BOSKOVIC (Hasta XII-2004) Personal Técnico / Technician Palabras clave: Microscopía Electrónica, Reconstrucción 3D, Reparación de ADN, DNA-PK, Vav La utilización de microscopía electrónica con muestras de proteínas purificadas permite observar moléculas individuales. El análisis de estas imágenes de proyección de una proteína permite generar un mapa tridimensional (3D) de la molécula a resoluciones medias. Los volúmenes obtenidos se pueden combinar con información atómica para obtener modelos pseudo-atómicos. Nuestro grupo trabaja en la obtención de información funcional y estructural con el objeto de que la información 3D contribuya a comprender los mecanismos íntimos que regulan la actividad de las distintas proteínas. Macromoléculas de reparación de roturas de ADN de doble hebra El ADN se encuentra expuesto a la acción de agentes que generan roturas de la doble hebra. Estas lesiones se generan por Keywords: Electron Microscopy, 3D Reconstruction, DNA repair, DNA-PK, Vav Single particle electron microscopy from purified proteins allows a directy observation of their individual molecules. The analysis of these projection images from a protein can generate a three-dimensional (3D) map for the molecule at medium resolution. These volumes can then be combined with structural information at atomic resolution to build the so-called pseudoatomic models. Our group obtains functional and structural data so that the 3D information can help us to understand the intimate molecular mechanisms regulating protein activation. Macromolecules involved in double stranded DNA break repair DNA is being constantly exposed to damaging agents that generate breaks of the double helix. These lesions can be for instance generated by toxic products of the oxidative metabo- 135

147 Microscopía Electrónica y Reconstrucción Tridimensional de Macromoléculas / Electron Microscopy and Three Dimensional Reconstruction of Macromolecules ejemplo por la acción de agentes tóxicos producto del metabolismo y por radiaciones externas y si no son adecuadamente reparadas desencadenan defectos y aberraciones cromosómicas que ponen en riesgo la viabilidad celular. ATM, ATR y DNA- PKcs son quinasas de un tamaño enorme que funcionan como detectores de daños en el ADN. Estas quinasas reconocen roturas de la doble hebra y activan los procesos de reparación del ADN. Por ello, mutaciones en estas PIKK quinasas aparecen asociadas a varios síndromes y a una predisposición a distintos tipos de tumores. Hemos caracterizado las estructuras 3D de ATM y DNA-PKcs en su forma libre y en el complejo de reconocimiento de roturas del ADN. Se ha propuesto el primer modelo de la organización molecular de estas quinasas. Además se ha contribuido a esclarecer las bases estructurales que determinan la activación de estas ATM y DNA-PKcs cuando reconocen ADN dañado. Reguladores de la actividad de las GTPasas de la superfamilia Ras La pequeñas GTPasas de la superfamilia Ras funcionan como interruptores moleculares que alternan entre un estado inactivo unido a GDP y una conformación activa unida a GTP. El intercambio de nucleótidos GDP/GTP y por tanto los ciclos de activación/desactivación se encuentran regulados por los Intercambiadores de nucleótido (GEF). Vav, un GEF relevante en la activación de linfocitos, consta de ocho dominios estructurales regulados de manera compleja. La distorsión de estos mecanismos de control genera formas de Vav con potencial oncogénico. Puesto que Vav es difícil de purificar en cantidades susceptibles de análisis mediante rayos X o RMN, hemos utilizado la microscopía electrónica para determinar su estructura 3D. Los resultados han revelado los mecanismos moleculares que determinan la activación de Vav tanto en condiciones fisiológicas como oncogénicas. Receptores celulares de la familia del receptor de manosa de macrófagos La familia del receptor de manosa incluye glicoproteínas transmembrana que comparten una organización estructural común. Hemos determinado las primeras estructuras tridimensionales de dos miembros de esta familia, Endo180 y el receptor lism and ionizing radiation, and if left non repaired, they can lead to several defects and chromatic aberrations. ATM, ATR and DNA-PKcs are large kinases implicated in DNA damage sensing. These proteins recognize breaks in the double stranded DNA and activate DNA repair processes. Consequently, mutations in these kinases are associated with several recessive human syndromes and susceptibility to develop some tumours. We have determined the 3D structures of ATM and DNA-PKcs both in their free and DNA-bound conformations. We have proposed the first molecular model of their structural organization and we have contributed to clarify the molecular basis regulating the activation of ATM and DNA-PKcs upon DNA damage detection. Regulators of small GTPases of the Ras superfamily The Ras superfamily of small GTPases functions as molecular switches that cycle between an inactive GDP-state and an activated GTP-bound conformation. GDP/GTP exchange is regulated by several other proteins such us Guanosine Exchange Factors (GEFs). Vav, a GEF implicated in lymphocyte activation, is made up of eight different and tightly regulated structural domains. The interference with these regulatory mechanisms can lead to oncogenic transformation. Vav can only be purified in modest amounts incompatible with structural analysis based of X-ray crystallography or NMR and therefore we have used the electron microscopy to determine the 3D structure of Vav. We have revealed the molecular mechanisms implicated in Vav activation both under physiological and oncogenic conditions. Lectin receptors of the macrophage mannose receptor family The mannose receptor family comprises several transmembrane glycoproteins that share a common structural arrangement. We have obtained the first 3D structures of two members of this family, Endo10 and the mannose receptor. Endo180 plays an important role in extracellular matrix remodelling and cell migration and its expression is found up-regulated in different types of tumour endothelium. The comparison between the two 3D structures has provided light on the essential aspects in the mechanisms of extracellular ligand recognition by these receptors. 136

148 Microscopía Electrónica y Reconstrucción Tridimensional de Macromoléculas / Electron Microscopy and Three Dimensional Reconstruction of Macromolecules de manosa. Endo180 juega una función clave en remodelación de matriz extracelular y migración celular y su expresión se encuentra elevada en distintos tipos de endotelios tumorales. La comparación de ambas estructuras ha permitido determinar los aspectos esenciales de los mecanismos de reconocimiento de ligandos extracelulares por parte de estos receptores. Organismos Financiadores/Funding Agencies MCYT, SAF ( ) MEC, Acción Especial en Genómica y Proteómica, GEN C06-06 ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Boskovic, J., Rivera-Calzada, A., Maman, J.D., Chacón, P., Willison, K.R., Pearl, L.H., and Llorca, O. (2003). Visualization of DNA-induced conformational changes in the DNA repair kinase DNA-PKcs. EMBO J. 22, Llorca, O., Rivera-Calzada, A., Grantham, J, and Willison, K.R. (2003). Electron microscopy and 3D reconstructions reveal that human ATM kinase uses an arm-like domain to clamp around double-stranded DNA. Oncogene 22, Rivera-Calzada, A., Robertson, D., MacFayden, J., Boskovic, J., Isacke, C.M., and Llorca, O. (2003). Three dimensional interplay among the ligand binding domains of the upar-associated protein Endo180. EMBO reports 4, Llorca, O, and Pearl, L.H. (2004). Electron Microscopy studies on DNA recognition by DNA-PK. Micron 35, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Junquera, E., del Burgo, P., Arranz, R., Llorca, O. y Aicart, E. (2005) Aggregation Phenomena on a Ternary Ionic-Nonionic Aqueous Surfactant System: Mixed Micro-aggregates, Vesicles and Micelles. Lagmuir (en prensa/in press) Llorca, O., Arias-Palomo, E., Zugaza, J.L. y Bustelo X.R.(2005) Global conformational rearrangements during the physiological and oncogenic activation of the GDP/GTP exchange factor Vav3. EMBO J. (en prensa/in press) Rivera-Calzada, A., Maman, J.P., Spagnolo, L., Pearl, L.H. y Llorca O. (2005) Three dimensional structure and regulation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) Structure (en prensa/in press) Ruiz-Ferrer, V., Boskovic, J., Alfonso, C., Rivas, G., Llorca, O., López-Abella, D. y López-Moya, J. (2005) Structural analysis of tobacco etch potyvirus HC-Pro oligomers involved in aphid transmission. Journal of Virology (en prensa/in press) 137

149 Ficología Medioambiental Environmental Phycology PEDRO J. APARICIO ALONSO Jefe de Grupo / Group Leader MIGUEL A. QUIÑONES GÓMEZ Investigadores de Carrera / Staff Scientists FEDERICO G. WITT SOUSA Investigador Contratado / Research Associate NURIA SOLOZÁBAL DUEÑAS B. Predoctoral / Graduate Student LUCAS OYA TARDÍO Personal Técnico / Technician Palabras clave: Algas, Asimilación de nitrógeno, Carbono y fósforo, Transporte de iones, Depuración de aguas superficiales Las algas verdes eucariotas que se desarrollan en medios acuáticos inorgánicos requieren para su proliferación nitrógeno combinado (son incapaces de fijar nitrógeno atmosférico) y el aporte del resto de elementos biogenésicos en forma de CO 2 o bicarbonato, fosfato, sulfato, potasio, calcio, magnesio, hierro y Keywords: Algae, Nitrogen assimilation, Carbon and phosphate, Ion transport, Superficial water depuration Eukaryotic green algae, which ordinarily grow in inorganic media, require combined nitrogen (they are unable to fix molecular nitrogen) together with biogenesic elements such as CO 2 or bicarbonate, phosphate, sulphate, potassium, calcium, magnesium, iron and all other micronutrients to sustain their growth. 138

150 Ficología Medioambiental / Environmental Phycology demás micronutrientes. Su proliferación genera una biomasa que almacena los elementos mencionados por lo que su crecimiento se puede utilizar para eliminar dichos compuestos del medio. Esto hace que se puedan utilizar como agentes depuradores de aguas superficiales. El alga Hydrodictyon reticulatum, por su estructura colonial reticular/filamentosa de varios centímetros de longitud, ofrece todas las ventajas de estos organismos fotosintéticos en cuanto a rapidez de crecimiento y capacidad de eliminación de nutrientes, y al mismo tiempo permite su manejo y separación del medio acuático por métodos sencillos y poco costosos. Nuestras experiencias preliminares, obtenidas en una planta piloto, han confirmado todas estas expectativas y, por tanto, nos proponemos desarrollar y perfeccionar esta planta con objeto de incrementar y automatizar la producción de algas de forma que las instalaciones operen ininterrumpidamente y sean independientes de las condiciones meteorológicas o el foto periodo, con lo que la producción de biomasa se verá notablemente incrementada y la depuración de las aguas procederá de forma continua. Se está estudiando la capacidad de estas algas para desarrollarse en aguas que contengan metales pesados y el posible almacenamiento de éstos en su sistema vacuolar de alta capacidad. Se espera que estas investigaciones nos ayuden a perfeccionar este sistema innovador para el tratamiento de aguas superficiales. Dependiendo de la utilidad de la biomasa obtenida, el funcionamiento de estas instalaciones podría autofinanciarse y quizá llegar a ser económicamente rentable. De ahí el interés por estudiar el/los posible/s destino/s de la biomasa obtenida. Their biomass production which contains all the described elements, can be used to remove them from the medium. This makes these organisms suitable for surface water depuration treatments. The green alga Hydrodictyon reticulatum (also known as water net) develops a network structure with filaments a few centimeters-long and as most photosynthetic organisms shows a rapid growth taking up inorganic nutrients. At the same time, Hydrodictyon is easy to handle and can be collected from the aquatic medium by simple and inexpensive methods. Our preliminary experiences, obtained in a pilot plant, have confirmed our expectations and, therefore, we pretend to develop further this pilot plant. Our aim is to increase and automatize the production of algae, so that the facility will operate non-stop, independently of weather conditions or photoperiod, so that algae production will increase significantly and water depuration will proceed continuously. We are studying the capacity of this alga to grow in waters containing heavy metals and how they are stored in its highcapacity vacuolar system. We expect that this research will help us improve our innovative system for water treatment. Depending on the utility of the obtained biomass, this facility may, eventually, be economically beneficial. Therefore, it is of great interest to study the possible uses of the biomass produced. Organismos Financiadores/Funding Agencies Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha ( ) Fund. Ramón Areces ( ) MEC, PNI ( ) Patentes/Patents Aparicio, P.J., Witt, F.G., y Quiñones, M.A. Diciembre de Cultivo de macroalgas verdes filamentosas en estanques provistos de mallas filtrantes con objeto de tratar y/o depurar aguas continentales para la eliminación de nutrientes y/o metales pesados así como para la obtención de biomasa vegetal, Nº de patente:

151 Departamento de Fisiopatología y Genética Molecular Humana Department of Physiopathology and Human Molecular Genetics Jefe de Departamento Department Head RAMÓN B. RODRÍGUEZ MARTÍNEZ Profesor de Investigación Investigadores Científicos ROBERTO PARRILLA SÁNCHEZ JOSÉ ANTONIO ABRISQUETA ZARRABE ANTONIO MARTÍN GONZÁLEZ CARLOS RODRÍGUEZ MURCIA Científicos Titulares ÁNGELA CASADO MORAGÓN OFELIA GARCÍA HERMIDA CONSUELO GONZÁLEZ MANCHÓN ÁNGELES MARTÍN REQUERO RAMÓN B. RODRÍGUEZ MARTÍNEZ Personal Técnico Mª JOSEFA FERNÁNDEZ-CABRERA BAZÁN TOMÁS FONTELA CASADO Mª ENCARNACIÓN LÓPEZ FERNÁNDEZ Mª CARMEN PÉREZ LAMIGUEIRO Mª JOSÉ TOBAJAS MARTÍN Secretaria MARÍA VICTORIA LAFITA TOGORES

152 Genética Humana Human Genetics JOSÉ ANTONIO ABRISQUETA ZARRABE JEFE DE GRUPO/ GROUP LEADER Investigador de Carrera / Staff Scientist VITALINO ALLER RACIMO MARIA ÁNGELES MARTÍN LUCAS JUAN MENAYA FERNÁNDEZ Investigadores Visitantes /Visiting Scientists MARIA AMPARO CERRAJERO HERNÁNDEZ ROSARIO DE ANDRÉS MONTES (Desde IX-2001) MARIA CARMEN PÉREZ LAMIGUEIRO Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Síndrome de Down, Cromosoma 21, Marcadores bioquímicos Investigación genética del síndrome de Down Se trata de un Proyecto Colaborativo de Investigación que se ha llevado a cabo en nuestro Laboratorio de Genética Humana, con la participación del Laboratorio de la Dra. Angela Casado y la colaboración de la Unidad de Pediatría Social del Hospital del Niño Jesús y el Servicio de Pediatría del Hospital de San Rafael. Esta investigación se propone profundizar en el conocimiento del cromosoma 21 y en los mecanismos que ocasionan su presencia por triplicado en los individuos con síndrome de Down. El proyecto se diseña con el intento de aportar nuevos datos al estado actual de conocimientos sobre la correlación fenotipogenotipo, asociando los rasgos clínicos característicos del síndrome con las alteraciones genéticas reveladas por el análisis citogenético y molecular, contribuyendo a la construcción del mapa fenotípico del síndrome. Al estudio se añade el análisis de varios marcadores bioquímicos SOD, CAT y MDA, de interés en la dinámica patológica del síndrome. Keywords Down syndrome, chromosome 21, biochemical markers. Genetic research on Down syndrome This project, established as a collaborative research work, is being carried out in our Laboratory of Human Genetics, the Laboratory of Dr. Angela Casado, the Unity of Social Pediatrics (Hospital del Niño Jesús. Madrid) and the Pediatric Service (Hospital de San Rafael. Madrid). Our research is aimed to seek a deeper knowledge of chromosome 21 and the mechanisms which trigger off the triple presence of that chromosome as observed in most patients affected by Down syndrome. The purpose of our project is to contribute with new information to the current knowledge on the phenotype-genotype correlations by associating the clinical traits of the syndrome with the genetic anomalies showed by the cytogenetic and molecular analysis. Thus, to contribute to complete the phenotypic Down syndrome map. In addition to the above studies, we are determining several biochemical markers, such as SOD, CAT, and MDA which are of interest in the dynamics of the syndrome's pathology. 142

153 Genética Humana / Human Genetics Organismos Financiadores / Funding Agencies Fund. Inocente-Inocente ( ) Fund. Síndrome de Down de Madrid ( ) Publicaciones/Publicatios Artículos en Revistas/Journal Articles Abrisqueta, J.A., Casado, A., Aller,V., y Menaya, J. (2003). Actualización en la genética del síndrome de Down. III Congreso Internacional de Educación Especial: Síndrome de Down Editorial Complutense. Madrid. Menaya, J., Aller, V., Casado, A., y Abrisqueta, J.A. (2003). Caso de mosaicismo de trisomía 21, caracterizado por la fusión terminal de los brazos largos y monosomía telomérica del 21 (Loci D21S1446 y D21S1575). Publicación del Congreso de la Sociedad Española de Genética, 68. San Lorenzo de El Escorial. Artículos de Divulgación/Press Articles Abrisqueta, J.A. (2003). Investigación genética sobre el síndrome de Down. Profesional.medicinatv.com/reportajes. 5 págs. (en prensa/in press). Próximos artículos/forthcoming Articles Abrisqueta, J.A. (2003). La vida está en nuestras manos. III Foro Internacional sobre Humanismo. Santiago de Querétaro (México). 24 págs. (en prensa/in press). Abrisqueta, J.A. (2003). Genética y Vida Humana: Dilemas éticos. Universidad Pontificia de Salamanca. Servicio de Publicaciones. 50 págs. (en prensa/in press). 143

154 Biomarcadores de Estrés Oxidativo y Procesos de Envejecimiento Oxidative Stress Biomarkers and Aging Processes ÁNGELA CASADO MORAGÓN Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist ROCÍO RUIZ SÁNCHEZ (Hasta XI-2003) GEMA MUÑOZ DURÁN (Desde I-2004) NATALIA ORTEGA GONZÁLEZ (Desde I-2004) B. Predoctorales / Graduate Students Mª ENCARNACIÓN LÓPEZ FERNÁNDEZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Síndrome de Down, Estrés oxidativo, Radicales libres, Envejecimiento, Cu/Zn superóxido dismutasa, Catalasa, Glutation peroxidasa, Glutation reductasa, Malondialdehido, Crenoterapia, Aguas mineromedicinales sulfuradas y sulfatadas Biomarcadores del estrés oxidativo en el síndrome de Down El síndrome de Down (SD) es una alteración genética asociada a la presencia de tres copias del cromosoma 21, y es uno de los defectos congénitos humanos más importantes, que ocurre en 1 de cada nacimientos. Los niños con síndrome de Down muestran una severa hipotonía, corta estatura, fisuras palpebrales oblicuas y epicantus. El síndrome está asociado con retraso mental, desordenes del sistema inmune y procesos autoinmunes. Envejecimiento prematuro y un incremento en la incidencia de leucemia y otros desórdenes hematológicos son comunes en individuos afectados, así como defectos cardiacos, alta susceptibilidad y algunos tipos de alteraciones endocrinas. Existen evidencias que muestran que los individuos con SD presentan un estrés oxidativo inusual. Este estrés oxidativo resulta de un exceso del enzima Cu/Zn superóxido dismutasa (Cu/ZnSOD), que está codificado en el cromosoma 21 región 21q22.1. Esta sobreexpresión del gen Cu/ZnSOD, debida a un efecto de dosis, puede perturbar el equilibrio de las especies reactivas de oxígeno en las células causando daño oxidativo en moléculas biológicas importantes, tales como ADN, proteinas y Keywords: Down syndrome, Oxidative stress, Free radicals, aging, Cu/Zn superoxide dismutase, Catalase, Glutathione peroxidase, Glutathione reductase, Malondialdehyde, Crenotherapy, Sulphured and sulfated mineral waters Biomarkers of oxidative stress in Down syndrome Down s syndrome (DS), a genetic abnormality associated with the presence of three copies of chromosome 21, is one of the most important human congenital diseases, occurring in 1 of live births. Most obvious among these are morphological defects such as hypotonia in the newborn, short stature and the epicanthic eyefolds which give rise to the eye shape characteristic of the syndrome. The disease is associated with mental retardation, immune system disorders, and autoimmune processes. Premature aging and an increase in the incidence of leukaemia and other haematological disorders are common in affected individuals, as well as cardiac defects, a high susceptibility to infections and several types of endocrine disorders. There are several lines of evidence showing that individuals with DS are under unusual oxidative stress. Oxidative stress may resutls from excess of the enzyme Cu/Zn superoxide dismutase (Cu/Zn SOD) that is encoded by a gene located on chromosomal region 21q22.1. This overexpression of the Cu/Zn SOD gene, due to gene dosage, may disturb the steady-state equilibrium of active oxygen species within the cells resulting in oxidative dam- 144

155 Biomarcadores de Estrés Oxidativo y Procesos de Envejecimiento / Oxidative Stress Biomarkers and Aging Processes lípidos. Debido a que el desequilibrio enzimático en los individuos con SD puede ser clave en la patogénesis del síndrome, nosotros analizamos las actividades de Cu/ZnSOD, catalasa (CAT), glutation peroxidasa (GPx), glutation reductasa (GR), que constituyen el principal mecanismo de protección enzimática frente a los efectos dañinos de las especies reactivas de oxígeno, y valoramos, también, los niveles de malondialdehído (MDA), uno de los productos finales de la peroxidación lipídica. Radicales libres y envejecimiento Los radicales libres de oxígeno (RLO) formados durante el metabolismo celular han sido reiteradamente implicados en el proceso general de envejecimiento. Las reducciones univalentes del oxígeno por las células aeróbicas generan RLO como el anión superóxido y el radical hidroxilo. Estas especies, altamente reactivas, provocan una cadena de lesiones en el interior celular, afectando entre otras biomoléculas a las proteínas, al DNA y a los lípidos. Los RLO se generan en los tejidos como consecuencia de diversas actividades metabólicas, entre las que cabe destacar algunas vías principales, como el sistema enzimático de la xantina oxidasa/dehidrogenasa, la autoxidación de las catecolaminas, la oxidación de grupos hemo, el metabolismo del ácido araquidónico, y por la alteración en la cadena de transporte mitocondrial. Se ha postulado que existe un equilibrio dinámico entre la generación de RLO y la actividad de los sistemas de defensa antioxidante. Estos sistemas actúan como un elemento de regulación con una notable expresión génica. Los antioxidantes protegen a las estructuras celulares de la acción nociva de los agentes oxidantes, por lo que se ha considerado su implicación en el proceso de envejecimiento. Se ha observado que la expectativa de vida máxima para diferentes cohortes de población se correlacionaba positivamente con la actividad de las defensas antioxidantes, y negativamente con la producción de RLO. A pesar de la existencia de defensas antioxidantes, una fracción variable de radicales libres escapan a los sistemas de eliminación y generan daño estructural. La peroxidación lipídica es una importante consecuencia biológica de la acción de los RLO sobre los fosfolípidos de membrana. Los RLO ejercen gran parte de sus efectos citotóxicos a través de este mecanismo, produciendo cambios en la permeabilidad de las membranas celulares, aumento de su fluidez, mayor rigidez, y en última instanage to biologically important molecules. Because the disturbance of antioxidant enzyme balance in individuals with DS can be a key to DS pathogenesis, we analysed activities of Cu/Zn SOD, catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR), which form the main enzyme protection mechanism against harmfull effects of reactive oxygen species, and the levels of malondialdehyde (MDA), an end product of lipid peroxidation. Free radical and aging Oxygen free radical (OFRs) generated during the cellular metabolism have been involved in the aging process. Univalent reductions of oxygen by aerobic cells generated OFRs like superoxide anion and hydroxyl radical. OFRs are unstable compounds which exert toxic effects by reacting with lipids, proteins and nucleotides to produce oxidiced compounds. OFRs are generated in the tissues as a consequence of several metabolic activities such as enzymatic system of xantine oxidase/dehydrogenase, autoxidation of catecholamines, oxidation hem groups, metabolism arachidonic acid and alteration in mitochondrial electronic transport chain. It have been postulated that a dynamic equilibrium exists between the generation of OFRs and the level of antioxidant defences, which acts as a set point for regulation of gene expression. Antioxidants protect biological system from oxidants and have been considered to act delaying aging. Longer life expectancy within cohort population is positively correlated to antioxidant defences and negatively to OFRs production. Despite the existence of antioxidant defences, a fraction of free radicals escape elimination and cause structural damage. Lipid peroxidation is an important biological consequence of oxidative cellular damage. OFRs have been suggested to exert their cytotoxic effect by peroxidation of membrane phospholipids, changing the permeability of cellular membrane, increasing their fluidity, their rigidity and in some cases making them lose their integrity and increasing the risk of membrane rupture. An essential result of lipid peroxidation is that polyunsatured fatty acids are decomposed by direct or indirect peroxidation processes that contain malondialdehyde (MDA) as an end product. MDA is the most abundant individual aldehyde resulting from lipid peroxidation. In this way, elevated levels of MDA are indicative of a high oxidative stress. This work is focussed on determination of two antioxidant enzymes superox- 145

156 Biomarcadores de Estrés Oxidativo y Procesos de Envejecimiento / Oxidative Stress Biomarkers and Aging Processes cia, pérdida de la integridad de las mismas. El malondialdehído (MDA) es uno de los productos de bajo peso molecular resultante de la fragmentación que sufren los ácidos grasos poliinsaturados por la agresión de los RLO. Niveles elevados de MDA son indicativos de un alto estrés oxidativo. Los objetivos de este trabajo se centran en la determinación de dos enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) y en la valoración de MDA. Estas determinaciones se realizan en pacientes con desordenes de envejecimiento y en profesionales que soportan elevados niveles de estrés. Efecto antioxidante del tratamiento crenoterápico con aguas mineromedicinales sulfuradas y sulfatadas Los efectos antioxidantes de determinadas aguas mineromedicinales y las técnicas hidrológicas que con ellas se prescriben abren nuevas vías terapéuticas para tratar un amplio rango de patologías propias del envejecimiento, retrasando su avance. El conocimiento del estado oxidativo mediante la medida de la producción urinaria de las Sustancias Reactivas al Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) es una fuente básica de información sobre el proceso de lipoperoxidación humana y envejecimiento. Estamos trabajando en la determinación de TBARS y su modificación por la crenoterapia con aguas que tengan presencia de azufre, habiendo comprobado con anterioridad que la crenoterapia con aguas minero-medicinales sulfuradas disminuía la producción de TBARS, probablemente debido a la absorción del azufre e incremento de radicales SH en la cisteina del tripéptido glutatión, que actuaría como antioxidante y barredor (scavenger) de radicales libres. Se analizan diferentes parámetros como, edad, sexo, estado oxidativo, origen de la población, duración mínima del tratamiento, vías de administración del tratamiento, tensión arterial, hábitos, época del año ide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and evaluation of MDA, marker of lipid peroxidation. These determinations are made in patients with aging disorders and in professionals that bear high levels of stress Antioxidant effect of crenotherapic treatment with sulphured and sulphated mineral waters The antioxidant effects of several mineral waters and the hydrological techniques that are prescribed with them make it possible to develop new therapeutical ways to treat a wide range of pathologies related aging, delaying its development. The measurement of urinary production of Thiobarbituric Acid Reactant Substances (TBARS) from an homogeneous population provides us with a huge amount of information about the process of human lipoperoxidation or aging. The crenotherapy treatment, using sulphured and sulphated mineral waters, decreases the TBARS production. It is probably due to the sulphur absortion which increases the SH radicals included the glutation tripeptid. These SH radicals work like free radicals scavengers. A complete case history has been done and the different medical variables were evaluated after treatment application of crenotheraphy. Different parameters are analysed such as age, sex, oxidative stress, place of birth, minimum treatment, treatment administration types, arterial pressure, season of the year. 146

157 Biomarcadores de Estrés Oxidativo y Procesos de Envejecimiento / Oxidative Stress Biomarkers and Aging Processes Organismos Financiadores/Funding Agencies Fundación Inocente-Inocente ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Casado, A., and López-Fernández, M.E. (2003). Age-correlated changes of the erythrocyte catalase activity in the Spanish population. Gerontology 49, Casado, A., De la Torre, R., López-Fernández, M.E., Gil, P., y Egido, J.A. (2004). Enzimas antioxidants en el infarto cerebral agudo. Neurología 19 (1), 5-9. Hernández-Torres, A., Cuenca, E., Ramón, J.R., Casado, A., y López-Fernández, E., (2004). Duración mínima del tratamiento balneario con aguas bicarbonatadas sulfatadas para conseguir un efecto antioxidante en personas mayores de 65 años. Rev. Esp. Geriatr. Gerontol. 39 (3), Hernández-Torres, A., Ramón, J.R., Cuenca, E., Casado, A., y López-Fernández, E. (2004). Capacidad antioxidante de la balnetoterapia con aguas minero-medicinales sulfuradas y sulfatadas. Medic. Nat. 7, Contribuciones a libros/contributions to books Abrisqueta, J.A., Casado, A., Aller, V., y Menaya, J. (2003). Actualizaciones en la genética del Síndrome de Down. En: Fundación Síndrome de Down (Ed. Universidad Complutense de Madrid) pp Casado, A. (2004). Evolución con la edad de enzimas antioxidantes y peroxidación lipídica. Pautas para un envejecimiento saludable. SINTESIS (Ed. Fundación Al Álandalus) pp Casado, A. (2004). Oxidation and ptotection of calcium channels in senile dementia. Medical and Biological Papers (Ed. Fundación Rodríguez Pascual). 147

158 Metabolismo y Patología Molecular Metabolism and Molecular Pathology ROBERTO PARRILLA SÁNCHEZ Jefe de Grupo / Group Leader OFELIA GARCÍA HERMIDA CONSUELO GONZÁLEZ MANCHÓN ÁNGELES MARTÍN REQUERO RAMÓN B. RODRÍGUEZ MARTÍNEZ MATILDE SÁNCHEZ AYUSO Investigadores de Carrera / Staff Scientists NORA VIVIANA BUTTA COLL Investigadora contratada Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist SUSANA LARRUCEA BILBAO ELENA GARCÍA ARIAS-SALGADO (Desde XII-2004) Investigadoras Contratadas / Contract Scientists MILAGROS FERRER ALDEA (Hasta III-2003) B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow SONIA ALONSO MARTÍN FERNANDO BARTOLOMÉ ROBLEDO (Desde IX-2004) NATIVIDAD DE LAS CUEVAS MORENO M. JOSÉ JAÉN LÓPEZ (Desde VI-2003) ASIER JAIO ANDRÉS (Desde I-2004) ÚRSULA MUÑOZ MORÓN DINA PAVÓN REALPE (Desde I-2004) SENÉN SEVILLA (Hasta V-2003) B. Predoctorales / Graduate Students JINGLI XIE ZHANG (Desde X-2003) Investigadora visitante / Visiting scientist JOSEFA FERNANDEZ-CABRERA BAZÁN (Desde VII-2003) TOMÁS FONTELA CASADO Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Enfermedades genéticas, Plaquetas, Hemostasia, Anulación Génica ( Knock out ), Complejo GPIb-IX, Formación de plaquetas, Agregación plaquetaria, Regulación transcripcional, Enfermedad de Alzheimer Fisiopatología y genética molecular de trastornos hemostáticos Los objetivos generales en este área son: 1) Caracterizar funcionalmente células obtenidas de pacientes con procesos patológicos de nuestro interés; 2) Desvelar las bases genético-moleculares de la etiopatogenia de procesos patológicos humanos y Keywords: Genetic diseases, Platelets, Haemostasis, Transgénesis, Gene targeting ( Knock out ) GPIb-IX complex, Platelet formation, Platelet aggregation, Gene transcription, Alzheimer disease Pathophysiology and molecular genetics of haemostatic disorders Succintly, the research on this area aimed at: 1) functional characterization of cells obtained from patients suffering from pathological processes of interest; 2) to disclose the existence of genetic structural changes associated with human pathology 148

159 Metabolismo y Patología Molecular / Metabolism and Molecular Pathology establecer experimentalmente una correlación precisa entre cambios estructurales y funcionales. Para ello, se ha procedido a la clonación de genes mutantes potencialmente responsables de alteraciones funcionales, y a su expresión en sistemas heterólogos con el fin de analizar la capacidad funcional de las proteínas mutadas. Se presta atención preferente a: a) El estudio de las bases genético-moleculares de los trastornos hemostáticos, en particular tromboastenias y síndromes macrotrombocitopénicos. b) Los mecanismo(s) de activación plaquetaria. Este estudio comprende: -La manipulación genética del receptor de fibrinógeno (Fg) humano y su expresión estable en líneas celulares establecidas para su caracterización funcional. -Coexpresión del receptor de Fg y receptores de agonistas fisiológicos. -Caracterización de las vías de señalización responsables del incremento de adherencia celular y de la agregación de células en suspensión, mediados por agonistas fisiológicos. -Sobreexpresión de genes plaquetarios de nuestro interés y su anulación específica condicional ( Knock out ) por el sistema Cre-LoxP Clonación y caracterización estructural y funcional de genes humanos implicados en la función plaquetaria El objetivo general de esta línea de trabajo es la identificación, aislamiento, y caracterización de proteínas implicadas en la función plaquetaria. Se ha prestado particular atención a la regulación de la expresión y función de la podocalicina humana. Este estudio comprende: 1) clonación y análisis funcional de la región promotora de este gen; 2) expresión heteróloga y análisis funcional; 3) estudio cuantitativo de la expresión de formas alternativas de splicing y su papel fisiológico; 4) producción de anticuerpos monoclonales y librerías de expresión para estudiar la interacción de podocalicina con otras proteínas. De forma paralela se ha procedido a desarrollar los medios técnicos necesarios para el análisis funcional de plaquetas con sobreexpresión de podocalicina así como anulación (KO) de este gen. Con tal fin hemos generado ratones portadores del transgen humano de podocalicina en megacariocitos y en células CHO. De igual forma, se ha procedido a la anulación génica and determine the relationship between the structural changes and the functional perturbations. For this purpose, we have cloned mutant genes involved in pathological processes and studied their functional properties. The latter has been achieved by either analyzing the translational products of these genes expressed in heterologous systems or transfecting constructions of the mutant genes into the appropriate strain of cultured cells. Special attention has been paid to the following subjects: a) Elucidation of the genetic molecular basis of haemostatic disorders, particularly thrombasthenias and macrothrombocytopenic syndromes. b) Mechanism(s) of platelet activation. This study comprises: -Genetic engineering of the human fibrinogen (Fg) receptor and its stable expression in established cell lines. -Coexpression of the human Fg receptor and receptors for known physiological agonists. -Characterization of signaling pathways responsible for the cell adherence or aggregating responses induced by physiological agonists. -Overexpression or genetic knock out or knock down of platelet proteins of interest Molecular cloning and structural and functional characterization of human genes controlling the platelet function In general terms, this line of research aims at identification, isolation, and characterization of proteins involved in controlling the platelet function. Particular attention is been paid to study the regulation of expression and function of the human podocalyxin. The latter study comprises: 1) molecular cloning and functional analysis of the regulatory region of this gene; 2) heterologous expression and functional analysis; 3) quantitative analysis of the expression of alternative splicing forms and their physiological significance; 4) production of resources, like murine monoclonal antibodies and phage display libraries to study the interaction of podocalyxin with other proteins. The above mentioned studies were accompanied by a parallel development of the technical resources needed for the functional analysis of platelets overexpressing human podocalyxin or platelet lacking podocalyxin. For that purpose we have produced mice selectively expressing the human transgen in megakaryocytes. At the same time we are producing mice carry- 149

160 Metabolismo y Patología Molecular / Metabolism and Molecular Pathology condicional en megacariocitos de ratón del gen de la podocalicina mediante el sistema Cre-LoxP. El desarrollo de estas herramientas de trabajo nos permitirá estudiar el efecto de la anulación selectiva de otras proteínas de importancia reguladora. Fisiopatología del complejo GPIb-IX o receptor plaquetario del factor de von Willebrand El complejo GPIb-IX es el principal receptor del factor de von Willebrand y desempeña un papel esencial en la adhesión y activación plaquetarias durante los estadíos iniciales de la hemostasia primaria. En el laboratorio hemos estudiado las alteraciones estructurales y funcionales de este receptor en fenotipos de síndrome de Bernard-Soulier, enfermedad autosómica recesiva que cursa con macrotrombocitopenia y diátesis hemorrágica. En la actualidad, estamos también interesados en el estudio de otros procesos en los que el complejo GPIb-IX podría tener un papel clave: I) la maduración del megacariocito y formación de plaquetas, y II) la agregación plaquetaria desencadenada por la interacción GPIb-trombina. I) Maduración del megacariocito y formación de plaquetas. La asociación de macrotrombocitopenia y alteraciones estructurales de los genes de GPIb-IX en el síndrome de Bernard-Soulier sugiere que este complejo juega un importante papel en la fragmentación del megacariocito para generar plaquetas. La macrotrombocitopenia resulta no sólo de la ausencia de GPIb-IX en la superficie plaquetaria, sino que también se asocia a la expresión superficial de complejos no funcionales debido a mutaciones que impiden la fijación del ligando. Nos proponemos determinar la participación de GPIb-IX en la formación de plaquetas utilizando como modelo líneas de células megacarioblásticas cuya diferenciación hacia megacariocito puede ser inducida en determinadas condiciones experimentales. Entre los objetivos del proyecto está la identificación de moléculas que interaccionan con el dominio extracelular de las subunidades de GPIb-IX, y de proteínas involucradas en la interacción del complejo con el citoesqueleto. II) Agregación plaquetaria en respuesta a la interacción GPIb-trombina. Clásicamente, el fibrinógeno y su producto proteolítico, la fibrina, son los agentes que, mediante su fijación a la integrina αiibβ3, actúan de agregantes plaquetarios. En este proceso, la activación del receptor responde a señales internas que le llegan a través de la estimulación de una serie de receping a conditional (floxed) null allele of podocalyxin and transgenic mice expressing the recombinase Cre controlled by a megakaryocyte-specific promoter. The production of these research tools will allow the selective disruption of the podocalyxin gene in megakaryocytes as well as in any other cell by crossing mice carrying the conditional allele with mice expressing the recombinase Cre in the target tissue. The skills and resources obtained by using the Cre-loxP system will be beneficial for the functional analysis of other proteins of interest. Pathophysiology of the GPIb-IX complex, the von Willebrand factor receptor The GPIb-IX complex is the major von Willebrand factor receptor playing an essential role in platelet adhesion to and activation on damaged vessel wall, during the early stages of primary haemostasis. In the laboratory we have studied the structural and functional alterations of this receptor associated to Bernard-Soulier syndrome phenotypes, an autosomal recessively inherited bleeding disorder characterized by thrombocytopenia, giant platelets and hemorrhagic diathesis. We are currently interested in the study of other processes in which GPIb- IX may have a pivotal role: I) megakaryocyte differentiation and platelet formation, and II) platelet aggregation via a GPIbthrombin interaction pathway. I) The macrothrombocytopenia associated to structural alterations of the GPIb-IX complex genes in the Bernard-Soulier syndrome suggests that this receptor plays an important role in the megakaryocyte fragmentation and platelet formation. Macrothrombocytopenia has also been observed associated to surface expression of non-functional complexes due to mutations preventing the ligand binding. Our goal is to determine the role of GPIb-IX in platelet formation by using megakaryoblastic cell lines which differentiation can be oriented toward megakaryocytes. One of the objectives is the identification of molecules interacting with the extracellular domains of the GPIb-IX complex, as well as proteins involved in the interaction of GPIb-IX with the cytoskeleton. II) It has been long assumed that fibrinogen and its proteolytic product, fibrin, are the crosslinking agents that bind to the αiibβ3 integrin in aggregating platelets. In this process, integrin activation is the result of transmission of internal signals due to agonist receptor stimulation at the platelet surface. 150

161 Metabolismo y Patología Molecular / Metabolism and Molecular Pathology tores de agonistas de la superficie de las plaquetas. Recientemente, se ha sugerido un nuevo mecanismo de agregación plaquetaria según el cual una conformación distinta de αiibβ3 sería capaz de fijar moléculas de fibrina polimerizante respondiendo a la estimulación del complejo GPIb-IX por bajas concentraciones de trombina. Es complejo estudiar este proceso en plaquetas debido al solapamiento de señales inducidas por la estimulación de los receptores PAR de trombina, y también por la dificultad de diferenciarlo del atrapamiento plaquetario en la red de fibrina. En el laboratorio hemos generado un modelo celular que nos está permitiendo caracterizar este proceso en ausencia de la interferencia con los receptores PAR de trombina. Bases celulares y moleculares de la enfermedad de Alzheimer: Alteraciones extraneurales El interés general de esta línea de trabajo es el estudio de las bases celulares y moleculares de procesos patológicos humanos, en especial los mecanismos de activación y transducción de señales generadas por receptores de superficie y su efecto sobre el control del metabolismo y de la homeostasis de Ca 2+ y H +. Hace unos años iniciamos un estudio encaminado a elucidar el papel de estos procesos en la enfermedad de Alzheimer (EA), con la hipótesis de que pudiera ser una enfermedad sistémica: aunque los síntomas más aparentes de esta patología tienen lugar en el sistema nervioso central, sería posible encontrar manifestaciones fisiopatológicas en tejidos periféricos. Por tal razón, creamos un banco de células de origen hematopoyético (transformación linfoblástica de linfocitos B con virus de Epstein Barr) de enfermos diagnosticados de demencia de Alzheimer y controles sanos de la misma edad. El estudio de la homeostasis iónica realizado con este modelo experimental puso de manifiesto que en la demencia de Alzheimer, existen cambios significativos en la homeostasis iónica, asociados a una mayor actividad proliferativa de las células procedentes de pacientes de EA. En la actualidad estamos estudiando los mecanismos de control del ciclo celular en linfoblastos de pacientes de EA, en un intento de determinar posibles alteraciones que puedan servir como marcadores de la enfermedad. Nuestra hipótesis de trabajo se basa en que alteraciones en los mecanismos de control del ciclo de división celular pudieran estar asociadas con la muerte neuronal, característica de la EA y que este fenómeno puede ser Recently, it has been suggested the existence of a platelet aggregation mechanism in which a distinct αiibβ3 conformation may allow the binding of polymerizing fibrin in response to a GPIbthrombin interaction-dependent pathway. The complexity of studying this process in platelets is due to the overlapped signals generated upon the stimulation of the PAR thrombin receptors, and also to the difficulty to distinguish it from simple trapping of platelets by the fibrin clot. We have developed a cellular model that is allowing the characterization of this process without the interference of the much stronger PAR-couple signals. Cellular and Molecular Basis of Alzheimer s Disease. Relevance of studies in non-neuronal cells The general interest of our laboratory is the study of the cellular and molecular basis of human pathological processes, mainly the mechanisms of activation and signal transduction of membrane receptors and their influence on the Ca 2+ and H + homeostasis. A few years ago, we initiated a project aimed at elucidating the role of these processes in the ethiology of Alzheimer disease (AD). We hypothesise that AD is a systemic disorder with more prominent neurological manifestations. For this purpose, we created a bank of cell lines by transforming lymphocytes from AD patients and age-matched individuals with the Epstein Barr virus. With this experimental model we revealed an altered Ca 2+ and H + homeostasis in lymphoblasts from patients with Alzheimer dementia (AD) associated with higher rates of proliferation of AD lymphoblasts. We are now investigating whether there is a dysfunction of cell division cycle in AD lymphoblasts that could be related to the cell cycle disturbances detected in brain. Compelling evidence supports the idea that uncoordinated expression of cell cycle molecules, and perturbation of cell cycle checkpoints may be one of the mechanisms by which post-mitotic neurons die. We will try to study the specificity of the observed changes in cell lines derived from AD patients by comparison with cell lines from patients suffering from vascular dementia, mixed dementia and other neurodegenerative dementias (Pick s disease). 151

162 Metabolismo y Patología Molecular / Metabolism and Molecular Pathology estudiado en células extraneurales. Nos basamos en trabajos recientes que indican una expresión anómala de proteínas reguladoras del ciclo celular y evidencias directas de replicación del ADN en necropsias cerebrales de pacientes de EA. Pretendemos también determinar la especificidad de las posibles alteraciones que se detecten, utilizando líneas celulares derivadas de individuos afectados por demencia vascular, demencia mixta (vascular más Alzheimer) y otras demencias degenerativas (complejo Pick). Organismos Financiadores/Funding Agencies DGICYT, SAF ( ) SAF, ( ) FIS, 01/1194 ( ) FIS, PI ( ) AECI, 2002CN0004 ( ) BMC, (2003) CAM, 08.4/0015/2001 ( ) CAM, 08.4/0029.1/2003 ( ) SAF, (2004) BMC, ( ) SAF, ( ) Tesis doctorales /Doctoral Theses Natividad de las Cuevas Moreno. Alteraciones en los procesos de señalización y ciclo celular en la enfermedad de Alzheimer. Universidad de Alcalá de Henares, Director: A. Martín Requero. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Arias-Salgado, E.G., Lizano, S., Sarkar, S., Brugge, J.S., Ginsberg, M.H., and Shattil, S.J. (2003). Src kinase activation by direct interaction with the integrin b cytoplasmic domain. Proc. Nat. Acad. Sci. U S A. 100, Butta, N., Arias-Salgado, E.G., González-Manchón, C., Ferrer, M., Larrucea, S, Ayuso, M.S., and Parrilla, R. (2003). Disruption of the b disulfide bridge confers constitutive activity to b3 integrins. Blood 102,

163 Metabolismo y Patología Molecular / Metabolism and Molecular Pathology Cuevas, N., Urcelay, E., Hermida, O.G., Sáiz, R., Bermejo, F., Ayuso, M.S., and Martín-Requero, A. (2003). Ca 2+ /calmodulindependent modulation of cell cycle elements, prb and P27 kip1 involved in the enhanced proliferation of lymphoblasts from patients with Alzheimer dementia. Neurobiol. Dis. 13, González-Manchón, C., Arias-Salgado, E.G., Martín, G., Butta, N., Rodríguez, R.B., Elalamy, I., Parrilla, R., and Favier, R. (2003). A novel homozygous splice junction mutation in gpiib associated with alternative splicing, nonsense-mediated decay of GPIbmRNA, and type II glanzmann s thrombasthenia. J. Thromb. Haemost. 1, González-Manchón, C., Butta, N., Iruín, G., Alonso, S., Ayuso, M.S., and Parrilla, R. (2003). Disruption of the Cys5-Cys7 disulfide bridge in the platelet glycoprotein Ibb prevents the normal maturation and surface exposure of GPIb-IX complexes. Thromb. Haemost. 90, Leng, X.H., Hong, S.Y., Larrucea, S., Zhang, W., Li,T.T., López, J.A., and Bray, P.F. (2003). Platelets of female mice are intrinsically more sensitive to agonists than are platelets of males. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, Buensuceso, C., Arias-Salgado, E.G., and Shattil, S.J. (2004). Protein-Protein interactions in plateletaiibb3 signaling. Seminars in Thromb. Haemost. 30, (Review). Butta, N., Larrucea, S., González-Manchón, C., Alonso, S., and Parrilla, R. (2004). a2-adrenergic-mediated activation of human reconstituted fibrinogen receptor (integrin alphaiibbeta3) in Chinese hamster ovary cells. Thromb. Haemost. 92, González-Manchón, C. Butta, N., Larrucea, S., Arias-Salgado, E.G., Alonso, S., López, A., and Parrilla, R. (2004). A variant thrombasthenic phenotype associated with compound heterozygosity of integrin beta(3)-subunit: (Met124Val)beta3 alters the subunit dimerization rendering a decreased number of constitutive active alphaiibbeta3 receptors. Thromb. Haemost. 92, Li, T.T., Larrucea, S., Souza, S., Leal, S.M., López, J.A., Rubín, E.M., Nieswandt, B., and Bray, P.F. (2004). Genetic variation responsible for mouse strain differences in integrin alpha 2 expression is associated with altered platelet responses to collagen. Blood 103, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Buensuceso, C.S., Obergfell, A., Soriano, A., Eto, K., Kiosses, W.B., Arias-Salgado, E.G., Kawakami, T., and Shattil, S.J. (2005). Regulation. Regulation of Outside-in Signaling in Platelets by Integrin-associated Protein Kinase C{beta}. J. Biol. Chem. 280 (1) Cuevas, N., Muñoz, U, Hermida, O.G., and Martín-Requero, A. (2005). Altered transcriptional regulators in response to serum in immortlized lymphocytes from Alzheimer s disease patients. Neurobiol. Aging 26, Xie, J., Pabón, D., Jayo, A., Butta, N., and González-Manchón, C. (2005). Type I Glanzmann thrombasthenia caused by an apparently silent b3 mutation that results in aberrant splicing and reduced b3 mrna. Thromb. Haemost. (en prensa/in press). 153

164 Departamento de Inmunología Department of Immunology Jefe de Departamento Department Head Profesores de Investigación Investigadores Científicos Científicos Titulares Personal Técnico Secretaria ÁNGELES GARCÍA PARDO (Hasta X-2004) JOAQUIN TEIXIDÓ CALVO (Desde XI-2004) CARMELO BERNABEU QUIRANTE ANGEL CORBÍ LÓPEZ SANTIAGO RODRÍGUEZ DE CÓRDOBA ÁNGELES GARCÍA PARDO JOSÉ MARÍA ROJO HERNÁNDEZ AUGUSTO SILVA GONZÁLEZ JOAQUÍN TEIXIDÓ CALVO ISABEL BARASOAIN BLASCO LUISA Mª BOTELLA CUBELLS ALICIA GARCÍA ARROYO EDUARDO PÁEZ ABRIL MIGUEL ANGEL VEGA PALACIOS Mª LUISA DEL POZO DEL CAMPILLO FRANCISCO GARCÍA TABARES MERCEDES HERNÁNDEZ DEL CERRO CARMEN LANGA POZA JUANA MARÍA LÓPEZ VERA Mª SOLEDAD MARTÍNEZ VARA DE REY ROMÁN BÁRBARA MORENO JIMÉNEZ CARMEN PARTEARROYO LACABA

165 Activación de Linfocitos T T-lymphocyte Activation JOSÉ MARÍA ROJO HERNÁNDEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist RAQUEL BELLO COLLANTES ALEJANDRA SÁNCHEZ PÉREZ B. Predoctorales / Graduate Students MARÍA LUISA DEL POZO DEL CAMPILLO Personal Técnico / Technician Palabras clave: Linfocitos T, TCR/CD3, ICOS, CD46 Dentro de los procesos de activación de los linfocitos T, nuestro laboratorio se ha centrado en algunos aspectos de la estructura del receptor para antígeno de los linfocitos T (Complejo TCR/CD3) y en la coestimulación por moléculas de la familia de CD28 (ICOS) y de la familia RCA de reguladores de la activación del complemento (CD46, MCP). Variabilidad de las cadenas CD3 epsilon del complejo TCR/CD3 de linfocitos T El complejo TCR/CD3 se encarga, mediante módulos diferentes, del reconocimiento específico de antígenos (TCR) y de la transducción de señales activadoras al interior celular (CD3). Aunque a nivel genético no hay variabilidad de los componentes de CD3, resultados previos de nuestro grupo utilizando anticuerpos e inhibidores de metaloproteasas indican que hay cierta variabilidad N-terminal en las cadenas CD3 epsilon (Criado, G. y cols., Eur. J. Immunol. (2000) 30:1469). Estas diferencias, derivadas de la actividad de metaloproteasas, se correlacionan con variaciones en la fuerza de interacción entre los elementos del complejo TCR-CD3 y se reflejan en la capacidad de los ligandos del TCR para activar las células, con el estado de activación de los linfocitos T, y con el fenotipo Th1/Th2 o CD4 + /CD8 + de las células T analizadas (Bello R. y cols., enviado). Keywords: T lymphocytes, TCR/CD3, ICOS, CD46, MCP Within the different aspects of T lymphocyte activation, our group is focused in certain structural aspects of the T cell receptor (TCR/CD3) complex as well as in the analysis of costimulation by molecules of the CD28 family like ICOS or by molecules of the Regulators of Complement Activation (RCA) family like CD46 (MCP). Variability of CD3 epsilon chains within the TCR/CD3 of CD4 + T lymphocytes The TCR/CD3 complex uses distinct modules to specifically recognize antigens (TCR) or transduce activating signals to the T cells (CD3). Although there is no variability of CD3 chains at the genetic level, previous data from our group using antibodies and metalloprotease inhibitors show that there is some N-terminal variability of CD3 epsilon chains (Criado, G. et al., Eur. J. Immunol. (2000) 30: 1469). These differences are due to the activity of metalloproteases, and correlate with differences in the strength of interaction between the elements of the TCR/CD3 complex. Furthermore, N-terminal variability is reflected in the ability of TCR ligands to activate T cells, is different in resting and activated cells, in Th1 and Th2 cells, or CD4 and CD8 cells (Bello, R., et al., submitted). The proteomic and immunochemical analysis of CD3 epsilon chains from different T cells or T 156

166 Activación de Linfocitos T / T-lymphocyte Activation El análisis proteómico e inmunoquímico de las cadenas CD3 epsilon de distintos tipos celulares T son congruentes con la variabilidad a nivel N-terminal de estas cadenas (Bello, R. y cols., enviado), y nuestro objetivo actual es determinar la influencia de las diferentes formas de esta cadena en las señales activadoras y las interacciones entre las cadenas del complejo TCR/CD3. Mecanismos de coestimulación por Inducible Costimulator (ICOS) ICOS es una molécula coestimuladora de la familia CD28, típicamente expresada por linfocitos T activados. Teniendo en cuenta la semejanza entre ICOS y CD28, que incluye la conservación de motivos de secuencia YMxM implicados en la señalización celular por medio de PI-3 quinasa, estamos estudiado posibles semejanzas y diferencias en las vías de activación de cada molécula. En células T que expresan ICOS constitutivamente, ICOS aumenta la fosforilación temprana de CD3, ZAP- 70 y Vav, y la activación de las MAP quinasas ERK, p38 y JNK. Estas coestimulación, así como el incremento de la secreción de IL-4 e IL-10 son dependientes de la polimerización de actina. Inhibidores farmacológicos muestran que la coestimulación de estas citoquinas es dependiente de ERK, JNK, pero no de PKC o p38 (Feito, M.J. y cols., Eur. J. Immunol. (2003) 33:204). Aunque la ciclosporina A no afecta la activación de ZAP-70 o MAP quinasas, sí que inhibe la secreción de IL-4, indicando un papel de calcineurina y factores NF-AT en la coestimulación de ICOS (Feito, M.J. y cols., Eur. J. Immunol. (2003) 33:204). Este papel esencial de NF-AT en las señales de ICOS se ha demostrado también al estudiar el papel de ICOS en la diferenciación de linfocitos T CD4 + normales hacia un fenotipo Th2 (Nurieva, R.I. y cols., Immunity (2003) 18:801). Estos datos indican la existencia de señales específicas de ICOS cuyas bases moleculares es necesario analizar. MCP (CD46) favorece la diferenciación Th1 de linfocitos CD4 + humanos Numerosos datos recientes indican que las moléculas reguladoras de complemento de la familia RCA cumplen diversas funciones en las células que las expresan. En colaboración con el cell lines is congruent with N-terminal variability of CD3 epsilon (Bello, R., et al., submitted), so that our present goal is to determine how the different forms of this chain determine different intracellular signals or change the interactions between TCR/CD3 polypeptides. Mechanisms of Inducible Costimulator (ICOS) function ICOS is a costimulatory molecule of the CD28 family, characteristically expressed by activated T lymphocytes. Given the resemblance between ICOS and CD28, including an YMxM sequence motif involved in PI-3 kinase-mediated signalling, we are currently analysing coincidences and differences between ICOS and CD28 in terms of costimulation mechanisms. In T lymphocytes constitutively expressing ICOS, it enhances tyrosine phosphorylation of CD3, ZAP-70 and Vav, or the activation of the MAP kinases ERK, p38 and JNK. ICOS-dependent costimulation of these early signals as well as enhanced IL-4 or IL- 10 secretion is dependent on actin polymerization (Feito, M.J. et al., Eur. J. Immunol. (2003) 33:204). In addition, using metabolic inhibitors we show that the effect on cytokine secretion is dependent on ERK and JNK, but not on PKC or p38 (Feito, M.J. et al., Eur. J. Immunol. (2003) 33:204). Cyclosporin A does not inhibit some early effects of ICOS costimulation including enhanced ZAP-70 or MAP kinase activity, yet enhanced IL-4 secretion is blocked by this drug. These data indicate a role of calcineurin and NF-AT factors in ICOSmediated costimulation (Feito, M.J. et al., Eur. J. Immunol. (2003) 33:204). An essential role of NF-AT in ICOS-mediated signals was also observed when the effect of ICOS in Th2 differentiation of normal CD4 + T lymphocytes was examined (Nurieva, R.I.et al., Immunity (2003) 18:801). These data suggest that ICOS provides distinct cell signals whose molecular bases need to be further studied. MCP (CD46) fosters Th1 differentiation of human CD4 + T lymphocytes There is growing data in recent years indicating that the molecules belonging to the Regulators of Complement Activation (RCA) family fullfil functions other than protection from autologous C attack of the cells where they are expressed. 157

167 Activación de Linfocitos T / T-lymphocyte Activation grupo de la Dra. Pilar Portolés (CN Microbiología, Instituto de Salud Carlos III), habíamos observado que la molécula RCA murina Crry/p56 producía una coestimulación muy potente de la activación de linfocitos T (Fernández-Centeno et al., J. Immunol. (2000) 164:4533). Con estos datos, estudiamos la coestimulación de linfocitos T humanos por CD46, como un homólogo funcional humano de Crry. Observamos, tanto en linfocitos T CD4 + normales como en blastos de células T, incrementos en señales tempranas de activación de tirosina quinasas y MAP quinasas (Sánchez, A. y cols., Eur. J. Immunol. (2004) 34:2439). Estas señales, en presencia de coestimulación por CD28, favorecen la diferenciación de los linfocitos a células de fenotipo Th1 productoras de IFN-γ e IL-2, e inhiben la producción de linfoquinas de tipo Th2 de modo dependiente de la MAP kinasa ERK (Sánchez, A. y cols., Eur. J. Immunol. (2004) 34:2439). Puesto que CD46 es el receptor celular de diversos virus, incluyendo el sarampión, ciertos herpesvirus y adenovirus, esta función coestimuladora podría favorecer las respuestas inmunitarias efectivas cuando estos patógenos infectan las células presentadoras de antígeno. En cambio, en ausencia de coestimulación por CD28 CD46 produce un incremento preferente de la secreción de IL-10, lo que podría contribuir a la inmunosupresión de las respuestas de los linfocitos por patógenos. In collaboration with Dr. P. Portolés and her group (C.N. Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid), we had previously observed that a mouse RCA molecule (Crry/p65) induced a potent costimulation of T cell activation in vitro (Fernández-Centeno, E. et al., J. Immunol. (2000) 164:4533). Based on these data, and as CD46 is a human homologous of Crry/p65, we set up experiments to examine the ability of CD46 as a costimulatory molecule. We observed in normal, naive or blast CD4 + cells, that CD46 enhanced early TCR/CD3 activation signals including tyrosine and MAP kinases (Sánchez, A., et al, Eur. J. Immunol. (2004) 34:2439). CD46 signals, in the presence of additional CD28 costimulus, favour CD4 + cell differentiation to a Th1 phenotype producing enhanced amounts of IFN-γ and IL-2. At the same time, CD46 inhibits Th2 lymphokines like IL-5 in an ERK-kinase-dependent manner (Sánchez, A., et al, Eur. J. Immunol. (2004) 34:2439). We believe that, since CD46 is a cell receptor for an array of human pathogens including measles virus, herpesvirus 6, and adenovirus, CD46 costimulation of Th1 reponses might favour effective adaptive immune responses upon viral infection of antigen presenting cells. In contrast, CD46 ligantion in the absence of additional CD28 costimulus favoured IL-10 secretion (Sánchez, A., et al, Eur. J. Immunol. (2004) 34:2439) which might contribute to pathogen-induced immunosuppression. Organismos Financiadores/Funding Agencies Instituto de Salud Carlos III, 01/30 ( ) DGI/PGC, BMC ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Feito, M.J., Vaschetto, R., Criado, G., Sánchez, A., Chiocchetti, A., Jiménez-Periáñez, A., Dianzani, U., Portolés, M.P., and Rojo, J.M. (2003). Mechanisms of ICOS costimulation: Effects on proximal TCR signals and MAP kinase pathways. Eur. J. Immunol. 33,

168 Activación de Linfocitos T / T-lymphocyte Activation Nurieva, R.I., Duong, J., Kishikawa, H., Dianzani, U., Rojo, J.M., Ho, I., Flavell, R.A., and Dong, C. (2003). Transcriptional regulation of Th2 differentiation by inducible costimulator. Immunity 18, de Astorza, B., Cortés, G., Crespí, C., Saus, C., Rojo, J.M., and Albertí, S. (2004). C3 promotes clearance of Klebsiella pneumoniae by A549 epithelial cells. Infect. Immunity 72, Sánchez, A., Feito, M. J., and Rojo, J. M. (2004). CD46-Mediated costimulation induces a Th1-biased response and enhances early TCR/CD3 signaling in human CD4 + T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 34, Artículos de divulgación/press Articles Rojo, J.M., and Portolés, P. (2003). Charles A. Janeway Jr., en el recuerdo. Inmunología 22,

169 Adhesión Celular en el Sistema Inmune Cell Adhesion in the Immune System MARIA DE LOS ÁNGELES GARCÍA PARDO Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist JOSÉ VICENTE MOYANO IDOETA (Hasta IV-2003) B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow ESPERANZA CANTERO ALFARO (Hasta XII-2003) ELISABETH ESCOBAR DIAZ (Desde I-2004) EVA Mª LÓPEZ MARTÍN (Hasta VII-2004) ALFREDO MAQUEDA FERNÁNDEZ JAVIER REDONDO MUÑOZ (Desde IX-2004) B. Predoctorales / Graduate Students MERCEDES HERNÁNDEZ DEL CERRO Personal Técnico / Technician Palabras clave: Integrina α4β1, Citoesqueleto, Adhesión y migración celular, LLC-B, Apoptosis Vías de activación de la integrina α4β1 y señalización intracelular en linfocitos T Las interacciones de linfocitos con fibronectina (Fn) o la proteína endotelial VCAM-1 regulan muchas funciones celulares, como la reorganización del citoesqueleto, migración y supervivencia. El receptor para ambas moléculas en linfocitos, es la integrina α4β1, que reconoce la secuencia CS-1 de Fn, contenida en el fragmento H89. La regulación de la actividad de α4β1 es por tanto esencial para el normal funcionamiento del sistema inmune y la respuesta anti-inflamatoria. α4β1 (como otras integrinas) puede ser regulada desde dentro (por PMA, anti-cd3, SDF-1α) o fuera (Mn 2+, el anticuerpo monoclonal anti-β1 TS2/16) de la célula, y en ambos casos hay aumento de adhesión y/o afinidad por sus ligandos. Nuestro grupo está estudiando si las diferentes vías de activación de α4β1 producen diferentes eventos post-adhesión. Utilizando células Jurkat hemos encontrado dos tipos de morfología diferentes, polariza- Keywords: α4β1 integrin, Cytoskeleton, Cell adhesion and migration, B-CLL, Apoptosis Activation pathways of α4β1 integrin and T cell intracellular signaling Lymphocyte interactions with fibronectin (Fn) or the endothelial protein VCAM-1 regulate many cellular programmes including cytoskeleton reorganization, migration, and survival. The lymphocyte receptor for both molecules is α4β1 integrin, which recognizes the CS1 site in Fn, within the H89 fragment. Regulation of α4β1 activity is therefore crucial for the development and function of the immune system and the inflammatory response. α4β1 (like oher integrins) may be activated from inside (PMA, CD3 crosslinking, SDF-1a) or outside (Mn 2+, the anti-β1 mab TS2/16) the cell, and activation results in increased adhesion and/or affinity for its ligands. Our laboratory is studying whether these various activation agents induce different post-adhesion events. Using Jurkat cells we have found two different morphological responses, polarization or round spreading, depending on the stimulus used to activate α4β1. 160

170 Adhesión Celular en el Sistema Inmune / Cell Adhesion in the Immune System ción o extensión redondeada, dependiendo del estímulo que activa α4β1. La inducción de polarización, pero no de extensión celular, requiere la inactivación de las GTPasas RhoA y Rac1. Además, las señales que resultan en polarización celular, pero no las que resultan en extensión redondeada, inducen altos niveles de fosforilación de la quinasa Pyk2 y del factor Vav. Nuestros estudios indican que las respuestas mediadas por α4β1 en células T pueden están reguladas diferencialmente in vivo por estímulos fisiológicos específicos. Papel de la integrina α4β1 en la formación de fibras de estrés y adhesiones focales La adhesión celular a Fn induce generalmente formación de fibras de estrés y contactos focales, mediados fundamentalmente por la interacción de la integrina α5β1 con la secuencia RGD y del sindecano-4 con el dominio Hep II de Fn. Nosotros hemos estudiado el papel de α4β1 en estos procesos. Dado que los linfocitos no forman fibras de estrés, hemos utilizado las células de melanoma SKMEL-178, para estos ensayos. Las células SKMEL-178 formaban fibras de estrés y adhesiones focales tras su adhesión al fragmento FN-III7-10 (secuencia RGD) via α5β1. La co-inmovilización de ligandos de α4β1 con FN-III7-10, inhibía las fibras de estrés e inducía protrusiones citoplasmáticas y migración celular. La ruta de señalización de a4b1 incluía la fosforilación de p190rhogap y la inactivación de RhoA. Por otra parte, la co-inmovilización de FN-III7-10 con fragmentos o péptidos de Fn que interaccionan con proteoglicanos tipo chondroitin-sulfato, produce el efecto contrario, es decir aumenta las fibras de estrés y adhesiones focales, y produce activación de RhoA. Estos resultados indican que la reorganización del citoesqueleto posterior a la adhesión celular, está finamente regulada por señales intracelulares que pueden ser antagonistas (dos integrinas) o cooperadoras (integrina y proteoglicano). Papel de la integrina α4β1 en la migración e invasión de órganos en la leucemia linfocítica crónica B (LLC-B) La LLC-B es la leucemia de mayor incidencia en los países occidentales y se caracteriza por la acumulación de linfocitos B CD5+ en sangre periférica y la progresiva infiltración de órganos linfoides. Para entender los mecanismos que conllevan a la Induction of polarization, but not spreading, requires inactivation of RhoA and Rac1 GTPases. Moreover, signals leading to polarization, but not those leading to spreading, induce high levels of Pyk2 kinase and Vav factor phosphorylation. Our results indicate that α4β1 mediated T cell responses may be distinctly modulated in vivo by specific physiological stimuli. Role of α4β1 integrin in stress fiber and focal contact formation Cell attachment to Fn generally results in formation of stress fibers and focal adhesions and this requires α5β1 integrin interaction with the RGD sequence and syndecan-4 binding to the Hep II domain. We have studied the role of α4β1 in these processes. Because lymphocytes do not form stress fibers, we have used SKMEL-178 melanoma cells for these assays. SKMEL-178 cells formed stress fibers and focal adhesions upon adhesion to the FNIII7-10 Fn fragment (RGD sequence) via α5β1. Co-immobilisation of α4β1 ligands with FNIII7-10, inhibited stress fibers and induced cytoplasmic protrusions and cell migration. The signaling pathway induced by α4β1 included phosphorylation of p190rhogap and downregulation of RhoA. Furthermore, co-immobilization of FNIII7-10 with Fn fragments or peptides that bind chondroitin-sulfate proteoglycans, results in the opposite effect, thus is stress fiber and focal adhesion enhancement and activation of RhoA. These results indicate that the cytoskeleton reorganization that follows cell adhesion, is finely regulated by intracellular signals which may be antagonistic (two integrins) or cooperative (integrin and proteoglycan). Role of α4β1 integrin in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) migration and organ infiltration B-CLL is the most common leukemia in the Western world, and consists in the accumulation of CD5+ B cells in the peripheral blood and the progressive infiltration of lymphoid organs. To understand the mechanisms that govern migration of B-CLL cells to these organs, we are studying the regulation of molecules possibly involved in this process, particularly metalloproteinases (MMPs), integrins and chemokine receptors. We have found that MMP-9 is constitutively present in samples from the 12 patients studied, with higher levels of expression than normal 161

171 Adhesión Celular en el Sistema Inmune / Cell Adhesion in the Immune System migración e invasión de células LLC-B, nuestro grupo está estudiando las posibles moléculas implicadas en estos procesos, fundamentalmente metaloproteinasas (MMPs), integrinas y receptores de quimioquinas. Hemos encontrado que la MMP-9 está presente en células LLC-B de los 12 pacientes estudiados, que su expresión es mayor que en linfocitos B normales, y que sus niveles y función aumentan después de la adhesión de células LLC-B a H89 o VCAM-1,y/o del tratamiento con las quimioquinas CXCL12 y CCL19. La adhesión a H89 o VCAM-1 también induce la formación de podosomas (estructuras invasivas) en células LLC-B, pero no en linfocitos normales. Actualmente estamos estudiando en detalle la composición y regulación de estos podosomas. Estudios sobre la apoptosis en la LLC-B Nuestro grupo ha demostrado previamente que la adhesión de células LLC-B a H89 o VCAM a través de α4β1, retrasa tanto la apoptosis espontánea como la inducida por el fármaco fludarabina in vitro. En trabajos recientes hemos demostrado que una de las señales de supervivencia inducida por α4β1 es la reducción de la expresión de p53 inducida por fludarabina. Actualmente estamos estudiando otros mediadores de esta ruta de señalización como las proteín-quinasas FAK, Pyk2, PI3-K y Akt y sus inhibidores fisiológicos. También hemos demostrado recientemente que existe una regulación a nivel de mrna de proteínas de la familia Bcl-2, durante la apoptosis espontánea de células LLC-B in vitro. Por otra parte, hemos encontrado recientemente un depsipéptido que induce apoptosis in vitro de células LLC-B, inhibiendo la ruta de supervivencia inducida por PI3K/Akt. En trabajos en marcha estamos caracterizando más detalladamente el mecanismo de acción de este compuesto, por si pudiera tener aplicación clínica en el futuro. B cells. MMP-9 expression and function is enhanced upon adhesion of B-CLL cells to H89 or VCAM-1, and/or upon incubation with CXCL12 or CCL19 chemokines. Adhesion to H89 or VCAM-1 also induced formation of podosomes (invadopodia) in B-CLL but not normal B cells. We are currently studying the composition and regulation of these podosomes. Studies on B-CLL apoptosis We have previously shown that B-CLL adhesion to H89 or VCAM-1 via α4β1, delays spontaneous and fludarabineinduced apoptosis in vitro. Recently, we have shown that α4β1 survival signaling reduces the expression of p53 induced by fludarabine. We are currently studying other possible mediators of this signaling pathway, such as FAK, Pyk2, PI3-K and Akt, and their physiological inhibitors. We have also recently demonstrated that the mrna levels for Bcl-2 familiy members are regulated during spontaneous apoptosis of B-CLL cells. On the other hand, we have found a depsipeptide that induces in vitro apoptosis of B-CLL cells, by directly inhibiting the PI3K/Akt survival pathway. Work in progress in the laboratory is aimed to further characterize the mode of action of this compound, which could have possible clinical applications in the future. 162

172 Adhesión Celular en el Sistema Inmune / Cell Adhesion in the Immune System Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, SAF ( ) FIS, 01/1183 ( ) CICYT, SAF ( ) CAM, 08.3/0030.1/2003 Fundación MMA Investigación Médica, ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles De la Fuente, M.T., Casanova, B., Cantero, E., Hernández del Cerro, M., García-Marco, J.A., Silva, A., and García-Pardo, A. (2003). Involvement of p53 in α4β1 integrin-mediated resistance of chronic lymphocytic leukemia B cells to fludarabine. Biochem. Biophys. Res. Comm. 311, Moyano, J.V., Maqueda, A., Albar, J.P., and García-Pardo, A. (2003). A synthetic peptide from the heparin-binding domain III (repeats III4-5) of fibronectin promotes stress fiber and focal adhesion formation in melanoma cells. Biochem. J. 371, Moyano, J.V., Maqueda, A., Casanova, B., and García-Pardo, A. (2003). α4β1 integrin/ligand interaction inhibits α5β1- induced stress fibers and focal adhesions via downregulation of RhoA and induces melanoma cell migration. Mol. Biol. Cell. 14, Sanz, L, García-Marco, J.A., Casanova, B., de la Fuente, M.T., García-Gila, M., García-Pardo, A., and Silva, A. (2004). Bcl-2 family gene modulation during spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 315, Próximos artículos/forthcoming Articles Escobar-Díaz, E., López-Martín, E.M., Hernández del Cerro, M., Puig-Kröger, A., Soto-Cerrato, V., Montaner, B., Giralt, E., García-Marco, J.A., Pérez-Tomás, R., and García-Pardo, A. (2005). AT514, a cyclic depsipeptide from Serratia marcescens, induces apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells. Interference with the Akt/NF-κB survival pathway. Leukemia 19, Peterson, J.A., Sheibani, N., David, G., García-Pardo, A., and Peters, D.M. (2005). Heparin II domain of fibronectin uses α4β1 integrin to control focal adhesion and stress fiber formation, independent of syndecan-4. J. Biol. Chem. 280,

173 Quimioquinas y Migración Celular Chemokines and Cell Migration JOAQUÍN TEIXIDÓ CALVO Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist RUBÉN A. BARTOLOMÉ CONDE DAVID GARCÍA BERNAL MARÍA EUGENIA MIQUILENA COLINA (Desde VII-2004) ISABEL MOLINA ORTIZ (Desde III-2003) MARÍA LUISA PARMO CABAÑAS ELENA SOTILLO MALLO (Desde VIII-2004) NATALIA WRIGHT (Hasta X-2003) B. Predoctorales / Graduate Students Palabras clave: Adhesión celular, Integrinas, Quimioquinas, Melanoma, Mieloma Las investigaciones actuales en nuestro laboratorio se centran en estudiar cómo las quimioquinas transmiten señales migratorias e invasivas a las células normales o tumorales. Tras la unión a sus receptores de membrana, las quimioquinas activan diversas vías de transducción de señales que finalmente contactan con la maquinaria celular responsable de promover motilidad celular. Para que las células puedan migrar deben regular dinámicamente la actividad de receptores de adhesión. Las integrinas α4 (α4β1 y α4β7) son receptores de adhesión expresados en linfocitos T que actúan conjuntamente con las quimioquinas en la inducción de la extravasación linfocitaria hacia tejidos, tanto en condiciones fisiológicas como inflamatorias. En uno de nuestros Proyectos estamos caracterizando los eventos de señalización requeridos en la inducción de la adhesión de linfocitos T dependiente de integrinas α4 en respuesta a quimioquinas, utilizando como modelos CXCL12 (SDF-1)/CXCR4 y CCL25 (TECK)/CCR9. Actualmente estudiamos el papel de GTPasas y guanine-nucleotide exchange factors en este proceso. Los resultados de estos estudios proporcionarán información valiosa para Keywords: Cell Adhesion, Integrins, Chemokines, Melanoma, Myeloma Current research in our laboratory focuses on how chemokines convey migratory and invasive properties on normal and tumor cells. Upon binding to their membrane receptors, chemokines activate several transduction pathways that finally impinge on cellular machinery promoting cell movement. In order for cells to migrate they must dynamically regulate the activity of adhesion receptors. The α4 integrins (α4β1 and α4β7) are adhesion receptors expressed on T lymphocytes that work together with chemokines to promote lymphocyte extravasation into tissues, both in physiological as well as during inflammatory conditions. One of our projects concern studies on the characterization of signaling events required for promoting T lymphocyte adhesion dependent on α4 integrins in response to chemokines, using as models CXCL12 (SDF-1)/CXCR4 and CCL25 (TECK)/CCR9. Present investigations address the role of GTPases and guanine-nucleotide exchange factors in this process. The results from these studies should provide useful information for the identification of molecular pathways activated by chemokines leading to T lymphocyte migration dependent on α4 integrins during physiological and pathological conditions. 164

174 Quimioquinas y Migración Celular / Chemokines and Cell Migration la identificación de las vías moleculares activadas por las quimioquinas y dirigidas a la migración de linfocitos T dependiente de integrinas α4 durante condiciones fisiológicas e inflamatorias. Las células tumorales tienen la capacidad de invadir tejidos alrededor del foco tumoral primario, y pueden desplazarse hacia órganos distantes para colonizar tejidos adicionales. De este modo, las células tumorales deben activar mecanismos migratorios que les permita atravesar membranas basales y tejidos intersticiales. Estudios recientes han evidenciado que las células tumorales expresan receptores de quimioquinas en sus membranas, y que ligandos para estos receptores son capaces de promover invasión y activación celular. Hemos demostrado que las células de melanoma expresan el receptor de quimioquinas CXCR4, y que su ligando CXCL12 confiere propiedades migratorias e invasivas a estas células. Los principales protagonistas durante la invasión de células de melanoma hacia CXCL12 son las GTPasas y metaloproteinasas. Específicamente las Rho GTPasas y MT1-MMP juegan un importante papel durante la invasión. La investigación actual está enfocada hacia el estudio de las relaciones existentes entre estos dos tipos de proteínas. Durante el mieloma múltiple, las células plasmáticas malignas se alojan en la médula ósea, acumulándose en íntimo contacto con el microambiente de la médula. Esta neoplasia se caracteriza por las lesiones óseas, fallo renal e infiltración extramedular en las últimas etapas de la enfermedad. El mieloma múltiple sigue siendo incurable por lo que se deben dedicar grandes esfuerzos para identificar los mecanismos responsables de su génesis, así como para identificar terapias dirigidas a la mejora de la calidad de vida de los pacientes. Una quimioquina abundante en la médula ósea es CXCL12, la cual contribuye probablemente al alojamiento y tráfico de las células de mieloma en la médula ósea ya que estas células expresan CXCR4. Actualmente estamos caracterizando la maquinaria celular implicada en el tráfico de las células de mieloma en la médula ósea. Tumor cells invade surrounding tissues at primary foci, and can travel to distant organs during the metastasis process to colonize further organs. Therefore, tumor cells must activate migratory mechanisms that allow them to traverse basement membranes and interstitial tissues. Recent studies have evidenced that tumor cells express chemokine receptors on their cell membranes, and that ligands for these receptors can promote cell invasion and activation. We have demonstrated that melanoma cells express the chemokine receptor CXCR4 and that its ligand CXCL12 conveys migratory and invasive properties to these cells. Main actors during melanoma cell invasion in response to CXCL12 are GTPases and metalloproteinases. Specifically, Rho GTPases and MT1-MMP do play an important role during invasion. Current research is devoted to study the functional relationships between these two families of proteins. During multiple myeloma, malignant plasma cells lodge in the bone marrow and accumulate in close contact with the marrow environment. Progression of the disease is characterized by bone osteolysis, renal failure and extramedullary infiltration at late stages. Multiple myeloma remains an uncurable neoplasia and therefore large efforts are invested to identify mechanisms responsible for its genesis and to find therapies addressed to improve the patients life quality. An abundant chemokine in the bone marrow is CXCL12, which likely contributes to myeloma cell homing and trafficking as these cells express CXCR4. At present we are characterizing the cellular machinery implicated in myeloma cell trafficking in the bone marrow. 165

175 Quimioquinas y Migración Celular / Chemokines and Cell Migration Organismos Financiadores/Funding Agencies FIS-MSC, 01/1168 ( ) CM, 08.3/0039/ ( ) CICYT, SAF ( ) MSC, Redes Temáticas de Investigación Cooperativa. G03/136 Fund. Mutua Madrileña Automovilística. ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Bartolomé, R.A., Sanz-Rodríguez, F., Robledo, M.M., Hidalgo, A., and Teixidó, J. (2003). Rapid upregulation of α4 integrinmediated cell adhesion by transforming growth factor-ß1. Mol. Biol. Cell 14, Wright, N., Laín de Lera, T., García-Moruja, C., Lillo, R., García-Sánchez, F., Caruz, A., and Teixidó, J. (2003). Transforming growth factor-ß1 downregulates expression of chemokine stromal cell-derived factor-1. Functional consequences in cell migration and adhesion. Blood. 102, Bartolomé, R.A., Gálvez, B.G., Longo, N, Baleux, F., van Muijen, G.N.P., Sánchez-Mateos, P., Arroyo, A.G., and Teixidó, J. (2004). SDF-1 promotes melanoma cell invasion across basement membranes involving stimulation of MT1-MMP and Rho GTP-ase activities. Cancer Res. 64, Parmo-Cabañas, M., Bartolomé, R.A., Wright, N., Hidalgo, A., Drager, A.M. and Teixidó, J. (2004). Integrin α4β1 involvement in stromal cell-derived factor-1α promoted myeloma cell transendothelial migration and adhesion: role of camp and the actin cytoskeleton in adhesion. Exp. Cell Res. 294, Tesis Doctorales/Doctoral Thesis Natalia Wright. La quimioquina SDF-1: Regulación de su expresión y papel en la modulación de la adhesión celular dependiente de integrinas α4. Universidad Autónoma de Madrid, Director: J. Teixidó. 166

176 Metaloproteinasas de Matriz en Inflamación Matrix Metalloproteinases in Inflammation ALICIA GARCÍA ARROYO (Hasta XII-2003) Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist LAURA GENÍS MARTÍN (II a XII, 2003) BEATRIZ GONZÁLEZ GÁLVEZ SALOMÓN MATÍAS ROMÁN B. Predoctorales / Graduate Students Palabras clave: Metaloproteinasas de matriz, Endotelio, Leucocito, Migración celular, Angiogénesis, Inflamación Regulación de la metaloproteinasa de matriz MT1-MMP en células endoteliales humanas La angiogénesis es el proceso biológico que lleva a la formación de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes y se desarrolla en diversos estadios que incluyen la degradación local de la membrana basal subendotelial, la migración local y dirigida de las células endoteliales, la proliferación de dichas células, la canalización, ramificación y formación de nuevas estructuras vasculares así como la deposición de una nueva membrana basal. La angiogénesis es importante en procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario y patológicos como la tumorigénesis o las enfermedades inflamatorias crónicas. Para el inicio de la angiogénesis se debe producir la transición de una célula endotelial quiescente y sin movimiento a una célula con fenotipo migratorio así como la degradación de la membrana basal subyacente. El endotelio emplea enzimas proteolíticas denominadas metaloproteinasas de matriz extracelular (MMP) para degradar los distintos componentes de la matriz extracelular. MT1-MMP es una MMP anclada a la membrana que desempeña un papel importante en proteolisis pericelular y también en angiogénesis. En nuestro grupo nos interesa estudiar los mecanismos moleculares que regulan la actividad de MT1-MMP en células endoteliales durante la respuesta angiogénica. Para ello se han generado anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio catalítico de MT1-MMP que han resultado ser inhibi- Keywords: Matrix metalloproteinasas, Endothelium, Leukocyte, Cell migration, Angiogenesis, Inflammation Regulation of the matrix metalloproteinase MT1-MMP in human endothelial cells Angiogenesis is the biological process that leads to the formation of new vessels from prexisting ones and it is developed in different steps that include local degradation of the subendothelial basement membrane, local and directed migration of endothelial cells, proliferation of such cells, canalization, branching, and formation of new vascular structures as well as deposition of a new basement membrane. Angiogenesis is important for physiologic processes such as embryonic development as well as in pathology such as in tumorigenesis or chronic inflammatory disease. For the initiation of angiogenesis, it is required the transition from a quiescent and resting endothelial cell to a cell with a migratory phenotype and the degradation of the basement membrane underneath. The endothelium uses proteolytic enzymes called matrix metalloproteinases (MMP) to degrade the variety of extracellular matrix components. MT1- MMP is a membrane-anchored MMP that plays a key role in pericellular proteolysis and also in angiogenesis. Our group is interested on studying the molecular mechanisms that regulate MT1-MMP activity in human endothelial cells during the angiogenic response. To that purpose, we have generated monoclonal antibodies directed against the catalytic domain of MT1- MMP that have resulted inhibitory of its proteolytic activity. By using these tools, we have investigated MT1-MMP regulation by 167

177 Metaloproteinasas de Matriz en Inflamación / Matrix Metalloproteinases in Inflammation dores de su actividad proteolítica. Con estas herramientas hemos investigado la regulación de MT1-MMP por el estado migratorio y por los distintos componentes de matriz extracelular que las células endoteliales pueden encontrarse durante la respuesta angiogénica. Así, hemos demostrado cómo la migración induce un aumento de la expresión y actividad de MT1-MM así como su relocalización a estructuras mótiles en las células endoteliales. Además, hemos observado cómo la interacción mediada por diferentes integrinas del endotelio con distintos componentes de la matriz extracelular como gelatina y colágeno tipo I regulan de forma diferencial la localización subcelular, la internalización, la expresión y la actividad de MT1-MMP. También hemos caracterizado una nueva ruta para la internalización de MT1- MMP en células endoteliales humanas dependiente de caveolae y hemos determinado cómo la internalización mediada por estos microdominios es crítica para una función adecuada de MT1- MMP en angiogénesis utilizando la tecnología de RNA de interferencia para caveolina-1. Regulación de la metaloproteinasa de matriz MT1-MMP en leucocitos humanos En la respuesta inflamatoria los leucocitos necesitan atravesar el endotelio, la membrana basal y la matriz intersticial para alcanzar los focos inflamatorios tisulares. Durante este proceso, el leucocito se encuentra con varias barreras que incluyen las fuertes uniones entre las células endoteliales así como la matriz extracelular subyacente. Se sabe que las MMPs desempeñan una función importante en la migración e invasión de células tumorales en los tejidos. Por homología, se ha especulado que los leucocitos podrían utilizar mecanismos proteolíticos similares para invadir los tejidos inflamatorios. Sin embargo, el posible papel funcional de las MMPs en el proceso de transmigración leucocitaria no se ha investigado en detalle. Nuestro grupo pretende caracterizar la expresión de MT1-MMP en los distintos tipos de leucocitos así como estudiar sus posibles mecanismos de regulación y sobre todo su posible función durante la transmigración leucocitaria. Hasta el momento, hemos observado cómo la expresión de MT1-MMP puede inducirse en líneas celulares mieloides como U937 y THP-1 por ésteres de forbol y/o lipopolisacárido. Además, hemos demostrado cómo la adhesión a la proteína de matriz extracelular fibronectina o a una monocapa de células endoteliales induce/aumenta la expresión the migratory state and the diverse components of the extracellular matrix that endothelial cells can find during the angiogenic response. Thus, we have demonstrated that migration induces an increase in MT1-MMP expression and activity as well as its relocalization to motile structures in human endothelial cells. Moreover, we have observed that the integrin-mediated interaction of endothelial cells with different extracellular matrix components such as gelatin or collagen type I distinctly regulates MT1-MMP subcellular localization, internalization, expression, and activity. Recently, we have characterized a novel pathway for MT1-MMP internalization caveolae-dependent in endothelial cells and we have determined that this microdomain-mediated internalization is critical for a proper function of MT1-MMP in angiogenesis. Regulation of the matrix metalloproteinase MT1-MMP in human leukocytes In the inflammatory response, leukocytes need to go through the endothelial monolayer, the basement membrane, and the interstitial matrix to reach the tissue inflammatory foci. During this process, the leukocytes find several barriers that include the junctions between endothelial cells as well as the subendothelial extracellular matrix. It is known that MMP play an important function in tumor cell migration and invasion into tissues. Likely, it has been hypothesized that leukocytes might use similar proteolytic mechanisms to invade into inflammatory tissues. However, the putative functional role of MMPs during leukocyte transendothelial migration has not been investigated in detail. Our group aims to characterizing MT1-MMP expression in different leukocyte subsets as well as studying the possible mechanisms of regulation and most of all its putative role during leukocyte transmigration. So far, we have observed that MT1- MMP expression can be induced in myeloid cell lines such as U937 and THP-1 by phorbol esters and/or lipopolysaccharide. Moreover, we have demonstrated that the adhesion to the extracellular matrix protein fibronectin or to an endothelial monolayer induces/increases MT1-MMP expression in human monocytes from peripheral blood. We are currently analyzing the subcellular localization of the protease in migratory monocytes and in myeloid cell lines stably transfected with MT1-MMP-GFP as well as its proteolytic activity and its possible function during the migration of such cells. 168

178 Metaloproteinasas de Matriz en Inflamación / Matrix Metalloproteinases in Inflammation de MT1-MMP en monocitos humanos aislados de sangre periférica. Se está caracterizando en este momento la localización subcelular de la proteasa en monocitos migratorios y en líneas mieloides transfectadas establemente con MT1-MMP-GFP así como su actividad proteolítica y su posible función durante la migración de dichas células. Función de MT1-MMP en angiogénesis y tráfico leucocitario durante la inflamación MT1-MMP parece desempeñar un papel importante durante la respuesta angiogénica como demuestra la disminución de la inducción de vasos en el modelo de córnea de ratón en ratones deficientes para MT1-MMP. Sin embargo, no se conocen en detalle los estadios en los que MT1-MMP podría estar participando. Con los anticuerpos monoclonales inhibidores obtenidos en el laboratorio hemos demostrado cómo la actividad de MT1- MMP es importante en la migración de células endoteliales sobre distintos sustratos de matriz extracelular cooperando con los receptores de adhesión integrinas; en la invasión de células endoteliales a través de geles de colágeno tipo I y de fibrina; y además en la formación de tubos capilares en el sistema de Matrigel in vitro. Ahora estamos explorando la posible función de MT1-MMP en un modelo de angiogénesis in vivo en ratón mediante la inyección subcutánea de Matrigel. Se estudiará también si MT1-MMP puede participar de forma diferencial en la angiogénesis inducida por factores de crecimiento como VEGF en comparación con quimiocinas angiomoduladoras que pueden ser importantes en inflamación como SDF-1, IL-8, o MCP-1. Por otra parte, como hemos comentado anteriormente se desconoce si MT1-MMP puede participar en la migración transendotelial de leucocitos durante la inflamación. Por ello, se testará el efecto de los anticuerpos anti-mt1-mmp bloqueantes en la migración de monocitos humanos sobre matriz extracelular, en la invasión de monocitos a través de matrices como Matrigel y colágeno tipo I así como en la transmigración de monocitos a través de endotelio. La posible participación de MT1-MMP en estas funciones in vitro se corrobará mediante ensayos in vivo de reclutamiento leucocitario inducido por quimiocinas inflamatorias en ratón (modelos de air pouch y/o inyección intraperitoneal de quimiocinas). Con estos estudios conseguiremos desvelar nuevos mecanismos moleculares implicados tanto en el reclutamiento leucocitario como en la angiogénesis inducida MT1-MMP function in angiogenesis and leukocyte traffic during inflammation MT1-MMP seems to play an important role during the angiogenic response as shown by the decrease in the induction of vessels in the mouse cornea model in mice deficient for MT1- MMP. However, it is not known yet the steps in which MT1- MMP might be participating. By using the inhibitory monoclonal antibodies obtained in the lab, we have shown that MT1- MMP activity is important in endothelial cell migration on different extracellular matrix substrates cooperating with the adhesion receptors integrins; in endothelial cell invasion through collagen type I and fibrin gels; and moreover, in the formation of capillary tubes in Matrigel in vitro. We are currently exploring the putative MT1-MMP function in an in vivo model of angiogenesis by injecting Matrigel subcutaneously in mice. The differential participation of MT1-MMP in the angiogenesis induced by growth factors such as VEGF in comparison with angiomodulating chemokines likely important in inflammation such as SDF-1, IL-8, or MCP-1 will also be analyzed. On the other hand, as aforementioned it is unknown yet whether MT1- MMP can participate in leukocyte transendothelial migration during inflammation. For this, the effect of blocking anti-mt1- MMP antibodies in human monocyte migration on extracellular matrix, in the invasion of monocytes through matrices such as Matrigel or collagen type I as well as in monocyte transendothelial migration will be tested. The possible participation of MT1- MMP during these functions in vitro will be confirmed by in vivo assays in mice of leukocyte recruitment induced by inflammatory chemokines ( air pouch model and/or intraperitoneal injection of chemokines). With these studies, we will try to unravel novel molecular mechanisms involved in both leukocyte recruitment and in angiogenesis induced during the inflammation and so we could provide information that might be relevant for the design of MT1-MMP blocking agents and for their possible therapeutic application in chronic inflammatory disease. 169

179 Metaloproteinasas de Matriz en Inflamación / Matrix Metalloproteinases in Inflammation durante la inflamación y con ello aportaremos información que podría ser relevante a la hora de diseñar agentes bloqueantes de MT1-MMP para su posible aplicación terapeútica en enfermedades inflamatorias crónicas. Organismos Financiadores/Funding Agencies Biogen Inc. (2002) MCYT, SAF ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Medina, J., Caveda, L., Sanz-Cameno, P., Arroyo, A.G., Martín-Vilchez, S., Majano, P.L., García-Buey, L., Sánchez-Madrid, F., and Moreno-Otero, R. (2003). Hepatocyte growth factor activates endothelial proangiogenic mechanisms relevant in chronic hepatitis C-associated neoangiogenesis. J. Hepatol. 38, Gálvez, B.G., Matías-Román, S., Yáñez-Mó, M., Vicente-Manzanares, M., Sánchez-Madrid, F., and Arroyo, A.G. (2004). Caveolae are a novel pathway for MT1-MMP traffic in human endothelial cells. Mol. Biol. Cell 15, (online 2003). 170

180 Receptores de Membrana Membrane Receptors CARMELO BERNABEU QUIRANTE Jefe de Grupo / Group Leader LUISA MARÍA BOTELLA CUBELLS Investigadores de Carrera / Staff Scientists JUAN FRANCISCO SANTIBAÑEZ DOMINGUEZ (Desde IV-2003) FRANCISCO SANZ RODRÍGUEZ (Hasta IX-2003) B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellows FRANCISCO JAVIER BLANCO LÓPEZ AFRICA FERNÁNDEZ LÓPEZ (Desde I-2003) ARTURO TRUJILLO VILLALOBOS (Desde IV-2004) B. Predoctorales / Predoctoral Fellows CARMEN LANGA POZA Personal Técnico / Technician Palabras clave: TGF-beta, Endotelio, Patología vascular, Endoglina Endoglina, un receptor auxiliar del TGF-beta implicado en el remodelado vascular y desarrollo cardiovascular Nuestro laboratorio tiene como objetivo elucidar la regulación de la expresión del gen de endoglina, así como la función y estructura de la proteína endoglina, tanto en la fisiología normal como en el contexto de la patología humana. Miembros de la superfamilia del TGF-beta ejercen sus funciones biológicas a través de receptores de membrana conocidos como serina/treonina quinasas tipo I (TbetaRI) y tipo II (TbetaRII). Después de unir ligando, el TbetaRII recluta y fosforila al TbetaRI, el cual inicia la vía de señalización mediante fosforilación de la familia de proteínas Smad. Endoglina es una glicoproteína homodimérica de membrana que tiene un tamaño de 180kDa y que funciona, en asociación con TbetaRI y TbetaRII, como un receptor auxiliar para TGF-beta1, TGFbeta3, activina, BMP-2, y BMP-7. Está altamente expresada en Keywords: TGF-beta, Endothelium, Vascular pathology, Endoglin Endoglin, an auxiliary receptor for TGF-beta involved in vascular remodeling and cardiovascular development The major goal of our laboratory is to elucidate the regulation of endoglin gene expression, as well as the function and structure of the endoglin protein in the normal physiology and in the context of human pathology. Members of the TGF-beta superfamily exert their biological functions through membrane receptors known as type I (TbetaRI) and type II (TbetaRII), serine/threonine kinases. After ligand binding, TbetaRII recruits and phosphorylates TbetaRI, which initiates the signaling pathway by phosphorylating the Smad family of proteins. Endoglin is a homodimeric membrane glycoprotein of 180kDa which functions, in association with TbetaRI and TbetaRII, as an auxiliary receptor for TGF-beta1, TGF-beta3, activin, BMP-2, and BMP-7. It is highly expressed by endothelial cells, and at lower levels by activated mono- 171

181 Receptores de Membrana / Membrane Receptors Figura.- La distribución subcelular de ZRP-1 está regulada por la presencia de endoglina: Células control y células que expresan endoglina fueron transfectadas con los vectores de expresión que codifican para la proteína fluorescente verde sola (EGFP) o fusionada con ZRP-1 (EGFP-ZRP-1), y analizadas mediante microscopia confocal. Como control, las células fueron teñidas con un anticuerpo anti-vinculina. EGFP-ZRP-1 se localizó en puntos de adhesión focal en células control (C), pero en presencia de endoglina se redistribuyó a lo largo de las fibras de estrés (D). La distribución subcelular de EGFP (A, B) o vinculina (E y F) no fue afectada por la presencia de endoglina. Figure.- The subcellular distribution of ZRP-1 is regulated by the presence of endoglin. Control cells and cells expressing endoglin were transiently transfected with the expression vectors coding for the green fluorescent protein alone (EGFP) or fused to ZRP-1 (EGFP-ZRP-1) and analyzed by confocal microscopy. As a control, untransfected cells were stained with anti-vinculin antibody. EGFP- ZRP-1 clearly targeted to focal adhesion sites in control cells (C), but in the presence of endoglin it was redistributed throughout the cell along fibers (D). The subcellular distribution of EGFP (A and B) or vinculin (E and F) was not affected by the presence of endoglin. células endoteliales, y en menores niveles en monocitos activados/macrófagos, así como en células mesenquimales, incluyendo fibroblastos, y células vasculares de músculo liso. Endoglina juega un papel importante en el remodelado vascular y en el desarrollo cardiovascular. La expresión de endoglina está regulada durante el desarrollo del corazón en humanos y en pollo; está altamente expresada en el endocardio durante la formación de la válvula y en las células mesenquimales del canal atrioventricular durante la formación del septo del corazón. Su papel en la morfogénesis se ha visto confirmado por el hallazgo de que embriones de ratones homocigotos para un mutante de endoglina mueren a los días postcoitum debido a anomalías vasculares y cardíacas. Además, endoglina juega un papel en la homeostasis vascular regulando la vasodilatación dependiente de oxido nítrico, y modula la organización del citoesqueleto de actina mediante su interacción con la familia de proteínas zyxin. cytes/macrophages, as well as by mesenchymal cells, including fibroblasts, and vascular smooth muscle cells. Endoglin plays an important role in vascular remodeling and cardiovascular development. Endoglin expression is regulated during heart development in humans and chicken; it is highly expressed at the level of endocardial cushion during valve formation and by the mesenchymal cells of the atrioventricular canal during heart septation. Its role in morphogenesis is further underscored by the finding that mice embryos homozygous for a mutant endoglin die at days postcoitum due to vascular and cardiac anomalies. In addition, endoglin plays a role in vascular homeostasis regulating the nitric-oxide-dependent vasodilatation, and modulates the organization of the actin cytoskeleton via its interaction with the zyxin family of proteins. 172

182 Receptores de Membrana / Membrane Receptors Endoglina y ALK-1 (miembro de la familia TbetaRI) son receptores de TGF-beta, expresados en el endotelio. Mutaciones en los genes de Endoglina y ALK-1 son responsables de la Telangiectasia Hemorrágica Hereditaria (HHT1 y HHT2, respectivamente). HHT es una displasia vascular autosómica dominante asociada con telangiectasias vasculares en la piel y la mucosa nasal, epistaxis, hemorragias gastrointestinales, y malformaciones arteriovenosas en pulmón, hígado y cerebro. Los niveles reducidos de endoglina funcional (haploinsuficiencia) están ampliamente aceptados como el mecanismo patogénico de HHT1. Recientemente, hemos iniciado un estudio pionero de análisis mutacional de los pacientes HHT en España. Se han diagnosticado un total de 41 pacientes procedentes de 24 familias, de las cuales se ha identificado la mutación en 15 familias (5 mutaciones en el gen de endoglina y 10 en el gen de ALK-1). Además, se han iniciado estudios funcionales sobre monocitos activados y células endoteliales procedentes de estos pacientes. Se ha encontrado que endoglina se expresa en epidermis humana y de ratón y en los apéndices de la piel, como folículos pilosos y glándulas sudoríparas. Para estudiar el papel de endoglina en la carcinogénesis de piel in vivo, ratones heterocigotos para endoglin se sometieron a carcinogénesis química. La reducción de endoglina tuvo un doble efecto en la carcinogénesis. Por una parte, inhibió la aparición temprana de papilomas benignos, pero incrementó la progresión maligna hacia carcinomas altamente indiferenciados. Estos resultados sugieren la implicación de endoglina en la transformación maligna. Endoglin and ALK-1 (member of the TβRI family) are TGFbeta receptors expressed in the endothelium. Mutations in Endoglin and ALK-1 genes are responsible for the Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT1 and HHT2, respectively). HHT is an autosomic dominant vascular dysplasia associated with vascular telangiectases in skin and nasal mucosa, epistaxis, gastrointestinal hemorrhages and arteriovenous malformations in lung, liver and brain. Reduced levels of functional endoglin (haploinsufficiency), are widely accepted as the pathogenic mechanism of HHT1. Recently, we have initiated a pioneer study on the mutational analysis of HHT patients in Spain. A total 41 patients from 24 different families were diagnosed and the mutation was identified in 15 families (5 mutations in endoglin gene and 10 in ALK-1 gene). In addition, functional studies on activated monocytes and endothelial cells derived from these patients are in progress. Endoglin is expressed in human and mouse epidermis and in the skin appendages such as hair follicles and sweat glands. To address the role of endoglin in skin carcinogenesis, endoglin heterozygous mice were subjected to chemical carcinogenesis. Reduction in endoglin had a dual effect during multistage carcinogenesis, by inhibiting the early appearance of benign papillomas, but increasing malignant progression to highly undifferentiated carcinomas. These results suggest the involvement of endoglin in the malignant transformation. Organismos financiadores/ Funding Agencies MCYT, SAF ( ) MEC, SAF ( ) CAM, 08.4/0026.1/2003 ( ) FIS, PI ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Cowan, P.J., Shinkel, T.A., Fisicaro, N., Godwin, J.W., Bernabeu, C., Almendro, N., Rius, C., Lonie, A.J., Nottle, M.B., Wigley, P.L., Paizis, K., Pearse, M.J., and d Apice, A.J. (2003). Targeting gene expression to endothelium in transgenic animals: a comparison of the human ICAM-2, PECAM-1 and endoglin promoters. Xenotransplantation 10,

183 Receptores de Membrana / Membrane Receptors García-Martínez, J.M., Fresno Vara, J.A., Lastres, P., Bernabeu, C., Ortiz Betes, P., and Martín-Pérez, J. (2003). Effect of metamizol on promyelocytic and terminally differentiated granulocytic cells. Comparative analysis with acetylsalicylic acid and diclofenac. Biochem. Pharmacol. 65, Li, C., Guo, B., Ding, S., Rius, C., Langa, C., Kumar, P., Bernabeu, C., and Kumar, S. (2003). TNF alpha down-regulates CD105 expression in vascular endothelial cells: a comparative study with TGF beta 1. Anticancer Res. 23, Li, C., Issa, R., Kumar, P., Hampson, I.N., López-Novoa, J.M., Bernabeu, C., and Kumar, S. (2003). CD105 prevents apoptosis in hypoxic endothelial cells. J. Cell. Sci. 116, Quintanilla, M., Ramírez, J.R., Pérez-Gómez, E., Romero, D., Velasco, B., Letarte, M., López-Novoa, J.M., and Bernabeu C. (2003). Expression of the TGF-β coreceptor endoglin in epidermal keratinocytes and its dual role in multistage mouse skin carcinogenesis. Oncogene 22, Botella, L.M., Sanz-Rodríguez, F., Sanchez-Elsner, T., Langa, C., Ramirez, J.R., Vary, C., Roughley, P., and Bernabeu C. (2004). Lumican is down-regulated in cells expressing endoglin. Evidence for an inverse correlationship between endoglin and lumican expression. Matrix Biol. 22, Conley, B.A., Koleva, R., Smith, J.D., Kacer, D., Zhang, D., Bernabeu, C., and Vary, C.P. (2004). Endoglin controls cell migration and composition o focal adhesions: Function of the cytosolic domain. J. Biol. Chem. 279, Guo, B., Rooney, P., Slevin, M., Li, C., Parameshwar, S., Liu, D., Kumar, P., Bernabeu, C., and Kumar, S. (2004). Overexpression of CD105 in rat myoblasts: role of CD105 in cell attachment, spreading and survival. Int. J. Oncol. 25, Guo, B., Slevin, M., Li, C., Parameshwar, S., Liu, D., Kumar, P., Bernabeu, C., and Kumar, S. (2004). CD105 inhibits transforming growth factor-beta-smad3 signalling. Anticancer Res. 24, Jerkic, M., Rivas-Elena, J.V., Prieto, M., Carron, R., Sanz-Rodríguez, F., Pérez-Barriocanal, F., Rodríguez-Barbero, A., Bernabeu, C., and López-Novoa, J.M. (2004). Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. FASEB J. 18, Epub 2004 Jan 20. Obreo, J., Díez-Marques, L., Lamas, S., Düwell, A., Eleno, N., Bernabeu, C., Pandiella, A., López-Novoa, J.M., and Rodríguez- Barbero, A. (2004). Endoglin expression regulates basal and TGF-β1-induced extracellular matrix synthesis in cultured L6E9 myoblasts. Cell. Physiol. Biochem. 14, Sánchez-Elsner, T., Ramírez, J.R., Rodríguez-Sanz, F., Varela, E., Bernabeu, C., and Botella, L.M. (2004). A cross-talk between hypoxia and TGF-beta orchestrates erythropoietin gene regulation through SP1 and Smads. J. Mol. Biol. 336, Sanz-Rodríguez, F., Fernández-L, A., Zarrabeitia, R., Pérez-Molino, A., Ramírez, J.R., Coto, E., Bernabeu, C., and Botella, L.M. (2004). Mutation Analysis in Spanish Patients with Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia: Deficient Endoglin Up-regulation in Activated Monocytes. Clin. Chem. 50, Sanz-Rodríguez, F., Guerrero-Esteo, M., Botella, L.M., Banville, D., Vary, C.P., and Bernabeu, C. (2004). Endoglin regulates cytoskeletal organization through binding to ZRP-1, a member of the LIM family of proteins. J. Biol. Chem. 279,

184 Genomica Funcional y Computacional de la Respuesta Inmune Mediada por Célular Dendríticas Functional and Computational Genomics of the Immune Response Mediated by Dendritic Cells MIGUEL ANGEL VEGA PALACIOS Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist Palabras clave: Células dendríticas, Respuesta inmune, Genómica funcional y computacional El proceso de reprogramación genética que tiene lugar durante la maduración de células dendríticas (DC) en respuesta a las invasiones microbianas, tumores, alergenos y tejidos transplantados orquesta la respuesta inmune adaptativa, confiriendo a las DC la capacidad de migrar a órganos linfoides secundarios donde presentan los antígenos captados a linfocitos T vírgenes. Además, la presentación a través de DC de moléculas propias e inocuas a linfocitos T autorreactivos y reguladores media la inducción de tolerancia. Así pues, la maduración de las DC constituye un punto de control crítico para la regulación de la respuesta inmunológica y la inducción de tolerancia, por lo que un conocimiento detallado de los cambios en la expresión génica que tienen lugar durante el proceso de maduración de las DC resulta esencial para su comprensión a nivel molecular, así como para el diseño racional de estrategias terapéuticas dirigidas a controlar la respuesta inmunológica. Regulación de la expresión del receptor CD36 en células dendríticas y macrófagos activados alternativamente por el factor de transcripción RUNX3 La captación por DC de células apoptóticas a través del receptor CD36 contribuye a la inducción de tolerancia a través de su efecto inhibidor en la maduración de las DC. La expresión del factor de transcripción RUNX3 se incrementa durante la maduración de las DC, y su ausencia conduce a una maduración Keywords: Dendritic cells, Immune response, Functional and computational genomics The process of genetic reprogramming that takes place during dendritic cell (DC) maturation in response to microbial invasion, tumors, alergens and transplantated tissues orquestrates the adaptive immune response by conferring DC the capacity to migrate towards secondary lymphoid organs where uptaken antigens are presented to naive T lymphocytes. Besides, DC presentation of self and innocuous molecules to autoreactive and regulatory T cells leads to tolerance induction. Thus, DC maturation constitutes a critical control point for the regulation of immune responses and tolerance. In this respect, a detailed knowledge of the changes in gene expression that occur during DC maturation is essential for its understanding at a molecular level, and for the rational design of therapeutic strategies directed to control the immune response. Regulation of CD36 expression in dendritic cells and alternatively activated macrophages by the transcription factor RUNX3 The uptake of apoptotic cells by DC through the CD36 receptor contributes to tolerance induction by impairing DC maturation. The expression of the transcription factor RUNX3 is increased during DC maturation, and its deficiency leads to accelerated DC maturation. Our studies demonstrate that CD36 is negatively regulated by RUNX3, both in matured DC and in alternatively activated macrophages. Given the influence of 175

185 Genomica Funcional y Computacional de la Respuesta Inmune Mediada por Célular Dendríticas / Functional and Computational Genomics of the Immune Response Mediated by Dendritic Cells acelerada de éstas. Nuestros estudios demuestran que la expresión de CD36 se regula negativamente por RUNX3, tanto en DC maduras como en macrófagos activados por la vía alternativa. Dada la influencia de RUNX3 y CD36 en la maduración de las DC, estos resultados sugieren que la modulación de la expresión de CD36 podría contribuir a los efectos reguladores sobre la maduración de las DC mediados por RUNX3. Caracterización de las redes genéticas que dictan la maduración de las células dendríticas Las alteraciones observadas en los perfiles de expresión génica de las DC en respuesta a su interacción con patógenos ha puesto de manifiesto que los procesos que tiene lugar durante la misma (respuesta pro-inflamatoria, migración, procesamiento de antígeno, estimulación de linfocitos T) son consecuencia de la activación de un programa genético predefinido que opera a través de redes reguladoras transcripcionales. Cada uno de estos procesos se caracteriza por la inducción/represión secuencial y coordinada de la expresión de grupos de genes con funciones similares/complementarias (genes corregulados). La corregulación de genes garantiza el desarrollo eficiente de aquellos procesos moleculares que requieren la cooperación de varios componentes y releva la existencia de secuencias reguladoras comunes entre los genes coregulados que dictan su expresión coordinada. La integración de datos de expresión génica con herramientas de genómica comparativa computacional, junto con experimentos de inmunoprecipitación de cromatina y de genes reporteros, proporcionan un adecuado punto de partida para la identificación en el genoma de las secuencias reguladoras implicadas en el programa de maduración de las DC, que puede conducirnos a descifrar la naturaleza de las redes genéticas responsables del desarrollo programado de la respuesta inmune frente a patógenos. Expresión y función del ácido polisiálico en células dendríticas La realización de un estudio sobre la alteración en la expresión génica durante la maduración de DC de genes implicados en la modificación post-traduccional de otras proteínas, nos ha permitido observar la inducción de novo de la transcripción de RUNX3 and CD36 on DC maturation, these results suggest that modulation of CD36 expression by RUNX3 might contribute to the regulatory effects mediated by RUNX3 on DC maturation. Characterization of the genetic networks that dictate dendritic cell maturation The alterations observed in the gene expression profiles of DC in response to their interaction with pathogens has revealed that the processes that take place during it (pro-inflammatory response, migration, antigen processing, T lymphocyte stimulation) are a consequence of the activation of a predefined genetic program that operates through regulatory transcriptional networks. Each of those processes is characterized by the sequential and coordinated induction/repression of groups of genes with similar/complementary functions (co-regulated genes). Gene co-regulation guarantees the efficient development of those molecular processes that require the cooperation of several components, and reveals the existence of shared regulatory sequences for the co-regulated genes that are responsible for their coordinated expression. The integration of gene expression data with comparative genomic computational tools, in combination with chromatin immunoprecipitation and reporter gene experiments will provide a reliable starting point for the identification in the genome of the regulatory sequences involved in the DC maturation program, and could lead to elucidate the nature of the regulatory genetic networks responsible for the programmed development of the immune response against pathogens. Expression and function of polysialic acid in dendritic cells During the course of a study on gene expression changes that occur during DC maturation, of the genes involved in the post-translational modification of other proteins, we have observed de novo transcriptional induction of the genes coding for the polysialyltransferases PST and STX. Both enzymes are involved in the post-translational addition of polysialic acid (PSA) to carbohydrates present in proteins. This induction is reflected at a phenotypic level in an important increase in the PSA content in the surface of matured DC vs immatured DC, and in the addition of PSA to several proteins present in matured DC, whose nature is so far unknown. 176

186 Genomica Funcional y Computacional de la Respuesta Inmune Mediada por Célular Dendríticas / Functional and Computational Genomics of the Immune Response Mediated by Dendritic Cells los genes que codifican para las polisialiltransferasas PST y STX, implicadas en la adición post-traduccional de ácido polisiálico (PSA) a carbohidratos presentes en proteínas. Esta inducción se refleja a nivel fenotípico en un notable incremento en el contenido en PSA en la superficie de las DC maduras versus las inmaduras y en la adición del PSA a una serie de proteínas presentes en las DC maduras, aún sin identificar. La modificación post-traduccional por PSA modula interacciones celulares en el sistema nervioso a través de la molécula aceptora de PSA, NCAM, que afectan a diversos procesos de adhesión y migración mediados por las neuronas y sus precursores (formación de neuritas, direccionalidad y ramificación de axones, migración a determinados compartimentos cerebrales y sinaptogénesis). La relación de estos procesos con funciones de remodelación y plasticidad estructural sugiere que la modificación post-traduccional por PSA podría severamente afectar a algunas de las funciones efectoras adquiridas por las DC tras su maduración, tales como su migración a órganos linfoides secundarios y la formación de sinapsis con los linfocitos T y la activación de éstos. This type of post-translational modification regulates cellular interactions in the nervous system through the PSA acceptor molecule NCAM, and affects a diverse set of migration and adhesion processes mediated by neuron cells and their precursors (neurite formation, axon pathfinding and branching, migration to several brain compartments, and synaptogenesis). The involvement of these processes in functions related to remodelling and structural plasticity suggest that the post-translational modification by PSA could severely affect some of the functions acquired by matured DC, such as migration to lymphoid organs, formation of synapses with T lymphocytes and activation of them. Organismos financiadores/funding Agencies MEC, GEN C06-06 ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Ruiz-Velasco, N., Domínguez, A., and Vega, M.A. (2004). Statins upregulate CD36 expression in human monocytes, and effect strengthened when combined with PPAR-g ligand. Putative contribution of Rho GTPases in statin-induced CD36 expression. Biochem. Pharmacol. 67,

187 Biología de las Células Mieloides Myeloid Cell Biology ÁNGEL LUIS CORBÍ LÓPEZ Jefe de Grupo/ Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist JOSÉ LUIS RODRÍGUEZ FERNÁNDEZ (Desde IX-2003) Investigadores Contratados Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientists MARÍA COLMENARES BRUNET (Hasta X-2004) AMAYA PUIG KRÖGER Investigadora Contratada / Postdoctoral Fellows ESTHER CAPARRÓS CAYELA Investigadora visitante / Visiting scientist ÁNGELES DOMÍNGUEZ SOTO LORENA RIOL BLANCO (Desde IX-2003) DIEGO SERRANO GÓMEZ ELENA SIERRA FILARDI (Desde V-2004) B. Predoctorales / Predoctoral Fellows Palabras clave: Regulación de la expresión génica, Adhesión celular, Integrinas, Células dendríticas, Reconocimiento de patógenos, DC-SIGN Vías de señalización intracelular y factores de transcripción implicados en la diferenciación y maduración de células dendríticas humanas Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno especializadas, que actúan como centinelas del sistema inmune y son esenciales para el inicio de la respuesta inmune primaria. La singularidad de las células dendríticas radica en su capacidad de estimular linfocitos T vírgenes. Además, las células dendríticas juegan un papel esencial en la polarización de los linfocitos con los que interaccionan, controlando el tipo de respuesta inmune (celular, humoral o tolerancia). Nuestro laboratorio ha puesto de manifiesto el efecto regulador opuesto que las quinasas ERK1/2 y p38mapk ejercen sobre la maduración fun- Keywords: Regulation of gene expression, Cell adhesion, Integrins, Dendritic cells, Pathogen recognition, DC-SIGN Signaling pathways and transcription factors involved in dendritic cell differentiation and maturation Dendritic cells are specialized antigen-presenting cells which are critically implicated in the triggering and regulation of primary immune responses, and which exhibit the unique ability of stimulating naive T lymphocytes. Besides, dendritic cells play a key role in T lymphocyte polarization, thus controlling the final outcome of the immune response (cellular, humoral, tolerance). Our group has demonstrated that ERK1/2 and p38mapk kinases exert opposite effects on the phenotypic and functional maturation of monocyte-derived dendritic cells. We have identified a number of genes whose expression is regulated during dendritic cell maturation, which include the fibronectin receptor CD49d integrin and the AML-2 transcription factor. With the aim of dis- 178

188 Biología de las Células Mieloides / Myeloid Cell Biology cional y fenotípica de células dendríticas derivadas de monocitos. Asimismo hemos identificado una serie de genes regulados durante dicho proceso, entre los que destacan la integrina CD49d (receptor de fibronectina) y el factor de transcripción AML-2, implicado en un alto porcentaje de cánceres gástricos y que funciona como gen supresor de tumores en otros tipos celulares. Con objeto de diseccionar el proceso de transición monocito-célula dendrítica, hemos determinado la existencia de líneas celulares mieloides con diferenciación dendrítica inducible por interleucina-4 (IL-4). Nuestros resultados pueden contribuir al desarrollo y la optimización de las técnicas de manipulación del sistema inmune en casos en los que su actividad haya de ser inducida/potenciada (desarrollo de vacunas, inmunoterapia anti-tumoral) o reprimida (enfermedades autoinmunes, transplantes). Expresión de moléculas de adhesión: Influencia del estado de proliferación/diferenciación celular y de proto-oncogenes Las funciones leucocitarias durante las respuestas inmune e inflamatoria y la capacidad metastática de leucemias y linfomas son absolutamente dependientes de mecanismos de adhesión y migración transendotelial mediados por las integrinas leucocitarias CD11a,b,c/CD18. Nuestros estudios están centrados en la identificación de las secuencias reguladoras y los factores nucleares implicados en la transcripción leucocito-específica y desarrollo-dependiente de los genes que codifican las integrinas CD11a y CD11c. Durante los dos últimos años hemos demostrado que la expresión de la integrina CD11a en células linfoides es dependiente del factor de transcripción AML-1, mientras que su expresión en células mieloides es controlada por los factores C/EBP y AML-2, según el estado de diferenciación celular. Estos estudios nos han conducido a la identificación de una nueva isoforma del factor AML-2 que exhibe actividad represora y cuya expresión hemos detectado en numerosos tipos celulares. El establecimiento de transfectantes estables de diferentes isoformas de AML-2 en células mieloides de diferenciación inducible nos ha permitido poner de manifiesto su papel sobre la expresión de la integrina CD11a. Asimismo hemos determinado el efecto negativo que la expresión de la molécula quimérica AML1/eto, producto de la translocación t(8;21) de numerosas leucemias mieloides, sobre la transcripción del gen que codifica para la integrina CD11a. secting the monocyte-dendritic cell transition, we have also identified myeloid cell lines with IL-4-dependent dendritic cell differentiation ability. Our results will contribute to the development and improvement of techniques to manipulate the immune system in situations where its activity should be potentiated (vaccines, cancer immunotherapy) or repressed (autoimmune diseases, transplant rejection). Adhesion molecule expression: Influence of proto-oncogenes and the state of cellular proliferation/differentiation Leukocyte functions during immune and inflammatory responses are absolutely dependent on adhesion and transmigration processes which are mediated by the leukocyte integrins CD11a,b,c/CD18. Our studies are focussed on the identification of the DNA regulatory elements and transcription factors which govern the leukocyte-specific and development-regulated expression of the CD11a and CD11c integrins. In the last two years we have demonstrated that CD11a integrin expression in lymphoid cells is controlled by the AML1 transcription factor, while C/EBP and AML-2 factors direct its expression in cells of the myeloid lineage. These findings have allowed us the identification of a previously unreported isoform of AML-2 which functions as a transcriptional repressor. We have generated stable transfectants of distinct AML2 isoforms in myeloid cells in order to fully demonstrate their effects on the CD11a expression and other integrin-dependent adhesive functions. Finally, we have determined the negative regulatory effect that the AML1/eto molecule, derived from the t(8;21) translocation in acute myeloid leukemia, has on the CD11a integrin gene transcription. Expression and structure/function relationships in the DC- SIGN molecule DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-3-Grabbing Nonintegrin) is a transmembrane C-type lectin preferentially expressed on myeloid dendritic cells. DC-SIGN mediates interactions between dendritic cells and naive T lymphocytes (at the initiation of immune responses) or endothelial cells (during dendritic cell migration towards peripheral lymph nodes). DC- SIGN also functions as a pathogen-associated molecular pattern receptor, and is involved in the initial stages of HIV infec- 179

189 Biología de las Células Mieloides / Myeloid Cell Biology Regulación de la expresión y relaciones estructura/función en la molécula DC-SIGN La molécula DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-3- Grabbing Non-integrin) es una lectina de membrana de tipo C y de expresión preferencial en células dendrítica mieloides. DC- SIGN media las interacciones de células dendríticas con linfocitos T vírgenes, así como con células endoteliales durante su migración hacia los nódulos linfáticos. Además, DC-SIGN funciona como receptor de patógenos, estando implicada en las etapas iniciales de infección por HIV. Nuestro laboratorio ha generado un anticuerpo monoclonal frente a DC-SIGN que bloquea todas sus interacciones adhesivas y de reconocimiento. Mediante el empleo de este anticuerpo hemos podido determinar, en colaboración con otros grupos, que DC-SIGN funciona como receptor específico para el virus Ebola y amastigotes del parásito Leishmania. Por otra parte, el anticuerpo nos ha permitido determinar que la expresión de DC-SIGN es inducible por IL-4 en monocitos, así como las vías de señalización que median dicha inducción. En la actualidad estamos analizando las relaciones estructura/función en DC-SIGN mediante la evaluación de las actividades funcionales de transfectantes estables de diferentes isoformas de DC-SIGN que se expresan de manera normal en células dendríticas derivadas de monocitos. tion. Our group has generated a monoclonal antibody against DC-SIGN which inhibits both its adhesive and pathogen recognition functions. The use of this antibody and DC-SIGN transfectants have been instrumental in the demonstration, carried out in collaboration with other groups, that DC-SIGN is also a specific receptor for Ebola virus and for amastigotes of the Leishmania parasite. On the other hand, we have determined the inducibility of DC-SIGN expression by IL-4, as well as the intracellular signalling pathways which participate in the process. At present we are analyzing structure/function relationships in the DC-SIGN molecule through the evaluation of the functional activities displayed by cells stably transfected with naturally occurring isoforms of the molecule. Organismos financiadores / Funding Agencies FIS, 01/ ( ) Fundación Renal Iñigo Alvarez de Toledo/Baxter Healthcare ( ) MCYT, SAF C02-01 ( ) FIPSE, /03 ( ) MEC, GEN CO6-01 ( ) MEC, AGL /ALI ( ) Publicaciones / Publications Artículos en Revistas / Journal Articles De la Rosa, G., Longo N., Rodríguez-Fernández, J.L., Puig-Kroger, A., Pineda, A., Corbí, A.L., Sánchez-Mateos, P. (2003). Migration of human blood dendritic cells across endothelial cell monolayers: adhesion molecules and chemokines involved in subset-specific transmigration. J. Leukoc. Biol. 73,

190 Biología de las Células Mieloides / Myeloid Cell Biology Puig-Kroger, A., Muñiz-Pello, O., Selgas, R., Criado, G., Bajo, M.A., Sánchez-Tomero, J.A., Alvarez, V., del Peso, G., Sánchez- Mateos, P., Colmes, C., Faict, D., López-Cabrera, M., Madrenas, J., Corbí, A.L. (2003). Peritoneal dialysis solutions inhibit the differentiation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells: effect of lactate and glucose-degradation products. J. Leukoc. Biol. 73, Puig-Kroger, A., Sánchez-Elsner, T., Ruiz, N., Andréu, E.J., Prosper, F., Jensen, U.B., Gil, J., Erickson, P., Drabkin, H., Groner, Y., Corbí, A.L. (2003). RUNX/AML and C/EBP factors regulate CD11a integrin expression in myeloid cells through overlapping regulatory elements. Blood 102: Colmenares, M., Corbí, A.L., Turco, S.J., Rivas, L. (2004). The dendritic cell receptor DC-SIGN discriminates among species and life cycle forms of Leishmania. J. Immunol. 172, Mari, S., Serrano-Gómez, D., Cañada, F.J., Corbí, A.L., Jiménez-Barbero, J. (2004). 1D-STD NMR Experiments On Living Cells. The DC-SIGN/oligomannose interaction. Angewandte Chemie, 44, Puig-Kroger, A., Serrano-Gómez, D., Caparros, E., Domínguez-Soto, A., Relloso, M., Colmenares, M., Martínez-Muñoz, L., Longo, N., Sánchez-Sánchez, N., Rincón, M., Rivas, L., Sánchez-Mateos, P., Fernández-Ruiz, E., Corbí, A.L. (2004). Regulated expression of the pathogen receptor dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3)-grabbing nonintegrin in THP-1 human leukemic cells, monocytes, and macrophages. J. Biol. Chem. 279, Riol-Blanco, L., Iglesias, T., Sánchez-Sánchez, N., de la Rosa, G., Sánchez-Ruiloba, L., Cabrera-Poch, N., Torres, A., Longo, I., García-Bordas, J., Longo, N., Tejedor, A., Sánchez-Mateos, P., Rodríguez-Fernández, J.L. (2004). The neuronal protein Kidins220 localizes in a raft compartment at the leading edge of motile immature dendritic cells. Eur. J. Immunol. 34(1), Ruiz-Velasco, N., Domínguez, A., Vega, M.A. (2004). Statins upregulate CD36 expression in human monocytes, an effect strengthened when combined with PPAR-gamma ligands. Putative contribution of Rho GTPases in statin-induced CD36 expression. Biochem. Pharmacol. 67, Sánchez-Martín, L., Sánchez-Sánchez, N., Gutiérrez-López, M.D., Rojo, A.I., Vicente-Manzanares, M., Pérez-Alvarez, M.J., Sánchez-Mateos, P., Bustelo, X.R., Cuadrado, A., Sánchez-Madrid, F., Rodríguez-Fernández, J.L., Cabanas, C. (2004). Signaling through the leukocyte integrin LFA-1 in T cells induces a transient activation of Rac-1 that is regulated by Vav and PI3K/Akt-1. J Biol Chem. 279(16), Sánchez-Sánchez, N., Riol-Blanco, L., de la Rosa, G., Puig-Kroger, A., García-Bordas, J., Martín, D., Longo, N., Cuadrado, A., Cabanas, C., Corbí, A.L., Sánchez-Mateos, P., Rodríguez-Fernández, J.L. (2004). Chemokine receptor CCR7 induces intracellular signaling that inhibits apoptosis of mature dendritic cells. Blood. 10, Serrano-Gómez, D., Domínguez-Soto, A., Ancochea, J., Jiménez-Heffernan, J.A., Leal, J.A., Corbí, A.L. (2004). Dendritic cellspecific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin mediates binding and internalization of Aspergillus fumigatus conidia by dendritic cells and macrophages. J. Immunol. 173,

191 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer Cancer Genetics and Cancer Stem Cells AUGUSTO SILVA GONZÁLEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de carrera /Staff Scientist JOSÉ A. GARCÍA SANZ (Desde IV-2003) Investigador Contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist JULIETA DEL PRETE (Desde IV-2003) B. Postdoctoral / Postdoctoral fellow CARMEN ARIAS LÓPEZ ALEJANDRO ARMESILLA DIAZ (Desde V-2004) PALOMA BRAGADO DOMINGO (Desde V-2004) IGNACIO DEL VALLE TORRES LEYRE GARCÍA BENZAQUEN MAJA GRASSOW (Desde IX-2004) SILVIA GUTIÉRREZ FERNÁNDEZ (Desde I-2004) ATOCHA ROMERO ALFONSO (IV a X, 2004) B. Predoctorales / Predoctoral Fellows Palabras clave: Cáncer de mama, p53, Células madre, perfiles transcripcionales, perfiles de expresión, regulación traduccional, respuesta inmune p53 y cáncer (Carmen Arias, Iciar Lázaro-Trueba, Alejandro Armesilla, Paloma Bragado, Augusto Silva) Una de las actividades de p53 es activar la apoptosis. Esta función se desarrolla a través de su capacidad transcripcional, regulando genes implicados en la ruta apoptótica. Unos de los más conocidos es Bax, aunque hoy se conocen más de veinte genes directamente implicados en apoptosis y regulados transcripcionalmente por p53. Utilizando mutantes de p53 deficientes en inducir la apoptosis hemos estudiado los acontecimientos moleculares que subyacen a este defecto. La actividad apoptótica de p53 se correlaciona con la fragmentación de Bax en una Key words: Breast cáncer cells, p53, stem cells, transcriptional profiles, translational regulation, immune response. p53 and cancer (Carmen Arias, Iciar Lázaro-Trueba, Alejandro Armesilla, Paloma Bragado, Augusto Silva) Role of p53 in the onset of apoptosis. One of the main activities involved in p53 response is the onset of apoptosis. p53 develops this activity through its transcriptional activity upregulating genes of the apoptotic pathway. One of the most prominent apoptotic genes is bax. We have studied molecular events that underlie impaired apoptosis of p53 mutations. Wild type p53-induced apoptosis correlates with the cleavage of Bax into an active p18bax subunit. Two p53 mutations, p53r280k and p53l194f, expressed in a p53-null cell background were unable to transcribe bax, induce the cleavage of Bax protein or elicit 182

192 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells subunidad Bax-18, más activa. De hecho dos mutaciones, p53r280k y p53l194f, eran incapaces de inducir apoptosis o fragmentar Bax. Sin embargo, el mutante conformacional p53l194f, era capaz de unirse a los elementos de p53 presentes en el promotor de Bax. Actualmente estamos estudiando el significado biológico de esta interacción y sus consecuencias, en distintos mutantes de p53. Utilización de mutantes de p53 como herramienta para definir funciones de p53. La presencia de un alto porcentaje de mutantes de p53 en el cáncer, podría sugerir que está directamente implicado en los mecanismos de selección de la célula cancerosa. La búsqueda de perfiles de transcripción de p53wt o mutante nos permitiría investigar genes implicados en el desarrollo tumoral. Esta búsqueda nos permitió descubrir genes reprimidos por p53 y que se expresaban en células expresando mutantes de p53. Un caso que hemos estudiado es la represión de Rad51, un gen asociado a la recombinación homóloga (HR), por p53. La recombinación homóloga está directamente implicada en la estabilidad genómica lo que es esencial para la supervivencia celular. Nuestros datos, utilizando CHIP, sugieren que p53 reprime Rad51 y la formación de Rad51 foci y sugiere que p53wt bloquea la reparación de daño celular inducida por rotura de doble cadena de DNA. Sus implicaciones durante los procesos biológicos que acontecen tras el daño celular, están ahora en estudio. Estudio de la relación entre p53 y la proteína Securina. La securina es una proteína implicada en el ciclo celular, actuando apoptosis. Moreover, p53l194f mutant transactivates weakly p53 target genes other than bax, but binds to p53 responsive elements in the bax promoter. Thus, we provide insight on Baxdependent molecular mechanisms implicated in apoptosis and evidenced by the characterization of p53 mutations. p53 mutants as a tool to unravel new functions p53. The high rate of p53 mutants in cancer would suggest a direct participation of the mutants in the selection of the cancer cell. Search for p53 transcriptional profiles induced by p53wt and mutants will give us a clue on genes associated with the tumour development. This research reveals a number of genes directly repressed by p53 but expressed in p53 mutant cells. One of these genes was Rad51, a gene associated with double strand break repair by homologous recombination (HR). HR is directly involved in genomic stability and essential for cell survival. Our data suggest a direct involve of p53 in Rad51 transcriptional repression through its binding to p53 responsive elements presents in Rad51 promoter. Rad51 foci formation was also impaired by p53wt which has a direct implication on the role of p53 as DSB DNA repair mediator. Crosstalk between p53 and Securin. Securin is a protein implicated in cell cycle, inhibiting anaphase through its interaction with Separases. Previously we have described the direct interaction between p53 and securin which have a direct effect on different p53 functions. Now we are analyzing the role of this interaction on the capacity of p53 to induced cell repair after DNA damage, mainly by DNA DSB repair in HR. Using HCT

193 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells como un inhibidor de la anafase, mediante su interacción con la Separasa. Se han descrito interacciones físicas entre p53 y Securina, afectando esta última a la actividad transcripcional de p53. En nuestro estudio intentamos ver el papel que tiene esta interacción en la reparación de daños en el DNA, especialmente daños de doble rotura (DSB). Para ello analizaremos el papel de Securina en las vías de reparación de p53 trabajando en células HCT116 WT y en células HCT116 donde hay ausencia de Securina (Securina KO) o ausencia de p53 (p53 KO). Mediante técnicas de interferencia por RNA (sirna) estamos obteniendo células donde ambas proteínas estén ausentes (doble KO Securina-p53). En todos los tipos celulares estudiaremos la respuesta a daño en el DNA, producido por agentes genotóxicos como Doxorubicina o irradiaciones ionizante (rayos X) analizando los cambios que en cada caso se puedan producir. También estamos analizando el papel de la quinasa p38αmapk en la regulación de la proteína supresora de tumores p53. La p38αmapk es miembro de la familia MAPKs, que participa en rutas de transducción de señales asociadas al estrés. Datos previos han demostrado que las p38 MAPKs modulan la función de p53 por fosforilación en distintos residuos de serina tales como ser 15, 20, 33, 47 y 389, lo cual puede conducir a la inducción de apoptosis o afectar a otras funciones de p53. Nuestro proyecto pretende analizar la interacción de p53 con proteínas reguladoras de la apoptosis y los cambios en la localización subcelular de p53 en distintas condiciones de activación de p38αmapk (respuesta a cisplatino y H 2 O 2 ) prestando especial atención a su posible translocación a la mitocondria. Plasticidad neural de células madre hematopoyéticas adultas (Leyre García, Ignacio del Valle, Augusto Silva) Las células progenitoras hematopoyéticas de medula ósea de ratones adultos pueden dar origen a oligodendrocitos, astrocitos, neuronas y a células con características de células madre neurales (NSC) al ser transplantadas en el cerebro de ratones neonatos y en el de adultos con lesiones desmielinizantes. Estas células derivadas del donante y localizadas en la región subventricular, pueden ser expandidas in vitro como neuroesferas que en determinadas condiciones de cultivo diferencian a los distintos linajes neurales. La capacidad de reproducir la capacidad plástica de las células progenitoras hematopoyéticas en un modelo in vitro, está siendo ahora objeto de estudio. Además WT and HCT116 Securina K.O. cell lines or HCT116 p53 K.O. we are developing double KO mutants by interference RNA (sirna) techniques. The capacity of DNA repair in these new cell lines is now under study after doxorubicine or ionizing radiation. Effect of p38αmapk KO in the activity of p53. p38αmapk is a member of MAPK family, directly involved in transduction pathways induced under cellular stress. Previous data have demonstrated that p38αmapks regulate the p53 function through its phosphorylation of serine residues such as ser15, 20, 33, 47 y 389. Lack of some residues phosphorylations has been implicated in the impaired on apoptosis or other p53 functions. Using p38αmapk-null cell lines, we are analyzing its effect on p53-dependent apoptosis, and changes at the sub-cellular localization induced after the apoptotic stimulus (cisplatine and ROS (H 2 O 2 )) taken special attention to the mitochondria. Neural plasticity of adult haematopoietic stem cells (Leyre García, Ignacio del Valle, Augusto Silva) Neural plasticity of adult haematopoietic stem cells. Haematopoietic stem cells from adult bone marrow could give rise oligodendrocytes, astrocytes, neurones or when grafted in neonatal brains and in adult brains after demiliniating damage. After long-term analysis only donor neural stem cells were observed. This donor NSC, localized at the subventricular region (SVZ) could be expanded in vitro as neurospheres and differentiate in neural lineages under specific cell culture conditions. The capacity to reproduce this differentiation in vitro is now underway. Using quantitative RT-PCR and TaqMan probes we have analyzed the expression of Sox2, Nestina o Musashi, previously associated to neural differentiation. Up to now only few markers have been described able to identify neural stem cells. New markers would be used for the correct identification of neural progenitor s cells either at the brain as well as other niche reservoirs. Furthermore, new hypothesis on carcinogenesis suggest the existence of cancer stem cells associated with the tumour development of glioblastomas. To these purposes we have generated monoclonal antibodies against NSC which identify already defined specific neurogenic brain areas. The selection of these cellular populations will be used to analyze the trancriptional profiles of these cells before and after differentiation and at the neural niche as well as in other no-neural related localizations. The morphological and molecular changes will be then analyzed and correlated with genes expression by DNA arrays. 184

194 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells mediante PCR a tiempo real estamos analizando la expresión de genes asociados con procesos de proliferación y diferenciación neural, tales como Sox2, Nestina o Musashi, tanto en modelos neurales in vitro como en células derivadas de la médula ósea en condiciones de cultivo neurales. Hoy no existen muchos marcadores de superficie de células madre neurales. La identificación de nuevos marcadores permitiría la correcta selección de células con características de células progenitoras, además de la posible identificación de estos tipos celular como posibles responsables de la generación de glioblastomas y otros canceres de origen neural. Con objeto de poder identificar con precisión estas poblaciones hemos generado anticuerpos monoclonales contra células madre neurales, los cuales nos han permitido la identificación de áreas donde se localizan células precursoras. La posterior identificación y selección de estás células servirá para analizar su perfiles transcripcionales de estos tipos celulares, tanto en su nicho neural como en otras localizaciones. Los cambios morfológicos y moleculares serán analizados mediante histoquímica, respuesta fisiológica o molecular utilizando chips de DNA. Control traduccional en la regulación de la expresión génica (Julieta del Prete, Silvia Gutiérrez, Maja Grassow, José A. García-Sanz) Hace tres años propusimos que la utilización de mrnas unidos a polisomas en perfiles de expresión representaba más fehacientemente los fenotipos celulares que perfiles de expresión utilizando RNA total, ya que los primeros permiten identificar, además de genes regulados a nivel transcripcional, o mediante cambios en la estabilidad de los mrnas, genes regulados a nivel de procesamiento, transporte núcleo-citoplásmico o mediante cambios en la eficiencia de traducción de los transcritos. Durante este periodo hemos acumulado datos en distintos modelos que apoyan la hipótesis propuesta. Estos trabajos nos han llevado a un análisis detallado de la respuesta inmune y el establecimiento de modelos que nos permitan modificar genéticamente dicha respuesta, así como al análisis de modelos de tumorigenesis in vivo e in vitro que detallamos a continuación. Análisis molecular de la respuesta Inmune (Julieta del Prete y José García-Sanz) Utilizando perfiles de expresión de RNA unido a polisomas (RNA activamente traducido por la célula) hemos analizado distintas fases de la respuesta inmune, incluyendo la fase inicial de Translational control in the regulation of gene expression (Julieta del Prete, Silvia Gutiérrez, Maja Grassow, José A. García-Sanz) We proposed three years ago that the use of polysome-bound mrna in profiling experints was a more faithful representation of cell phenotypes that profiling experiments using total RNA, since they allow to identify, in addition to genes regulated by transcriptional changes or changes in transcript stability (already detected using total RNA) genes regulated at the levels of processing, núcleo-cytoplasmic transport or by changes in translation efficiency. During this period we have accumulated data in different model systems that fully support the proposed hypothesis. The work led to a detailed analysis of the immune response and the establishment of models allowing us to genetically modify the response, as well as the analysis of in vivo and in vitro tumorigenesis models that are detailed below. Molecular analysis of the immune response (Julieta del Prete and José A. García-Sanz) Using polysome bound mrna profiling (actively translated mrna) we have analyzed different phases of the immune response, including the in vivo analysis of the initial activation phase, the subsequent differentiation of CD8 + cells to cells with a Tc 1, Tc 2, Tc 1L or Tc null phenotypes and the subsequent phase characterized by the apoptosis of the vast majority of cells triggered by deprivation of growth factor. This extensive analysis allowed us to identify groups of genes with a regulated expression in specific phases of the immune response, which allows to hypothesize that they may play a relevant role in them. A subgroup of these genes has been already verified (using either northern blot, western blot or FACS analysis) and some candidate genes have been chosen for a functional analysis. Generation of mice with a genetically modified immune system (Silvia Gutiérrez Fernández y José A. García-Sanz) From bone marrow derived from T cell receptor transgenic mice (transgenic for the alpha and beta chains of the TCR, Vα 4,Vβ 11 or F5TCR) and knock out for Rag1 (F5TCR +/+ Rag1 -/- ), we have derived populations enriched in bone marrow stem cells that are modified in vitro with the genes of interest (IL4, GATA3, etc.) and subsequently transferred to recipient immunodefient mice due to a knock out in Rag 2 (Rag 2 -/- ). In these Rag2 -/- mice we can reconstitute an immune system with a given 185

195 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells activación in vivo, la fase subsiguiente de diferenciación de células CD8 + a células de fenotipo Tc 1, Tc 2, Tc 1L ó Tc null, y la fase de muerte por apoptosis inducida por privación de factor. Este análisis nos ha permitido identificar grupos de genes cuya expresión esta regulada en fases específicas de la respuesta inmune, lo que presupone que pueden jugar un papel importante en las mismas. Un subgrupo de los mismos ha sido verificado (mediante northern blot, western blot, análisis fluorocitométrico, etc.), y hemos escogido algunos candidatos para analizar a nivel funcional Obtención de ratones con un sistema inmune genéticamente modificado (Silvia Gutiérrez Fernández y José A. García-Sanz) A partir de médula ósea procedente de ratones transgénicos para las cadenas alfa y beta del receptor T (TCR Vα 4,Vβ 11 ó F5TCR) y con una deleción para Rag1 (F5TCR +/+ Rag1 -/- ), hemos obtenidos poblaciones enriquecidas en células madre hematopoyéticas que son modificadas con los genes de interés (IL4, GATA3, etc.) y subsecuentemente transferidas a ratones receptores inmunodeficientes debido a su carencia del gen Rag 2 (Rag 2 -/- ) en los que logramos reconstituir un sistema inmunitario con una especificidad determinada (todos los linfocitos son linfocitos T CD8 + capaces de reconocer el péptido antigénico reconocido por el transgén F5) de tal manera que el sistema inmune genéticamente modificado puede ser analizado in vivo e in vitro. Control traduccional y cáncer de mama (Julieta del Prete y José A. García-Sanz) Estamos analizando mediante perfiles de expresión de RNAs unidos a polisomas (RNA activamente traducido) RNAs procedentes de glándulas mamarias de ratones normales y animales que poseen insertado en su genoma un transgén para el protooncogén c-myc bajo el control de MMTV. Estos animales poseen una elevada frecuencia de tumores de mama. Este tipo de análisis nos permitirá identificar genes implicados en tumorogénesis mamaria y que están regulados a nivel traduccional (el RNA está presente en glándulas mamarias de animales normales y en el portador del transgén, pero solo se traducen en los animales transgénicos). specificity (determined by the F5TCR transgene), all mature cells from the reconstituted mice derive from the F5TCR, and the genetically modified immune system can be subsequently analyzed both in vivo and in vitro. Translational control and mammary tumorigenesis (Julieta del Prete y José A. García-Sanz) We are currently analyzing by polysome-bound mrna profiling (profiling of actively translated mrnas) RNAs from mammary glands from wild type and c-myc transgenic animals (MMTV-c-myc). The MMTV-c-myc animals have a high frequency of mammary tumours. This analysis will allow top identify genes involved in mammary tumorigenesis that are regulated at the translational level (the mrna is present in mammary glands from both wild type and transgenic animals, but is only translated in transgenic animals). Translational control and cancer: malignant transformation induced by over-expression of translation initiation factors (Maja Grassow, Atocha Romero y José A. García-Sanz). It is widely known that over-expression of translation initiation factors (eif4e, eif4g, eif2a, etc.) induces malignant transformation of NIH3T3 cells. The main question remaining to be answered is: What are the target genes affected by overexpression of these factors?. We have hypothesized that the immediate early effect of over-expression of these factors should affect the translation of a restricted group of transcripts, including the mrnas responsible for the malignant transformation. To unravel these genes we over-express these factors in inducible vectors and are currently analyzing the expression profiles the polysome-bound transcripts ont these cells. This will allow us to identify the genes regulated at the translational level and implicated in the malignant transformation. Immune inflammation disease: Periodontitis (Jorge Gamonal, Mariano Sanz, Laura Lau, Augusto Silva) Neutrophil cells constitute the first barrier against the oral bacterial. Our previous work implicates the apoptosis of neutrophils in the pathogenesis of periodontitis. We now demonstrate that granulocyte monocyte-colony stimulated factor (GM- CSF) present in the gingival crevicular fluid and secreted during the immune response reduce the apoptosis of neutrophils. The presence of GM-CSF and TNF_ were detected in the major- 186

196 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells Control traduccional y cáncer: transformación maligna inducida por la sobre expresión de factores de traducción (Maja Grassow, Atocha Romero y Jose A. García-Sanz) La sobre-expresión de varios factores de iniciación de la traducción (eif4e, eif4g, eif2a, etc.) induce transformación maligna de células NIH3T3, sin embargo no se conocen los genes afectados por la sobre expresión de dichos factores. Nosotros hemos hipotetizado que el efecto inmediato de la sobre expresión de dichos factores de traducción será un aumento de la eficacia de traducción de un grupo de mrnas entre los que se incluyen los responsables de la transformación maligna de dichas células. Hemos sobre expresado, en vectores inducibles, varios de los factores de iniciación de la traducción y estamos analizando los perfiles de expresión de mrnas traducidos en dichas células, lo que nos permitirá identificar los genes regulados a nivel traduccional e implicados en la transformación maligna. Respuesta Inflamatoria Inmune: Periodontitis (Jorge Gamonal, Mariano Sanz, Laura Lau, Augusto Silva) Los neutrófilos constituyen la primera defensa contra la infección bacteriana. Nuestro trabajo previo implicaba la apoptosis del neutrófilo durante la patogénesis de la periodontitis. Demostramos que el factor estimulador de colonias granulocitos-monocitos (GM-CSF) está presente en el fluido gingival crevicular y es secretado durante la respuesta inmune reduciendo la apoptosis de los neutrófilos. El GM-CSF reduce la apoptosis de los neutrófilos creviculares detectado por TUNEL y mieloperoxidasa y reduce la expresión de Bax. Estos resultados sugieren un nuevo mecanismo por el cual los neutrófilos pueden acumularse en periodontitis de pacientes adultos. Detección y cuantificación de bacterias periodontopatogénicas en muestras de placas subgingivales. Los cultivos microbiológicos han sido el método clásico de detección de bacterias utilizado en el diagnostico de la microflora subgingival. Sin embargo, estas técnicas tienen muchas limitaciones. Los recientes avances por RT-PCR con sondas específicas ofrecen un método altamente sensible y especifico para la detección de microorganismos. Recientemente hemos desarrollado un test para la detección de Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis y Tannerella forsythensis en muestras de placas subgingivales. Este ensayo es altamente específico y reproducible y esta metodología puede ser utilizada para cuantificar estas bacity of sites from periodontal patients. GM-CSF reduces the neutrophil apoptosis and Bax expression. These findings suggest a novel mechanism by which neutrophils specifically accumulate in adult patients with periodontitis. Detection and quantification of periodontopathogenic bacteria in subgingival plaque samples. Culture techniques have been the classic diagnostic method to detect the bacterial species residing in the subgingival microflora. However, these techniques have serious limitations. The recent advent of RT-PCR with species-specific primers provides a very specific and sensitive method for an accurate detection of target microorganisms. Our group has recently developed and tested a RT-PCR assay for the quantitation of bacteria in subgingival plaque samples. This assay has shown a high degree of specificity and a very reproducible and consistent methodology to quantitate these pathogenic species. However, this test has only been evaluated on reference strains and therefore, its diagnostic utility on subjects with different periodontal conditions is unknown. 187

197 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells terias. Sin embargo este test solo ha sido evaluado en cepas de referencia (ATCC) y su estudio en individuos con diferentes condiciones periodontales debe ser analizado. Organismos financiadores / Funding Agencies FIS, ( ) NeuroPharma, SA ( ) CSIC/Universidad de Chile 2003CL0014, ( ) PN, SAF ( ) CAM, 08.1/ _1 ( ) PN, SAF , ( ) US Army Medical Research and Acquisition Activity. DAMD ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Thesis M. Julieta del Prete. Molecular analisis of the aopototic process. Universidad de Barcelona, Director: J.A. García Sanz. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Álvarez, B., Garrido, E., García-Sanz, J.A., and Carrera, A.C. (2003). Phosphoinositide 3-kinase activation regulates cell división rime by coordinated control of cell mass and cell cycle progresión rate. J. Biol. Chem. 278, De la Fuente, M.T., Casanova, B., Cantero, E., Hernández del Cerro, M., García Marco, J., Silva, A., and García-Pardo, A. (2003). Involvement of p53 in a4b1 integrin/mediated resistance of B/CLL cells to fludarabine. Biochemical and Biophysical Research Communications 311, Gamonal, J., Sanz, M., O`Connor, A., Acevedo, A., Suárez, I., Sanz, A., Martínez, B., and Silva, A. (2003). Delayed neutrophil apoptosis in chronic periodontitis patients. J. Clinical Periodontol. 30, Gutiérrez del Arroyo, A., de Marco, M.C., and Silva, A. (2003). IL-3 is unable to rescue IL-3-dependent scid cells after exposure to X-ray irradiation. Inmunología. 22, Morillo, J.M,. Lau, L. Sanz, M., Herrera, D., and Silva, A. (2003). Quantitative Real-time PCR based on single copy gene sequence for detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis. J. Periodontol. Res 38,

198 Genética del Cáncer y de Células Progenitoras del Cáncer / Cancer Genetics Stem Cells Bascones, A., Gamonal, J., Gómez, M., Silva, M., González, A. (2004). New knowledge of the molecular mechanisms in periodontitis. Quintessence Int. 35, Lau, L., Sanz, M., Herrera, D., Morillo, J.M., Martín, C., and Silva, A. (2004). Quantitative Real-time PCR versus culture: a Comparison between two methods for the detection and quantification of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in subgingival plaque samples. J. Clinical Periodontol. 31, Morillo, J.M., Lau, L., Sanz, M., Herrera, D., Martín, C., and Silva, A. (2004). Quantitative Real-time PCR based on single copy gene sequence for detection of periodontal pathogens. J. Clin. Periodontol. 31, Sanjuan, M.A., Pradet-Balade, B., Jones, D.R., Martínez, A.C., Stone, J.C., García-Sanz, J.A., and Merida, I.T. (2003). Cell activation in vivo targets diacylglycerolk kinase α to the membrane: A novel mechanism for ras attenuation. J. Immunol. 170, Sanz, L., García Marco, J. de la Fuente, T., Casanova, B., García-Gila, M., García-Pardo, A., Silva, A. (2004). Differential expression of the pro-apoptotic protein Bik in chronic lymphocytic leukemia. Biochem. Biophys. Res. Comm. 315, Sanz, M., Lau, L., Herrera, D., Morillo, J.M., and Silva, A. (2004). Methods of detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis, in periodontal microbiology with special emphasis on advanced molecular techniques: a review. J. Clin. Periodontol. 31, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Bonilla, S., Silva, A., Valdés, L., Geijo, E., García-Verdugo J.M., and Martínez, S. (2005). Functional neural stem cells are derived from adult bone marrow. Neuroscience (en prensa/in press). Patentes/Patents Alarcón Martínez, P., Bonilla Jiménez, S., Silva González, A., Martínez, S. Empleo de células madre hematopoyéticas en la generación de células madre neurales. No. Solicitud PCT/ES02/

199 Mecanismos Celulares de Agentes Estabilizantes de Microtúbulos Cellular Mechanisms of Microtubule Stabilizing Agents ISABEL BARASOAIN BLASCO Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist Palabras clave: Microtúbulos, Taxol, Células tumorales Mecanismos celulares de acción de agentes estabilizantes de microtúbulos El sitio de unión de Taxol en los microtúbulos es una diana farmacológica cuya función es todavía desconocida. Diversas substancias naturales químicamente diferentes mimetizan los efectos citotóxicos de Taxol, aparentemente uniéndose al mismo sitio ubicuo de unión de Taxol en los microtúbulos. Entre éstas se encuentran las epotilonas (de myxobacterias), la discodermolida (de esponjas marinas) y eleuterobina (de un coral marino). Estos compuestos, llamados agentes estabilizantes de microtúbulos, los estabilizan y bloquean su dinámica, de esta forma detienen la división celular. Por ello Taxol se utiliza en la quimoterapia de cáncer de ovario, cáncer de mama metastático, cáncer de cabeza y cuello y en cáncer de pulmón. El sitio de unión de Taxol se ha mapeado en la subunidad de β-tubulina en el lumen de los microtúbulos. Este sitio en la superficie interna de los microtúbulos dificultaría en principio el acceso de los ligandos del sitio de Taxol en microtúbulos ensamblados. Hemos estudiado la cinética de unión de un taxoide fluorescente (Flutax-2) a microtúbulos celulares. El sitio de unión es perfectamente accesible a Flutax-2 en citoesqueletos nativos de células PtK2. La cinética de unión y disociación observada es similar a la obtenida con microtúbulos in vitro conteniendo proteínas asociadas (MAPs). Los datos cinéticos indican que los taxoides se unen directamente de la solución a un sitio expuesto en el microtúbulo. Por otro lado, hemos caracterizado posibles nuevos miméticos de taxol procedentes de diversos extractos de origen marino, capaces de desplazar el taxoide fluorescente de su sitio de unión a los microtúbulos, estudiando su efecto sobre la red microtubu- Keywords: Microtubules, Taxol, Tumour cells Cellular mechanisms of action of microtubule stabilizing agents The Taxol binding site of microtubules is a pharmacological target with an unknown cellular function. A number of diverse natural substances, including epothilones (from myxobacterias), discodermolide (from marine sponges), and eleutherobine (from a marine soft coral), mimic the cytotoxic effects of Taxol, apparently by binding to the ubiquitous microtubule site. These compounds, called microtubule stabilizing agents bind to microtubules, stabilized them and block their dynamics, thus disrupting cell division. Subsequently, since they blocked cell division they are useful as antitumour drug. Taxol and its derivatives are the main choices for the chemotherapy of ovarian cancer, metastatic breast cancer, head and neck cancer and lung cancer. The binding site of Taxol has been mapped in the β- tubulin subunit in the microtubule lumen. Such location in the microtubule inner surface will in principle make the binding site difficult to access for Taxol site ligands in assembled microtubules. We have studied the kinetics of binding of a fluorescent taxoid Flutax-2 to cellular microtubules. The binding site is fully accessible to Flutax-2 in native cytoskeletons of PtK2 cells. The observed kinetic rates of Flutax-2 microtubule staining and destaining are similar to the reaction rates with microtubule associated proteins-containing microtubules. The kinetic data prove that taxoids bind directly from the bulk solution to an exposed microtubule site. On the other hand, we have characterized possible new taxol mimetic compounds from a screen of marine extracts that are able to displace the fluorescent taxoid from its microtubule binding site, studying their effect on the microtubule network, 190

200 Mecanismos Celulares de Agentes Estabilizantes de Microtúbulos / Cellular Mechanisms of Microtubule Stabilizing Agents Figura.- Imágenes representativas del curso de tiempo de la unión de 200 nm Flutax-2 (A-D) a citoesqueletos de células PtK2 y curso de tiempo de la intensidad media de citoesqueletos interfasicos de células PtK2 incubados con 200nM (E) o 1 µm (F) Flutax- 2 Figure.- Representative images of the time course of 200 nm Flutax-2 binding to cytoskeletons of PtK2 cells (A-D) and time course of the average intensity of interphase PtK2 cytoskeletons upon incubation with 200 nm (E) or 1 µm (F) Flutax-2. lar, citotoxicidad e inhibición del ciclo celular sobre lineas tumorales representativas. En una colección de agentes estabilizantes de microtúbulos, algunos no son capaces de desplazar taxoide fluorescente de microtúbulos, ya que se unen a un sitio distinto del de Taxol, el sitio de laulimalida. Nos proponemos caracterizar los sitios de unión de estos ligandos activadores así como estudiar la relación estructura/actividad biológica de estos ligandos utilizando diversas líneas tumorales, entre ellas algunas resistentes a Taxol y otras que sobreexpresan proteína P y son multirresistentes. cytotoxicity and inhibition of cell cycle in representative tumour cell lines. Among a collection of purified or synthesized microtubule stabilizing agents, some of them are not able to displace fluorescent taxoid from microtubules, because they bind to the laulilamide site, and we intend to characterize the binding site of these activating ligands as well as to study the structure/biological activity relationship of these ligands employing different tumour cell lines, including taxoid resistant cells as well as multidrug- resistant overexpressing P-glycoprotein lines. 191

201 Mecanismos Celulares de Agentes Estabilizantes de Microtúbulos / Cellular Mechanisms of Microtubule Stabilizing Agents Organismos Financiadores/Funding Agencies MCyT, BIO ( ) Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Abal, M., Andreu, J.M., and Barasoain, I. (2003). Taxanes: Microtubule and centrosome targets and cell cycle dependent mechanism of action. Current Cancer Drug targets 3, Diaz, J.F., Barasoain, I., and Andreu, J.M. (2003). Fast Kinetics binding to microtubules. Effects of solution variables and microtubule associated proteins. J. Biol. Chem. 278, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Diaz, J.F., Barasoain, I., Souto, A.A., Amat-Guerri, F., and Andreu, J.M. (2005). Macromolecular accessibility of fluorescent taxoids bound at a paclitaxel binding site in the microtubule surface. J. Biol. Chem., electronically published Nov 2004, DOI/ jbc. M

202 Patología Molecular / Genética del Complemento Molecular Pathology / Complement Genetics Laboratory SANTIAGO RODRÍGUEZ DE CÓRDOBA Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist VICTOR LUIS RUIZ PÉREZ (Desde V-2004) Investigador Contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist Mª ESTHER GALLARDO PÉREZ Investigadora Contratada / Research Associate OLGA CRIADO GARCÍA B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow JORGE ESPARZA GORDILLO Mª ELENA FERNÁNDEZ SÁNCHEZ BELEN GARCÍA FOJEDA GARCÍA VALDECASAS ELENA GOICOECHEA DE JORGE OLATZ HUARTE PANIEGO (Hasta II-2004) CELIA LÓPEZ MENÉNDEZ (Desde I-2004) IRIA MEDRAÑO FERNÁNDEZ B. Predoctorales / Graduate Students Palabras clave: Complemento, Síndrome hemolítico urémico, Epilepsia de Lafora, DNA mitocondrial, Ellis-van Creveld Perspectiva histórica Nuestro laboratorio realiza investigación en Genómica y Biología Molecular con un interés específico en Genética Molecular Humana. Durante muchos años hemos estudiado la genética y la función de las proteínas que regulan el sistema del complemento humano. En 1985 describimos y dimos nombre al agrupamiento genético RCA (regulators of complement activation) en 1q32 y posteriormente hemos contribuido significativamente al conocimiento actual de esta región del Genoma Humano. Nuestro trabajo más reciente se ha centrado en el papel de los productos de los genes del sistema RCA en patologías Keywords: Complement, Hemolytic uremic syndrome, Epilepsy of the Lafora type, Mitochondrial DNA, Ellis-van Creveld Historical perspective Our laboratory uses genomics and molecular biology to carry out research in Human Genetics. For many years we have studied the genetic and the function of the proteins that regulate the human complement system. We discovered the RCA (regulators of complement activation) gene cluster in the chromosomal region 1q32 and contributed significantly to the current knowledge on the organization of this region of the Human Genome. Recently, our work in this area of the Complement system has focussed in studying the role of the gene products of the RCA system in chronic and infectious diseases. Among these studies 193

203 Patología Molecular / Genética del Complemento / Molecular Pathology / Complement Genetics Laboratory infecciosas o crónicas. Entre estos estudios está la caracterización de la interacción de proteínas reguladoras del complemento y Streptococcus pyogenes y los análisis genéticos y funcionales de las proteínas del sistema RCA en el síndrome hemolítico urémico atípico (ahus). Nuestro laboratorio es también responsable de la clonación molecular de una serie de genes humanos causantes de enfermedades no relacionadas con el sistema inmune. Estas líneas de investigación incluyen: 1) Clonación del gen responsable de la alcaptonuria (AKU) y caracterización completa de las bases moleculares, estructurales y epidemiológicas de la enfermedad; 2) Clonación molecular y análisis genómico de los genes homeobox humanos de la familia SIX. Identificación del gen SIX6 como un gen responsable de anoftalmia; 3) Clonación molecular del gen responsable de la 3-metilcrotonilglicinuria; y 4) Clonación del gen responsable de la epilepsia mioclónica progresiva de tipo 2 o Enfermedad de Lafora (EPM2) en 6q24 y estudios relacionados con la caracterización funcional de laforina. Bases moleculares de la epilepsia mioclónica progresiva de Lafora La enfermedad de Lafora (LD, MIM ) es una patología neurodegenerativa fatal y la causa más frecuente de epilepsia mioclónica progresiva en los países del sur de Europa. La mayoría de los enfermos con LD fallecen antes de 10 años después del comienzo de la enfermedad tras evolucionar a un estado vegetativo terminal. LD se caracteriza por la presencia sistémica de depósitos intracelulares de una sustancia intensamente PAS positiva (llamados cuerpos de Lafora) de composición similar al glucógeno o la amilopeptina por lo que se ha sugerido que LD podría ser una patología relacionada con las glucogenosis. LD se hereda como un carácter autosómico recesivo. Se han identificado dos genes responsables de LD (EPM2A, 6q24 y EPM2B, 6p22.3) que codifican una proteína tirosina fosfatasa dual y una posible E3-ubiquitina ligasa denominadas laforina y malina, respectivamente. Los pacientes con defectos en uno u otro gen son indistinguibles fenotípicamente. Recientemente hemos obtenido evidencia de que laforina interacciona con proteínas que participan en la organización de los complejos multiproteicos asociados a las partículas de glucógeno intracelulares, consolidando la idea de que laforina esta implicada en la regulación del metabolismo del glucógeno. Nada se sabe sobre la are the characterization of the interaction of the regulatory proteins of complement and Streptococcus pyogenes and the genetic and functional analyses of RCA proteins in atypical Hemolytic Uremic Syndrome (ahus). Our laboratory is also interested in areas of human genetics that are away from the Immune System. This work includes: 1) The cloning of the gene responsible for alkaptonuria (AKU) and the complete characterization of the molecular, structural, and epidemiological basis of this disease; 2) The cloning of the human homeobox gene SIX6 as a gene responsible for anophtalmia and pituitary anomalies; 3) The cloning of the genes MCCA and MCCB responsible for the 3-methylcrotonyglycinuria; and 4) The molecular cloning of the genes responsible for Lafora s disease (EPM2). Progressive myoclonus epilepsy of the Lafora type The Lafora disease (LD, MIM ) is a fatal neurodegenerative disorder and the most frequent cause of progressive myoclonus epilepsy in Southern Europe. Most patients die within 10 years from the onset, following a rapid progression to a vegetative terminal state. LD is characterized by the presence of polyglucosan intracelular inclusion bodies (so-called Lafora bodies) showing a composition that resembles that of glycogen or amylopeptin. LD is inherited as an autosomal recessive trait. Two genes causing LD have been identified. EPM2A (6q24) encodes laforin, a dual protein tyrosine phosphatases. EPM2B (6p22.3) encodes malin, a putative E3-ubiquiting ligase. Patients carrying mutations in laforin are indistinguishable from those with mutations in malin. Recently we have obtained evidence that laforin interacts with proteins that participate in the assembly of the multiprotein complexes associated to the intracellular glycogen particles, reinforcing the concept that laforin is involved in the regulation of the glycogen metabolism. The function of malin is still unknown. The goal of this line of research is to functionally characterize laforin and malin and to determine why their absence causes Lafora disease. To this end we are developing a multidisciplinary strategy, including genetic, biochemical and molecular and cellular biology approaches. We expect that our results will increase our understanding of the molecular processes underlying the pathology and that this knowledge will allow us to delineate therapeutic approaches. 194

204 Patología Molecular / Genética del Complemento / Molecular Pathology / Complement Genetics Laboratory posible función de malina. En esta línea de investigación pretendemos la caracterización funcional de laforina y malina y establecer por qué su ausencia determina la enfermedad de Lafora. Con este fin, estamos desarrollando una estrategia múltiple con aproximaciones genéticas, bioquímicas y de biología molecular y celular. Esperamos que los resultados de este proyecto aporten datos sobre los procesos moleculares causantes de la patología y que este conocimiento permita delinear abordajes terapéuticos. El síndrome hemolítico urémico atípico (ahus) El Síndrome Hemolítico Urémico (ahus; MIM ) es una de las causas principales de fracaso renal agudo en niños. HUS es un trastorno de la microvasculatura, clínicamente definido por anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia, que afecta preferentemente a los riñones y se manifiesta con hematuria, oligoanuria y fracaso renal. La forma más frecuente de HUS se asocia a infecciones por la cepa de E. coli O157:H7, que secreta una potente toxina capaz de unirse a receptores Gb3 (globotriaosilceramida) de la superficie de las células endoteliales y provocar la destrucción de las mismas de forma directa o a través de la activación de mecanismos inflamatorios y procoagulantes. La gran mayoría de los pacientes con esta forma típica evolucionan satisfactoriamente al cabo de 2 o 3 semanas y recuperan completamente la función renal. En discrepancia con estos casos típicos, existe un grupo de pacientes con HUS no asociado a diarrea, comienzo insidioso, evolución muy mala y elevada mortalidad. Entre los supervivientes de este grupo la mitad tiene recurrencias y la mayoría evoluciona a insuficiencia renal terminal. Esta forma atípica de HUS no muestra una relación particular con infecciones, aunque tiende a asociarse con tratamientos inmunosupresores o anticancerígenos, con el uso de anticonceptivos, con el embarazo o con el postparto. El complemento es el mecanismo efector humoral más importante de la defensa natural o inespecífica, y está diseñado para defendernos de la infección generando componentes activos capaces de lisar los microorganismos o de revelar su presencia al sistema inmune celular. Su correcto funcionamiento requiere de reguladores de su actividad y de receptores para sus componentes activos en células del sistema inmune. La mayoría de estos componentes reguladores y receptores pertenece a la misma familia de proteínas cuyos genes están estrechamente ligados en un agrupa- Atypical Hemolytic Uremic Syndrome (ahus) Hemolytic Uremic Syndrome (HUS; MIM ) is a major cause of acute renal failure in children. HUS is a microvasculature disorder clinically defined by thrombocytopenia, microangiopathic hemolytic anemia and acute renal failure. In typical HUS, the etiologic agent is frequently an infection of the E. coli strain O157:H7, which secretes a potent toxin that inhibits protein synthesis and damages endothelial cells in the microvasculature. Most of these HUS patients evolve satisfactorily and complete recovery of the renal function is achieved in 2-3 weeks. Five to ten percent of patients with HUS have a poorer prognosis. This atypical form of HUS (ahus) shows no particular relationship with infection, but it is frequently associated to immunosuppressive drugs, cancer therapies, oral contraceptives, pregnancy or postpartum. Complement is a major defense and clearance system in the bloodstream that is designed to fight infection by generating active elements that will have the potential of killing microorganisms or marking their presence to the cellular immune system. The efficiency of the complement system as an innate defense mechanism against microbial infections depends on a fine control that avoids the wasteful consumption of its components and restricts its activation to the surface of microorganisms, thus preventing non-specific damage to host tissues. Complement regulation is performed by a set of plasma and membrane-associated proteins, many of them encoded by genes in the RCA gene cluster in human chromosome 1q32. Genetic and functional analyses performed by us and others have shown that this critical control of complement activation may be impaired in ahus patients. The current goal of our project is to provide insight into the genetic complexity of ahus by characterizing genetic predisposition factors. These data will help to understand the molecular basis of ahus, providing tools for early diagnosis and knowledge to develop appropriate therapeutics. Sequencing of mitochondrial DNA The mitochondrial DNA (mtdna), the second genetic system of the eukaryotic cell, plays an important role in the cellular physiology and is frequently involved in the development of pathologic processes. Its small size ( bp) makes the mitochondrial genome susceptible of being completely analyzed in 195

205 Patología Molecular / Genética del Complemento / Molecular Pathology / Complement Genetics Laboratory miento genético localizado en el brazo largo del cromosoma 1 humano (1q32). Estudios genéticos y funcionales realizados por nosotros y otros grupos han mostrado que este control crítico del sistema del complemento está alterado en ahus. El objetivo actual de nuestro proyecto es analizar la complejidad genética en ahus caracterizando factores de predisposición. Los datos generados ayudarán a entender las bases moleculares de la patología, proporcionando herramientas para su diagnóstico precoz y conocimiento para desarrollar terapias adecuadas. Secuenciación DNA mitocondrial El DNA mitocondrial (mtdna), el segundo sistema genético de las células eucariotas, tiene un papel fundamental en la fisiología celular y está frecuentemente implicado en el desarrollo de procesos patológicos. Su tamaño reducido ( bp) hace que sea susceptible de ser analizado completamente de cara a identificar variaciones en su secuencia que determinen alteraciones funcionales. Sin embargo, en la actualidad no existen estrategias que permitan la secuenciación completa del mtdna de forma automática con un coste razonable. Esther Gallardo Pérez es responsable de un proyecto que tiene como objetivo el desarrollo de un procedimiento rápido, sencillo y económico para secuenciar y anotar automáticamente el mtdna y su aplicación al diagnóstico molecular de enfermedades con base mitocondrial. El síndrome de Ellis-van Creveld El síndrome de Ellis-van Creveld (EvC, MIM ) o displasia condroectodérmica es una patología autosómica recesiva que afecta al desarrollo y que combina anormalidades del esqueleto -corta estatura, polidactilia, tórax estrecho, displasia de pelvis y tibia- con defectos ectodérmicos en uñas y dientes y alteraciones cardiacas, generalmente una aurícula única. La mortalidad neonatal es del 30% y otras anormalidades orofaciales son múltiple frénula, tabique nasal ancho y labio pseudo-leporino. Los dos genes, EVC y EVC2, que hasta la fecha se han encontrado mutados en pacientes con Ellis-van Creveld codifican proteínas nuevas -sin parecido a otras proteínas conocidas- y se localizan en el brazo corto del cromosoma 4 (4p16.1) donde se disponen en una organización cromosómica adyacente con transcripción divergente conservada en todos los vertebrados. order to identify sequence variations that result in functional anomalies. However, nowadays there are no strategies to sequence completely the mtdna at low cost. The goal of Esther Gallardo Pérez, as responsible of this project, is to develop a simple, fast and affordable protocol to sequence completely and annotate automatically the mtdna on a routine basis. Ellis-van Creveld syndrome Ellis-van Creveld syndrome (EvC, MIM ) or condroectodermic dysplasia is an autosomal recessive disorder affecting development of the skeleton and ectodermis. Patients show short stature, polydactyly, narrow thorax, abnormal pelvis and hypoplastic teeth and nails. Heart defects more often a common atrium, multiple frenula, broad nasal bridge and pseudocleft lip are other clinical features. The heart and rib cage defects are thought to be responsible for the 30% of neonatal death. Two novel genes EVC and EVC2 have been found mutated in EvC patients. The two genes map to the short arm of chromosome 4 (4p16.1) and encode proteins that have no resemblance to other known proteins. EVC and EVC2 are arranged in a head-to-head chromosomal organization conserved in all vertebrates. Victor L Ruiz-Pérez isolated the Ellis-van Creveld EVC and EVC2 genes during his postdoctoral research in the UK and is currently responsible of a project that aims to gain insights into the function of the EVC proteins. An Evc lacz mouse model, already available, has provided knowledge relative to the spatiotemporal expression of the Evc gene and has allowed posing hypothesis about the function of the Evc protein. New Ellis-van Creveld animal models are also being developed by Victor L. Ruiz-Pérez. 196

206 Patología Molecular / Genética del Complemento / Molecular Pathology / Complement Genetics Laboratory Victor L. Ruiz-Pérez identificó estos dos genes durante su etapa postdoctoral en el Reino Unido y actualmente es responsable de un proyecto cuyo objetivo final es la caracterización funcional de las proteínas EVC. Disponemos ya de un modelo animal Evc lacz que ha permitido determinar el patrón de expresión espaciotemporal del gen EVC y plantear hipótesis sobre la función de este gen. La construcción de otros modelos animales de Ellisvan Creveld, complementarios al ya disponible, permitirá profundizar en el conocimiento de la función de estos dos genes de crucial importancia para el desarrollo embrionario. Organismos Financiadores/Funding Agencies MCyT, SAF ( ) Fund. Ramón Areces ( ) MCyT, SAF ( ) Fund. La Caixa ( ) ISCIII, C03/05 ( ) ISCIII, C03/06 ( ) ISCIII, G03/054 ( ) ISCIII, G03/011 ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses María Elena Fernández Sánchez. Bases moleculares de la Enfermedad de Lafora. Análisis de la función biológica de los genes responsables mediante la caracterización de interacciones proteicas. Universidad Complutense de Madrid, Director: S. Rodríguez de Córdoba. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Desviat, L.R., Pérez-Cerdá, C., Pérez, B., Esparza-Gordillo, J., Rodríguez-Pombo, P., Peñalva, M.A., Rodríguez de Córdoba, S., and Ugarte, M. (2003). Functional analysis of MCCA and MCCB mutations causing methylcrotonylglycinuria, Mol. Genet. Metab. 80, Esparza Gordillo, J., Soria, J.M., Buil, A., Souto, J.C., Almasy, L., Blangero, J., Fontcuberta, J., and Rodríguez de Cordoba S. (2003). Genetic determinants of variation in the plasma levels of the C4b-binding protein (C4BP) in Spanish families. Immunogenetics 54,

207 Patología Molecular / Genética del Complemento / Molecular Pathology / Complement Genetics Laboratory Fernández-Sánchez, M.E., Criado-García, O., Heath K.E., García-Fojeda, B., Medraño-Fernández, I., Gomez-Garre, P., Sanz, P., Serratosa, J.M., and Rodríguez de Córdoba, S. (2003). Laforin, the dual-phosphatase responsible for Lafora disease, interacts with R5 (PTG), a regulatory subunit of protein phosphatase-1 that enhances glycogen accumulation. Hum. Mol. Genet. 12, Uyguner, O., Goicoechea de Jorge, E, Cefle, A., Baykal, T., Kayserili, H., Cefle K., Demirkol, M., Yuksel-Apak, M., Rodríguez de Córdoba, S., and Wollnik, B. (2003). Molecular analyses of the HGO gene mutations in Turkish alkaptonuria patients suggest that the R58fs mutation originated from Central Asia and was spread throughout Europe and Anatolia by human migrations. J. Inherit. Metab. Dis. 26, Esparza Gordillo, J., Soria, J.M., Buil, A., Almasy L., Blangero, J., Fontcuberta, J., and Rodríguez de Cordoba, S. (2004). Genetic and environmental factors influencing the human factor H plasma levels. Immunogenetics 56, Esparza Gordillo, J., Soria, J.M., Buil, A., Souto, J.C., Almasy, L., Blangero, J., Rodríguez de Córdoba, S., and Fontcuberta, J. (2004). Genetic correlation between plasma levels of b chain-containing C4BP isoforms and susceptibility to thrombosis. J. Med. Genet. 41:e5. Gallardo M.E., Schneider A.E., Dwyer M.A. Ayuso C., Bovolenta, P., and Rodríguez de Cordoba, S. (2004). Analysis of the developmental SIX6 homeobox gene in patients with anophthalmia/microphthalmia. Am. J. Med. Genet. 129A, Pérez-Caballero, D., García, I., Cortés, G., Wessels, M.R., Albertí, S., and Rodríguez de Córdoba, S. (2004). Interaction between complement regulators and S. pyogenes. Binding of C4BP and factor H/FHL-1 to M18 strains involves two different cell surface molecules. J. Immunol. 173, Rodríguez de Córdoba, S., Esparza Gordillo, J., Goicoechea de Jorge, E., López-Trascasa, M., and Sánchez-Corral, P. (2004). The human complement factor H: functional roles, genetic variations and disease associations. Mol. Immunol. 41, Rodríguez de Córdoba, S., Peña Carrión, A., Rivera Hernández, F., López Trascasa M., y Sánchez-Corral, P. (2004). Factores genéticos de predisposición al Síndrome Hemolítico Urémico. Implicaciones diagnósticas y terapéuticas. Nefrologia XXIV(1), 9-11 (Comentario Editorial). Sánchez-Corral, P., González-Rubio, C., Rodríguez de Córdoba, S., and López-Trascasa, M. (2004). Functional analysis in serum from atypical Hemolytic Uremic Syndrome patients reveals impaired protection of host cells associated with mutations in Factor H. Mol. Immunol. 41, Próximos Artículos/Forthcoming Articles Esparza-Gordillo, J., Goicoechea de Jorge, E., López-Trascasa, M., Sánchez-Corral, P., and Rodríguez de Córdoba, S. (2005). Predisposition to atypical Hemolytic Uremic Syndrome involves the concurrence of different susceptibility alleles in the Regulators of Complement Activation gene cluster in 1q32. Hum. Mol. Genet. 14, Gómez-Abad, C., Gómez-Garre, P., Gutiérrez-Delicado, E., Saygi, S., Michelucci, R., Tassinari, C.A., Rodríguez de Córdoba, S., and Serratosa. J.M. (2005). Identification of novel mutations in EPM2B in Lafora Disease and genotype-phenotype correlations Neurology 64,

208 Virología Molecular de Vaccinia Molecular Virology of Vaccinia EDUARDO PÁEZ ABRIL Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist JOSÉ IGNACIO QUETGLAS MAS (Hasta VII-2003) RAMÓN VICENTE TAMAYO (Desde IX-2003) B. Predoctorales / Graduate Students FRANCISCO GARCÍA TABARES Personal Técnico / Technician Mecanismo de la fusión celular inducida por el virus vaccinia: identificación y caracterización de las proteínas implicadas y su aplicación al desarrollo de nuevos vectores recombinantes más seguros El virus vaccinia es la especie tipo del género Ortopoxvirus y es bien conocido por su utilización como vacuna viva en la única campaña de vacunación que ha conseguido la erradicación de una enfermedad viral, como es el caso de la viruela. El virus vaccinia u otros virus relacionados pueden ser utilizados en el futuro como vacuna viva contra otros patógenos de importancia médica y veterinaria. Este proyecto pretende identificar y caracterizar proteínas de membrana de virus vaccinia implicadas en el fenómeno de fusión celular y diseminación víricas con el fín de definir los mecanismos de infectividad y patogénesis de este virus humano y de obtener mejores vectores basados en el virus vaccinia que pudieran tener un uso más seguro en el laboratorio y una aplicación en el desarrollo futuro de nuevas vacunas recombinantes. Este proyecto permitiría acometer el objetivo propuesto recientemente por la OMS de crear una nueva vacuna de la viruela más segura. Utilizando virus vaccinia recombinantes obtenidos por mutagénesis insercional en el virus salvaje, o alternativamente mediante la utilización de vectores de expresión transitoria, se caracterizarán una serie de genes involucrados en interacciones virus-huésped cuya posible función podría tener importantes implicaciones en virulencia in vivo. Se analizará la posible función de estos genes en la repli- Mechanism of vaccinia virus induced cellular fusion: identification and characterization of viral proteins involved and implications in the development of safer recombinant vectors Vaccinia virus is the prototype of the Orthopoxvirus group. A vaccine prepared with live vaccinia virus was used in the first example of a worldwide immunization program that successfully eradicated a human disease, smallpox. Vaccinia virus might be used in the near future as a recombinant vaccine against several pathogens with human and veterinary importance. This project proposes the identification and characterization of vaccinia virus membrane proteins involved in virus-induced cellular fusion and viral dissemination to define the mechanisms of infectivity and pathogenesis of this human virus. This study will be useful to generate safer expression vectors to be used in the laboratory and to develop new recombinant vaccines in the future. The task recently put by WHO to create a novel safer smallpox vaccine can be accounted with projects like this.vaccinia virus recombinants obtained by insertional mutagenesis of specific genes in wild-type virus will be used to characterize genes involved in virus-host interactions, which might have important implications in virulence. Transient expression vectors will also aid toward deciphering the function of these genes. The role of these genes in viral replication in vitro and in vivo will be determined. To this end, virus recombinants will be obtained. Expression of viral proteins in prokaryotic and eukaryotic systems will allow to further characterize the func- 199

209 Virología Molecular de Vaccinia / Molecular Virology of Vaccinia cación viral in vitro e in vivo, mediante la obtención de virus recombinantes y la expresión de estos genes en sistemas procarióticos y eucarióticos. Por último, se valorará la eficacia de estos virus recombinantes atenuados con respecto al virus salvaje. tion of these genes. Finally, the efficiency of these attenuated virus recombinants when compared with the wild-type virus will be tested. Publicaciones/Publications Páez, E. (2004). Una nueva vacuna de viruela basada en el virus vaccinia clonado y crecido en cultivos celulares. Virología 10, nº1, R. Paéz, E. (2004). El factor de transcripción TFIIH, una diana para el virus de la fiebre hemorrágica del valle del Rift. Virología 10, nº2, R. Páez, E. (2004). El origen de la vacuna de la viruela. En La Real Expedición Filantrópica de la Vacuna: Doscientos años de lucha contra la viruela (Ramírez, S., Valenciano, L., Nájera, R., Enjuanes, L. Eds.) CSIC, Colección Biblioteca de Historia de América, 32, R. 200

210 Departamento de Microbiología Molecular Department of Molecular Microbiology Jefe de Departamento Department Head Profesores de Investigación Investigadores Científicos Científicos Titulares Titulados Superiores de OPI Personal Técnico Secretaria RUBENS LÓPEZ GARCÍA ERNESTO GARCÍA LÓPEZ JOSÉ LUIS GARCÍA LÓPEZ RUBENS LÓPEZ GARCÍA RAMÓN DÍAZ OREJAS MIGUEL ÁNGEL PEÑALVA SOTO ÁNGEL T. MARTÍNEZ FERRER PEDRO GARCÍA GONZÁLEZ CONCEPCIÓN GARCÍA MENDOZA JUAN ANTONIO LEAL OJEDA EDUARDO DÍAZ FERNÁNDEZ Mª ELENA FERNÁNDEZ-TRESGUERRES EDUARDO ESPESO FERNÁNDEZ RAFAEL GIRALDO SUÁREZ ALDO GONZÁLEZ BECERRA MARÍA JESÚS MARTÍNEZ HERNÁNDEZ Mª AUXILIADORA PRIETO JIMÉNEZ MARÍA TERESA SUÁREZ GONZÁLEZ SARA ISABEL PÉREZ PRIETO ALICIA PRIETO ORZANCO SYLVIA RODRÍGUEZ SAINT-JEAN ELOÍSA CANO CONGOSTO MANUEL CARRASCO FERNÁNDEZ Mª AMPARO CERRAJERO HERNÁNDEZ LUIS MANUEL GUAITA BENEIT JESÚS LÓPEZ RAMÍREZ FRANCISCA PILAR MORANTE GONZÁLEZ CONSUELO PARDO ABARRIO ELENA REOYO HERNÁNDEZ Mª MERCEDES SÁNCHEZ CARMONA ANA Mª SERRANO LÓPEZ MARIA JOSÉ TOBAJAS MARTÍN Mª VICTORIA LAFITA TOGORES

211 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds ÁNGEL T. MARTÍNEZ FERRER Jefe de Grupo / Group Leader MªJESÚS MARTÍNEZ HERNÁNDEZ Investigadores de Carrera / Staff Scientists FRANCISCO GUILLÉN CARRETERO Dr. Vinculado / Project Associate Scientist SUSANA CAMARERO FERNÁNDEZ Investigadora contratada Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist PATRICIA FERREIRA NEILA JAVIER RUIZ DUEÑAS Investigadores Contratados / Contract Scientists ANA AGUILAR ARRIETA ANA MARIELA SPERANZA FERNÁNDEZ B. Postdoctorales / Postdoctoral Fellow VÍCTOR BARBA CEDILLO (Desde IX-2004). OLGA CALERO RUEDA ANA ISABEL CAÑAS PORTILLA (Desde XII-2004). DAVID IBARRA TREJO MARIA MORALES ESTEBAN (Desde XII-2003) MARTA PÉREZ BOADA (Hasta XII- 2003) ENRIQUE RODRÍGUEZ SÁNCHEZ ISABEL VALLES ALBERDI ELVIRA ROMERO GUZMÁN B. Predoctorales / Graduate Students Palabras clave: Hongos, Enzimas, Biodegradación, Lignina, Contaminantes Los estudios realizados por nuestro grupo han dado lugar a significativos avances en el conocimiento del sistema enzimático implicado en la degradación de la lignina y otros compuestos recalcitrantes por los hongos. En función de estos resultados, los estudios más recientes se han planteado desde dos puntos de vista diferentes pero complementarios: i) proyectos más básicos, sobre el estudio de relaciones estructura-función de las enzimas 202 JIMMY BERRIO (II-IX, 2004). KATIUSKA GONZÁLEZ (X-XII, 2004). ATEF JAOUANI (IV-VI, 2003) TAHAR MECHICHI (V-VII, 2003) MARIA ISABEL PÉREZ LEBLIC (Desde X-2004). HELA ZOUARI (IX-XII, 2003; X-XII, 2004). Investigadores Visitantes / Visiting Scientists MARÍA JOSÉ TOBAJAS MARTÍN Personal Técnico / Technician Keywords: Fungi, Enzymes, Biodegradation, Lignin, Pollutants Studies carried out by our research group have provided important contributions to the knowledge of the enzymatic system involved in the degradation of lignin and other recalcitrant compounds by fungi. According to these results, the most recent studies have been focused on two different and complementary points of view: i) basic projects on structure-function of the enzymes involved in the biodegradation processes (to improve their catalytic properties); and ii) more applied projects related

212 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds involucradas en los procesos de degradación (con la intención de poder mejorar sus propiedades catalíticas); y ii) proyectos más aplicados, relacionados con el uso de los hongos y sus enzimas en aplicaciones industriales y medioambientales. Los estudios relacionados con los proyectos mencionados, realizados durante el bienio 2003 y 2004, ya finalizados o en curso, se pueden resumir en los siguientes apartados: Metaloenzimas de hongos que oxidan compuestos aromáticos de interés industrial y medioambiental A fin de saber cómo los basidiomicetos ligninolíticos son capaces de degradar compuestos aromáticos recalcitrantes y aprovechar esta información para diseñar nuevos bioprocesos, se definieron los siguientes objetivos: i) Optimizar sistemas de expresión para peroxidasas y lacasas de hongos (para ser utilizados en ingeniería de proteínas y fermentaciones industriales) comparando el replegado de la proteína recuperada a partir de cuerpos bacterianos de inclusión, la expresión mejorada en ascomicetos industriales y el desarrollo de un sistema de expresión en basidiomicetos; ii) caracterizar en términos de relaciones estructura-función algunas de las metaloenzimas más relevantes producidas por los basidiomicetos y, basándose en esta información, mejorar las propiedades catalíticas de algunas de ellas para su aplicación industrial utilizando técnicas de ingeniería de proteínas; iii) desarrollar procesos eficaces de fermentación para la producción de las metaloenzimas más prometedoras usando los sistemas de expresión desarrollados, y evaluar su aplicación industrial en la producción de alimentos, fabricación de papel (como alternativa a procesos contaminantes) y/o otras aplicaciones respetuosas con el medio ambiente. El plan de trabajo incluye las siguientes tareas: i) clonación de peroxidasas y lacasas (para optimización de la expresión, mutagénesis dirigida y fermentación con enzimas recombinantes); ii) Expresión en Escherichia coli y producción de enzima activa (replegado de proteína a partir de los cuerpos de inclusión); iii) expresión de metaloenzimas fúngicas en ascomicetos (utilizando Emericella nidulans como referencia y Aspergillus oryzae para la expresión industrial); iv) Expresión de metaloenzimas en basidiomicetos usando Schizophyllum commune como modelo, con objeto de desarrollar un nuevo modelo de expresión en el basidiomiceto industrial Pycnoporus cinnabarinus v) Aislamiento y caracterización de enzimas relevantes (incluyento the use of fungi and their enzymes in industrial and environmental applications. The studies related to the above projects carried out in the period , already completed or still in course, can be summarized in the following points: Fungal metalloenzymes oxidizing aromatic compounds of industrial and environmental interest In order to understand how ligninolytic basidiomycetes manage to degrade recalcitrant aromatic compounds and to take advantage of this to design new bio-processes the following objectives are defined: i) To optimize an expression systems for fungal peroxidases and laccases (to be used for protein engineering and industrial fermentation) by comparing refolding of protein from bacterial inclusion bodies, improved expression in industrial ascomycetes, and development of a basidiomycete expression system; ii) to characterize in terms of structure-function relationships some of the most relevant metalloenzymes produced by basidiomycetes and, based on the above information, to improve the catalytic properties of some of them for industrial application by protein engineering techniques; and iii) to develop efficient fermentation processes for the production of the most promising metalloenzymes using the expression tools developed, and to evaluate their industrial applicability in food production, paper pulp manufacture (as alternative to contaminating processes) and/or other environmentally-sound applications. The workplan includes the following workpackages: i) Cloning DNA encoding peroxidases and laccases (for optimization of expression, site-directed mutagenesis, and recombinant enzyme fermentation); ii) Expression in Escherichia coli and production of active enzyme (refolding of protein from inclusion bodies); iii) Fungal metalloenzyme expression in Ascomycetes (using Emericella nidulans as a reference and Aspergillus oryzae as a fungal host for industrial expression); iv) Metalloenzyme expression in Basidiomycetes (using Schizophyllum commune as a model to develop a new expression system in the industrial basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus); v) Isolation and characterization of relevant enzymes (including new peroxidase); vi) NMR spectroscopy and crystallographic analysis (to obtain molecular models and structural information on new and recombinant enzymes); vii) Structure-function and protein modification studies (for elucida- 203

213 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds do una nueva peroxidasa); vi) Análisis de espectroscopía de NMR y difracción de rayos X (para obtener modelos moleculares e información estructural sobre las enzimas nuevas y recombinantes); vii) Estudios estructurales y modificación de proteínas (utilizando los sistemas de expresión mas adecuados) y ix) evaluación de la aplicabilidad industrial de las enzimas estudiadas (incluyendo los sectores de alimentación y papel). Este trabajo se realizará en el marco de un proyecto europeo y en colaboración con grupos con experiencia en i) biotecnología (CIB-CSIC, ES, y UHEL, FI); ii) genética de hongos (RuG, NL, e INRA, FR); iii) ingeniería de peroxidasas (USussex, GB) y iv) NMR (UFIR, IT) y difracción de rayos X (ETH, CH); junto con v) dos compañías productoras de enzimas con experiencia en producción de proteínas recombinantes (Frimond, BE, y Novozymes, DK). Este consorcio, con participantes de 8 países miembros de la UE y Suiza, da al proyecto una fuerte dimensión europea. Caracterización de los sitios de unión a sustratos y otros aspectos de la arquitectura molecular de nuevas peroxidasas y oxidasas implicadas en la degradación de lignina y compuestos aromáticos. El paso clave en la biodegradación de la lignina es la oxidación extracelular por H 2 O 2 (generado por oxidasas) catalizada por peroxidasas de alto potencial redox. El proceso presenta interés para oxidar una variedad de compuestos aromáticos. Los solicitantes han clonado, caracterizado y expresado en forma heteróloga dos enzimas que actúan sinérgicamente en el ataque a la lignina por Pleurotus eryngii. Se trata de: i) un nuevo tipo de peroxidasa, que denominamos peroxidasa versátil (VP) por su capacidad para oxidar sustratos típicos de las otras dos peroxidasas ligninolíticas (lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa, con las que comparte 54-61% de secuencia); y ii) una oxidasa, aril-alcohol oxidasa (AAO), que produce H 2 O 2 durante la oxidación de alcoholes aromáticos (con 34% de identidad de secuencia con la glucosa oxidasa de Aspergillus niger). El objetivo del proyecto es conocer su estructura molecular, con especial atención a los sitios de unión a sustratos, utilizando diferentes técnicas (incluyendo mutagénesis dirigida, difracción de rayos-x, 1 H-NMR, MALDI-TOF, modelado molecular, dicroismo circular, biosensor óptico y stopped flow ). Para la obtention of key aspects of enzyme catalysis and production of improved variants); viii) Fermentation technology for metalloenzyme production (using the most adequate host systems); and ix) Evaluation of the industrial application of the enzymes studied (including food and pulp-paper sectors). Because of high multi-disciplinarity required, the project consortium includes groups with expertise in: i) biotechnology (CIB-CSIC, ES; and UHEL, FI); ii) fungal genetics (RuG, NL; and INRA, FR); iii) peroxidase engineering (USussex, GB); and iv) protein NMR (UFIR, IT) and X-ray diffraction analyses (ETH, CH); together with v) two enzyme-producing companies with experience in recombinant protein production (Frimond, BE; and Novo Nordisk, DK). The above consortium (with partners from eight EU members and Switzerland) gives the proposal a strong European dimension. Study of substrate binding sites and other aspects of the molecular architecture of novel peroxidases and oxidases involved in degradation of lignin and aromatic compounds Extracellular oxidation by H 2 O 2 (generated by oxidases) in a reaction catalyzed by high redox potential peroxidases is a key step in lignin biodegradation. The process has interest for oxidation of a variety of aromatic compounds. The applicants have cloned, characterized, and expressed in heterologous systems two enzymes that act synergistically in lignin attack by Pleurotus eryngii. These enzymes are: i) a novel per oxidase type, we called versatile peroxidase (VP) due to its ability to oxidize typical substrates of the two other ligninolytic peroxidases (i.e. lignin peroxidase and manganese peroxidase, sharing 54-61% sequence with VP); and ii) an oxidase, aryl-alcohol oxidase (AAO) producing H 2 O 2 from oxidation of aromatic alcohols (sharing 34% sequence with Aspergillus niger glucose oxidase). The objective of the project is to establish their molecular architecture, with special emphasis on the substrate binding sites using different techniques (such as site-directed mutagenesis, X- ray diffraction, 1H-NMR, MALDI-TOF, molecular modeling, circular dichroism, optical biosensor, and stopped flow). Recombinant VP (VP*) will be expressed in Escherichia coli followed by optimized in vitro folding, while AAO* will be initially produced in Emericella nidulans. Crystallization conditions have been obtained for both enzymes, therefore, crystal 204

214 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds ción de VP recombinante (VP*) se utilizará la expresión en Escherichia coli y replegado in vitro (ya optimizado), mientras que la AAO* será inicialmente obtenida en Emericella nidulans. Existen ya condiciones de cristalización para ambas proteínas por lo que se espera disponer en breve de modelos cristalográficos. En el caso de la VP, se pretende además: i) confirmar el papel de los tres residuos ácidos que constituirían el sitio de unión de Mn 2+ junto al propionato interno del hemo (propuesto a partir de los primeros modelos moleculares y resultados de mutagénesis); ii) identificar los sitios implicados en la oxidación de sustratos aromáticos, incluyendo posibles rutas de transferencia electrónica de largo rango (una de ellas a partir de un Trp superficial) u oxidación directa en el canal de hemo; y iii) modular la actividad sobre diferentes sustratos mediante modificación de los correspondientes sitios de unión. En el caso de la AAO, se plantea: i) identificar los residuos catalíticos (incluyendo dos histidinas junto al anillo de flavina) y el mecanismo de catálisis; y ii) definir la arquitectura de su bolsillo de unión a sustratos que es capaz de unir eficazmente alcoholes poli-insaturados con estructuras moleculares muy diferentes. Nuevos métodos respetuosos con el medioambiente para el control del "pitch" en diferentes procesos de fabricación de papel El primer objetivo es desarrollar métodos respetuosos con el medio ambiente para el control del pitch durante la fabricación de papel basados en: i) el estudio de los extraíbles de la madera durante la fabricación de pasta kraft de eucalipto y pasta TMP de Picea, y la identificación de los compuestos responsables de los depósitos de pitch ; ii) cepas de hongos seleccionadas capaces de eliminar los extraíbles de ambos tipos de madera; iii) nuevas enzimas (nativas o modificadas) capaces de degradar los compuestos en las pastas o en los líquidos de proceso y iv) métodos físico-químicos mejorados para eliminar el pitch o disminuir su depositabilidad. El segundo objetivo es desarrollar los anteriores métodos a escala piloto incluyendo: i) optimización del crecimiento fúngico y formulación de inóculos; ii) protocolos optimizados para la producción de las nuevas enzimas desarrolladas., iii) combinación de tratamientos enzimáticos y físico-químicos; iv) pasteo y blanqueo a escala piloto; v) análisis de las ventajas de los nuevos procesos en términos de eliminación de extraíbles, depositabilidad del pitch, parámemodels could be soon available. VP studies will also include. i) confirmation of the role of three acidic residues forming a Mnbinding site near the internal propionate of heme (postulated from the first models and mutagenesis results); ii) identification of the sites involved in oxidation of aromatic substrates, including electron transfer pathways (one of them from an exposed Trp) or direct oxidation at the heme channel; and iii) modulate the activity on different substrates by modifying the corresponding binding sites. In the case of AAO, we plan: i) to identify the residues involved in catalysis (including two histidines near the flavin ring) and the corresponding mechanism; and ii) to establish the architecture of the substrate pocket taking into account that it is able to bind efficiently alcohols with very different molecular structures New environmentally-sound methods for pitch control in different paper pulp manufacturing processes To design environmentally-sound methods for pitch control during manufacture of selected paper pulps based on: i) previous balance of extractive-derived compounds during manufacturing of eucalypt Kraft pulp and spruce TMP pulp, and identification of compounds responsible for pitch deposition; ii) selected fungal strains removing extractives from both wood types; iii) new (native or engineered) enzymes being able to degrade target compounds in pulps or liquids; and iv) improved physicochemical methods to remove pitch or decrease depositability. To develop the above pitch control methods at a pilot scale including: i) fungal growth optimization and formulation of inocula to treat wood; ii) optimized protocols for production of the new enzymes developed; iii) combined enzymaticphysicochemical treatments; iv) pilot-scale pulping and bleaching including the above optimized treatments; v) analysis of advantages of the new processes in terms of extractive removal, pitch depositability, pulp and process parameters, and effluent toxicity; and vi) evaluation of their commercial interest for different raw materials, pulping processes and world markets. The work plan established includes studies on wood extractive compounds to show how they are chemically-modified or degraded in the course of the pulp manufacturing processes, which of them survive pulping and bleaching, how colloidal pitch stability and depositability are modified, and what are the main compounds responsible for the formation of deposits as 205

215 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds tros de proceso y toxicidad de los efluentes; vi) evaluación del interés comercial para diferentes materias primas, procesos de fabricación y mercados mundiales. El plan de trabajo incluye estudios sobre los compuestos extraíbles con objeto de saber cómo son modificados químicamente durante la fabricación de pasta, cuáles sobreviven en los procesos de pasteo y blanqueo, cómo se modifican la estabilidad y depositabilidad del pitch coloidal y cuáles son los principales compuestos responsables de los depósitos y las reacciones implicadas en su formación. Se desarrollarán tratamientos biológicos para reducir la formación de depósitos y obtener ventajas adicionales (ambientales o de proceso). Se investigarán hongos seleccionados y se optimizará la inoculación y condiciones de tratamiento (para maderas de eucalipto y Picea) comparados con CartapipTM. Estos estudios incluirán experimentos de pasteo/blanqueo para evaluación de las propiedades de cocción, refinado y fabricación de papel, producción de inóculos microbianos y el tratamiento de la madera a escala piloto. El uso de enzimas ofrece ventajas adicionales para el control del pitch al poder incluirlas en diferentes fases del proceso. Actualmente, la ResinaseTM y otras lipasas se están comercializando para el proceso de tratamiento del pitch. Sin embargo éstas son de poca utilidad en muchos procesos de fabricación de pasta de papel ya que su acción de limita a los glicéridos, que en muchos casos no son los principales responsables de los depósitos. Para ampliar el potencial de los tratamientos enzimáticos para el control de pitch se explorarán dos alternativas: i) la búsqueda de nuevas enzimas en hongos que degraden eficazmente los extraíbles del eucalipto y la Picea (utilizando compuestos sencillos, pitch sintético y otros sustratos); y ii) mejorando las enzimas industriales ya conocidas mediante las herramientas proporcionadas por la ingeniería genética. Finalmente varios métodos físico-químicos mejorados para el control del pitch, basados en la flotación por aire disuelto y la ultrafiltración serán investigados y se evaluará su complementariedad con los tratamientos biológicos. El proyecto incluye grupos con experiencia en microbiología, biotecnología, ingeniería y química; centros técnicos y compañías de biotecnología y producción de papel, de 5 países europeos. well as the main reactions and mechanisms involved. Then, biological treatments will be developed with the aim of reducing deposit formation and obtaining additional environmental or process improvements. Selected fungal strains will be investigated and optimized inoculation and treatment conditions (for both eucalypt and spruce wood) defined at the laboratory scale (compared with CartapipTM). These studies will include pulping/bleaching experiments for evaluation of cooking, refining and papermaking properties, the subsequent production of microbial inocula, and the treatment of wood at pilot-scale. The use of enzymes offers additional advantages for pitch control due to the possibility of including them at different stages of pulping and bleaching. Currently, ResinaseTM and other lipases are being commercialized for pitch control. However, they are of limited utility in many pulping processes because their action is limited to glycerides, which in many cases are not the main responsible for pitch deposition. In order to expand the potential of enzymatic treatments for pitch control, two alternatives will be explored based on: i) the search for new enzymes in fungi efficiently-degrading eucalypt and spruce extractive compounds (using simple target compounds, "synthetic pitch" and other substrates); and ii) enlarging the potential of the already-known industrial enzymes for pitch control by the use of tools provided by the genetic engineering. Finally, several improved physicochemical methods for the control of pitch deposition based on dissolved-air flotation and ultrafiltration technologies, and their complementarity with the biological ones will be investigated. The project includes academic groups with expertise in microbiology, biotechnology, engineering and chemistry, technical centers, and biotechnology and paper pulp-producing companies, from 5 EU countries. Molecular characterization and expression of a new esterase involved in pitch biocontrol. Role of ligninolytic peroxidases in the degradation of esterase hydrolysis products We propose to perform the molecular characterization of a new fungal esterase and to study its possible application, in cooperation with ligninolytic peroxidases, in the degradation of lipophilic compounds causing pitch deposits in pulp and paper manufacture. The esterase to be used in this project is a newly characterized enzyme from the ascomycete Ophiostoma piceae. This enzyme is able to hydrolyze both triglycerides and sterol 206

216 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds Caracterización molecular y expresión de una nueva esterasa relacionada con el control biológico del pitch. Papel de las peroxidasas ligninolíticas en la degradación de los productos de hidrólisis de la esterasa. Se propone realizar la caracterización molecular de una nueva esterasa fúngica para su posible aplicación, junto con una peroxidasa ligninolítica, en la degradación de compuestos lipofílicos de la madera que participan en la formación de depósitos indeseables en las pastas de papel ( pitch ). La esterasa, producida por el ascomiceto Ophiostoma piceae, es capaz de hidrolizar triglicéridos y ésteres de esteroles. Estos compuestos están presentes tanto en los extraíbles de la madera de frondosas como en los de coníferas y se encuentran en los depósitos de las pastas. Por otro lado, la peroxidasa producida por el basidiomiceto Pleurotus eryngii, es un nuevo tipo de enzima ligninolítica, con una amplia especificidad de sustrato, que podría disminuir los problemas de pitch degradando los productos de hidrólisis de la esterasa a través de su peroxidación. Ambas enzimas han sido caracterizadas por nuestro grupo de trabajo en el CIB. Además la peroxidasa ha sido clonada y expresada y en la actualidad su producción en biorreactores está siendo optimizada. El presente proyecto incluye: i) la clonación y secuenciación de la esterasa de O. piceae y la comparación de su secuencia con la de otras esterasas y lipasas descritas; ii) la expresión de la esterasa en sistemas utilizados para la producción industrial de enzimas fúngicas; iii) el estudio de las propiedades cinéticas de las enzimas recombinantes y su comparación con las de la enzima nativa y otras esterasas y lipasas comerciales; iv) la optimización de la producción de las esterasas (enzima nativa y recombinantes); v) la evaluación de la capacidad de la peroxidasa ligninolítica de P. eryngii de degradar, vía peroxidación, los ácidos grasos y esteroles libres producidos por la esterasa al hidrolizar los triglicéridos y ésteres de esteroles; vi) la evaluación de los tratamientos enzimáticos con esterasa y peroxidasa en la degradación de pitch en pastas de diferentes maderas (coníferas y frondosas) y en aguas de proceso; y vii) la evaluación de las propiedades de las pastas tras el tratamiento enzimático. La posible aplicación de estas esterasas y peroxidasas en el proceso de fabricación de la pasta podría mejorar su calidad y reducir las pérdidas económicas causadas por el pitch en la industria papelera. esters. These lipophilic compounds are present in both softwood and hardwood. Pleurotus eryngii peroxidase is a new ligninolytic enzyme with a wide substrate specificity and could cooperate to decrease the pitch problem by degrading the reaction products of esterase hydrolysis via lipid peroxidation. Both enzymes were isolated and characterized by us in the CIB. The peroxidase has been cloned and expressed and its production is being currently optimized in bioreactors. The present project includes: i) Cloning and sequencing the esterase from O. piceae and comparison with other lipases and esterases previously reported; ii) the expression of this new esterase in organisms used for industrial enzyme production; iii) the study of the properties of the recombinant enzymes comparing them to those of the native enzyme and other commercial lipases and esterases; iv) the optimization and scale up production of native and recombinant esterases; v) the evaluation of P. eryngii peroxidase in the degradation, via peroxidation, on the fatty acids and free sterols produced by esterase hydrolysis of triglycerides and sterol esters; vi) the treatment of softwood and hardwood pulps and water process with esterases and peroxidases and vi) evaluation of the enzymatic treatments on the properties of pulps. The application of esterases and peroxidases in the pulp and paper manufacture process could improve the pulp quality and reduce the economic loss caused by pitch in paper pulp industries. Study of new fungi and their enzymes for applications in the degradation of compounds causing environmental problems The use of ligninolytic enzymes, laccases and peroxidases, in the industrial process of paper manufacture is related to the possibility to apply biotechnological process (green technologies) for removing lignin, or its derived products, in the process, including bleaching free of chloride compounds. The enzymatic treatment could be used as an alternative to the traditional chemical methods, very contaminant principally by the presence of chlorinated compounds in the effluents, contributing to reduce the environmental impact caused by paper companies. Although some peroxidases have a high redox potential, being able to oxidize phenolic and non phenolic compounds, the use of oxygen (as electron acceptor) made laccases more suitable enzymes for industrial applications. The use of laccases in paper pulp manufacture is being studied from different aspects: i) The ability of laccases to degrade phenolic and non-phenolic com- 207

217 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds Estudios relacionados con la búsqueda de nuevos hongos y enzimas para su aplicación en la degradación de compuestos que causan problemas medioambientales El uso de enzimas ligninolíticas, lacasas y peroxidasas, en el proceso de fabricación de pasta de papel está relacionado con la posibilidad de desarrollar procedimientos biotecnológicos (tecnologías limpias) para la eliminación de la lignina, o productos derivados de ésta, en los procesos de fabricación de pasta, incluyendo su blanqueo libre de cloro. El tratamiento enzimático podía ser utilizado como una alternativa a los métodos químicos tradicionales, fuertemente contaminantes principalmente por la liberación de clorofenoles y otros productos cloroaromáticos en los efluentes, contribuyendo a reducir el impacto ambiental generado por estas empresas. Aunque las peroxidasas presentan un alto potencial redox, siendo algunas de estas enzimas capaces de oxidar compuestos aromáticos no fenólicos, la utilización de oxígeno (como aceptor de electrones) por las lacasas hace a estas enzimas más adecuadas para posibles aplicaciones industriales. El uso de lacasas en la fabricación de pasta de papel se está abordando siendo los objetivos inmediatos: i) estudiar la capacidad de las lacasas para degradar compuestos fenólicos y no-fenólicos (estos últimos en presencia de mediadores de bajo peso molecular, ii) la búsqueda de mediadores naturales que sean más baratos y menos perjudiciales para el medioambiente, iii) la aplicación de estas enzimas para deslignificación y blanqueo de pasta de papel y iv) su posible aplicación en el proceso industrial. Dada la inespecificidad del sistema enzimático producido por estos hongos, a la caracterización de nuevas enzimas con alto potencial redox y a la semejanza entre la estructura de los productos que provienen de la degradación de la lignina con algunos compuestos aromáticos que provocan graves problemas de contaminación ambiental, también estas enzimas podrían aplicarse para degradar compuestos aromáticos recalcitrantes presentes en efluentes industriales (colorantes presentes en efluentes de la industria textil y residuos procedentes de la fabricación del aceite de oliva). En la actualidad están vigentes dos proyectos de colaboración con Túnez y Cuba para: i) buscar nuevos microorganismos para degradar estos compuestos, ii) caracterizar el sistema enzimático involucrado en la degradación, iii) estudiar la degradación enzimática de compuestos pounds (the latter in presence of low molecular mass compounds as mediators); ii) the study of new natural mediators cheaper and less problematic for the environment; iii) bleaching of paper pulp with laccases and its effects in pulp properties and iv) possible application in the industrial process. Taking into account the unspecificity of the enzymatic system secreted by these fungi, the characterization of new enzymes and the similar structure of lignin products and some aromatic recalcitrant compounds causing environmental problems, we also are studying the role of ligninolytic enzymes in the degradation of problematic aromatic compounds present in industrial effluents (dyes form textile industry and aromatic compounds present in olive oil mill wastewaters). At the moment we have 2 collaboration projects with Cuba and Túnez to: isolate new fungi able to degrade recalcitrant aromatic compounds, ii) characterize the enzymatic system involved in the biodegradation process, iii) study the enzymatic degradation of model compounds and iv) check the efficiency of the enzymatic treatment in industrial effluents. This line also includes the study on the biological alteration of a compact disk (CD) carried out in collaboration with the Museum of Natural Sciences of CSIC. This CD-audio was found in Belize, a small country between Mexico and Guatemala, and showed evident symptoms of progressive biodeterioration. The fungus isolated from this CD is able to reproduce the degradation pattern of the original CD. The objectives of this work are: to study the degradation of the polycarbonate and the other CD components by the isolated fungus, ii) to study the enzymatic system secreted by this fungus, and other related strains, iii) to study the biotechnological applications of this fungus and other fungi for biodegradation/recycling of plastic materials. 208

218 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds modelo y iv) comprobar la eficiencia de las enzimas en efluentes industriales. Esta línea de trabajo se encuadra también el estudio de la alteración biológica de discos compactos (CD) en colaboración con el Museo Nacional de Ciencias Naturales del CSIC. El estudio se inició con un CD-audio encontrado en Belice, un pequeño país tropical situado entre Méjico y Guatemala, que presentaba síntomas de biodegradación progresiva. El hongo aislado de este CD reproduce in vitro un patrón de degradación similar al encontrado en el CD biodeteriorado en Belice. Los estudios en curso incluyen. i) comprobar si este hongo es capaz de degradar el policarbonato y/o el resto de los materiales que componen estos soportes informáticos, ii) comprobar si otros hongos, filogenéticamente relacionados son capacidades de hacerlo, ii) estudiar el sistema enzimático de estos hongos implicado en la degradación de compuestos aromáticos y el policarbonato e iii) investigar otras posibles aplicaciones biotecnológicas de estos hongos en la biodegradación/reciclado de materiales los diferentes componentes de los CD. Organismos Financiadores/Funding Agencies V PM UE-Agricultura Sostenible, QLK ( ) V PM UE-La Fábrica Celular, QLK ( ) CAM-Contrato Programa-Genómica Proteómica ( ) Grupo empresarial ENCE, Contrato ENCE-CSIC ( ) MCyT, BIO ( ) RI, Cooperación con Cuba, Ref. 2003CU0013, ( ). RI, Cooperación con Túnez, Ref 31p/02 ( ) MCyT, BIO ( ) MEC, BIO ( ) Agrenvec, Contrato Agrenvec-CSIC, ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Marta Pérez Boada. Expresión heteróloga y estudios estructura-función de una nueva peroxidasa versátil de Pleurotus eryngii, Universidad Complutense de Madrid, Julio Director: A.T. Martínez 209

219 Biodegradación de la Lignina y Compuestos Recalcitrantes / Biodegradation of Lignin and Recalcitrant Compounds Ana Mariela Speranza. Hongos de la podredumbre blanca: Deslignificación y control del pitch en Eucalyptus globulus, Facultad de Ciencias de la Universidad de la República (Uruguay), August 2003, Directoras: M.J. Martínez y L. Bettucci. Patricia Ferreira Leila. Estudios estructura-función sobre la enzima aril-alcohol oxidasa implicada en la biodegradación de la lignina. Facultad de Biología, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Junio 2004, Director: A.T. Martínez Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Banci, L., Camarero, S., Martínez, A.T., Martínez, M.J., Pérez-Boada, M., Pierattelli, R., and Ruiz-Dueñas, F.J. (2003). NMR study of Mn(II) binding by the new versatile peroxidase from the white-rot fungus Pleurotus eryngii. J. Biol. Inorg. Chem. 8, De las Heras, A., Patiño, B., Posada, M.L., Martínez, M.J., Vázquez, C., and González-Jaén, M.T. (2003). Characterization and in vitro expression patterns of an exopolygalacturonase encoding gene from Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici. J. Appl. Microbiol. 94, García, O., Camarero, S., Colom, J., Martínez, A.T., Martínez, M.J., Monje, R., and Vidal, T. (2003). Optimization of a laccasemediator stage for TCF bleaching of flax pulp. Holzforschung 57, Calero-Rueda, O., Gutiérrez, A., del Río, J.C., Prieto, A., Plou, F.J., Ballesteros, A., Martínez, A.T., and Martínez, M.J. (2004). Hydrolysis of sterol esters by an esterase from Ophiostoma piceae: Application for pitch control in pulping of Eucalyptus globulus wood. Intern. J. Biotechnol. 6, Camarero, S., García, O., Vidal, T., Colom, J., del Río, J.C., Gutiérrez, A., Gras, J.M., Monje, R., Martínez, M.J., and Martínez, A.T. (2004). Efficient bleaching of non-wood high-quality paper pulp using laccase-mediator system. Enzyme Microb. Technol. 35, Del Río, J. C., Gutiérrez, A., and Martínez, A.T. (2004). Identifying acetylated lignin units in non-wood fibers using pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18, Ibarra, D., del Río, J.C., Gutiérrez, A., Rodríguez, I.M., Romero, J., Martínez, M.J., and Martínez, A.T. (2004). Isolation of highpurity residual lignins from eucalypt paper pulps by cellulase and proteinase treatments followed by solvent extraction. Enzyme Microb. Technol. 35, Lú-Chau, T.A., Ruiz-Dueñas, F.J., Camarero, S., Feijoo, G., Martínez, M.J., Lema, J.M., and Martínez, A.T. (2004). Effect of ph on the stability of Pleurotus eryngii versatile peroxidase during heterologous production in Emericella nidulans. Bioprocess. Biosyst. Eng 26, Rodríguez, E., Nuero, O., Guillén, F., Martínez, A.T., and Martínez, M.J. (2004). Degradation of phenolic and non-phenolic aromatic pollutants by four Pleurotus species: the role of laccase and versatile peroxidase. Soil Biol. Biochem. 36, Contribuciones a Libros/Contributions to Books Gutiérrez, A., del Río, J.C., and Martínez, A.T. (2003). Chemical analysis and biological removal of wood lipids forming pitch deposits in paper pulp manufacturing In J.F.T. Spencer (ed.), Protocols in Environmental Microbiology. Chapter 19. Humana Press, Totowa, USA. 210

220 Bioquímica de Hongos Biochemistry of Fungi CONCEPCIÓN GARCÍA MENDOZA Jefe de Grupo / Group Leader Investigadora de Carrera / Staff Scientist MONIQUE NOVAES-LEDIEU Investigadora Emérita / Emeritus Scientist AMELIA PÉREZ CABO Doctora Vinculada / Associated Scientist DOLORES BERNARDO LÓPEZ B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow Mª AMPARO CERRAJERO HERNÁNDEZ (Desde I-2004). Personal Técnico / Technician Palabras clave: Micoparasitismo, Pared celular, Agaricus bisporus, Verticillium fungicola, Fungicida Procloraz-Mn, Substratos de cultivo Mecanismos celulares y moleculares del micoparasitismo de Verticillium fungicola sobre los cultivos industriales de Agaricus bisporus (champiñón) La verticiliosis o "mole seca" de los cultivos industriales de champiñón está producida por el hongo hifomiceto Verticillium fungicola, que parasita los carpóforos del hongo superior basidiomiceto Agaricus bisporus pero no su correspondiente micelio vegetativo. Estudios realizados en este laboratorio han puesto de manifiesto las diferentes estructuras químicas de las paredes celulares de las hifas del micelio agregado de los carpóforos de A. bisporus y de las paredes celulares del correspondiente micelio vegetativo. Hemos estudiado también paralelamente la estructura química de las paredes celulares del micoparásito V. fungicola. Igualmente hemos puesto de manifiesto que V. fungicola sintetiza in vitro las enzimas necesarias para degradar ambas clases de paredes celulares de A. bisporus, mientras que Keywords: Mycoparasitism, Cell wall, Agaricus bisporus, Verticillium fungicola, Fungicide Prochloraz-Mn, Cultivation substrates Cellular and molecular mechanisms of the Verticillium fungicola mycoparasitism on the Agaricus bisporus industrial cultures (cultivated mushroom) The verticillium disease or "dry bubble" of the cultivated mushroom is caused by the fungus hyphomycete Verticillium fungicola, which parasitizes the higher fungus basidiomycete Agaricus bisporus fruit bodies, but does not parasitize the corresponding vegetative mycelium. Studies carried out in this laboratory have shown the different hyphal wall chemical structure of the aggregated mycelium of the A. bisporus fruit bodies and that of the vegetative mycelium. In parallel we also studied the chemical structure of the cell walls of the mycoparasite V. fungicola. We have also proved that V. fungicola synthesized in vitro the necessary enzymes to degrade both kinds of A. bisporus cell walls, whereas the mycopathogen was only able to digest in vivo the aggregated hyphal walls of fruit bodies. 211

221 Bioqímica de Hongos / Biochemistry of Fungi solo es capaz de digerir in vivo las paredes celulares de las hifas agregadas del carpóforo. Nuestros estudios más recientes han podido demostrar que las hidrofobinas, proteínas estructurales presentes en las tres clases de paredes celulares descritas, son las responsables junto con el mucílago de los dos tipos de paredes celulares de A. bisporus, de la adhesión inespecífica que se produce entre ambos hongos, micopatógeno y hospedador. Seguidamente también hemos podido demostrar que la proteína lectina, presente únicamente en el micelio agregado de los carpóforos de A. bisporus, es la responsable del reconocimiento y unión específicos de este último micelio con las paredes celulares del micoparásito V. fungicola, gracias a su polisacárido glucogalactomanano, siendo ambas etapas de adhesión inespecífica y reconocimiento específico los mecanismos previos necesarios para el desarrollo de la degradación enzimática que se produce a lo largo de la micosis. Efecto del fungicida Procloraz-Mn sobre las paredes celulares del micoparásito Verticillium fungicola y de su hospedador Agaricus bisporus El fungicida Procloraz-Mn es utilizado rutinariamente en los cultivos industriales de champiñón Agaricus bisporus para controlar la verticiliosis o "mole seca" producida por Verticillium fungicola, que ocasiona cuantiosas pérdidas económicas en el sector. Nuestros estudios previos sobre los mecanismos celulares y moleculares de dicha patogénesis han mostrado el importante papel desempeñado por las paredes celulares tanto del micopatógeno (V. fungicola) como del hospedador (A. bisporus). Por todo ello y dado el uso intensivo del citado fungicida en los cultivos industriales de champiñón, el estudio del efecto que produce el Procloraz-Mn sobre la estructura de las paredes celulares de ambos organismos complementa los estudios que estamos llevando a cabo en paralelo para tratar de controlar la enfermedad. Los resultados obtenidos apuntan a la inhibición parcial de la síntesis de proteínas de las paredes celulares de V. fungicola, junto con una modificación también parcial de ciertos componentes polisacarídicos (los glucanos y particularmente los glucogalactomananos) de estas mismas paredes celulares. Al mismo tiempo el fungicida también afecta a la estructura química de las paredes celulares del hospedador A. bisporus, dado que igualmente se trata de otro hongo, aunque más evolucionado, pero en este caso las modificaciones químicas estructurales de Our more recent studies have demonstrated that the hydrophobins, structural proteins present in the three types of described cell walls, are responsible along with the mucilage present in both kinds of A. bisporus cell walls of the unspecific adhesion produced between both microorganisms, mycopathogen and its host. Successively we also have demonstrated that the protein lectin, which is only present in the aggregated mycelium of the A. bisporus fruit bodies, is responsible for the specific recognition and union of this mycelium with V. fungicola cell walls by means of their polysaccharide glucogalactomannan. Therefore both steps, unspecific adhesion and specific recognition, are previous necessary mechanisms to further mycosis development which finally leads to the mushroom necrosis. Effect of the fungicide Prochloraz-Mn on the cell walls of the mycoparasite Verticillium fungicola The fungicide Prochloraz-Mn is routinarily used in industrial cultures of the mushroom Agaricus bisporus to control the verticillium disease or "dry bubble" caused by Verticillium fungicola, which creates heavy economic losses caused in the sector. Preliminary studies on the cellular and molecular mechanisms of such pathogenesis have shown the important role played, not only by the cell walls of the the mycopathogen (V. fungicola), but also by those of the host (A. bisporus). For this reason and due to the intensive use of the cited fungicide in the mushroom industrial cultures, the study of the effect produced by Prochloraz-Mn on the cell wall structure complements the studies carried out trying to control the disease. The results obtained point out a partial inhibition of cell wall protein synthesis in V. fungicola, as well as a partial modification of certain polysaccharide components (the glucans and particularly the glucogalactomannans) in the same cell walls. At the same time the fungicide also affects the chemical structure of the host A. bisporus cell walls, as it deals with another more evolucionated fungus, but in this case the modifications in the chemical structure of the corresponding walls only appear in certain glucan fractions. 212

222 Bioqímica de Hongos / Biochemistry of Fungi las correspondientes paredes celulares aparecen únicamente en ciertas fracciones polisacarídicas glucánicas. Caracterización de la calidad de los substratos para el cultivo de hongos superiores comestibles mediante diferentes parámetros microbiólogicos y bioquímicos Los substratos sobre los que se desarrollan los hongos superiores comestibles están compuestos básicamente por subproductos lignocelulósicos, adicionados, en algunos casos, con otros componentes orgánicos más ricos en nitrógeno. Los substratos utilizados para el cultivo de Agaricus bisporus (champiñón) requieren un proceso de compostaje o fermentación en estado sólido que, tradicionalmente, ha constado de una Fase I de fermentación libre y una Fase II de fermentación controlada. Por el contrario el cultivo de Pleurotus utiliza substratos poco fermentados, pero generalmente controlados mediante pasteurización. Cada uno de estos procesos debe contar con unos marcadores microbiológicos y/o bioquímicos con el fín de proporcionar unos substratos con una calidad contrastada y repetitiva. Como marcadores microbiológicos de los substratos de A. bisporus se está evaluando en la Fase II la presencia de distintos hongos termófilos y particularmente de Scytalidium termophilum, y en relación con los substratos de Pleurotus se consideran marcadores específicos las bacterias Bacillus subtilis y B. liqueniformis. Entre los marcadores bioquímicos de ambos tipos de sustratos hemos determinado, junto con los azúcares neutros totales, la presencia de los disacáridos de glucosa, xilosa y manosa (celobiosa, xilobiosa y manobiosa respectivamente). Characterization of the quality of the substrates for edible higher fungi cultivation by means of different microbiological and biochemical parameters The substrates utilized for the cultivation of edible mushrooms are mainly composed of lignocellulosic by-products, in some cases activated by other richer nitrogenous components. The substrates for Agaricus bisporus (mushroom) cultivation require a composting or solid state fermentation process that traditionally consists of Phase I (free fermentation) and Phase II (controlled fermentation). On the contrary the Pleurotus cultivation utilizes few fermented substrates although generally controlled by means of pasteurization. Each one of these processes should show some microbiological and/or biochemical markers in order to repeatedly supply quality controlled substrates. As microbiological markers of Phase II in A. bisporus substrates the presence of certain termophilic fungi (particularly Scytalidium termophilum) have been determined, while in Pleurotus substrates the bacteria Bacillus subtilis and B. liqueniformis are considered to be the specific markers. Among the biochemical markers in both kinds of substrates the total neutral sugars and the presence of the disaccharides of glucose, xylose and mannose (cellobiose, xylobiose and mannobiose respectively) have been evaluated. 213

223 Bioqímica de Hongos / Biochemistry of Fungi Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, AGL ( ). Comunidad de Castilla-La Mancha, 188/CH-51 ( ) CICYT, REN ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Mª Dolores Bernardo López. Bases celulares y moleculares de la verticiliosis (producida por Verticillium fungicola) de los cultivos industriales de champiñón (Agaricus bisporus) y efecto del fungicida Procloraz-Mn. Universidad Complutense de Madrid, Abril Directora: C. García Mendoza. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Bernardo, D., Pérez Cabo, A., Novaes-Ledieu, M., and García Mendoza, C. (2004). Verticillium disease or dry bubble of cultivated mushrooms: The Agaricus bisporus lectin recognizes and binds the Verticillium fungicola cell wall glucogalactomannan. Can. J. Microbiol. 50, Bernardo, D., Pérez Cabo, A., Novaes-Ledieu, M., Pardo, J., and García Mendoza, C. (2004). Comparative effect produced by the fungicide Prochloraz-Mn on Agaricus bisporus vegetative-mycelium and fruit-body cell walls. Int. Microbiol. 7, Contribución a libros/contribution to books García Mendoza, C., Bernardo, D., Pérez Cabo, A. y Novaes-Ledieu, M. (2003). Mechanisms involved in the Verticillium fungicola mycoparasitism on Agaricus bisporus fruit bodies: Verticillium disease or dry bubble of cultivated mushrooms. In: Recent Research Developments in Microbiology, Research Signpost, Kerala, India, Vol. 7, Part I, pp García Mendoza, C., Bernardo, D., Pérez Cabo, A. y Novaes-Ledieu, M. (2004). Bioquímica del empleo de Procloraz-Mn: Modificaciones estructurales en las paredes celulares de los micelios de Agaricus bisporus y Verticillium fungicola inducidas por el fungicida. En: Avances en la tecnología de la producción comercial del champiñón y otros hongos cultivados. Patronato de Promoción Económica. Diputación Provincial de Cuenca, pp

224 Virología en Acuicultura Virology in Fish-Aquaculture SARA ISABEL PÉREZ PRIETO Jefe de Grupo / Group Leader SYLVIA RODRÍGUEZ SAINT-JEAN Investigadoras de Carrera / Staff Scientists LUIS MANUEL GUAITA BENEIT Mª MERCEDES SÁNCHEZ CARMONA Personal Técnico / Technicians CAROLINA TAFALLA PIÑEIRO (Desde VI-2004). Investigadora Visitante / Visiting Scientist Palabras clave: Virus de peces, IPNV, IHNV, Proteínas antivíricas, MX, Coinfecciones Inducción de proteínas antivíricas en salmónidos y estudio de su actividad frente a cepas de distinta virulencia Los estudios sobre factores moleculares de virulencia y resistencia natural a la infección por virus, son frecuentes en mamíferos y aves pero solo recientemente se han iniciado en peces teleósteos. El objetivo de este proyecto es determinar la inducción, producción y actividad de proteínas antivíricas en Salmónidos y las interacciones entre estas proteínas y cepas de virus virulentas o atenuadas. Estas proteínas son componentes importantes de la respuesta antivírica y forman la primera línea de defensa frente a las infecciones por virus, pero no está definido su modo de acción. En este proyecto se han desarrollado tres objetivos: I) Analizar comparativamente secuencias de nucleótidos del segmento A del genoma del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), en cepas de distinta virulencia. Keywords: Fish viruses, IPNV, IHNV, Virulence, Interferon, Antiviral proteins, Mx, Dual-infections. Induction of antiviral proteins in Salmonid fish and study of their actvity against virus strains of different virulence Research on molecular aspects of viral virulence and the natural resistance to viral infections are frequent in mammals and birds, but their study on fish has been recently started. The aim of this project is to determine the induction, expression and activity of antiviral proteins in Salmonid fish, and the interaction between these proteins and virulent or attenuated viral strains. The Mx proteins are important components of the antiviral response and form the first line of the body's defence against viral infections in mammals, but the antiviral function of the trout Mx proteins has not been satisfactorily established. The main objectives of the project were: I) To analyse comparatively the nucleotide sequences of genome A from IPNV strains of different virulence, in order to define molecular markers for virulence. 215

225 Virología en Acuicultura / Virology in Fish-Aquaculture II) Estudiar la inducción de proteínas Mx en trucha arco-iris (Oncorynchus mykiss) y trucha común (Salmo trutta fario), su producción en diversos órganos y su actividad frente a aislados de IPNV de distinta virulencia. III) Determinar la modulación de la cinética de una coinfección IPNV-IHNV inducida por interferón y proteína Mx. Diseño de métodos inmunológicos y moleculares para el diagnóstico precoz de infecciones producidas por el virus de linfocistis en los cultivos de doradas (Sparus aurata, L) En colaboración con el Dr. Juan José Borrego (Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga), se han diseñado métodos diagnósticos basados en técnicas inmunológicas (ELISA, inmunoblot y citometría de flujo) y en técnicas moleculares (sondas DNA, hibridación DNA y PCR), para la detección precoz del iridovirus linfocitis (FDLV), un virus que afecta a la dorada cultivada (Sparus aurata, L). Estudio de interacciones virus-célula en dos modelos de infección de salmónidos y mecanismos de potenciación de la expresión de proteínas antivíricas El propósito de este proyecto es estudiar algunos factores que modifiquen la virulencia de los virus IPNV e IHNV de Salmónidos, en las etapas inicial y final de sus ciclos infectivos, tanto en infecciones simples como en coinfecciones. También nos proponemos establecer las conexiones entre pérdida de virulencia y activación del estado antivírico de resistencia y las posibilidades de potenciar este estado para eliminar virus lítico y persistente. El proyecto se centrará en tres objetivos: - Estudiar las interacciones virus-célula en el inicio de la infección de cepas de virus atenuados y virulentos, en infecciones simples y en coinfecciones. - Analizar dos modelos de infección de virulencia alterada (persistencia y coinfección), estimando las conexiones con la II) To study the induction of Mx proteins in rainbow trout (Oncorynchus mykiis) and common trout (Salmo trutta), the expression in organs and the activity against IPNV strains of different virulence. III) To determine modulation of the IPNV-IHNV dual infection kinetics, induced by interferon and Mx protein. Design of immunological and molecular techniques for the diagnostic of lymphocystys virus infections affecting cultured gilt-head seabream (Sparus aurata, L.) In collaboration with Dr. Juan José Borrego (Department of Microbiology, Sciences, Málaga University), we have designed diagnostic methods based on immunological (ELISA, immunoblot and flow cytometry) and molecular (DNA probes, DNA hybridisation and PCR) techniques for the detection of an iridovirus, named fish lymphocystis disease virus (FDLV), a virus affecting cultured gilt-head seabream. (Sparus aurata L). Study of the virus-cell interactions in two models of salmonid fish infections and the enhancing mechanisms to the expression of antiviral proteins The aim of this project is the study of the factors that modulate the virulence of Salmonid fish viruses (such as IPNV and IHNV) in the first and last steps of their infective growth cycles, in single and dual infections. We are also interested in establishing the relationships between the loss of virulence and induction of antiviral resistance state, as well as recording the chances to enhance this state, in order to eliminate lytic and persistent viruses. The project is focused on: -The study of early virus-cell interactions (binding) of virulent and attenuated strains, in single and dual infections. -The analysis of two infection models of altered virulence (persistence and coinfection), evaluating the expression of antiviral proteins and enhancing mechanisms. 216

226 Virología en Acuicultura / Virology in Fish-Aquaculture expresión de proteínas antivíricas y los mecanismos de potenciación. - Determinar si el gen de la proteína VP2 del IPNV desempeña un papel relevante en: a) la producción de proteínas antivíricas (MX, Vig 1) y b) la interferencia inducida por este virus sobre el IHNV en coinfecciones y en superinfecciones. -The role of IPNV.VP2 gene in: a) The induction of antiviral proteins (Mx, Vig-1) and, b) The loss of IHNV virulence in a dual infection. Organismos Financiadores/Funding Agencies MCYT, AGL ( ) MEC, AGL ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Irene Cano Cejas. Diagnóstico de Infecciones Producidas por el virus de Linfocistis en peces marinos cultivados. Universidad de Málaga, Octubre Directores: S. Rodríguez Saint-Jean y D. Castro. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Alonso, M., Rodríguez, S., and Pérez-Prieto, S.I. (2003). Virulence of IHNV and IPNV coinfection in rainbow trout and nucleotide sequence analysis of the IHNV glycoprotein gene. Arch. Virol. 148, Alonso, M.C., Cano, I., Castro, D., Pérez-Prieto, S.I., and Borrego, J.J. (2003). Development of an in situ hybridisation procedure for the detection os sole aquabirnavirus in infected fish cell cultures. J. Virol. Methods 116, Rodríguez, S., Borrego, J.J., and Pérez-Prieto, S.I. (2003). Infectious Pancreatic Necrosis Virus: Biology, Pathogenesis and Diagnostic Methods. Adv. Virus Res. 62, García Rosado, E., Casto, D., Cano, I., Alonso, M.C., Pérez-Prieto, S.I., and Borrego, J.J. (2004). Protein and glycoprotein content of lymphocystic disease virus ( LDCV). Int. Microbiol. 7, Artículos de Divulgación/Press Articles Sara I. Pérez Prieto y Sylvia Rodríguez Saint-Jean. Virus en la Acuicultura de peces teleósteos y su impacto en las instalaciones españolas. (2003). Biopress. net ( 217

227 Virología en Acuicultura / Virology in Fish-Aquaculture Próximos artículos/forthcoming Articles Pérez-Prieto, S.I. y Rodríguez Saint-Jean, S., (2005). Enfermedades virales de peces objeto de cultivo. En: Inmunología e Inmunopatología en Piscicultura. Universidad Internacional del Mar. Aguilas (Murcia). (en prensa/in press). Rodríguez, S., Alonso, M., and Pérez-Prieto, S.I., (2005). Comparison of two birnavirus-rhabdovirus coinfections in fish cell lines. (Dis. Aquat. Org.). (en prensa/in press). 218

228 Carbohidratos Microbianos Microbial Carbohydrates JUAN ANTONIO LEAL OJEDA Jefe de Grupo / Group Leader ALICIA PRIETO ORZANCO Investigadores de Carrera / Staff Scientists OUSSAMA AHRAZEM (Hasta VI-2003) B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow Mª INMACULADA GIMÉNEZ ABIÁN (Desde XI-2003) Investigadora Contratada / Research Associate DOMINGO MARQUINA DÍAZ (Desde XI-2003) ANTONIO SANTOS DE LA SEN (Desde III-2004 hasta XII-2004). Investigadores Visitantes / Visiting Scientists JESÚS LÓPEZ RAMÍREZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Polisacáridos, Quimiotaxonomía, Evolución de hongos, Pared celular Polisacáridos de la pared celular de hongos filamentosos como marcadores quimiotaxonómicos y evolutivos La pared celular de los hongos está compuesta principalmente por polisacáridos. De entre ellos, los componentes mayoritarios (quitina, α- y β-glucanos) tienen estructuras conocidas y comunes a un gran número de especies pertenecientes a diferentes grupos taxonómicos. Existen, sin embargo, componentes minoritarios de la pared, que generalmente constituyen el componente glucídico de glicoproteínas, cuya estructura ha sido descrita en un limitado número de géneros y especies. En nuestro laboratorio hemos estudiado el componente principal o único de la fracción soluble en agua de los extractos alcalinos de la pared de los hongos (polisacáridos F1SS). De los resultados acumulados a lo largo de las dos últimas décadas podemos concluir que estas sustancias son excelentes caracteres para establecer relaciones taxonómicas y filogenéticas de los hongos. Keywords: Polysaccharides, Chemotaxonomy, Fungal evolution, Cell wall Cell wall polysaccharides from filamentous fungi as chemotaxonomic and evolutionary markers Fungal cell wall is mainly built of polysaccharides. Major components (chitin, α- and β-glucans) have well known structures and are found in many species belonging to different high level taxa. There are also polysaccharides which represent a small percentage of the cell wall, that generally are the glucidic portion of glycoproteins, whose structure has been described in a limited number of genera and species. In our laboratory, we have studied the main polysaccharide contained in a water-soluble fraction isolated from the alkali extracts of fungal cell walls (polysaccharides F1SS). These polysaccharides are excellent taxonomic and phylogenetic characters. This conclusion is based on the accumulated results from this laboratory along the last two decades. 219

229 Carbohidratos Microbianos / Microbial Carbohydrates En los dos últimos años se ha finalizado el estudio de los polisacáridos F1SS de las especies seleccionadas de las clases Plectomycetes y Pyrenomycetes y se ha iniciado el análisis de taxones de Ascomycetes cuya clasificación es incierta, con la finalidad de ver si la estructura de sus polisacáridos se relaciona con la descrita en alguno de los grupos taxonómicos que ya hemos estudiado. También se ha abordado el estudio de especies pertenecientes a las clases Discomycetes y Loculoascomycetes. El estudio comparativo de la estructura de los polisacáridos F1SS obtenidos de unas 900 cepas de hongos pertenecientes a las clases Plectomycetes y Pyrenomycetes nos ha permitido proponer un esquema evolutivo (Prieto et al., 2004). En este esque- In the past two years, we have completed the study of polysaccharides F1SS purified from a selected group of species belonging to classes Plectomycetes and Pyrenomycetes. We have started the analysis of several ascomycetous taxa whose classification is unsettled, with the aim of testing if the structure of their F1SS polysaccharides is related to some of the structures already described for other taxa. We have also initiated the study of species selected from classes Discomycetes and Loculoascomycetes. The comparative study of the polysaccharide F1SS structures obtained from about 900 strains of fungi belonging to the classes Plectomycetes and Pyrenomycetes allowed us to propose an evolutive scheme (Prieto et al., 2004). In this scheme (Fig.1), the radiation of the Onygenales precedes that of the Eurotiales Figura 1.- Esquema evolutivo de algunos Ascomycetes basado en las estructuras de los polisacáridos F1SS (Prieto et al., 2004). Figure 1.- Evolutionary scheme of several Ascomycetes based on the structure of polysaccharides F1SS (Prieto et al., 2004). 220

230 Carbohidratos Microbianos / Microbial Carbohydrates ma (Fig. 1), la radiación de los Onygenales precede a la de los Eurotiales (estos dos órdenes están incluidos en la clase Plectomycetes) y ésta a la de los Hypocreales (clase Pyrenomycetes). Al extender el estudio de los polisacáridos F1SS a hongos de las clases Loculoascomycetes y Discomycetes pretendemos resolver sus relaciones filogenéticas con las otras dos clases ya estudiadas. Polisacáridos F1SS del hongo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis En colaboración con la Dra. San Blas (IVIC, Caracas), que nos suministró paredes celulares de las fases levaduriforme y micelial de Paracoccidioides brasiliensis, se ha determinado la estructura del polisacárido F1SS obtenido de ambos estados del hongo, observando que el polisacárido F1SS de cada una de las fases tiene diferente estructura (Ahrazem et al., 2003). Por otra parte, la comparación del polisacárido de la fase micelial con los obtenidos de otros Ascomycetes nos ha permitido incluir este microorganismo en la familia Onygenaceae (San-Blas et al., en prensa/in press). Reconocimiento de polisacáridos F1SS por receptores específicos de células dendríticas La participación de los polisacáridos F1SS en el proceso de internalización de los conidios de hongos por células dendríticas y macrófagos ha sido investigada en colaboración con el grupo del Dr. Corbí (Serrano-Gómez et al., 2004). (these two orders are included in the class Plectomycetes) and this antecedes that of the Hypocreales (from class Pyrenomycetes). We have extended the study of the polysaccharide F1SS from species of Discomycetes and Loculoascomycetes in order to complete the evolutive scheme of the Ascomycetes. Polysaccharides F1SS from the dimorphic fungi Paracoccidioides brasiliensis In collaboration with Dr. San Blas (IVIC, Caracas), which prepared the cell walls from the two phases of P. brasiliensis, we have determined the structure of the F1SS polysaccharide from both phases of the fungus. It has been found that the polysaccharide isolated from each phase has a different structure (Ahrazem et al., 2004). In addition, the comparison of the structure of the polysaccharide purified from the mycelial phase with those found in other Ascomycetes allows to include this microorganism in the family Onygenaceae (San-Blas et al., en prensa/in press). Polysaccharides F1SS recognition by specific receptors from dendritic cells The role of polysaccharides F1SS in the internalization of fungal conidia by dendritic cells and macrophages has been investigated in collaboration with the group of Dr. A. Corbí (Serrano-Gómez et al., 2004). 221

231 Carbohidratos Microbianos / Microbial Carbohydrates Organismos Financiadores/Funding Agencies DGICYT BQU C02-01 ( ) ALK-ABELLÓ (2003) DGICYT BQU C03-01 ( ) ALK-ABELLÓ (2004). Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Ahrazem, O., Prieto, A., Jiménez-Barbero, J., Leal, J.A., and Bernabé, M. (2003). Structure of a cell wall rhamnogalactomannan isolated from Cubonia bulbifera. J. Carboh. Chem. 22, Ahrazem, O., Prieto, A., San-Blas, G., Leal, J.A., Jiménez-Barbero, J., and Bernabé, M. (2003). Structural differences between the alkali-extracted water-soluble cell wall polysaccharides from mycelial and yeast phases of the pathogenic dimorfic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Glycobiology 13, Pereyra, M.T., Prieto, A., Bernabé, M., and Leal, J.A. (2003). Studies on new polysaccharides from Lasallia pustulata (L.) Hoffm. The Lichenologist 35, Gómez-Miranda, B., Prieto, A., Leal, J.A., Ahrazem, O., Jiménez-Barbero, J., and Bernabé, M. (2004). Differences among the cell wall galactomannans from Aspergillus wentii and Chaetosartorya chrysella and that of Aspergillus. Glycoconjugate J. 20, Serrano-Gómez, D., Domínguez-Soto, A., Ancoechea, J., Jiménez-Hefferman, J.A., Leal, J.A., Corbí, A.L. (2004). Dendritic cellspecific intracellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin mediates binding and internalization of Aspergillus fumigatus conidia by dendritic cells and macrophages. J. Immunol. 173, Contribución a libros/contribution to books Prieto, A., Ahrazem, O., Bernabé, M., and Leal, J.A. (2004). Polysaccharides F1SS: Taxonomic and evolutionary characters for Ascomycetes. In Pathogenic Fungi: Cellular and Molecular Biology. Sect. 2: New taxonomic tools. Capítulo 10. pp G. San-Blas and R. Calderone (Eds.) Caister Academic Press. Wyndmonham, Norfolk, UK. Próximos Artículos/Forthcoming Articles San-Blas, G., Prieto, A., Bernabé, M., Ahrazem, O., Moreno, B., and Leal, J.A. (2004). _-galf-1æ6-_-mannopyranoside side chains in Paracoccidioides brasiliensis cell wall are shared by members of the Onygenales, but not by galactomannans of other fungal genera. Medical Mycology (en prensa/in press). 222

232 Genética Bacteriana Bacterial Genetics RUBENS LÓPEZ GARCÍA Jefe de Grupo / Group Leader PEDRO GARCÍA GONZÁLEZ ERNESTO GARCÍA LÓPEZ Investigadores de Carrera / Staff Scientists DANIEL LLULL PEÑALBA (Desde III-2004). MIRIAM MOSCOSO NAYA (Desde VI-2003) VIOLETA RODRÍGUEZ CERRATO (Desde IV-2004). Investigadores Contratados / Contract Scientists LAURA ARAGONESES FENOLL (Desde VII a XII-2004). ANGELA KRÜGER (Desde X hasta XII-2004). ANA GONZÁLEZ MORENO ELENA LÓPEZ CAMACHO (Desde VI a XI-2004). CRISTINA MOLDES TABARÉS (Hasta XII-2003) PATRICIA ROMERO FERNÁNDEZ B. Predoctorales / Graduate Students ELOÍSA CANO CONGOSTO MANUEL CARRASCO FERNÁNDEZ (Hasta XI-2003) Personal Técnico / Technicians Figura.- Representación esquemática de los genomas de los fagos Cp-1, Dp-1, MM1 y EJ-1 de S. pneumoniae. Los genes se representan como flechas que señalan la dirección de transcripción. Las flechas de color amarillo, azul oscuro, verde, azul claro y rojo corresponden, respectivamente, a genes implicados en la regulación de la lisogenia, replicación del DNA, empaquetamiento y ensamblaje de la cápsida, morfogénesis de la cola y lisis de la bacteria huésped. Figure.- Schematic representation of the genomes of the pneumococcal phages Cp-1, Dp-1, MM1, and EJ-1. Genes are represented as arrows indicating the direction of transcription. Yellow, dark blue, green, light blue, and red arrows correspond to genes involved in lysogeny regulation, DNA replication, packaging and head assembly, tail morphogenesis, and lysis of the host cell, respectively. 223

233 Genética Bacteriana / Bacterial Genetics Palabras clave: Neumococo, Cápsula, Bacteriófagos, Enzimas líticas Factores de virulencia de Streptococcus pneumoniae y terapia fágica: cápsulas, proteínas de unión a colina y bacteriófagos Cápsulas. Los mutantes galu de neumococo están bloqueados en la biosíntesis de la cápsula, principal factor de virulencia de neumococo. Hemos purificado la enzima GalU y estudiado sus propiedades bioquímicas. Se está procediendo a la cristalización de la enzima lo que nos permitirá ensayar la actividad de posibles inhibidores identificados mediante 'docking'. Asimismo, se han iniciado experimentos que combinan transformación genética y análisis en un modelo murino de sepsis con el fin de establecer qué gen(es) coadyuvan a la virulencia. Proteínas de unión a colina. Aunque la cápsula es el principal factor de virulencia en neumococo, se ha observado que varias proteínas de superficie son, asimismo, factores de virulencia. Varias de estas proteínas están siendo evaluadas como candidatas para el desarrollo de vacunas. Entre ellas, las denominadas proteínas de unión a colina (CBPs) poseen un interés especial. Las CBPs poseen entre 6 y 18 repeticiones, según la proteína, de unos 20 aminoácidos cada una. Se han estudiado PcpB, PcpC y CbpF. PcpB es una posible proteasa mientras que CbpF es una proteína con péptido señal procesable que ha sido purificada en nuestro laboratorio. Aparte de su secuencia, no se poseen más datos sobre PcpC. Estas proteínas han sido purificadas. Asimismo, se han concluido los análisis fisicoquímicos de Pce, una CBP encargada de regular el número de moléculas de colina presentes en los ácidos teicoicos de neumococo y, en colaboración con los grupos de los Drs. Juan Hermoso y Margarita Menéndez, se ha determinado la estructura tridimensional de esta enzima. Bacteriófagos. El 75% de los aislados clínicos de neumococo son lisogénicos. Para determinar la posible contribución de los genes fágicos a la virulencia estamos estudiando las características moleculares de los fagos atemperados en esta especie y en otras filogenéticamente relacionadas. Se han secuenciado los genomas de dos fagos atemperados de neumococo (MM1 y EJ- 1) aislados, respectivamente, de una cepa multirresistente 23F y de una estirpe atípica. Se ha caracterizado la región que controla el estado lisogénico en MM1. El análisis comparativo de algu- Keywords: Pneumococcus, Capsule, Bacteriophages, Lytic enzymes Virulence factors of Streptococcus pneumoniae and phage therapy: capsules, choline-binding proteins, and bacteriophages Capsules. The capsular polysaccharide is the main responsible for pneumococcal virulence, and we showed that the galu gene is essential for capsule formation. So, GalU is an appropriate target for the search of new drugs to fight the pneumococcus. We have studied the biochemical properties of the GalU uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase. This achievement has been a required step to establish the crystal structure of the enzyme. Docking of a 3D-structure library of small molecules into the crystal structure of GalU will be an interesting tool for the development of new drugs. Choline-binding proteins. There is a group of about 15 genes in the genome of S. pneumoniae encoding a set of surfacelocated proteins named choline-binding proteins (CBPs) that play a central role in pneumococcal virulence. Several of these proteins have been well characterized in our laboratory. These proteins exhibit between 6 and 18 repeats (motifs), each about 20-amino acid long. Our current work is focused in several CBPs isolated by us: PcpB, PcpC, and CbpF. PcpB is a putative protease. We have completed the physicochemical characterization of the teichoic acid phosphorylcholine esterase (Pce), a pneumococcal enzyme that appears to play an important role in the regulation of the number of choline molecules located at the pneumococcal surface. Finally, as the result of a collaborative work with the groups of Dr. J. Hermoso and M. Menéndez, the crystal structure of Pce has been determined. Bacteriophages. Up to 75% of the pneumococcal clinical isolates are lysogenic and, consequently, it is important to study the role of temperate bacteriophages in virulence. We have determined the genomic sequences of MM1 (a siphovirus) and EJ-1 (a myovirus), two phages isolated from the Spain 23F -1 epidemic, multiresistant clone and from an atypical pneumococcus, respectively. Also, we have reported the first characterization of the lysogenic control region of a temperate phage in pneumococcus. Moreover, we have isolated two temperate phages isolated from Streptococcus mitis strains, and characterized the LytA amidases coded by these phages. These findings revealed 224

234 Genética Bacteriana / Bacterial Genetics nas regiones de los genomas de MM1 y de otros dos fagos atemperados de neumococo (HB-3 y VO1) ha proporcionado información sobre la presencia de genes que codifican metiltransferasas. El fago EJ-1 es un miovirus inducible de la estirpe atípica de neumococo denominada 101. Ésta es la primera vez que se secuencia un fago Myoviridae de una bacteria Gram-positiva de bajo contenido en G+C. Asimismo, se han aislado dos nuevos fagos de Streptococcus mitis que contienen genes lyta muy similares a los ya estudiados en neumococo lo que podría sugerir que los fagos actúan como vectores de genes de virulencia entre diferentes especies de estreptococos del grupo mitis. Las amidasas codificadas por estos genes son activas frente a paredes de neumococo purificadas y poseen características bioquímicas y estructurales intermedias entre las amidasas de neumococos típicos y las de las estirpes atípicas. Enzibióticos. La universalización de las resistencias antibióticas está haciendo reconsiderar el empleo terapéutico de los fagos. Se ha demostrado asimismo que también las enzimas líticas codificadas por fagos son potentes agentes antibacterianos (enzibióticos). En colaboración con los Drs. Jado, Fenoll y Casal del Insto. Carlos III se ensayó, en un modelo murino de sepsis, el efecto de dos enzimas líticas de origen fágico (enzibióticos) de especificidad bioquímica diferente, una amidasa (Pal) y una lisozima (Cpl-1). Nuestros resultados han mostrado que las lisinas fágicas protegen a los animales de experimentación tanto de la bacteriemia como de la muerte causada por una cepa multirresistente de neumococo produciéndose, además, un notable efecto sinérgico que resulta en una destrucción incrementada de la pared celular bacteriana. Actualmente estamos estudiando el papel protector de LytA, la principal enzima autolítica de neumococo, en el mismo modelo de infección habiéndose comprobado la superioridad de LytA sobre Pal así como la repetición de sinergismo entre Cpl-1 y la autolisina neumocócica LytA. En colaboración con el grupo del Dr. Soriano de la Fundación Jiménez Díaz, se está estudiando el papel de las enzimas líticas fágicas en otros modelos animales, particularmente, en un modelo de neumonía en ratas. Los datos disponibles hasta el momento indican que la lisozima Cpl-1 inoculada por vía intraperitoneal, una vez establecida la neumonía, es capaz de causar la eliminación del 90% de los neumococos pulmonares. the presence of typical LytA pneumococcal amidases in S. mitis that are able to digest not only their homologous cell walls but also those from pneumococci. Interestingly, atypical pneumococcal isolates also encode atypical LytA amidases lacking two amino acid residues and being inhibited by sodium deoxycholate. However, the phage-encoded amidases newly discovered were full-length enzymes (as the typical LytA amidases) but still showed a deoxycholate-sensitive enzymatic activity. These studies allowed the identification of Val317 as a key residue for the formation of the LytA dimer, which is the active enzymatic form of the amidase. Crystallization trials in collaboration with Dr. G. Giménez and A. Romero to determine the three-dimensional structures of these peculiar variants of this virulence factor are under currently progress. Enzybiotics. Recently, phages have again come to prominence due to the discovery of the remarkable dynamics underlying their evolution, role in virulence, and use as therapeutic agents. Another alternative to the use of whole phages to destroy bacteria relies on one of the key enzyme phage products, the lysin (also designated as enzybiotics). We have expanded such experimental approach using a murine sepsis model to study the ability of pneumococcal phage amidases (Pal) or lysozymes (Cpl-1) to cure bacteremia and to prevent death produced by an antibiotic-multiresistant 6B strain. We are currently testing the potential therapeutic use of the pneumococcal autolysin (LytA) in a bacteremia mouse model. Preliminary results indicate that LytA is superior to the phage amidase and a synergistic effect on the combined use of LytA and Cpl-1 has been observed. Besides, in collaboration with the team headed by Dr. F. Soriano from the Fundación Jiménez Díaz, we are studying the effect of Cpl-1 as a therapeutic agent in a rat model of pneumonia and preliminary results appear to suggest that up to 90% of the lung-associated pneumococci can be killed by this lytic enzyme. Development of new systems for producing fusion proteins by fermentation The use of affinity polypeptides, also called tags, is a common technology both in basic research and industrial processes. We have developed two advantageous systems to purify and immobilize fusion proteins in solid supports using two types of tags: 1) The ChBD, which recognizes choline and other analog compounds, allows the purification of fusion proteins in one 225

235 Genética Bacteriana / Bacterial Genetics Desarrollo de nuevos sistemas para la producción de proteínas de fusión por fermentación El uso de polipéptidos de afinidad, también llamados tags, es una tecnología ampliamente utilizada tanto en investigación básica como en procesos industriales. Se ha trabajado con dos sistemas muy ventajosos que permiten purificar e inmovilizar proteínas de fusión en soportes sólidos utilizando dos tipos de tags: 1) El ChBD, Tag de afinidad que reconoce colina y otros componentes análogos, permite purificar proteínas en un solo paso cromatográfico utilizando DEAE-celulosa. Entre las proteínas obtenidas, es relevante destacar por su interés industrial la DAO-ChBD, con actividad D-aminoácido oxidasa y la ChBD- Pyr, con actividad pirofosfatasa. 2) BioF, un nuevo tag que permite obtener proteínas de fusión inmovilizadas en gránulos de polihidroxialcanoato de cadena media, un soporte sólido biodegradable y biocompatible conocido como bioplástico. Se ha desarrollado un novedoso producto biotecnológico, Pfk-Bt1, que representa una nueva formulación de un producto insecticida, basado en la inmovilización de una toxina de Bacillus thuringiensis a gránulos de plástico biodegradable. Esta última línea de trabajo se está realizando en colaboración con el grupo de Biotecnología Medioambiental. step, by DEAE-cellulose chromatography. We have successfully purified the DAO-ChBD, with D-amino acid oxidase activity and ChBD-Pyr, with pyrophosphatase activity. 2) BioF, a new tag to obtain fusion proteins immobilized to medium chain length polyhydroxyalkanoates, a biodegradable and biocompatible solid support. We have prepared a biotechnological product, Pfk-Bt1, based on the immobilization of a Bacillus thuringiensis toxin to biodegradable bioplastics. This project is being developed in collaboration with the group of Environmental Biotechnology. 226

236 Genética Bacteriana / Bacterial Genetics Organismos Financiadores/Funding Agencies MCyT, BMC ( ) Fundación Ramón Areces ( ) BIO P4-04 ( ) MCyT, BMC ( ) MSC, Redes G03/103 y C03/104 ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Cristina Moldes Tabarés. Desarrollo de nuevos sistemas para la producción de proteínas de fusión por fermentación. Universidad Complutense de Madrid, Directores: P. García y J.L. García. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Guerrero, R., and López, R. (2003). A brief history of the SEM journal(s): staunchly resisting improbability. I. From 1947 to Internatl. Microbiol. 6, Guerrero, R., and López, R. (2003). A brief history of the SEM journal(s): staunchly resisting improbability. II. From Internatl. Microbiol. 6, Hermoso, J. H., Monterroso, B., Albert, A., Galán, B., Ahrazem, O., García, P., Martínez-Ripoll, M., García, J.L., and Menéndez, M. (2003). Structural basis for selective recognition of pneumococcal cell wall by modular endolysin from phage Cp-1. Structure 11, Jado, I., López, R., García, E., Fenoll, A., Casal, J., García, P., and the Spanish Pneumococcal Infection Study Network. (2003). Phage lytic enzymes as therapy of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae infection in a murine sepsis model. J. Antimicrob. Chemother. 52, Obregón, V., García, J.L., García, E., López, R., and García, P. (2003). Genome organization and molecular analysis of the temperate bacteriophage MM1 of Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 185, Obregón, V., García, P., Fenoll, A., López, R., and García, J.L. (2003). VO1, a temperate bacteriophage of the type 19A multiresistant epidemic 8249 strain of Streptococcus pneumoniae: Analysis of variability of lytic and putative C5 methyltransferase genes. Microb. Drug Res. 9, Obregón, V., García, P., López, R., and García, J.L. (2003). Molecular and biochemical analysis of the system regulating the lytic/lysogenic cycle in the pneumococcal temperate phage MM1. FEMS Microbiol. Lett. 222, Ronda, C., Vázquez, M., y López, R. (2003). Los bacteriófagos como herramienta para combatir infecciones en Acuicultura. Aquatic 18, 3-10 ( 227

237 Genética Bacteriana / Bacterial Genetics López, R. (2004). Streptococcus pneumoniae and its bacteriophages: one long argument. Internatl. Microbiol. 7, López, R., and García, E. (2004). Recent trends on the molecular biology of pneumococcal capsules, lytic enzymes, and bacteriophage. FEMS Microbiol. Rev. 28, López, R., García, E., and García, P. (2004). Enzymes for anti-infective therapy: phage lysins. Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 1, López, R., García, E., García, P., and García, J.L. (2004). Cell wall murein hydrolases. In The Pneumococcus, E.I. Tuomanen, T.J. Mitchell, D. Morrison, and B.G. Spratt, eds. (Washington, D.C.: ASM Press), pp Moldes, C., García, J.L., and García, P. (2004). Construction of a chimeric thermostable pyrophosphatase to facilitate its purification and immobilization by using the choline-binding tag. Appl. Environ. Microbiol. 70, Moldes, C., García, P., García, J.L., and Prieto, M.A. (2004). In vivo immobilization of fusion proteins on bioplastics by the novel tag BioF. Appl. Environ. Microbiol. 70, Obregón, V., García, J.L., García, E., López, R., and García, P. (2004). Peculiarities of the DNA of MM1, a temperate phage of Streptococcus pneumoniae. Internatl. Microbiol. 7, Romero, P., López, R., and García, E. (2004). Characterization of LytA-like N-acetylmuramoyl-L-alanine amidases from two new Streptococcus mitis bacteriophages provides insights into the properties of the major pneumococcal autolysin. J. Bacteriol. 186, Romero, P., López, R., and García, E. (2004). Genomic organization and molecular analysis of the inducible prophage EJ-1, a mosaic myovirus from an atypical pneumococcus. Virology 322, Varea, J., Monterroso, B., Sáiz, J.L., López-Zumel, C., García, J.L., Laynez, J., García, P., and Menéndez, M. (2004). Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci. J. Biol. Chem. 279, Próximos Artículos/Forthcoming Articles García, P., García, J.L., López, R., and García, E. (2005). Pneumococcal phages. In Phages: Their Role in Bacterial Pathogenesis and Biotechnology, M. Waldor, D. Friedman, and S. Adhya, eds. (Washington, D.C.: ASM Press). Lagartera, L., González, A., Stelter, M., García, P., Kahn, R., Menéndez, M. and Hermoso, J.A. (2005). Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of the pneumococcal teichoic acid phosphorylcholine esterase Pce. Acta Crystallogr. (en prensa/in press). 228

238 Biotecnología Medioambiental Environmental Biotechnology JOSÉ LUIS GARCÍA LÓPEZ Jefe de Grupo/Group Leader EDUARDO DÍAZ FERNÁNDEZ Mª AUXILIADORA PRIETO JIMÉNEZ Investigadores de Carrera / Staff Scientists MANUEL CARMONA PÉREZ Investigador contratado Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist BALTASAR MIÑAMBRES RODRÍGUEZ (Hasta VI-03) SERGIO ALONSO UTRILLA (Hasta VI-03) BEATRIZ GALÁN SICILIA Investigadores Contratados / Contract Scientists Mª TERESA ZAMARRO MOLINA B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow Mª JOSÉ LÓPEZ BARRAGÁN CRISTINA FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ JOSÉ IGNACIO JIMÉNEZ ZARCO JUAN NOGALES ENRIQUE (Desde VII-03) LAURA ISABEL DE EUGENIO MARTÍNEZ (Desde IX-03) ISABEL MANSO COBOS (Desde X-03) BLAS BLÁZQUEZ CASTIÑEIRA (Desde XI-03) GONZALO DURANTE RODRÍGUEZ (Desde VII-04) JULIO MIGUEL RUBIO ARANDA (Desde VII-04) INMACULADA PÉREZ DORADO (Hasta XI-04) B. Predoctorales / Graduate Students Mª EDITH CALVO ALAGUERO (Hasta VI-03) IRENE ALONSO PELEGRINA (Desde VI-03) Personal Técnico Contratado / Technicians Figura 1.- Estructura del gránulo de PHA. A) Fotografía al microscopio óptico en contraste de fases de una estirpe de P. putida produciendo gránulos de biopolímero. B) Modelo donde se muestran las tres clases de proteínas asociadas al gránulo (GAPs) en bacterias: PHA polimerasas, PHA despolimerasas y fasinas. C) Fotografia al microscopio electrónico de células de P. putida produciendo PHA sometidas a criofractura. Figure 1.- PHA granule structure. A) Phase-contrast micrography of a P. putida strain that produces PHA granules. B) Schematic model showing the three types of granule associated proteins (GAPs) in bacteria: PHA polymerases, PHA depolymerases and phasins. C) Freeze-fracture electron microscopy of P. putida cells producing PHA. 229

239 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology Palabras clave: Biodegradación, Compuestos aromáticos, Bioplásticos, Catabolismo anaeróbico, Ingeniería metabólica. Caracterización del catabolismo aeróbico de compuestos aromáticos en Escherichia coli y Pseudomonas putida El control de la expresión de los genes responsables del catabolismo de compuestos aromáticos es un factor clave en el estudio y manipulación de dichas rutas catabólicas. El trabajo realizado en nuestro grupo durante los últimos años ha revelado que Escherichia coli es capaz de mineralizar distintos compuestos aromáticos y constituye un sistema modelo ideal para el estudio de los mecanismos moleculares que controlan la expresión de los genes responsables del catabolismo de estos compuestos. Durante este bienio se han estudiado las relaciones estructurafunción de los reguladores transcripcionales que controlan específicamente las rutas de degradación de los ácidos 3- y 4-hidroxifenilacético (represor HpaR), 3-hidroxifenilpropiónico (activador MhpR), y fenilacético (represor PaaX) y la síntesis de la penicilina G (represor PaaX). La interacción con los correspondientes inductores y promotores regulados también se ha analizado y ha permitido desvelar aspectos novedosos en el campo de la regulación transcripcional en procariotas. A la regulación específica de cada ruta se sobreimpone otro control que está mediado por reguladores globales de E. coli, tales como las proteínas IHF y CRP, que ajustan la transcripción de los genes catabólicos al estado fisiológico de la célula (fenómenos de represión catabólica, condiciones de stress, etc.), y que también están siendo objeto de intenso estudio en nuestro grupo. Algunos estudios estructurales de los reguladores HpaR, MhpR, y PaaX se están realizando en colaboración con los grupos de cristalografía (Dr. J. Hermoso) y calorimetría (Dra. M. Menéndez) del Instituto de Química-Física Rocasolano del CSIC en Madrid; y con el grupo del Prof. J.M. Sanz de la Universidad Miguel Hernández de Elche. Pseudomonas putida KT2440 es uno de los organismos más utilizados en biotecnología medioambiental y el prototipo de bacteria capaz de catabolizar compuestos aromáticos. Nuestro grupo ha identificado los clusters génicos responsables de las rutas centrales de degradación de catecol (cat), protocatecuato (pca), homogentisato (hmg), y fenilacetato (paa) en el genoma de P. putida KT2440. En colaboración con el grupo del Prof. J.M. Luengo de la Universidad de León se han estudiado distin- Keywords: Biodegradation, Aromatic compounds, Bioplastics, Anaerobic catabolism, Metabolic engineering Characterization of the aerobic catabolism of aromatic compounds in Escherichia coli and Pseudomonas putida Gene expression control for the catabolism of aromatic compounds is a key factor in the study and manipulation of aromatic catabolic pathways. The work carried out in our group during the last years has shown that Escherichia coli is able to mineralize different aromatic compounds and it becomes an excellent model system to study the molecular mechanisms that control the expression of the genes involved in degradation of aromatic compounds. During this biennial period we have studied the structure/function relationships of the transcriptional regulators that specifically control the degradation routes of 3- and 4-hydroxyphenylacetic acid (HpaR repressor), 3-hydroxyphenylpropionic acid (MhpR activator), and the phenylacetic acid and penicillin G (PaaX repressor). The interactions between the regulatory proteins, the inducers and their cognate promoters have been also analyzed and they have revealed novel and important findings within the field of prokaryotic transcriptional regulation. Superimposed to the specific regulation, some global regulators such as the IHF and CRP proteins mediate a higher level of regulation that adjusts the transcriptional output from the catabolic promoters to the overall growth status of the cell (catabolic repression, stress conditions etc.). Some structural studies of the HpaR, MhpR and PaaX regulators are being carried out in collaboration with the groups of crystallography (Dr. J. Hermoso) and calorimetry (Dra. M. Menéndez) of the Insitute Rocasolano-CSIC in Madrid, and with the group of Prof. J.M. Sanz at the University Miguel Hernández in Elche. Pseudomonas putida KT2440 is one of the microorganisms most frequently used in environmental biotechnology and the prototype of bacteria able to degrade aromatic compounds. We have identified in the genome of P. putida KT2440 the gene clusters responsible of the central pathways for catechol (cat), protocatechuate (pca), homogentisate (hmg) and phenylacetate (paa) degradation. In collaboration with the group of Prof. J.M. Luengo of the University of León, we have studied different aspects of the biochemistry and transcriptional regulation of the homogentisate (the first described in bacteria) and phenylac- 230

240 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology Figura 2.- Modelo tridimensional del dominio C-terminal del regulador transcripcional BzdR de Azoarcus sp. CIB y su interacción con el compuesto inductor, benzoil-coa (en amarillo). Figure 2.- Three-dimensional model of the C-terminal domain of the BzdR transcriptional regulator from Azoarcus sp. CIB and its interaction with the inducer molecule, benzoyl-coa (in yellow). tos aspectos del catabolismo y regulación transcripcional de las rutas centrales del homogentisato (la primera que se describe en bacterias) y fenilacetato, así como de las rutas periféricas de Phe y Tyr. Además, se han identificado y caracterizado dos nuevas rutas centrales cuyos genes no habían sido descritos previamente en bacterias: el cluster gal para la degradación de ácido gálico y el cluster nic para la degradación del ácido nicotínico. La identificación de metabolitos mediante técnicas de RMN se ha realizado en colaboración con el Prof. J. Jiménez-Barbero del Departamento de Estructura y Función de Proteínas del CIB. Ambas rutas contienen proteínas que definen nuevas familias de enzimas, tales como las dioxigenasas de ruptura del anillo aromático, o que son de gran interés biotecnológico, como la monoxigenasa que transforma el nicotinato a 6-hidroxinicotinato, un importante precursor de insecticidas en la industria farmacéutica. En colaboración con el grupo del Prof. J. Perera de la Universidad Complutense de Madrid se ha caracterizado la ruta de degradación de fenilacetato de Pseudomonas sp. Y2 y se han construido casetes de DNA con los genes sty de Pseudomonas sp. Y2 responsables de la transformación de estireno a fenilacetato. Estas casetes se han utilizado para generar distintas cepas de Pseudomonas capaces de combinar el catabolismo del estireno con la degradación de otros compuestos tóxicos tales como mezclas BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno). etate central pathways, as well as the Phe and Tyr peripheral pathways. Moreover, we have identified and characterized two new gene clusters for the catabolism of aromatic compounds that had not been reported previously, i.e., the gal and nic clusters for degradation of gallic and nicotinic acids, respectively. Pathway intermediates have been determined by NMR in collaboration with Prof. J. Jiménez- Barbero at the Department of Proteins, Structure and Function of the CIB. Both the gal and nic pathways contain proteins, such as ringcleavage dioxygenases, that constitute the first members of new families of enzymes, as well as proteins of great biotechnological interest, as is the case of the nicotinate monooxygenase that converts nicotinate into 6-hydroxynicotinate, a precursor of insecticides in the pharmaceutical industry. In collaboration with the group of Prof. J. Perera from the University Complutense de Madrid, the phenylacetate pathway of Pseudomonas sp. Y2 has been characterized, and DNA cassettes containing the sty genes that convert styrene into phenylacetate have been constructed. These DNA cassettes have been used to engineer recombinant Pseudomonas strains able to combine the styrene catabolism with the degradation of several other toxic compounds such as BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene and xylene) mixtures. Anaerobic catabolism of aromatic compounds Despite the aerobic catabolism of aromatic compounds is well characterized, the anaerobic catabolism of aromatics is poorly studied, especially at the genetic level. We have isolated and studied a facultative anaerobe β-proteobacterium, Azoarcus sp. CIB, able to mineralize a variety of aromatic compounds, such as toluene and m-xylene, under denitrifying conditions. The bzd gene cluster responsible of the central pathway for anaerobic degradation of benzoate in strain CIB has been characterized at the molecular level and, in collaboration with the group of Prof. G. Fuchs (Univ. Freiburg, Germany), we have performed biochemical studies of some of the most relevant 231

241 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology Catabolismo anaeróbico de compuestos aromáticos. Si bien se conoce mucho sobre el catabolismo aeróbico de compuestos aromáticos, el catabolismo anaeróbico está mucho menos estudiado, especialmente en lo que concierne a la genética y regulación de las correspondientes rutas degradativas. En nuestro grupo hemos aislado y estudiado la cepa Azoarcus sp. CIB, una β-proteobacteria anaerobia facultativa y capaz de mineralizar una serie de compuestos aromáticos, tales como tolueno y m-xileno, en condiciones desnitrificantes. El cluster de genes bzd responsable de la ruta central de degradación anaeróbica de benzoato en Azoarcus sp. CIB se ha caracterizado a nivel molecular y, en colaboración con el grupo del Prof. G. Fuchs (Univ. de Friburgo, Alemania), se han realizado estudios bioquímicos de algunas de las etapas enzimáticas más relevantes. La proteína BzdR, el represor transcripcional que controla específicamente la expresión de los genes catabólicos, constituye el primer miembro de una nueva subfamilia de reguladores transcripcionales por lo que las relaciones estructura-función de esta proteína están siendo objeto de un intensivo estudio. Algunos estudios estructurales del regulador BzdR se están realizando en colaboración con el grupo de cristalografía del Dr. J.M. Mancheño del Instituto de Química-Física Rocasolano del CSIC en Madrid. A la regulación específica mediada por BzdR se sobreimpone una regulación global que implica fenómenos de represión catabólica y control por niveles de oxígeno en los que está implicado, entre otros, el regulador global FNR. Los genes implicados en la ruta periférica que convierte tolueno y m-xileno en benzoil-coa también se han identificado y secuenciado. Mediante ingeniería de rutas catabólicas, un abordaje novedoso en catabolismo anaeróbico, se está procediendo a la construcción de casetes de DNA que permitan ampliar el potencial catabólico de distintas bacterias desnitrificantes hacia la degradación de tóxicos como el tolueno y m-xileno. Se ha identificado el primer cluster génico responsable de la degradación anaeróbica de benzoato en una α-proteobacteria desnitrificante, Magnetospirillum magnetotacticum MS-1, lo que ha permitido sacar importantes conclusiones de tipo evolutivo sobre el origen de estas rutas bacterianas. Recientemente hemos iniciado el aislamiento e identificación en sedimentos obtenidos de distintos lugares del mundo de bacterias reductoras de Fe(III) capaces de utilizar compuestos aromáticos. Dentro de enzymatic steps of the pathway. The BzdR protein, the transcriptional repressor that specifically controls the expression of the catabolic genes, becomes the first member of a new subfamily of transcriptional regulators. Thus, insights on the BzdR structure-function relationships are of great interest. The studies to elucidate the three-dimensional structure of BzdR are being performed in collaboration with Dr. J.M. Mancheño from the Institute Rocasolano-CSIC in Madrid. Superimposed to the BzdR-mediated specific regulation, there is a high-level regulation that accounts for catabolite repression and oxygen-dependent gene expression, and that involves global regulators such as FNR. The genes responsible for the peripheral pathway that converts toluene and m-xylene into benzoyl-coa have been also identified and sequenced. We are developing DNA cassettes to expand the catabolic potential of several denitrifying bacteria towards degradation of toxic compounds such as toluene and m- xylene. Pathway engineering is a novel approach in the field of the anaerobic catabolism of aromatic compounds. We have identified the first gene cluster responsible for the anaerobic degradation of benzoate in a denitrifying α-proteobacterium, Magnetospirillum magnetotacticum MS-1. This work has revealed important evolutionary considerations about the origin of the anaerobic degradation pathways. Recently, we have started the isolation and identification from samples collected all over the world of Fe(III) reducers that anaerobically degrade aromatic compounds. In collaboration with the group of Dr. M. Boll (Univ. Freiburg, Germany) we are studying the transcriptional regulation of the gene cluster involved in the anaerobic catabolism of benzoate in the δ-proteobacterium Geobacter metallireducens. This is the first gene cluster described for the anaerobic catabolism of aromatics in Fe (III) reducers. Biodesulfurization of oil The oxidation of the sulfur present in fossil fuels is one of the main causes of the acid rain and smog. Biodesulfurization is devoted to use the abilities of some microorganisms to reduce the sulfur content of fossil fuels. During this biennial period we have addressed the role of the DszB desulfinase as the limiting step of the dibenzothiophene (DBT) desulfurization. Moreover, we have engineered a novel catabolic pathway for the complete mineralization of DBT in recombinant Pseudomonas strains that 232

242 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology esta línea de trabajo, y en colaboración con el grupo del Dr. M. Boll (Univ. Friburgo, Alemania), estamos estudiando la regulación transcripcional del cluster génico implicado en la degradación anaeróbica de benzoato en la δ-proteobacteria Geobacter metallireducens, el primero que se describe en organismos reductores de Fe (III). Biodesulfuración de petróleo La oxidación del azufre presente en los combustibles fósiles es una de las principales causas de la lluvia ácida y el smog. La biodesulfuración trata de reducir, mediante el uso de microorganismos, el contenido en azufre orgánico de dichos combustibles. Durante este bienio hemos estudiado el papel de la desulfinasa DszB como etapa limitante en la desulfuración de dibenzotiofeno (DBT). Además, se ha diseñado una nueva ruta catabólica para la completa mineralización del DBT en Pseudomonas recombinantes que expresan simultáneamente los genes dsz de Rhodococcus sp. IGTS8, responsables de la desulfuración del DBT, y los genes hbp de Pseudomonas azelaica, responsables del catabolismo del 2-hidroxibifenilo (producto final de la desulfuración). Los biocatalizadores construidos se están ensayando en biorreactores en colaboración con el grupo del Prof. F. García-Ochoa de la Universidad Complutense de Madrid. Bioplásticos Los biopolímeros conocidos como bioplásticos o polihidroxialcanoatos (PHA) son producidos y acumulados en forma de gránulos de reserva en el interior celular de ciertas bacterias cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento. En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster biodegradable rodeado por una monocapa fosfolipídica y proteínas asociadas al gránulo (GAPs), las cuales forman una fina capa en su superficie. Las fasinas, componente principal de las GAPs forman una capa proteica en la superficie del gránulo, generando una interfase entre el citoplasma celular (ambiente hidrofílico) y el núcleo hidrofóbico del gránulo de PHA. El dominio N-terminal de la fasina PhaF de P. putida se ha utilizado como polipéptido de afinidad (BioF) para construir fusiones de proteínas inmovilizadas en gránulos de PHA. La posibilidad de separar los gránulos de PHA mediante sencillas express simultaneously the dsz genes for DBT desulfurization from Rhodococcus sp. IGTS8 and the hbp genes for the catabolism of 2-hydroxybiphenyl, the aromatic end product of biodesulfurization, from Pseudomonas azelaica. The biodesulfurization efficiency of the new generation of biodesulfurizers is being tested in bioreactors in collaboration with the group of Prof. F. García-Ochoa at the University Complutense in Madrid. Bioplastics Bioplastics or polyhydroxyalkanoates (PHA) are bacterial storage compounds that are synthesized and accumulated intracellularly in the form of inclusion bodies (granules) when the bacteria face non-optimal growth conditions. The PHA granules consist of a biodegradable polyester, surrounded by a monolayer of phospholipids and some granule associated proteins (GAPs). Phasins, major component of the GAPs, have been identified in several microorganisms and they cover the surface of the granule becoming an interphase between the cytoplasm (hydrophilic) and the hydrophobic core of the granule. The N- terminal domain of the PhaF phasin of P. putida has been successfully used as a polypeptide tag (BioF) for generating fusion proteins with enzymatic activity that retain the ability to bind to the PHA granule. Since PHA granules are easily purified by centrifugation, this experimental approach becomes an interesting strategy for large scale protein purification. Moreover, since the PHA granule is biodegradable, the BioF-based system can be considered as an ecological method for the release of proteins to the open environment. In this sense, we have developed an insecticide product consisting of the Cry1Ab toxin from Bacillus thuringiensis fused to the BioF tag. This project has been done in collaboration with the groups of Bacterial Genetics and Plant-Insect Interactions of the CIB. The structural studies of the BioF tag are being performed in collaboration with the groups of Dr. J. Hermoso and M. Menéndez of the Institute Rocasolano-CSIC in Madrid. Other collaborative projects The group is developing different collaborative projects of basic and applied research with other groups of the CIB, Universities and industries. Thus, we have been collaborating 233

243 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology técnicas de centrifugación hace que este sistema sea ideal para su desarrollo a gran escala. Se han desarrollado proteínas de fusión a BioF con actividad enzimática y que mantienen la capacidad de unión al gránulo. Si se tiene en cuenta la biodegradabilidad de la matriz de inmovilización, el sistema BioF puede ser además considerado como un método ecológico para liberar y diseminar proteínas al medio ambiente. En este sentido, se ha desarrollado un producto insecticida consistente en la toxina Cry1Ab de Bacillus thuringiensis fusionada a BioF. Este proyecto se está realizando en colaboración con los grupos de Genética Bacteriana y de Interacciones Planta-Insecto del CIB. Los estudios estructurales del polipéptido de afinidad BioF se están realizando en colaboración con los grupos de los Drs. J. Hermoso y M. Menéndez del Instituto de Química-Física Rocasolano del CSIC en Madrid. Otros proyectos en colaboración El grupo desarrolla distintos proyectos de colaboración tanto de investigación básica como aplicada con otros grupos del CIB, la Universidad y la empresa. Entre los primeros hay que destacar la colaboración con los Drs. R. López, E. García y P. García del grupo de Genética Bacteriana del CIB con el que se desarrollan desde hace muchos años estudios moleculares sobre las relaciones estructura-función de las autolisinas de neumococo y de otras proteínas que tienen capacidad de unión a colina (choline-binding proteins, CBPs). Un aspecto aplicado interesante de este trabajo es el desarrollo de vectores de expresión de proteínas de fusión con las CBPs que permiten una fácil purificación por su capacidad de unirse a matrices que contengan colina o moléculas análogas. En esta línea de trabajo se colabora con las empresas Biotools (Madrid) y Biomedal (Sevilla) y con el grupo del Prof. J.M. Sanz de la Universidad Miguel Hernández de Elche. En el estudio de los aspectos estructurales de las CBPs y otras proteínas también se colabora con los grupos de los Drs. M. Menéndez y M. Martínez del Instituto de Química-Física Rocasolano (CSIC). Entre los proyectos más aplicados, se está colaborando con los Drs. R. Muñoz y R. González del Instituto de Fermentaciones Industriales (CSIC, Madrid) en la producción de pepsina bovina, y con el Dr. A. Carrascosa (Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC) y el Prof. J.M. Guisán (Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid) en la producción e inmovilización de enzimas como la beta- y alfafor many years with Drs. R. López, E. García and P. García from the CIB group of Bacterial Genetics to study the structure-function relationships of the pneumococcal autolytic proteins and other choline-binding proteins (CBPs). A remarkable objective of this research is the development of expression vectors to generate fusion proteins with the CBPs that can be easily purified on a matrix containing choline or choline analogues. In this activity we are collaborating with the companies Biotools (Madrid) and Biomedal (Sevilla) as well as with the group of Prof. J.M. Sanz from the University Miguel Hernández in Elche. We are also collaborating with the groups of Drs. M. Menéndez and M. Martínez of the Institute Rocasolano-CSIC on the structural aspects of CBPs. Regarding to the most applied research projects, we are collaborating with Drs. R. Muñoz and R. González of the Institute of Industrial Fermentations-CSIC (Madrid) in the production of bovine pepsine, and with Dr. A. Carrascosa (Institute of Industrial Fermentations-CSIC) and Prof. J.M. Guisán (Institute of Catalysis and Petrochemistry- CSIC, Madrid) in the production and immobilization of betaand alfa-galactosidases from Thermus sp. In addition, we are collaborating with Drs. I. de la Mata, P. Castillón and C. Acebal (Universitiy Complutense Madrid) and with the companies INBIOTEC (León) and Antibióticos S.A. (León) on the overproduction of industrial enzymes, such as the bacterial beta-lactam acylases and the D-amino acid oxidases of yeast, used for the semisynthesis of beta-lactam antibiotics. 234

244 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnologys galactosidasas de Thermus sp. También se colabora con las Drs. I. de la Mata, P. Castillón y C. Acebal (Universidad Complutense de Madrid) y con las empresas INBIOTEC (León) y Antibióticos S.A. (León) en la producción de enzimas industriales como las beta-lactam-acilasas bacterianas y las D-aminoácido oxidasas de levaduras, utilizadas para la obtención de antibióticos beta-lactámicos semisintéticos. Organismos Financiadores/Funding Agencies CAM, Contrato Programa Grupos Estratégicos ( ). Fund. Ramón Areces, FRA-XICN-BT ( ) Repsol YPF ( ) EU, QLK ( ) MCyT, BIO ( ) MCyT, BCM CO4-02 ( ) MCyT, BMC ( ) MCyT, BIO P4-04 ( ). MCyT, BIO P4-03 ( ). MCyT, GEN C05-02 ( ) CAM, 07M/0076/2002 ( ). MCyT, BIO ( ) MEC, VEM C02-02 ( ) MEC, BIO C04-02 ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Cristina Moldes Tabarés. Desarrollo de nuevos sistemas para la producción de proteínas de fusión por fermentación. Universidad Complutense de Madrid, Directores: P. García y J.L. García. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Alonso, S., Bartolomé-Martín, D., del Alamo, M., Díaz, E., García, J.L., and Perera, J. (2003). Genetic characterization of the styrene lower catabolic pathway of Pseudomonas sp. strain Y2. Gene 319,

245 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology Galán, B., Kolb, A., Sanz, J., García, J.L., and Prieto, M.A. (2003). Molecular determinants of the hpa regulatory system of Escherichia coli: the HpaR repressor. Nucleic Acids Res. 31, Lorenzo, P., Alonso, S., Velasco, A., Díaz, E., García, J.L., and Perera, J. (2003). Design of catabolic cassettes for styrene biodegradation. Antonie van Leuwenhoek. 84, Pessela, B.C., Vián, A., Mateo, C., Fernández-Lafuente, R., García, J.L., Guisán, J.M., and Carrascosa, A.V. (2003). Engineering the β-galactosidase gene from Thermus sp. T2 to facilitate its overproduction in Escherichia coli and its downstream processing by tailor-made metal chelate supports. Appl. Environ. Microbiol. 69, Pessela, B.C.C., Fernández-Lafuente, R., Fuentes, M., Vián, A., García, J.L., Carrascosa, A.V., Mateo, C., and Guisán, J.M. (2003). Reversible immobilization of a thermophilic β-galactosidase via ionic adsorption on PEI-coated sepabeds. Enz. Microbiol. Technol. 32, Pessela, B.C.C., Mateo, C., Carrascosa, A.V., Vián, A., García, J.L., Rivas, G., Alfonso, C., Guisán, J.M., and Fernández-Lafuente, R. (2003). One step purification, covalent immobilization and additional stabilization of a thermophilic poly-his-tagged beta-galactosidase from Thermus sp. strain T2 by using novel heterofunctional chelate-epoxy sepabeads. Biomacromol. 4, Pessela, B.C.C., Mateo, C., Fuentes, M., Vián, A., García, J.L., Carrascosa, A.V., Fernández-Lafuente, R., and Guisán, J.M. (2003). The immobilization of a thermophilic β-galactosidase on sepabeads supports promotes the reduction of product inhibition. Full enzymatic hydrolysis of lactose in dairy products. Enz. Microbiol. Technol. 33, Torres, B., Jaenecke, S., Timmis, K.N., García, J.L., and Díaz, E. (2003). A dual lethal system to enhance containment of recombinant microorganisms. Microbiology 149, Torres, B., Porras, G., García, J.L., and Díaz, E. (2003). Regulation of the mhp cluster responsible for 3-(3-hydroxyphenyl)propionic acid degradation in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 278, Abián, O., Grazu, V., Hermoso, J., González, R., García, J.L., Fernández-Lafuente, R., and Guisán, J.M. (2004). Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment. Appl. Environ. Microbiol. 70, Arias-Barrau, E., Olivera, E.R., Luengo, J.M., Fernández, C., Galán, B., García, J.L, Díaz, E., and Miñambres, B. (2004). The homogentisate pathway: a central catabolic pathway involved in the degradation of L-phenylalanine, L-tyrosine and 3-hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 186, Barragán, M.J.L., Carmona, M., Zamarro, M.T., Thiele, B., Boll, M., Fuchs, G., García, J.L., and Díaz, E. (2004). The bzd gene cluster, coding for anaerobic benzoate catabolism, in Azoarcus sp. strain CIB. J. Bacteriol. 186, Barragán, M.J.L., Díaz, E., García, J.L., and Carmona, M. (2004). Genetic clues on the evolution of anaerobic catabolism of aromatic compounds. Microbiology. 150, Díaz, E. (2004). Bacterial degradation of aromatic pollutants: a paradigm of metabolic versatility. Int. Microbiol. 7, Galán, B., García, J.L., and Prieto, M.A. (2004). PaaX repressor, a link between penicillin G acylase and the phenylacetyl-coa catabolon of Escherichia coli W. J. Bacteriol. 186, Moldes, C., García, P., García, J.L., and Prieto, M.A. (2004). In vivo immobilization of fusion proteins to bioplastics by the novel tag BioF. Appl. Environ. Microbiol. 70, Este trabajo ha sido seleccionado en el Journal Highlights de la revista ASM News, August. Muñoz, R., García, J.L., Carrascosa, A.V., and González, R. (2004). Cloning of the authentic bovine gene encoding pepsinogen A and its expression in microbial cells. Appl. Environ. Microbiol. 70, Pessela, B.C., Mateo, C., Fuentes, M., Vián, A., García, J.L., Carrascosa, A.V., Guisán, J.M., and Fernández-Lafuente, R. (2004). Stabilization of a multimeric beta-galactosidase from Thermus sp. strain T2 by immobilization on novel heterofunctional epoxy supports plus aldehyde-dextran cross-linking. Biotechnol. Prog. 20,

246 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnologys Pessela, B.C., Torres, R., Fuentes, M., Mateo, C., Filho, M., Carrascosa, A.V., Vián, A., García, J.L., Guisán, J.M., and Fernández- Lafuente, R. (2004). A simple strategy for the purification of large thermophilic proteins overexpressed in mesophilic microorganisms: application to multimeric enzymes from Thermus sp. strain T2 expressed in Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 20, Pessela, B.C., Torres, R., Fuentes, M., Mateo, C., Munilla, R., Vián, A., Carrascosa, A.V., García, J.L., Guisán, J.M., and Fernández-Lafuente, R. (2004). Selective and mild adsorption of large proteins on lowly activated immobilized metal ion affinity chromatography matrices. Purification of multimeric thermophilic enzymes overexpressed in Escherichia coli. J. Chromatogr. A. 1055, Prieto, M.A., Galán, B., Torres, B., Ferrández, A., Fernández, C., Miñambres, B., García, J.L., and Díaz, E. (2004). Aromatic metabolism versus carbon availability: the regulatory network that controls catabolism of less-preferred carbon sources in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Rev. 28, Próximos artículos/forthcoming Articles Barragán, M.J.L., Blázquez, B., Zamarro, M.T., Mancheño, J.M., García, J.L., Díaz, E., and Carmona, M., (2005). BzdR, a repressor that controls the anaerobic catabolism of benzoate in Azoarcus sp. CIB, is the first member of a new subfamily of transcriptional regulators. J. Biol. Chem. 280, Carmona, M., Fernández, S., Rodríguez, M.J., and de Lorenzo, V., (2005). m-xylene responsive Pu/PnifH hybrid σ 54 promoters that overcome physiological control in Pseudomonas putida KT2442. J. Bacteriol. 187, Artículos de Divulgación/Press Articles Casal, I., García, J.L., Guisán, J.M., and Martínez-Zapater, J.M. (2003). Biotecnología y Alimentos: Preguntas y Respuestas, en La Biotecnología en Pocas Palabras Vol. 3. SEBIOT. Madrid. Díaz, E. (2003). Biorremediación: los microorganismos y la eliminación de contaminantes medioambientales, en La Tierra. No. 56. Fungesma. Casal, I., García, J.L., Guisán, J.M., Martínez-Zapater, J.M., and Rojo, F. (2004). Biotecnología y Medio Ambiente: Preguntas y Respuestas, en La Biotecnología en Pocas Palabras Vol. 4. SEBIOT. Madrid. García, J.L. (2004). El Nuevo Programa Nacional de Biotecnología. Revista Economía Industrial. Ministerio de Industria, Comercio y Energía. Madrid. García, J.L. (2004). Políticas públicas de Investigación, desarrollo e innovación. Especial Biotecnología. Revista Industria Farmacéutica. Vol Editorial Alción Ingeniería Química S.A. Madrid. Contribuciones a Libros/Contributions to Books García, J.L. (2003). Razones que apoyan la utilización de las plantas transgénicas, en Plantas transgénicas: las caras contrapuestas del progreso. E. Muñoz y H. Rodríguez, eds. Vol. 2. Colección Poliedro. Cátedra Miguel Sánchez Masas. Universidad del País Vasco. García, J.L. (2003). Ingeniería genética y biotecnología, en Nuevos Avances en Medicamentos. J. Tamargo y C. Avendaño, eds. Real Academia de Farmacia. Monografía Vol. XV. pp

247 Biotecnología Medioambiental / Enviromental Biotechnology García, J.L. (2003). Biotecnología y Sociedad, en Gen-Etica. F. Mayor y C. Alonso, eds. Editorial Ariel. Madrid. Jiménez, J.I., Miñambres, B., García, J.L., and Díaz, E. (2004). Genomic insights in the metabolism of aromatic compounds in Pseudomonas. En The Pseudomonas, J.L. Ramos, ed. (Kluwer Publishers). Chapter 15. Vol. III. pp Torres, B., García, J.L., and Díaz, E. (2004). Plasmids as tools for containment. En Plasmid Biology, G. J. Phillips and B. Funnell, eds. (ASM Press). Chapter 29. pp Patentes/Patents Muñoz, R., García, J.L., Carrascosa, A.V., y González, R. (2003). Pepsina y pepsinógeno bovinos recombinantes producidos en células procariotas y eucariotas. Patente Española Nº Solicitud P Isabel de la Mata, Jesús Torres-Bacete, Raquel Torres-Guzmán, Miguel Arroyo, María Pilar Castillón, Carmen Acebal, Marta Rodríguez, José Luis Barredo, Miguel Angel Moreno, Juan Francisco López, Walter Cabri y José Luis García (2004). Procedimiento para producir la enzima penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae en microorganismos recombinantes. Patente Española Nº Solicitud P Isabel de la Mata, Jesús Torres-Bacete, Miguel Arroyo, María Pilar Castillón, Carmen Acebal y José Luis García. (2004). Procedimiento para producir ácido 6-aminopenicilánico mediante la enzima aculeacina A acilasa de Actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante Streptomyces lividans CECT Patente Española Nº Solicitud: P

248 Unidad de Genética Molecular de Aspergillus Aspergillus Molecular Genetics Unit MIGUEL ÁNGEL PEÑALVA SOTO Jefe de Grupo / Group Leader EDUARDO A. ESPESO FERNÁNDEZ (Desde VII-2004) Investigadores de Carrera / Staff Scientists OLIVIER VINCENT Investigadora contratada Programa Ramón y Cajal / Ramón y Cajal Contract Scientist JOSÉ MANUEL RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow LIDIA ARAUJO BAZÁN (Desde IX-2004) LAURA COBEÑO FARIÑAS (Desde IX-2004) JAVIER FERNÁNDEZ MARTÍNEZ ANTONIO GALINDO REVILLA (Desde IX-2004) SILVIA HERRANZ FERNÁNDEZ (Desde VI-2003) AMÉRICA HERVÁS AGUILAR OLGA RODRÍGUEZ GALÁN (Desde V-2004) JUAN CARLOS SÁNCHEZ FERRERO B. Predoctorales / Graduate Students CRISTINA DELGADO MARTÍN Estudiante Pregraduada / Pregraduate Student ELENA REOYO HERNÁNDEZ Personal Técnico / Technician Palabras clave: Transducción de señal; Endocitosis, Tráfico núcleo-citoplásmico, Regulación por ph ambiental, Metabolopatía En la Unidad de Genética Molecular de Aspergillus (UGMA) estudiamos la transducción de señales ambientales a los factores de transcripción, mediante una combinación de genética formal, biología molecular y biología celular. La Unidad, supervisada por el Dr. Miguel A. Peñalva, está dividida en tres grupos de investigación, dirigidos por el Dr. Eduardo Espeso, el Dr. Olivier Vincent y el Dr. Peñalva, que utilizan como modelo el moho Aspergillus nidulans, un organismo ampliamente usado para el estudio de la regulación de la expresión génica ( La UGMA ha estudiado, en colaboración con el grupo del Prof. Arst (Imperial College, London, Keywords: Signal transduction, Endocytosis, Endosome, Nucleo-cytoplasmic trafficking, ph regulation, Inborn errors of metabolism At the Aspergillus Molecular Genetics Unit (UGMA), we are currently studying ambient signal transduction to transcription factors using formal genetics and molecular and cellular biology techniques. The Unit, supervised by Dr. Miguel A. Peñalva, is organised into three research groups, directed by Dr. Eduardo Espeso, Dr. Olivier Vincent and Dr. Peñalva, which use the mould Aspergillus nidulans, a filamentous ascomycete fungus that has been broadly used for studying gene regulation, as a model organism ( /annotation/fungi/aspergillus/). Through the years, the UGMA has been studying, in close collaboration with Prof. Arst s group (Imperial College, London, 239

249 Unidad de Genética Molecular de Aspergillus / Aspergillus Molecular Genetics Unit rial.ac.uk/medicine/contacts/people/h.arst.html) la regulación del factor de dedos de zinc PacC, que media la regulación de la expresión génica por ph ambiental en hongos filamentosos y levaduras. En respuesta a una ruta de transducción de señal mediada por los 6 productos Pal (PalA, B, C, F, H, I), el producto primario de traducción de 72 kda, de localización preferentemente citoplásmica, sufre un procesamiento proteolítico para dar lugar a un intermediario PacC 53, predestinado a un segundo procesamiento proteolítico que da lugar a PacC 27, que es exclusivamente nuclear. (Peñalva MA, and Arst HN Jr. (2003). Recent advances in the characterization of ambient ph regulation of gene expression in filamentous fungi and yeasts Annu. Rev. Microbiol. 58, ). Transducción de señal de ph. La caracterización molecular de los seis genes pal no aportó mucha información acerca su función bioquímica precisa, pero permitió la identificación de ortólogos en metazoos. PalB parece ser una cisteín proteasa relacionada con las calpaínas que media uno de los dos pasos de activación proteolítica de PacC. PalH (7-TM) y PalI (4-TM) son ple/h.arst.html) the regulation of the zinc finger transcription factor PacC, which mediates regulation of gene expression by ambient ph in filamentous fungi and yeasts. The primary translation product, PacC 72 which shows preferential cytosolic localisation, undergoes a two-step proteolytic processing activation to yield nuclear PacC 27 in response to a signal transduced at alkaline ambient ph by the six pal gene products (PalA,B,C,F,H,I) (Peñalva MA, and Arst HN Jr. (2003). Recent advances in the characterization of ambient ph regulation of gene expression in filamentous fungi and yeasts Annu. Rev. Microbiol. 58, ). Ambient ph signal transduction. The molecular characterisation of the pal genes gave, with few exceptions, no clues as to the precise biochemical function of their products, although it revealed the existence of metazoan orthologues. PalB appears to be a calpain-related cysteine protease mediating the first of the two steps in PacC proteolytic activation. The seven-pass protein PalH and the four-pass protein PalI are membrane proteins which appear to cooperate to yield a functional ambient 240

250 Unidad de Genética Molecular de Aspergillus / Aspergillus Molecular Genetics Unit proteínas de membrana que cooperan para dar lugar a un receptor funcional. PalF parece estar implicado en tráfico intracelular y PalA es un doble interactor que reconoce por un lado tetrapéptidos Tyr-Pro-X-Leu y, por otro, Vps32. Vps32 es un componente del complejo ESCRT-III, uno de los tres complejos multiproteicos situados en la superficie del endosoma tardío que son necesarios para la selección del cargo en vesículas del multivesicular body pathway que son volcadas al lumen vacuolar para la destrucción de estas proteínas en el orgánulo homólogo del lisosoma de metazoos. Este hecho indica la existencia de una conexión entre trafico de vesículas, endosomas y señalización de ph. La elucidación del papel del endosoma (y de la endocitosis) en la señalización de ph tiene interés básico y aplicado, dado que se ha demostrado, en modelos de ratón, que el funcionamiento normal de la respuesta de ph es necesario para la infección por los patógenos humanos Aspergillus fumigatus y Candida albicans y así como para la infección de plantas por hongos fitopatógenos. PalA es ortóloga de AIP1/Alix, una proteína de metazoos implicada en el MVB pathway que tiene una función clave en la invaginación de vesículas en el endosoma. Alix está implicada en la gemación de retrovirus de la membrana celular, pues durante su salida de la célula huésped, los retrovirus son capaces de reclutar y usar la maquinaria del MVB pathway en un proceso topológicamente equivalente a la invaginación de vesículas en el MVB. PalC es el único componente de la ruta que parece existir sólo en hongos filamentosos y no en levaduras, por lo que hipotetizamos que su función tiene que ver con las necesidades impuestas por la morfología filamentosa, donde las señales deben viajar a distancia en tiempos biológicamente significativos desde los receptores de membrana al factor de transcripción/núcleo. PalC no parece tener ortólogos evidentes ni en metazoos ni en plantas, por lo que, a la vista del mencionado papel de la regulación de ph en patogenicidad, sería una diana ideal para antifúngicos. Los grupos de O. Vincent y M.A. Peñalva estudian diversos aspectos de la conexión entre tráfico intracelular y señalización por ph ambiental. Transporte nucleocitoplásmico en células multinucleadas: La división de la célula eucariota en compartimentos subcelulares ha sido aprovechada por la evolución para desarrollar puntos de control. Por ejemplo, la actividad de factores de transcripción puede regularse a nivel de transporte nucleocitoplásmico. ph receptor. PalF appears to be involved in the control of intracellular protein trafficking while PalA is a double interactor recognising on the one hand a Tyr-Pro-X-Leu tetrapeptide and Vps32 on the other. Vps32 is a component of ESCRT-III, one of the three multiprotein complexes located at the surface of the late endosome which are essential for cargo selection into the multivesicular body pathway (MVB), a process by which vesicles bud inwardly at the surface of the late endosome to give it a multivesicular appearance. Such vesicles are released into the vacuolar lumen where their components are destroyed by lysosomal (vacuolar) enzymes. This fact indicates a connection between vesicle trafficking, endosomes and ambient ph signalling that we are currently studying. The likely role of the endosome (and endocytosis) in ambient ph signal has basic as well as applied value, in view that the ambient ph signalling pathway is essential for pathogenicity in mouse models of aspergillosis and systemic candidiasis and for plant infection by fungal plant pathogens. PalA is the fungal orthologue of AIP1/Alix, a metazoan protein which plays a key role in the MVB pathway, possibly during the inward budding of vesicles into the endosomal lumen. Alix also plays a role during retroviral budding at the cell membrane, as retrovisuses recruit the MVB machinery to facilitate exiting of mature particles from infected cells, in a process which is topologically equivalent to the inward budding of vesicles into the lumen of the late endosome. PalC is the only Pal protein which appears to be exclusive form filamentous fungi and is absent from yeasts and we therefore hypothesise that its function is related to the needs imposed by filamentous cell morphology, in which signals need to travel at a distance in within biologically meaningful times from plasma membrane receptors to transcription factors/nuclei. PalC appears to have no obvious orthologues in either plants or metazoans. therefore, inview of the involvement of the ph signaling pathway in fungal pathogenicity, PalC would be an ideal antifungal target. O. Vincent s and M.A. Peñalva s groups are currently studying different aspects of the connection between intracellular trafficking and ambient ph signalling. Nucleus-cytoplasmic transport in multinucleated cells. The division of the eukaryotic cell in subcellular compartments has been used by evolution to set up regulatory checkpoints. For example, the activity of transcription factors can be regulated at 241

251 Unidad de Genética Molecular de Aspergillus / Aspergillus Molecular Genetics Unit Aspergillus es un organismo cenocítico, con varios núcleos por célula y crecimiento altamente polarizado, que depende del citoesqueleto microtubular. Esto implica que la secreción, que usa carriles de microtúbulos para el transporte vesicular, está también polarizada, lo que afecta a la distribución de los receptores de membrana que señalizan hacia los reguladores transcripcionales. Las señales que emanan de los receptores de membrana, a diferencia de la situación en levaduras unicelulares, debe interpretarse de manera coordinada por los múltiples núcleos de una célula, por lo que deben existir mecanismos que aseguren la propagación uniforme de dichas señales en tiempos biológicamente significativos, aparentemente incompatibles con la simple difusión bien del receptor en el plano de la membrana o de sus efectores dentro de la célula. Este problema es particularmente notable en el caso de los factores de transcripción regulados a nivel de su distribución núcleo-citoplásmica, como PacC. A lo largo de los últimos dos años, el Dr. Eduardo Espeso ha explotado la localización exclusivamente nuclear de una fusión PacC 27 ::GFP para analizar la maquinaria de transporte nucleocitoplásmico en A. nidulans. Nuestra hipótesis de trabajo es que la translocación de PacC al núcleo que ocurre tras la recepción de la señal de ph ambiental y que está mediada por la maquinaria clásica de importación nuclear, dependientes de señales de localización nuclear (NLSs) requiere además de mecanismos que pre-dirijan a PacC hacia el complejo del poro nuclear (NPC). Aspergillus nidulans como sistema modelo para el estudio de metabolopatías. La UGMA ha sido pionera en la utilización de A. nidulans como sistema modelo para el estudio de metabolopatías congénitas humanas (véase M.A. Peñalva, 2001) A fungal perspective on human inborn errors of metabolism: alkaptothe level of their nucleus-cytoplasmic transport. Aspergillus is a coenocytic organism having several nuclei per cell and a highly polarised mode of growth which rests on the microtubule cytoskeleton. The secretory pathway, which uses microtubule tracks, is also polarised, thereby affecting the distribution of membrane receptors which transduce signals to their cognate transcription factors. In contrast to the situation in unicellular yeasts, signals emanating from plasma membrane receptors must be interpreted by the different nuclei located in the same cell compartment in a coordinated manner, suggesting that there must be mechanisms ensuring that these signals are uniformly distributed within the cell. This must be achieved within biologically meaningful times which appear to be hardly compatible with simple diffusion of receptors within the membrane plane and/or their effectors within the cell. This problem is particularly noteworthy in the case of transcription factors such as PacC, which are regulated at the level of their subcellular localisation. Over the past two years, Dr. Espeso has exploited the exclusively nuclear subcellular localisation of a GFP::PacC 27 protein fusion to analyse nucleocytoplasmic trafficking in Aspergillus nidulans. Our working hypothesis is that translocation of PacC into the nucleus which occurs after ambient ph signal reception and is mediated by nuclear localisation signal(s) recognised by the classical nuclear protein import pathway requires, in addition, as yet unidentified mechanisms pre-directing the cargo towards the nuclear pore complexes (NPCs). Aspergillus as a model system for studying human inborn errors of metabolism. The UGMA has pioneered the use of Aspergillus nidulans as a model system for studying human inborn errors of metabolism (see M.A. Peñalva, 2001) A fungal perspective on human inborn errors of metabolism: alkaptonuria and beyond. Fungal.Genet.Biol. 34, 1-10). This research has crystallised in the characterisation of the human genes for alkaptonuria (in close collaboration with S. Rodríguez de Córdoba, CIB), the human gene encoding maleylacetoacetate isomerase and, in collaboration with Prof. Magdalena Ugarte (Centro de Biología Molecular) and S.R.C. (CIB), the human genes involved in 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase and 3- methylglutaconyl-coa hydratase deficiencies. The characterisation of the human gene for alkaptonuria carried out by our two collaborating groups within the CIB is of notable interest and has been incorporated in the thoroughly used textbook of 242

252 Unidad de Genética Molecular de Aspergillus / Aspergillus Molecular Genetics Unit nuria and beyond. Fungal.Genet.Biol. 34, 1-10), línea que ha cristalizado en la caracterización del gen humano de alcaptonuria (en colaboración con S. Rodríguez de Córdoba, del CIB), del gen humano de maleilacetoacetato isomerasa, y, en colaboración con Magdalena Ugarte, del Centro de Biología Molecular, y S.R.C., de los genes humanos implicados en la deficiencia aislada de metilcrotonil-coa carboxilasa y metilglutaconil-coa hidratasa. La caracterización del gen de alcaptonuria mediante la utilización del modelo fúngico realizada en el CIB fue, por la importancia histórica y básica de la alcaptonuria en la genética humana, incorporada como ejemplo ilustrativo en la nueva edición del texto clásico de Genética de Griffiths et al. Asímismo se ha incorporado a libros best-séllers de divulgación sobre Genoma Humano, como Genome: the autobiography of a species in 23 chapters de Matt Ridley, The missing moment: how the unconscious shapes modern science de Robert Pollack y ADN, el secreto de la vida por Jim Watson. Genetics by Griffiths et al. and mentioned in best-sellers such as Genome: the autobiography of a species in 23 chapters by Matt Ridley, and DNA, the secret of life by Jim Watson and by assays such as The missing moment: how the unconscious shapes modern science by Robert Pollack. Organismos Financiadores/Funding Agencies DGXII QLK-3 CT EUROFUNG (Hasta 2003) DGCYT, BIO (Hasta 2003) DGCYT, BIO (Hasta 2005) FIS, Redemet (Hasta 2005) DGCYT, BMC (Hasta 2006) DGCYT, BIO (Hasta 2006) Tesis Doctorales/Doctoral Theses José Manuel Rodríguez Rodríguez. Aspergillus nidulans, un modelo para el estudio de metabolopatías humanas, Universidad Complutense de Madrid, Director: M.A. Peñalva Soto. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles Arst, H.N., Jr., and Peñalva, M.A. (2003). ph regulation in Aspergillus and parallels with higher eukaryotic regulatory systems. Trends in Genetics 19,

253 Unidad de Genética Molecular de Aspergillus / Aspergillus Molecular Genetics Unit Arst, H.N., Jr., and Peñalva, M.A. (2003). Recognizing gene regulation by ambient ph Fungal. Genet. Biol. 40, 1-3. Caracuel, Z., Roncero, M.I., Espeso, E.A., González-Verdejo, C.I., García-Maceira, F.I., and Di Pietro, A. (2003). The ph signalling transcription factor PacC controls virulence in the plant pathogen Fusarium oxysporum. Mol. Microbiol. 48, Desviat, L.R., Pérez-Cerdá, C., Pérez, B., Esparza-Gordillo, J., Rodríguez-Pombo, P., Peñalva, M.A., Rodríguez de Córdoba, S., and Ugarte, M. (2003). Functional analysis of MCCA and MCCB mutations causing methylcrotonylglycinuria. Mol. Genet. Metabolism 80, Fernández-Martínez, J., Brown, C.V., Díez, E., Tilburn, J., Arst, H.N. Jr., Peñalva, M.A., and Espeso, E.A. (2003). Overlap of nuclear localization signal and specific DNA binding residues within the third finger domain of PacC. J. Mol. Biol. 334, Vincent, O., Rainbow, L., Tilburn, J., Arst, H.N., Jr., and Peñalva, M.A. (2003). YPXL/I is a protein interaction motif recognized by Aspergillus PalA and its human homologue AIP1/Alix. Mol. Cell. Biol. 23, Peñalva, M.A., and Arst, H.N., Jr. (2004). Recent advances in the characterization of ambient ph regulation of gene expression in filamentous fungi and yeasts. Annu. Rev. Microbiol. 58, Rodríguez, J.M., Ruiz-Sala, P., Ugarte, M., and Peñalva, M.A. (2004). Fungal metabolic model for type I 3-methylglutaconic aciduria. J. Biol. Chem. 279, Rodríguez, J.M., Ruíz-Sala, P., Ugarte, M., and Peñalva, M.A. (2004). Fungal metabolic model for 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency. J. Biol. Chem. 279,

254 Iniciadores de la replicación del DNA y sistemas de muerte condicional en microorganismos DNA replication initiators and conditional death systems in micro-organisms RAMÓN DÍAZ OREJAS Jefe de Grupo / Group Leader ELENA FERNÁNDEZ-TRESGUERRES RAFAEL GIRALDO SUÁREZ Investigadores de Carrera / Staff Scientists TERESA DÍAZ LÓPEZ (Desde IX-2004) MARC LEMONNIER ALICIA SÁNCHEZ GOROSTIAGA Investigadores Contratados / Research Associates CRISTINA DÁVILA FAJARDO TERESA DÍAZ LÓPEZ (Hasta IX-2004) JUÁN LÓPEZ VILLAREJO (Desde VI-2004) MARÍA MORENO DEL ÁLAMO (Desde II-2004) ANA JOSEFA MUÑOZ GÓMEZ (Hasta XI-2004) B. Predoctorales / Graduate Students ELIIZABETH DIAGO NAVARRO (Desde VII-2004). FÁTIMA GASSET ROSA (Desde IX-2004) Estudiantes / Students CONSUELO PARDO ABARRIO ANA Mª SERRANO LÓPEZ Personal Técnico / Technicians Palabras clave: Replicación del DNA, Iniciadores (RepA/ORC), Toxinas y antitoxinas bacterianas (Kid, Kis), Plásmidos, Estructura y función de proteínas y del DNA Biología Molecular de los iniciadores de la replicación del DNA en microorganismos RepA es la proteína iniciadora de la replicación del DNA del plásmido pps10 (un replicón específico de Pseudomonas aislado por nuestro grupo). RepA también actúa como represor transcripcional de su propia síntesis. Como resultado de nuestros estudios sobre las bases moleculares de ambas funciones, hemos hallado: Keywords: DNA replication, Initiators (RepA/ORC), Bacterial toxin-antitoxin systems, Bacterial plasmids, Structure-function of proteins and DNA Molecular Biology of DNA replication initiators in microorganisms RepA is the DNA replication initiator protein of the plasmid pps10 (a replicon specific of Pseudomonas isolated by our group). RepA also acts as a transcriptional repressor of its own synthesis. As a result of our studies on the molecular basis of both functions, we have found: 245

255 Iniciadores de la replicación del DNA y sistemas de muerte condicional en microorganismos / DNA replication initiators and conditional death systems in micro-organisms - La existencia de dos clases de secuencias de DNA reconocidas por RepA: cuatro repeticiones directas de 22 pb (iterones) en el origen de replicación y una repetición inversa de 8 pb (operador) en el promotor del gen repa. - Dos diferentes especies moleculares de RepA se unen a cada una de dichas secuencias de DNA, con funciones distintas: Iniciar la replicación (los monómeros en los iterones) y reprimir la transcripción (los dímeros en el operador). - RepA se compone de dos dominios del tipo "winged-helix". El dominio C-terminal (WH2) se une, a través del surco mayor del DNA, a cada uno de los brazos de la repetición inversa en el operador y también a uno de los extremos en cada iterón. El dominio N-terminal (WH1) es la interfase de dimerización de la proteína pero, una vez se disocian los dímeros, se convierte en un segundo módulo de interacción con el DNA, reconociendo el extremo libre de cada iterón a través de los fosfatos de éste. - La transformación estructural de los dímeros de RepA en monómeros conlleva un incremento en el contenido de estructura secundaria β-laminar a expensas del componente α-helicoidal (espectroscopia de CD). La unión alostérica de la secuencia de un iterón a los dímeros de RepA induce dicho cambio estructural in vitro. - En colaboración con el grupo de Antonio Romero (CIB- CSIC), hemos resuelto la estructura cristalina de la forma dimérica del dominio WH1 de RepA (drepa, código PDB 1HKQ). Su plegamiento es similar al del dominio homólogo del iniciador del plásmido F (mrepe). Sin embargo, en buen acuerdo con nuestros datos espectroscópicos, la dimerización transforma un lazo + hebra-β inter-dominios (mrepe) en tres vueltas adicionales de la hélice C-terminal en WH1 (α5). Esta se empaqueta junto con las dos hélices N-terminales del dominio, de las cuales α1 también gana una vuelta adicional (drepa). Estos cambios afectan la distancia relativa entre ambos dominios y con ello el reconocimiento diferencial de iterones y operador. El cambio conformacional observado es uno de los mayores descritos hasta la fecha en una proteína que se une al DNA. La estructura de drepa abre nuevas vías al diseño de drogas cuya diana sea la replicación de plásmidos portadores de resistencias a los antibióticos en bacterias Gram-negativas patógenas. - En la estructura de drepa, cada subunidad se asemeja al extremo C-terminal del iniciador de arqueas y eucariotas Cdc6. Esto confirma y extiende nuestros estudios bioquímicos y espectroscópicos previos, que mostraban similitudes entre RepA y la -Two kinds of DNA sequences are recognised by RepA: four directed repeats of 22 bp (iterons) in the origin of replication and an inverted repeat of 8 bp (operator) in repa gene promoter. -Two different species of RepA protein bind to each one of those DNA sequences, with distinct functions: DNA replication initiation (monomers at iterons) and transcriptional repression (dimer at operator). -RepA is composed of two domains of the "winged-helix" type. The C-terminal domain (WH2) binds to each one of the operator half repeats, and also to one end of the iteron sequence, through the DNA major groove. The N-terminal domain (WH1) is the dimerization interface but, upon dimer dissociation, it is converted into a secondary DNA binding module, recognizing the free end of iteron DNA through its phosphate backbone. -The structural transformation of RepA dimers into monomers implies an increase in the α-strand secondary structure content at the expense of the β-helical component (CD spectroscopy). The allosteric binding of an iteron sequence to RepA dimers induces such a change in vitro. -In collaboration with the group of Antonio Romero (also at CIB-CSIC), we have solved the crystal structure of the dimeric form of RepA WH1 domain (drepa, PDB entry 1HKQ). Its fold is similar to the homologous domain in the monomeric initiator of F plasmid (mrepe). However, in agreement with our spectroscopic data, dimerization transforms an interdomain loop plus β-strand (mrepe) into three new turns in the C-terminal a-helix (α5) of WH1. This becomes tightly packed with the two N-terminal helices, of which a1 also gains a helical turn (drepa). This would affect the relative distance between both WHs and thus operator vs. iteron recognition. The observed conformational change is one of the largest described for a DNA binding protein. drepa structure opens a new way to the design of drugs targeting the replication of plasmids carrying antibiotic resistance genes in pathogenic Gram-negative bacteria. -In drepa structure, each subunit closely resembles the C- terminus of the eukaryotic / archaeal initiator Cdc6. This confirms and extends our previous biochemical and spectroscopic data showing similarities between RepA and a subunit (Orc4, an orthologue of Cdc6) of the S. cerevisiae initiator ORC. Both pieces of work give clues on the phylogeny of DNA replication initiators, back to the universal ancestor (LUCA). 246

256 Iniciadores de la replicación del DNA y sistemas de muerte condicional en microorganismos / DNA replication initiators and conditional death systems in micro-organisms subunidad Orc4 (un ortólogo de Cdc6) del complejo iniciador ORC de S. cerevisiae. Ambos trabajos dan pistas sobre la filogenia de los iniciadores de la replicación del DNA, que se remontarían al ancestro común de todas las células vivas (LUCA). - Mutaciones que afectan el dominio WH1 en RepA amplían el rango de huésped de pps10 a Enterobacterias. Hemos encontrado que algunas de tales mutaciones incrementan el número de copias y/o potencian la interacción de RepA con el iniciador cromosómico DnaA. Hemos aislado mutaciones en este último que mejoran su unión con RepA silvestre. Sistemas de muerte condicional bacterianos -pard (kis, kid) es un sistema de muerte condicional que fue encontrado en nuestro laboratorio en el factor de resistencia a antibióticos de enterobacterias R1. Este sistema forma parte de los sistemas de mantenimiento del plásmido R1 y se encuentran homólogos suyos en el cromosoma de eubacterias y arqueas. El sistema pard es un operón que codifica para dos pequeñas proteínas, una toxina (Kid por determinante de "killing", 12 kda) y una anti-toxina (Kis por supresor de Kid, 10 kda). -La interacción toxina-antitoxina neutraliza la acción de Kid y da lugar a un complejo que regula la transcripción del operón pard. Se han definido genéticamente regiones de la antitoxina Kis implicadas en co-regulación (Kis y Kid regulan coordinadamente el operón pard) y en antitoxicidad, y regiones en la toxina implicadas en co-regulación, toxicidad y estabilidad estructural. -Kid y Kis son activas tambien en eucariotas donde Kid inhibe proliferación celular y Kis protege de esta inhibición. Se ha definido y verificado una estrategia para activar la muerte condicional por apoptosis de células tumorales humanas basada en la expresión diferencial de la toxina Kid y de su antitoxina en colaboración con el lab. del Prof. R. Laskey (Cambridge, UK). -Se ha obtenido la estructura cristalina de la toxina Kid con alta resolución en colaboración con el grupo de J. Rafferty (Sheffield, UK). El análisis comparado de la estructura de Kid con el banco de estructuras conocidas ha puesto en evidencia la existencia de un módulo estructural común a las toxinas Kid y CcdB que tienen muy baja homología de secuencia y también ha evidenciado que distintas regiones de este módulo se utilizan en Kid y CcdB para llegar a sus distintas dianas (RNA y DNA girasa respectivamente). -Mutations affecting the WH1 domain in RepA broaden the host-range of pps10 to Enterobacteria. We have found that some of these mutations increase plasmid copy number and/or enhance RepA binding to the chromosomal initiator DnaA. Mutations in the latter that improve binding to wild-type RepA have been also isolated. Conditional killer systems in bacteria -pard (kis, kid) is a conditional killer system found in the drug resistance factor R1 of enterobacteria and it is one of the maintenance systems of this plasmid. pard is an operon coding for two small proteins, Kid (12 kda) a toxin, and Kis (10 kda), an antitoxin. Homologous to pard can be found in the chromosome of eubaceria and archaea. -Kis and Kid form a complex that inactivates the toxin and that forms the co-repressor of the system. The genetic analysis identified residues/regions in the antitoxin Kis involved in coregulation and anti-toxicity and residues/regions in the toxin involved in toxicity, co-regulation and structural stability. -Kid and Kis are active also in eukaryotes, where Kid can inhibit proliferation and Kis protects. A strategy to activate conditional death by apoptosis in human tumor cell lines based in the differential expression of Kid and Kis has been defined and tested in collaboration with the lab. of Prof. R. Laskey (Cambridege, UK). -The structure of the Kid toxin has been solved at 1.4 Amstrongs in collaboration with the group of J. Rafferty (Sheffield, UK). This structure revealed the existence of a common structural module with CcdB, an apparently unrelated toxin of plasmid F. Different regions of this common module are adapted to reach different targets. -The Kid toxin and its chromosomal homologous, the ChpAK toxin, are endo-ribonucleases able to cut RNA in single and double-stranded regions with different specificity. Using a Kid mutant specifically affected in toxicity we have established the correlation between the toxicity of the protein and its RNase activity. The RNase activity of Kid leads to the inhibition of translation both in prokaryotes and eukaryotes and can also inhibit some other RNA dependent processes independent of translation, such as the replication of plasmid ColE1. -Different aspects related to the regulation, function, structure and biotechnological implications of the pard system are now being explored. 247

257 Iniciadores de la replicación del DNA y sistemas de muerte condicional en microorganismos / DNA replication initiators and conditional death systems in micro-organisms -Se ha determinado que la toxina Kid y su homóloga cromosómica ChpAK son endo-ribonucleasas capaces de cortar el RNA en regiones de banda sencilla o doble y que ambas tienen distinta especificidad. Utilizando un mutante de Kid específicamente afectado en toxicidad se ha establecido la correlación entre la toxicidad de la proteína y su actividad RNasa. La actividad RNasa de Kid se traduce en la inhibición de síntesis de proteínas tanto en procariotas como en eucariotas y también se manifiesta en la inhibición de algunos procesos dependientes de RNA pero independientes de síntesis de proteínas como la replicación del plásmido ColE1. -Se continúan explorando diferentes aspectos relacionados con la regulación, función, estructura y proyecciones biotecnológicas del sistema pard y de sus proteínas. Organismos Financiadores/Funding Agencies PM ( ) CA, CP ( ) EC, QLK2-CT ( ) MEC-CICYT, PM ( ) CAM, Programa Grupos Estratégicos ( ) MCyT, SAF ( ) FIS, Red REIPI -CO314 ( ) BMC ( ) CSIC, E006 ( ) CSIC, E062 ( ) CSIC, F0330 ( ) CAM, GR/SAL/0651 (2004) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Teresa Díaz López. Interacción de la proteína RepA con el DNA del plásmido de Pseudomonas pps10: claves sobre la activación conformacional de un iniciador de la replicación. Universidad Complutense de Madrid, Director: R. Giraldo. Ana Josefa Muñoz Gómez. Identificación y Caracterización de la actividad RNasa de las toxinas bacterianas Kid y ChpAK. Universidad Autónoma de Madrid, Directores: R. Díaz Orejas y M. Lemonnier. 248

258 Iniciadores de la replicación del DNA y sistemas de muerte condicional en microorganismos / DNA replication initiators and conditional death systems in micro-organisms Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles De la Cueva-Méndez, G., Mills, A.D., Clay-Farrace, L., Díaz-Orejas, R., and Laskey, R. (2003). Regulatable killing of eukaryotic cells by the prokaryotic proteins Kid and Kis. EMBO J. 22, Díaz-López, T., Lages-Gonzalo, M., Serrano-López, A., Alfonso, C., Rivas, G., Díaz-Orejas, R., and Giraldo, R. (2003). Structural changes in RepA, a plasmid replication initiator, upon binding to origin DNA. J. Biol. Chem. 278, Díaz-Orejas, R., Muñoz-Gómez, A.J., and Lemonnier, M. (2003). The Kid-Kis toxin-antitoxin: a tale of selfishness, survival and death. The ELSO Gazette. Giraldo, R. (2003). Common domains in the initiators of DNA replication in Bacteria, Archaea and Eukarya: combined structural, functional and phylogenetic perspectives. FEMS Microbiol. Rev. 26, Giraldo, R., Fernández-Tornero, C., Evans, P.R., Díaz-Orejas, R., and Romero, A.A. (2003). Conformational switch between transcriptional repression and replication initiation in the RepA dimerization domain. Nature Structural Biol., 10, Lemonnier, M., Ziegelin, G., Reick, T., Gómez, A.M., Díaz-Orejas, R., and Lanka, E. (2003). Bacteriophage P1 Ban protein is a hexameric DNA helicase that interacts with and substitutes for Escherichia coli DnaB. Nucleic Acids Research 31, Maestro, B., Sanz, J.M., Díaz-Orejas, R., and Fernández-Tresguerres, E. (2003). Modulation of pps10 host range by plasmid encoded RepA initiator protein. J. Bacteriol. 185, Santos-Sierra, S., Lemonnier, M., Núñez, B., Hargreaves, D., Rafferty J., Giraldo, R., Andreu, J.M., and Díaz-Orejas, R. (2003). Non-cytotoxic variants of the Kid protein that retain their auto-regulatory activity. Plasmid 50, Giraldo, R., and Fernández-Tresguerres, M.E. (2004). Twenty years of the pps10 replicon: insighths on the molecular mechanism for the activacion of DNA replication in iteron-containing bacterial plasmids. Plasmid 52, Giraldo-Suárez, R. (2004). Replicación de plásmidos y resistencia a los antibióticos. Investigación y Ciencia 336, Muñoz, A., Santos-Sierra, S., Berzal-Herranz, A., Lemonnier, M and Díaz-Orejas, R. (2003). Insigths into the specificity of RNA cleavage by the Escherichia coli MazF toxin. FEBS Letters 567, Santos-Sierra, S., Lemonnier, M., Pardo-Abarrio, C., and Díaz-Orejas, R. (2004). Identification of residues of the Kid toxin involved in auto-regulation of the pard system. J. Bacteriology. 186,

259 Diferenciación celular en Dictyostelium discoideum Cellular Differentiation in Dictyostelium discoideum TERESA SUÁREZ GONZÁLEZ Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist BEATRIZ NÚÑEZ CORCUERA (Desde II-2004) B. Predoctoral / Graduate Student Palabras clave: Dictyostelium, Diferenciación celular, Transducción de señal, DIF-1 La respuesta diferencial de las células a un mismo estímulo es una constante universal de numerosos procesos. Nos proponemos entender las bases moleculares y fisiológicas responsables de este fenómeno, estudiando la diferenciación de las células del tallo inducida por DIF-1 en D. discoideum. En el inicio Key words: Dictyostelium, cell differentiation, signal transduction, DIF-1 Cells differential response to the same stimulus is a common feature to several processes. We investigate the molecular and physiological mechanisms acting within cells which underlie this phenomenon. We will address it studying DIF-1-induced pre-stalk and stalk cell differentiation in D. discoideum. At the onset of development, cell-cell communication and diffusible factors, like camp and DIF-1, determine cell fate. There are many genes differently regulated by DIF-1 in prespore and Figura 1.- Ciclo de vida de Dictyostelium discoideum (cortesía de Blanton y Grimson). 250

260 Diferenciación celular en Dictyostelium discoideum / Cellular Differentiation in Dictyostelium discoideum Figura 2.- Expresión del gen lacz bajo el control de un promotor específico de células del tallo entre las 10 y 15 h de desarrollo. (Cortesía de Rob Key). del desarrollo, la comunicación entre las amebas y varios factores difusibles, como el AMP cíclico y DIF-1, determinan el destino de las células. Se han descrito varios genes que están regulados por DIF-1 de forma diferente en esporas o en células del tallo, sin embargo, no se conocen ninguno de los genes implicados en la ruta de transducción de la señal de DIF-1. Estamos buscando mutantes incapaces de formar células del tallo en un ensayo in vitro y mutantes incapaces de activar el promotor de un gen inducido específicamente por DIF-1, ecmb. Esperamos identificar así genes implicados en la transducción de la señal de DIF-1, incluso si su deleción no afecta fenotípicamente al desarrollo. El estudio de las proteínas identificadas, sus interacciones y regulación, nos permitirá proponer un modelo de diferenciación de las células del tallo. El organismo: Dictyostelium discoideum Dictyostelium discoideum es una ameba unicelular, que pertenece a un grupo monofilético independiente, Mycetozoa, relacionado con hongos y animales. D. discoideum vive habitualmente en el suelo, se alimenta de bacterias y se multiplica por división binaria. Cuando las células carecen de nutrientes inician un programa de desarrollo que implica la comunicación entre las células. Las amebas se agrupan y forman un cuerpo fructífero, que es una estructura multicelular que contiene las esporas, sostenidas por un tallo de células muertas. Las esporas germinan después para generar amebas y cerrar el ciclo. El desarrollo se inicia cuando un grupo de amebas, debido a la ausencia de nutrientes, comienza a producir AMP cíclico (AMPc). Este agente quimiotáctico atrae a otras amebas del entorno y aproximadamente 10 5 células convergen formando un prestalk cells, unfortunately none of the genes involved in DIF- 1 signal transduction pathway have been identified. We are isolating mutants unable to form stalk cells in an in vitro assay and mutants where the ecmb promoter (a DIF-1 inducible gene) remains uninduced in the presence of DIF-1. These screens should identify genes involved in DIF-1 signalling even if their absence has no developmental consequences. Analysis of the identified proteins, their interactions and regulation, should allow us to propose a model for stalk cell differentiation. The organism: Dictyostelium discoideum Dictyostelium discoideum is a unicellular social amoeba belonging to the monophyletic group Mycetozoa, related to fungi and animals. D. discoideum lives usually in the soil, feeds on bacteria and reproduces by binary division. Lack of nutrients forces a developmental program based on cell-cell communication. All amoebae get together in an aggregate and undergo cell differentiation and morphogenesis. The result is a fruiting body consisting on a ball of resistant spores suspended on a stalk, made up of dead cells. The onset of development occurs when a group of bacteria, due to starvation, start to produce cyclic AMP (camp). This chemotactic agent attracts other amoebae and 10 5 collect together and form a mound. This structure gets more compact, elongates and becomes a slug, able to move in search of perfect conditions of light and humidity. The final structure, culminant, has a sorus full of spores placed on top of a stalk and contains at least two perfectly differentiated cell types. Dictyostelium discoideum is an excellent model to study different cellular processes, particularly cell movement, chemo- 251

261 Diferenciación celular en Dictyostelium discoideum / Cellular Differentiation in Dictyostelium discoideum mound (montón). Esta estructura se hace cada vez más compacta, se alarga y se convierte en un slug (babosa) capaz de desplazarse en busca de luz y condiciones adecuadas para completar su desarrollo. La estructura final, que se denomina culminante, consta de un tallo que sujeta un esporocarpo que contiene miles de esporas (ver figura 1) y tiene al menos dos tipos celulares perfectamente diferenciados: las células del tallo y las esporas. Dictyostelium discoideum es un excelente modelo para el estudio de varios procesos celulares, especialmente movimiento celular, quimiotaxis y fagocitosis. Los mecanismos moleculares que intervienen en estos procesos pueden estudiarse en un organismo eucariota sencillo como Dictyostelium. Las proteínas de D. discoideum implicadas en estas rutas comparten similitud de secuencia y función con las de metazoos por lo que se ha convertido en un interesante modelo para la disección de procesos comunes a todos los organismos eucariotas. Diferenciación de las células tallo Nuestro grupo está interesado en la diferenciación de las células tallo, específicamente en la identificación de las señales y proteínas implicadas en transmitir la información que obliga al 25% de las células presentes en un agregado de Dictyostelium a sacrificarse para que las esporas, el 75% restante, sean capaces de perpetuarse. El AMPc juega un papel fundamental en el inicio del desarrollo, en la maduración de todos los tipos celulares y en la expresión de genes. Hay también factores específicos que intervienen, el más conocido es DIF-1 (differentiation inducing factor-1). DIF-1 es una alquil-fenona clorada sintetizada por D. discoideum capaz de inducir la diferenciación de las células del tallo, mediante la activación de programas específicos de expresión génica, diferentes en los distintos tipos celulares. D. discoideum produce también otros DIFs (DIF-2-5) y otras pequeñas proteínas importantes en la diferenciación celular. Inicio del desarrollo Cómo se inicia esta diferenciación celular es uno de los aspectos menos conocidos del desarrollo de Dictyostelium. En el slug (babosa), el destino final de las células ya está decidido: taxis and phagocytosis. All molecular mechanisms responsible for these processes can be studied in a simpler eukaryote like Dictyostelium. The dissection of these pathways common to all metazoans is amenable in this organism because the proteins involved share sequence homology and function with higher eukaryotes. Stalk cell differentiation We are interested in stalk cell differentiation, particularly in the signals and proteins involved in forcing a 25% of the cells present in an aggregate to die, so that the other 75% can become spores and survive. The main player at the onset of development is camp which is also involved in other processes like maturation and gene expression. There are also other specific factors involved in cell fate determination, DIF-1 is the most studied. DIF-1 is synthesised by Dictyostelium and induces stalk cell differentiation, activating different expression programs in different cell types. There are also other DIFs and some small proteins produced by Dictyostelium that play a role in cell differentiation. The onset of development The beginning of Dictyostelium cell differentiation is quite unknown. In the slug, cell fate is already fixed: prestalk cells (25%) are placed in the anterior part and prespore cells, at the back. The first signs of cell differentiation have been detected in the loose mound where prestalk cells appeared scattered through the whole structure and then they sort to a particular region of the mound to define a developmental pattern (figure 2). This mechanism, where different cell types initially arise scattered amongst one another before sorting, also appears at some stages in mammalian development. So an alternative model to pattern formation is needed to fully explain tissue pattern. It has also been shown that cells exhibit different intrinsic sensitivity to external stimuli. This sensitivity seems to be dependant on the cell cycle position and on the physiological condition of the cell. For example, when cells grown with and without glucose are mixed, all prestalk cells in the slug come from the population grown without glucose. 252

262 Diferenciación celular en Dictyostelium discoideum / Cellular Differentiation in Dictyostelium discoideum las células que van a originar el tallo (25%, células pre-tallo) están situadas en la parte anterior del slug y el resto de la estructura está formado básicamente por las células que originarán las esporas. Los primeros signos de diferenciación celular se detectan al principio de la formación del mound, y las células pre-tallo aparecen distribuidas por toda la estructura para reunirse después en una región determinada y definir un patrón (ver figura 2). Esta diferenciación al azar, donde células sujetas a los mismos estímulos están respondiendo de manera diferente, se da en distintos momentos del desarrollo de eucariotas superiores, como la formación de la cresta neural. A nivel del individuo completo, crea un conflicto con los modelos ortodoxos de desarrollo (moscas, mamíferos) donde el establecimiento de gradientes de morfógenos es fundamental en la definición del patrón de diferenciación celular. Se ha demostrado también que las amebas poseen diferente sensibilidad intrínseca a las señales que inducen la diferenciación. Esta sensibilidad es dependiente de la posición en el ciclo celular en que se encuentran y de las condiciones fisiológicas de las células cuando llegan al mound. Así, por ejemplo, si se mezclan amebas cultivadas previamente con y sin glucosa, se observa que todas las células pre-tallo del slug (babosa) provienen de la población que ha crecido sin glucosa. Todos estos resultados parecen sugerir la ausencia de un gradiente y es necesario otro modelo para explicar cómo se inicia y prosigue la diferenciación celular en D. discoideum. Nos proponemos contribuir a entender las bases moleculares y fisiológicas de las diferentes respuestas de las células a los mismos estímulos. Para ello estamos aislando mutantes en la diferenciación celular provocada por DIF-1 en D. discoideum. We aim to understand the molecular and physiological basis underlying the different responses of cells to the same stimulus. We are now isolating Dictyostelium mutants unable to respond to DIF-1. The mechanism of cell death Another very interesting aspect of cell differentiation is the opportunity to study non-apoptotic programmed cell death. Besides the evolutionary aspect of cooperation: the fact that a 25% of the cells die to allow the survival of the rest, the molecular mechanism of cell death is totally unknown. Our preliminary experiments to establish the type of developmental cell death in Dictyostelium suggest the existence of more than one mechanism. This organism can be a very good model to study non-apoptotic cell death in eukaryotes. Muerte celular Otro aspecto muy interesante de este proceso de diferenciación es la muerte celular programada no apoptótica que sufren las células tallo, es decir el 25% de las amebas reunidas para el desarrollo. Al margen del componente evolutivo de la cooperación, es decir del hecho de que en un conjunto de amebas, una porción de ellas se sacrifique para que una mayoría sea capaz de sobrevivir, se desconoce el mecanismo concreto por el que esta muerte tiene lugar. 253

263 Biología Molecular de los cromosomas Eucarióticos / Molecular Biology of Eukaryotic Chromosomes Nuestros experimentos iniciales para establecer qué tipo de muerte ocurre en Dictyostelium apuntan a la existencia de más de un tipo de muerte celular. Dictyostelium puede ser un organismo idóneo para estudiar la muerte celular no apoptótica en eucariotas. Organismos Financiadores/Funding Agencies CICYT, BMC ( ) CAM, GR/SAL/0666/2004 (2005) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Josué Álvaro Blanco. Análisis de la fosforilación del factor de transcripción PacC y de la respuesta temprana al ph alcalino en Aspergillus nidulans. Universidad Autónoma de Madrid. Abril, Directora: T. Suárez. 254

264 Biología Molecular de Hongos Basidiomicetos Molecular Biology of Basidiomycete Fungi ALDO E. GONZÁLEZ BECERRA Jefe de Grupo / Group Leader Investigador de Carrera / Staff Scientist Mª CARMEN TERRÓN ORELLANA B. Postdoctoral / Postdoctoral Fellow JOSÉ Mª CARBAJO GARCÍA SUSANA YAGÜE PLAZA (Hasta IX-2004) B. Predoctorales / Graduate Students MARÍA LÓPEZ FERNÁNDEZ (Hasta VII-2004) ARANTXA RODA MORAZA (Hasta VII-2003) Estudiantes / Students Palabras clave: Hongos basidiomicetos, Lacasas, Ambientes extremos, Expresión génica Estudio de nuevas cepas de hongos basidiomicetos para cultivos en fase sólida y producción de enzimas oxidantes extracelulares Para este estudio se incorporaron a nuestros ensayos un grupo de hongos basidiomicetos de podredumbre blanca algunos de ellos próximos filogenéticamente al género Trametes procedentes de los bosques de la selva templada y lluviosa del cono sur de América y otros de la zona más cálida cercana al Ecuador. Se estudió su patrón enzimático en diferentes condiciones y medios de cultivo. En una primera fase los ensayos en cultivo sumergido demostraron su capacidad para producir diferentes isoformas de lacasas y peroxidasas en diferentes tiempos de incubación. La producción de cada una de ellas se correlacionó estrechamente con el medio de cultivo, en especial con la relación C/N, y con parámetros ya conocidos como el ph, la agitación o la presión de oxígeno. La respuesta frente a diferentes compuestos inductores de estas actividades condicionó fuertemente el nivel de proteína activa detectado, así como el número de isoformas. En estudios más básicos se ha hecho necesario uti- Key words: Basidiomycetous fungi, Laccases, Extreme environmental, Gene expression Study of new strains of basidiomycetous fungi grown on solidstate cultures and production of extracellular oxidative enzymes. In this study a group of white-rot basidiomycetous fungi were added to our assays. Some of them are phylogenetically close to Genus Trametes coming from forest of the warm and raining jungle located in South America, others coming from hotter locations close to Ecuador. Their enzymatic patterns produced at different culture media and culture conditions were studied. In a first phase the submerged-culture assays showed their capacity to produce different laccase and peroxidase isoforms at different incubation times. The production of each of these enzymes was notable correlated with the culture medium especially with C/N ratio and with parameters already known such as ph, agitation or oxygen pressure. The response to different inducers of these activities strongly conditioned the level of active protein detected, as well as the number of isoforms. As a basic research we have used strong inducers that will be not recommended in further applications due to their toxicity, but we have also kept 255

265 Biología Molecular de Hongos Basidiomicetos / Molecular Biology of Basidiomycete Fungi lizar inductores potentes que no son recomendables en posteriores aplicaciones por su toxicidad, pero también hemos continuado trabajando con inductores naturales que son inocuos para la salud humana y animal. Posteriormente se ensayaron estas cepas en sistema de fermentación en fase sólida para mejorar las condiciones de deslignificación industrial para lo que se construyó un prototipo de fermentador para controlar las variables antes mencionadas. Estos ensayos se han realizado en el grupo del Dr. J.C. Villar (CIFOR-INIA, Madrid) con el que mantenemos un convenio de cooperación inter-institucional, aprovechando la infraestructura y la amplia experiencia de este grupo en investigación en celulosa y papel. En esa misma dirección se puso a punto un sistema lacasa-mediador con el que se están llevando a cabo ensayos de blanqueo en pastas industriales con resultados satisfactorios. Las cepas de hongos han sido gentilmente cedidas por el Prof. Dr. Jorge Wright del Laboratorio de Micología de la Universidad de Buenos Aires, Argentina con el que mantenemos colaboración desde hace muchos años. Expresión y regulación de la transcripción de lacasas. Expresión heteróloga de las lacasas en levaduras industriales. En esta línea se continuaron los estudios de expresión en diferentes sistemas. En el caso de las enzimas se detectaron diferencias significativas en su producción dependiendo de las condiciones del medio pero sin embargo aún no teníamos datos de la expresión a nivel de los genes que las codificaban. En esta dirección se analizó la presencia de transcritos cuando se cultivaba el hongo en cultivo sumergido y en agitación, además se ensayaron una gran variedad de parámetros que teníamos conocimiento de que influían en las actividades enzimáticas. Con los mejores resultados de las cinéticas elegimos el día que se producía el máximo de actividad e hicimos estudios de inducción con diferentes compuestos aromáticos. Seleccionamos como modelo un hongo que probablemente tiene un sólo gen de lacasa y otro en el que hasta la fecha en que se hicieron estos experimentos, se habían clonado y descrito tres. La idea era cuantificar la expresión génica y para ello se utilizó la técnica de RT- PCR múltiple que ya habíamos puesto a punto. Se probaron una gran variedad de posibles inductores, desde isómeros de una molécula simple como el alcohol veratrílico (que algunos basidiomicetos lo producen de novo y que actúa on working with natural inducers that result innocuous for human beings and animals. Subsequently these strains were assayed in a solid-state fermentation system in order to improve the conditions of industrial delignification. With this aim, a fermenter prototype able to controlling the previously mentioned variables was constructed. These assays have been carried out in the Dr. J.C. Villar s team (CIFOR-INIA, Madrid) whom we maintain an inter-institutional cooperation agreement, taking advance of the infrastructure and of their wide experience in investigation on cellulose and paper. In this same direction, we have setup a laccase-mediator system to perform bleaching assays of industrial pulps with promising results. The fungal strains were a kind gift of Prof. Dr. Jorge Wright from Mycology Laboratory of Buenos Aires University in Argentina whom we have collaborated during many years. Expression and transcription-regulation of laccases. Laccase heterologous expression in industrial yeasts. In this line the expression studies using different systems were continued. Significant differences were detected in the production of enzymes depending on the culture conditions, nevertheless we did not have yet data regarding the expression of genes codifying for them. In this direction, the presence of transcripts when the fungus was grown on submerged culture and agitation conditions was analyzed. In addition a variety of parameters that we had evidences that affect on the enzymatic activities were assayed. The culture-day yielding the highest activity was selected to perform induction studies using different aromatic compounds. We selected as a model a fungus that probably has only one laccase-gene, and other one in which, up to date of experiments, three laccase-genes were cloned and described. The aim was to quantify the gene expression, and for that, the RT-PCR technique, already setup previously in our laboratory, was used. A wide variety of possible inducers were assayed. They ranged from isomers of a simple molecule such as veratryl alcohol (produced de novo by some basidiomycetes and able to induce these enzymes in almost all of them), to industrial effluents of complex composition and containing high aromatics content. In addition, different aromatic compounds which present minimal structural differences between them were assayed in order to know how these differences affect their capacity to 256

266 Biología Molecular de Hongos Basidiomicetos / Molecular Biology of Basidiomycete Fungi como inductor de estas enzimas en casi todos ellos) hasta efluentes industriales de composición compleja y con una alta carga de aromáticos. Asimismo se ensayaron diferentes compuestos aromáticos que presentaban diferencias estructurales mínimas entre ellos para ver cómo esas diferencias afectaban en la capacidad de inducción de las enzimas. Todo este conjunto de experimentos dio lugar a los siguientes resultados: i) La expresión de una familia de genes de lacasa en Trametes sp. I-62 es diferencial, tanto frente a pequeños cambios estructurales de un inductor como en presencia de sustratos complejos de alto peso molecular. El nivel de ARN sm fluctuaba dramáticamente en presencia de los diferentes isómeros del alcohol veratrilico mientras que la cantidad total de transcritos de lacasa parecía estar modulada por una regulación coordinada de los diferentes genes. ii) El incremento de la actividad enzimática está estrechamente relacionado con la expresión de los genes lcc, pero cada gen de manera individual se está transcribiendo de manera independiente de los demás aunque la sumatoria de la actividad aumenta en el curso de una cinética. En el caso de Trametes sp. I-62 detectamos un alelo del gen lcc1 al que hemos llamado lcc1a y que pone de manifiesto la importancia de las variantes alélicas en el avance de la genética en especies de heterocariontes tan complejas como éstas. Por otra parte, utilizando el ADNc del gen de lacasa cglcc1 de Coriolopsis gallica se hicieron construcciones para llevar a cabo la transformación heteróloga de levaduras que se han utilizado para blanquear pasta kraft de papel obteniéndose resultados preliminares que mostraron reducciones apreciables del nº kappa. También se obtuvieron resultados de interés transformando Saccharomyces cerevisiae con el mismo gen para tratar efluentes polifenólicos que provienen de la fabricación de la cerveza. En estas líneas de trabajo hemos colaborado en la parte de ingeniería genética con el grupo del Dr. Alan Dobson, Microbiology Dpto. Univ. Cork, Irlanda, el Dr. Ángel Domínguez, Departamento de Microbiología y Genética, CSIC, Univ. Salamanca y la Dra. María Fernández-Lobato, Fac. Ciencias. Univ. Autónoma, Madrid. Aislamiento de cepas y estudio de las actividades enzimáticas en ambientes extremos. Esta línea de investigación se orientó a la búsqueda de enzimas extracelulares oxidativas de hongos que crecen en ambieninduce the enzymes. All this group of experiments gave rise to the following results: i) the expression of a family of laccasegenes in Trametes sp. I-62 is a differential expression both against minor structural changes of the inducer molecule and in the presence of complex substrates of high molecular weight. RNAs level fluctuated dramatically in the presence of the different veratryl-alcohol-isomers assayed while the total amount of laccase transcripts seemed to be modulated by a regulation coordinated by the different genes. ii) The increment of enzymatic activity is closely related with the expression of lcc genes, but each gene individually is being transcribed independently of the others although the total amount of activity increases in the time-course of the experiment. In the case of Trametes sp. I-62 we have detected an allele of lcc1 gene named lcc1a, this reveals the importance of considering the allelic variants to make progress in the genetics of heterocaryon species such complex as these are. On the other hand, the cdna of the laccase-gene cglcc1 from Coriolopsis gallica was used to make some constructions to perform the heterologous transformation of some yeast strains. These yeasts were further utilized to bleach kraft paper-pulp rendering preliminary results that show noticeable reductions of kappa number. In addition, some promising results were attained transforming Saccharomyces cerevisiae with this same gene, the transformants were successfully used in the decolouration of polyphenolic effluents from a beer industry. In these research-lines we have collaborated in the genetic engineering part with the group of Dr. Alan Dobson, Microbiology Department. Univ. Cork, Irlanda, Dr. Ángel Domínguez, Departamento de Microbiología y Genética, CSIC, Univ. Salamanca and Dr. María Fernández-Lobato, Fac. Ciencias. Univ. Autónoma, Madrid. Isolation of strains from extreme environmental conditions and study of their enzymatic activities This research-line was oriented to look for extracellular oxidative enzymes in fungi growing in extreme environments such as high temperatures, acid ph or high metal concentrations. We have kept on with the studies on the diversity of microbiota of Tinto River that is an aquatic system with an extreme acid ph. In addition Tinto River is considered as a model to study the possible conditions of life that could exist on Mars sur- 257

267 Biología Molecular de Hongos Basidiomicetos / Molecular Biology of Basidiomycete Fungi tes extremos tales como altas temperaturas, ph ácido o elevada concentración de metales. Se ha dado continuidad a los estudios sobre diversidad en la microbiota de Río Tinto que es un sistema acuático con ph extremo y está siendo considerado como un modelo para estudiar las posibles condiciones de vida que han podido existir sobre la superficie del planeta Marte. En la UAMI México se ha continuado con la búsqueda de enzimas oxidantes extracelulares de hongos aislados en la zona de Mérida, Yucatán. En estos estudios hemos colaborado con los siguientes grupos: Dr. Ricardo Amils, Fac. Ciencias Univ. Autónoma, y Centro de Astrobiología, Madrid, Dr. Gustavo Viniegra y Dr. Sergio Huerta, Dpto. Biotecnología, Univ. Autónoma Metropolitana, México D.F., y finalmente con la Dra. Sara Solís, del Dpto. de Biotecnología de Universidad de Mérida Yucatán (México). face. The group of UAMI México have continued doing the screening of extracellular oxidative enzymes from fungi isolated in the location of Mérida Yucatán. In these studies we have collaborate with the following groups: Dr. Ricardo Amils, Fac. Ciencias Univ. Autónoma, Madrid, and Centro de Astrobiología, Madrid, Dr. Gustavo Viniegra, and Dr. Sergio Huerta Dpto. Biotecnología, Univ. Autónoma Metropolitana, México D.F., and Dr. Sara Solís, Dpto de Biotecnología, Univ. de Mérida, Yucatán (México). Organismos Financiadores/Funding Agencies CONACYT/UAMI, México ( ) CICYT, REN ( ) CICYT, AGL C03-03 AGR-FOR ( ) Tesis Doctorales/Doctoral Theses Susana Yagüe Plaza. Caracterización Fisiológica y Molecular del Proceso de Decoloración de un Efluente Industrial con el Basidiomiceto Coriolopsis gallica. Universidad de Alcalá. Julio, Director: A.E. González. Publicaciones/Publications Artículos en Revistas/Journal Articles González, T., Terrón, M.C., Zapico, E.J., Téllez, A., Yagüe, S., Carbajo, J.M., and González, A.E. (2003). Use of Multiplex Reverse Transcription-PCR to Study the Expression of a laccase Gene Family in a Basidiomycetous Fungus. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), González, T., Terrón, M.C., Zapico, E.J., Yagüe, S., Téllez, A., Junca, H., and González, A.E. (2003). Identification of a new laccase gene and confirmation of genomic predictions by cdna sequences of Trametes sp. I-62 laccase family. Mycol. Res. 107, Mansur, M., Arias, M.E., Copa-Patiño, J.L., Flärdh, M., and González, A.E. (2003). The white-rot fungus Pleurotus ostreatus secretes isoenzymes with different substrate specificities. Mycologia 95,

268 Biología Molecular de Hongos Basidiomicetos / Molecular Biology of Basidiomycete Fungi Arana, A., Téllez, A., González, T., and González, A.E. (2004). Aspectos generales de la biodegradación de la madera: aplicaciones industriales de las lacasas. BioTecnología. 7, Arana-Cuenca, A., Roda, A., Téllez, A., Loera O., Carbajo, J.M., Terrón, M.C., and González A.E. (2004). Comparative analysis of laccase-isozymes patterns of several related Polyporaceae species under different culture conditions. J. Basic Microb. 44 (2), Blanco, M.J., González, A.E., y Martín, C. (2004). Tratamiento biológico de suelos contaminados: contaminación por hidrocarburos. Aplicaciones de hongos en tratamientos de biorrecuperación. Rev. Iberoam. Micol. 21, López-Archilla, A.I., González, A.E., Terrón, M.C., and Amils, R. (2004). Ecological study of the fungal populations of the acidic river of Tinto River in southwestern Spain. Can. J. Microbiol. 50 (11), Terrón, M.C., González, T., Carbajo, J.M., Yagüe,S., Arana-Cuenca, A., Téllez, A., Dobson, A.D.W., and González, A.E. (2004). Structural close-related aromatic compounds have different effects on laccase activity and on lcc gene expression in the ligninolytic fungus Trametes sp. I-62. Fungal Genet Biol 41, Terrón, M.C., López-Fernández, M., Carbajo, J.M., Junca, H., Téllez, A., Yagüe, S., Arana-Cuenca, A., González, T., and González, A.E. (2004). Tannic acid interferes with the commonly use laccase-detection assay base don ABTS as rhe substrate. Biochimie 86, Próximos artículos/forthcoming Articles González, T., Terrón, M.C., Yagüe, S., Junca, H., Carbajo, J.M., Zapico, E.J., Silva, R., Arana, A., Téllez, A., and González, A.E. (2005). Distillery wastewater decolorization by the basidiomycetous fungus Trametes sp. I-62 is related with laccase gene induction. Appl. Environ. Microbiol. (en prensa/in press). Terrón, M.C., López-Fernández, M., Arana-Cuenca, A., González, A.E (2005). Induction by several aromatic compounds of the laccase activity recently described in strains of genus Trametes. Arch. Microbiol. (en prensa/in press). Patentes/Patents González Becerra, A.E., Villar Gutiérrez, J.C., y Silva Soto, R.A. 10 de Julio Procedimiento para la deslignificación de pastas de celulosa. Número: P Esta patente está siendo gestionada por empresas británicas para solicitar la licencia internacional. 259

269 Servicios Especiales Microscopía Electrónica/Electron Microscope Service DRA. CONCEPCIÓN GARCÍA MENDOZA Responsable Científico / Scientific Responsible DR. OSCAR A. LLORCA BLANCO Investig. Responsable Criomicroscopía / Cryomicroscopy Researcher Responsible JASMINKA BOSCOVIC (Hasta XII-2004) Mª DOLORES GUIRAO REY Personal Técnico / Technical Staff El Servicio de Microscopía Electrónica (SME) del CIB está equipado con un Microscopio Electrónico de Transmisión de 120 Kv JEOL JEM 1230, con cámara de TV de alta resolución y sistema de digitalización de imagen con software de control, así como con los accesorios para criomicroscopía (brazo de criotransferencia Gatan). El SME cuenta además con tres ultramicrotomos (dos LKB y un Reichert), dos equipos para hacer cuchillas (LKB), un vaporizador (Polaron Turbo), y un aparato de criosustitución (Reichert AFS). Para la utilización y mantenimiento de los equipos citados el SME dispone de dos técnicos, Mª Dolores Guirao y Jasminka The Electron Microscope Service (SME) of the CIB is equipped with a 120 kv Transmission Electron Microscope JEOL JEM 1230, with a high resolution TV chamber and an imaging digitizer with control software, and also with the cryomicroscopy accesories (Gatan cryotransfer). The SME is also equipped with three Ultramicrotomes (two LKB and one Reichert), two Knife Makers (LKB), one Vaporizer (Polaron Turbo) and one Cryosubstitution apparatus (Reichert AFS). For the correct use and maintenance of all the cited equipments the SME disposes of two technicians, Mª Dolores Guirao y Jasminka Boskovic who, besides teaching equipment handling 260

270 Servicios Especiales Boscovic que, junto con la enseñanza del manejo de los aparatos a los usuarios que así lo requieren, se ocupan también del procesamiento de muestras, e igualmente de la enseñanza de dichas técnicas. Con los equipos y personal señalados, el SME ofrece actualmente una microscopía electrónica convencional así como criomicroscopía. La Responsable Científica del SME es la Dra. Concepción García Mendoza, y el Investigador Responsable de la criomicroscopía es el Dr. Oscar Llorca. El SME permanece abierto de 8 h a 17,30 h para todos los usuarios potenciales (pertenecientes al CIB y externos). De 17,30 h a 19 h, únicamente podrán acceder los usuarios frecuentes del CIB con asistencia parcial. Actividad del Servicio durante el Bienio de Microscopía Electrónica Durante el año 2003 el Servicio de Microscopía Electrónica (SME) del CIB de la calle Velázquez permaneció en funcionamiento hasta el mes de Mayo utilizándose el Microscopio Philips 300, a la vez que se instalaba y comenzaba a funcionar el Microscopio Jeol 1230 en el mes de Marzo en el nuevo CIB. Además de los usuarios del CIB (9 en el Philips y 18 en el Jeol), ha utilizado el SME el Instituto Torroja, habiéndose alcanzado 85 h de utilización del M. Philips y 271 h del M. Jeol, con 240 placas fotográficas impresionadas en el Philips y 1288 en el Jeol, 25 series de cortes ultrafinos observados en el Philips y 13 en el Jeol, 6 series de sombreados en el Philips y 30 en el Jeol, realizándose 2 series de preparaciones mediante criosustitución. En el año 2004 han utilizado el Microscopio Jeol del actual SME, 22 usuarios del CIB y otros usuarios del Centro Nacional de Biotecnología, Instituto del Frío, Instituto de Química Física Rocasolano, Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, y Facultades de Ciencias Biológicas y Ciencias Químicas de la Universidad Complutense, alcanzándose 802 h de observación, con 3841 placas fotográficas impresionadas, realizándose 67 series de cortes ultrafinos, 48 series de sombreados, 2 series de inclusión de muestras, 23 series de preparaciones mediante criosustitución y 28,5 sesiones de criomicroscopía to the interest staff, are also in charge of the sample processing as well as its teaching. With the cited equipment and technicians the SME offers today a conventional electron microscopy as well as cryomicroscopy. The SME Scientific Responsible is Dr. Concepción García Mendoza, and the Cryomicroscopy Researcher Responsible is Dr. Oscar Llorca. The SME remains open from 8 h to 17,30 h for the possible users (associated to the CIB and also external). From 17,30 h to 19 h, it will only be accessible to the CIB frequent users with partial assistance. Activity Report of the Electron Microscope Service During the year 2003 the Electron Microscope Service (SEM) of the CIB at Velázquez Street continued working until May using a Philips 300 Electron Microscope, whereas the Jeol 1230 Electron Microscope was installed in the new CIB (at the University Campus) and started to be used in March. Not only the CIB has utilized the SME (9 scientists in the Philips and 18 in the Jeol) but also the Torroja Institute. During this time 85 h of observation in the Philips and 271 in the Jeol have been reached which resulted in 240 exposed photographic plates in the Philips and 1288 in the Jeol, 25 series of ultrathin sections for the Philips and 13 for the Jeol, 6 series of shadowed samples for the Philips and 30 for the Jeol, performing also 2 series of cryosubstitution samples. In the year 2004 the Jeol Microscope of the actual SME has been utilized by 22 scientists of the CIB and other people of the following Institutions, Centro Nacional de Biotecnología, Instituto del Frío, Instituto de Química Física Rocasolano, Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, and Facultades de Ciencias Biológicas y Ciencias Químicas de la Universidad Complutense. During this time 802 h of observation were reached providing 3841 exposed photographic plates, performing 67 series of ultrathin sections, 48 series of shadowed samples, 2 series of inclusion samples, 23 series of cryosubstitution samples and 28,5 cryomicroscopy sessions. 261

271 Servicio de Animalario/The Animal Facility DR. JOSÉ Mª ROJO HERNÁNDEZ Responsable Científico / Scientific Responsible NOHEMÍ ARELLANO SÁNCHEZ ISABEL CHICO CALERO (Hasta XII-2003) GABINO GARCÍA AMAYA FRANCISCO JOSÉ GARCÍA GONZÁLEZ JORGE HUERTAS LATORRE MANUEL MORENO CALLE SUSANA SERNA MARTÍNEZ ISABEL TORRES VIDAL Personal Técnico / Technical staff El Animalario del Centro de Investigaciones Biológicas produce y mantiene los animales necesarios para el trabajo de los investigadores del Centro. No existen restricciones para la utilización de cualquier especie de laboratorio, pero teniendo en cuenta los intereses mayoritarios de los investigadores y el espacio disponible, en estos momentos solamente trabajamos de modo permanente con ratones y conejos, y esporádicamente con ratas y hámsters. Áreas El servicio ocupa una superficie de unos 450 m 2. Hay instalaciones destinadas específicamente a la estabulación de conejos y de ratones. El espacio dedicado a los ratones consta de tres áreas separadas, claramente definidas. 1) Área de producción: La producción se realiza bajo barrera en condiciones libres de gérmenes patógenos específicos (SPF). Se realizan controles periódicos para detectar la presencia de estos gérmenes. 2) Área de Investigación: Se trata de una área limpia, próxima al área de producción, en la que no se pueden garantizar las condiciones SPF de ésta área. A ella accede tanto el personal del Servicio como los investigadores autorizados, que deben utilizar bata estéril, guantes, gorro, mascarilla y calzas. 3) El Área de cuarentena se encuentra físicamente separada del resto de las instalaciones. Está destinada a la realización de experimentos con ratones procedentes de otras instalaciones, o al mantenimiento de cepas de ratón hasta su rederivación por transferencia de embriones. Servicios que se prestan a los usuarios del CIB En relación con la producción y mantenimiento de animales: El Animalario produce ratones de cualquier cepa o línea que necesiten los investigadores de la edad y sexo necesaria. El resto The Animal Facility of the Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) produces and maintains the animals needed for the work along the different research lines carried out by scientists in our Centre. There are no restrictions to the use of experimental animal species, yet the actual research interest and the available space limit our permanent stocks to mice and rabbits, plus occasional stock of rats and hamsters. Areas The size of the Animal Facility is about 450 m 2. There are separate facilities specific for the maintenance of mice and rabbits. The mouse facilities are divided in three distinct, clearly defined areas: Production area: Breeding of mouse strains is carried out under specific pathogen-free (SPF) conditions. The colony is periodically checked for the presence of pathogens. Research area: In this clean area, physically close to the Production area, SPF conditions cannot be guaranteed. However, the access is restricted to service personnel as well as to authorized researchers wearing sterile cloak, gloves, cap, mask, and shoe covers. Quarantine area: This is a separate facility used to carry out experimental procedures with mice obtained from other facilities, or to maintain mouse strains waiting for a cleanout process by embryo transfer. Services provided to CIB users Related to breeding and maintenance of animals, the Animal Facility breed mice of any strain, of any age and sex needed by scientist in our Centre. All other species, including rabbits, are purchased from specialized dealers. We provide female mice with known date of gestation and carry out all other tasks related to inoculation and extraction of 262

272 Servicios Especiales de especies, incluyendo los conejos, se adquieren en empresas especializadas. También se suministran hembras con fecha de gestación conocida, se realizan tareas de inoculación y extracción de fluidos, extracción de órganos y sacrificio de animales, incluyendo las relacionadas con la producción de anticuerpos monoclonales en ratón y policlonales en ratón y conejo. Asimismo, se realizan controles serológicos y parasitológicos de los animales estabulados. En relación con la producción de ratones transgénicos: Se realiza la vasectomía de ratones, se suministran hembras pseudogestantes de la fecha deseada, y se realiza la rederivación de líneas mediante transferencia de embriones. Servicios ofrecidos a usuarios externos: Rederivación de líneas mediante transferencia de embriones. fluids, extraction of organs and animal sacrifice. These include those related with the production of monoclonal antibodies in mice, or the production of polyclonal antibodies in mice and rabbits. Serology and parasitology control of animals in the colony is also performed. Related to the generation of transgenic mice, we perform vasectomy of male mice, provide pseudogestant female mice with known date, and carry out re-derivation of mouse strains by embryo transfer. Services offered to external users: Re-derivation of mouse strains by embryo transfer. Cromatografía/Chomatography DR. JUAN ANTONIO LEAL OJEADA Responsable Científico / Scientific Responsible PROF. JUAN MANUEL RAMÍREZ DE VERGER Responsable Científico (MALDI-TOF) / Scientific Responsible (MALDI-TOF) ALICIA PRIETO ORZANCO Investigadora de Carrera / Staff Scientist El Servicio de Cromatografía del Centro de Investigaciones Biológicas se creó en el año 1988 para cubrir la demanda de usuarios internos o procedentes de otros centros e instituciones. La cromatografía de gases está indicada para la separación, identificación y cuantificación de sustancias volátiles (o susceptibles de serlo tras la adecuada derivatización). Los equipos disponibles son un cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama y otro con detector de masas (GC-MS), ambos de Perkin-Elmer. En 1996 el CIB adquirió un espectrómetro de masas de MALDI-TOF (Bruker) que pasó a formar parte del Servicio. Este equipo permite determinar la masa molecular de material biológico o sintético. The Gas Chromatography service was created in 1988 in order to fulfil the needs of CIB and external users. This technique allows the separation, identification and quantification of volatile analyses. The available instruments are a gas chromatograph with flame ionisation detector and other with a mass detector (GC-MS), both from Perkin-Elmer. In 1996 the CIB acquired a MALDI-TOF instrument (Bruker) which was incorporated to the Service. This instrument permits molecular mass determination of biological or synthetic samples. 263

273 Espectroscopía / Spectroscopy PROF. JUAN MANUEL RAMÍREZ DE VERGER Responsable Científico / Scientific Responsible El Laboratorio de Espectroscopía (LE; sala S17) facilita la aplicación de diversas técnicas espectroscópicas a los grupos de investigación del Centro. Los equipos disponibles son: The Spectroscopy Lab (room #S17) houses several pieces of spectroscopic equipment that may be needed by the research groups. The following instruments are installed at the present time: Espectrofotómetro uv-vis de precisión Cary 4000, de Varian. Espectropolarímetro (dicrógrafo) Jasco J700. Espectrofotómetro infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR), Bruker IFS28. Espectrofotómetro de absorción atómica, Perkin Elmer Espectrofluorímetro modular Fluorolog, de Jobin Yvon Spex. Equipo modular de stopped flow, de Bio-Logic. Lector de placas Olarstar Galaxy. Luminómetro Star DP8340. Refractómetro diferencial Dn-1000, WGE Dr Bures (este instrumento se instalará próximamente como detector de un cromatógrafo en el laboratorio 308, sin que cambie su régimen de utilización). Precision uv-vis spectrophotometer Cary 4000 (Varian) Spectropolarimeter (dichrograph) J700 (Jasco) FTIR spectrophotometer IFS28 (Bruker) Atomic absorption spectrophotometer Perkin Elmer 2380 Modular spectrofluorimeter Fluorolog (Jobin Yvon Spex) Modular stopped-flow system (Bio-Logic) Microplate reader Olarstar Galaxy Luminometer Star DP8340 Differential refractometer (Dn-1000, WGE Dr Bures) Each instrument at the Lab has a staff scientist as its specific supervisor. Users should address to her/him for instructions and doubts on either the technique or the instrument itself. A list of the supervisors and their phone extensions is posted at the entrance door of room #S17. El LE no tiene ningún técnico dedicado, por lo que para consultas o dudas sobre el uso de los diversos instrumentos se debe acudir al supervisor específico de cada uno de ellos (véase listado a la entrada del propio LE) o al coordinador del servicio, Juan M. Ramírez de Verger. 264

274 Cultivo de Células Animales / Animal Cell Culture Facility DR. AUGUSTO SILVA GONZÁLEZ Responsable Científico / Scientific Responsible BLANCA PÉREZ MACEDA Investigadora de Carrera / Staff Scientist Mª ESTHER MIGUEL GÓMEZ (Hasta II-2004) Personal Técnico / Technical staff Correo electrónico: bpm@cib.csic.es,.ccelulas@cib.csic.es Banco de Células Humanas y Animales En la actualidad consta de 80 líneas Cell Bank.xls, incluyendo 17 hibridomas, de origen conocido y libre de micoplasmas. Este Banco se encuentra a disposición de la comunidad científica, pudiendo solicitar las células cuando así se precise. Las células se entregan bien en cultivo en frasco de 25 cm 2 ó bien directamente congeladas en un criovial. Detección y Eliminación de micoplasmas El Servicio lleva a cabo, la detección de micoplasmas en líneas celulares y medios de cultivo mediante tinción DNA-Hoechst utilizando la línea celular Vero como indicadora. También elimina el micoplasma de los cultivos contaminados, mediante tratamiento con diferentes antibióticos específicos. Este es un procedimiento lento y que no siempre se puede garantizar. En los dos últimos años se han tratado un total de 18 líneas celulares contaminadas con micoplasmas, todas ellas tratadas con éxito. Selección de Suero Fetal Bovino El Suero Fetal Bovino presenta variaciones tanto entre los distintos proveedores como entre lotes del mismo proveedor. El Servicio selecciona un lote/s de SFB, que se ofrece como reserva general del CIB a aquellos grupos que quieran utilizar el mismo lote que utiliza este laboratorio. Actualmente tenemos dos lotes reservados de diferentes distribuidores. La duración de esta reserva se calcula en un período entre 18 a 24 meses. The Animal Cell Culture Facility of the CIB offers the following services: Human and Animal Cell Bank Contains a collection of 80 cell lines Cell Bank.xls, including 17 hybridomas, of known origin and mycoplasma-free. This human and animal cell collection has been established to make the cells available to the scientific community. The cell lines can be supplied as a growing culture in a 25 cm 2 culture flask or as frozen vials. Testing and removal of Mycoplasma Cell lines and culture media can be tested for mycoplasma contamination by Hoechst DNA stain using Vero cells as indicators. For mycoplasma contaminated cell lines this Facility offers a service to remove mycoplasma with specific antibiotics. This procedure often requires the subsequent sub-cloning of the cells and functional checking. The last two years we have treated 18 mycoplasma contaminated cell lines successfully. Foetal Bovine Serum Selection A significant variation between different Foetal Bovine Serum batches and suppliers and the general use of FCS under different culture conditions require testing and selection. This Facility selects batches of FBS and offers to CIB users the possibility to reserve aliquots of the serum batch of their wish. Actually, we have two FCS batches from two independent suppliers. The reserved batch has duration of 18 to 24 months. 265

275 Química de Proteínas / Protein Chemistry Core Facility PROF. GUILLERMO GIMÉNEZ GALLEGO Responsable Científico / Scientific Responsible JOSÉ JAVIER VARELA ESPINOSA Investigador de Carrera (en funciones) / Staff Scientist EMILIA APORTA SOSA Personal Técnico / Technical staff En la actualidad el Servicio de Química de Proteínas dispone de los siguientes equipos: Secuenciador de proteínas (Perkin Elmer, Procise 494). Permite establecer la secuencia amino terminal de péptidos y proteínas mediante degradación secuencial de Edman. Se requieren pmol de muestra pura (proteína/péptido), que puede estar en solución o electrotransferida a membrana de PVDF. Sintetizador de péptidos (Perkin Elmer, Synergy). Trabaja con química Fmoc y puede sintetizar péptidos de hasta 30 residuos en una única escala de 25 µmoles. Sintetizador de oligonucleótidos (Applied Biosystems 3400). Puede realizar 4 síntesis simultáneas, con un tiempo de proceso total inferior a 4 horas para oligonucleótidos de 25 bases. Existen tres escalas de síntesis disponibles: 0.04, 0.2 y 1 µmol. Analizador de aminoácidos (Pharmacia, Biochrom 20). Permite determinar cuantitativamente la composición de aminoácidos de hidrolizados de péptidos y proteínas. La separación de los aminoácidos tiene lugar mediante cromatografía de intercambio catiónico y la derivatización es postcolumna con ninhidrina. Se requieren 5-10 µg de proteína/péptido puros. Cromatógrafos de líquidos. Equipo de alta presión (0-25 MPa) HPLC (ÄKTA, Amersham Pharmacia Biotech), equipo de media presión (0-5 MPa) FPLC (Pharmacia) y equipo de baja presión (0-1 MPa), (ÄKTA prime, Amersham Pharmacia Biotech). Permiten la purificación de una gran variedad de moléculas. En el servicio se utili- The protein chemistry core facility has, at this moment, the following equipment: Protein sequenator Perkin Elmer, Procise 494. It performs automatically the N-terminal Edman degradation of proteins and peptides to establish their primary structure. It works with pmol of analyte, which is loaded in the sequenator either from a solution or blotted in a PVDF membrane. Peptide synthesizer Perkin Elmer, Synergy. It uses Fmoc chemistry and synthesizes peptides up to 30 residues at a 25 µmol scale. Oligonucleotide synthesizer Applied Biosystems It can perform up to four simultaneous syntheses at a rate of 6.25 incorporated bases per hour. It has three synthesis scales: 0.04, 0.2 y 1 µmol. Amino acid analyzer Pharmacia, Biochrom 20. It allows to determine the amino acidic composition of proteins and peptides. It uses cationic exchange chromatography and postcolumn ninhidrine derivatization to separate and identify the different amino acids. It requires between 5 and 10 µg of pure analyte per analysis. Liquid chromatography setups: ÄKTA 900 (Amersham Pharmacia Biotech); FPLC (Pharmacia); ÄKTA prime (Amersham Pharmacia Biotech). They are mainly used for protein and peptide purification. The Protein chemistry core facility has been used by many scientists from the CSIC, Universities from all over Spain and 266

276 Servicios Especiales zan mayoritariamente para purificar péptidos y proteínas. Durante estos dos años el Servicio ha prestado apoyo científico técnico a un gran número de grupos de investigación, tanto del CSIC como de otros organismos públicos de investigación y algunas empresas privadas. El número de trabajos realizados en este periodo aparece reflejado en la siguiente tabla: Total Síntesis de Nº ciclos síntesis oligonucleótidos Nº oligonucleótidos Secuencias de Nº ciclos proteínas Nº muestras Análisis de aminoácidos Horas de uso de cromatógrafos Síntesis de péptidos industrial laboratories. A summary of the work carried out along the period appears in the following table: Total Oligonucleotide Number of cycles synthesizer Number of oligos Protein Number of cycles Sequenator Number of samples Amino acid analyzer Chromatography hours Peptide synthesizer Citometría de Flujo / Flow Citometry Facility DR. AUGUSTO SILVA GONZÁLEZ Responsable Científico / Scientific Responsible PEDRO LASTRES VARO Investigador de Carrera / Staff Scientist El servicio de citometría de flujo está equipado con un analizador EPICS, Coulter con un láser de argón sintonizado a 488 nm capaz de procesar seis señales simultáneas: dos de dispersión y cuatro de fluorescencia en el rango de 525 a 675 nm y un separador modelo FACS Vantage, Becton Dickinson, equipado con un láser de argón (emisión a 360 y 488 nm simultáneamente) y un láser de He- Ne con emisión a 635 nm, con capacidad para procesar The Flow cytometry Facility is equipped with a Coulter analyzer with an argon laser tune at 488 nm and able to analyze simultaneously Forward and side scatter and four fluorescence signals from 525 to 675 nm. The Service is also equipped with a FACS Vantage, Becton Dickinson Sorter, with an argon laser (emission at 360 and 488 nm simultaneously) and an He-Ne laser emission at 635 nm, with capacity to analyze seven signals simultaneously 267

277 Servicios Especiales siete señales simultáneas: dos de dispersión y cinco de fluorescencia en el rango 424 a 670 nm. Este servicio es utilizado de forma rutinaria por 30 grupos de trabajo. Algunas de las aplicaciones que se llevan a cabo son: Serotipaje y detección mediante inmunofluorescencia de antígenos en células eucariotas. Identificación de genes reporteros mediante inmunofluorescencia. Caracterización de mutantes de levaduras de ciclo celular y de función, asociados a cambios de potencial de membrana plasmática y/o mitocondrial. Ensayos de viabilidad celular mediante medidas de dispersión, captación de fluorocromos tipo aniónico (oxonoles), y catiónicos (cianinas). Evaluación de los cambios en el potencial de membrana plasmática, como medida de la toxicidad de compuestos (péptidos, etc.) con actividad citotóxica. Fenotipaje celular con fluorocromos. Análisis del ciclo celular (Ioduro de Propidio, Hoechst). Apoptosis y necrosis. Monitorización del ciclo celular mediante marcaje con BrdU. Análisis estructural de la cromatina con fluorocromos de efecto metacromático (Naranja de Acridina). Caracterización de vías de señalización en dobles transfectantes mediante trazadores tipo GFP, BFP (green, blue fluorescent proteins). Determinación de asociaciones moleculares mediante ensayos de transferencia de radiación entre fluorocromos. Producción de metabolitos del oxígeno (superóxido, peróxido y óxido nítrico). Cambios de ph intracelular y flujos de Ca 2+ con fluorocromos de excitación en el espectro visible. (FSC, SSC, and five fluorescence signals between 424 to 670 nm) More than 30 research groups have been using this Facility, 20 from CIB. The most frequent applications were: Serotyping and detection of cell surface antigens by immunofluorescence. Identification of reporter genes through fluorescence s dyes. Characterization of cell cycle and functional mutants in yeast associated to changes at the plasmatic or mitochondrial membrane potential. Cell viability assays through dispersion measurements, fluorochroms trapping anionic (oxonols), and cationic (cyanine). Changes of membrane potential as a cellular toxicity measure. Cellular Phenotyping with fluorochromes. Cell cycle analysis (Propidium Iodide, Hoechst). Apoptosis and necrosis. BrdU labelling of cell cycle analysis. Structural analysis of the Chromatin by fluorochromes with metachromatic effect (Acridine Orange). Characterization of signalling in transfected with GFP, BFP (green, blue fluorescent proteins). Determination of molecular association using radiation transference assays between fluorochromes. Oxigen reactive species analysis (superoxide, peroxide and nitric oxide). Changes in intracelular ph and Ca 2+ flux with specific fluorochromes. 268

278 Esterilización y Cocina de Medios / The Sterilization & Culture Media Preparation DR. EDUARDO DÍAZ FERNÁNDEZ (Desde IX-03) DR. JUAN ANTONIO LEAL OJEDA (Hasta XII-03) Responsables Científicos / Scientific Responsibles ROSA DÍAZ LÓPEZ Mª ESTHER DE MIGUEL GÓMEZ (Desde II a XI-04) VIRGINIA QUESADA GUERRERO Mª TERESA SEISDEDOS DOMÍNGUEZ (Hasta II-04) Personal Técnico / Technical staff El Servicio de Esterilización del CIB es el encargado de esterilizar, mediante calor seco o húmedo, el material de trabajo o de desecho, de los distintos grupos de investigación. El Servicio de Esterilización del CIB dispone de los siguientes aparatos: 2 hornos (D06836, Memmert), para esterilización por calor seco. 2 autoclaves de 490 L (LE-2, LV-1, Matachana) y 2 autoclaves de 165 L (500V-2, Matachana), para esterilización por calor húmedo. En uno de los hornos se esteriliza a 160ºC el material de vidrio de los diferentes grupos del Centro. El otro horno se destina a la esterilización a 230ºC del material de vidrio previamente tratado con NaOH y que será utilizado para la obtención y manipulación de RNA. Todo este material llega al servicio de esterilización antes de las 10:30, y se recoge al día siguiente. En los cuatro autoclaves se esteriliza diariamente material sólido y líquido a diferentes presiones y temperaturas. El material sólido se recibe antes de las 13:00, envuelto con el papel apropiado (papel crepado color verde) y perfectamente identificado. El material líquido se recibe en frascos Pirex convenientemente identificados y antes de las 12:30. Cuando se trata de medios líquidos que no soportan la temperatura de esterilización estándar de 120ºC, como es el caso por ejemplo de muchos azúcares, se procede a su esterilización a 110ºC, y estos medios se reciben antes de las 11:30. El material que se esteriliza en los autoclaves queda disponible para su uso el mismo día. El material de desecho, es decir, residuos biológicos o de otro tipo, debe llegar al servicio en bolsas adecuadas para su tratamiento y perfectamente identificadas. Estas bolsas se introducen The Sterilization Service of the CIB is devoted to sterilize, through dry or wet heat, the working material and wastes of the different research groups. The Sterilization Service has: Two ovens (D06836, Memmert) for sterilization by dry heat. Two autoclaves of 490 L (LE-2, LV-1, Matachana) and 2 autoclaves of 165 L (500V-2, Matachana), for sterilization by wet heat. One oven is used to sterilize at 160ºC the glass material of the different groups of the Center. The second oven is used to sterilize at 230ºC the glass material that has been previously treated with NaOH and that will be utilized for the isolation and manipulation of RNA. This material must arrive to the service before 10:30, and it is given back the next working day. Every day, solid material and liquids are sterilized at different pressures and temperatures in the four autoclaves. Solid material is received before 13:00 conveniently wrapped and identified. The liquid material is received before 12:30 in glass bottles accurately identified. In those cases that liquids do not support the standard sterilization temperature (120ºC), as is the case of several sugars, sterilization takes place at 110ºC and these media should arrive to the service before 11:30. All materials sterilized in the autoclaves are ready for use within the same day. Waste material, i. e., biological residues, etc., must be conveniently wrapped and identified in plastic bags. The bags are introduced in the autoclaves within metallic containers and once they are sterilized, they must be taken back from the Service in the next 24h. The Culture Media Preparation Service is associated to the Sterilization Service and it has all the necessary equipment (bal- 269

279 Servicios Especiales en los autoclaves en contenedores metálicos y se deben retirar del servicio en las próximas 24h. El servicio de Cocina de Medios está asociado al servicio de Esterilización y cuenta con todo el equipamiento necesario (balanzas, ph metro, agitadores, neveras, etc.) para la preparación y almacenamiento de medios de cultivo (e.g., LB, LB-agar) y soluciones estériles (e.g., PBS, EDTA, TBE, TAE, Tris-HCl ph 7.4, etc.) que son de uso común y están a disposición de todos los grupos del Centro. Actualmente se ha iniciado la preparación de soluciones libres de RNasas (e.g., SDS, NaCl, Tris- HCl, EDTA, NaOH, SSC, etc.), lo que, en gran medida, facilitará la labor a todos aquellos grupos que trabajan con RNA. ances, ph meter, stirrers, refrigerators, etc.) for preparation and storage of culture media (e.g., LB, LB-agar) and sterile solutions (e.g., PBS, EDTA, TBE, TAE, Tris-HCl ph 7.4, etc.). Recently, the Service is also preparing RNase-free solutions (e.g., SDS, NaCl, Tris-HCl, EDTA, NaOH, SSC, etc.) for those groups working with RNA. Microscopía Confocal y CCD / Confocal and CCD Microscopy Service PROF. Mª DEL CARMEN RISUEÑO ALMEIDA Responsable Científica / Scientific Responsible Mª ANGELES OLLACARIZQUETA DONAZAR (Hasta VII-2004) MIRELLA MARTÍNEZ CENDEJAS (Desde II a XII-2004) Mª TERESA SEISDEDOS DOMÍNGUEZ (Desde II-2004) Personal Técnico / Technical staff En marzo del año 2003 quedó finalmente instalado y en pleno funcionamiento el equipo de microscopía confocal Leica, quedando el equipamiento del Servicio como sigue: * CLSM Leica TCS SP2 equipado con 9 líneas de láser y sistemas AOTF y AOBS. (Facilidad de observación para UV y amplio rango GFPs, realización de FRET, FRAP y otros análisis dinámicos). * Cámara CCD Photometrics CH 250/A sobre MO Zeiss Axioplan. * CLSM BioRad MCR 1024 sobre MO Axiovert 135 Zeiss. Lo que nos ha permitido aportar resultados a 36 grupos de investigación del CIB y de otros centros públicos de Investigación. Since the installation of the new Leica confocal microscope in March 2003, the equipments running in the service are as follows: * Leica CLSM TCS SP2 with 9 laser lines and AOTF and AOBS systems (for UV emission and wide range of GFPs observation, FRET, FRAP and other dynamic analysis). * Photometrics CCD camera CH 250/A on a LM Zeiss Axioplan. * BioRad CLSM MCR 1024 on an inverted LM Zeiss Axiovert 135. The service is used by 36 research groups of the CIB and other institutes. The confocal microscopes have been used for 1700 hours and 270

280 Servicios Especiales Las horas utilizadas por los usuarios son: en el caso de los equipos confocal 1700 y en el equipo de microscopía de fluorescencia con cámara CCD alrededor de Las imágenes obtenidas se facilitan en CD o DVD o se envían por la red del Centro a cada laboratorio. Se ha intentado mantener un bajo coste de tarifas para lo cual se ha establecido un sistema de adquisición y pago por bloques de horas de plazo limitado. El Servicio mantiene un stock bastante amplio de fluorocromos que adquiere sobre la base de las necesidades de los usuarios y facilita alícuotas a bajo costo. El número de alícuotas proporcionadas por este servicio ha sobrepasado el centenar. Asimismo se han facilitado numerosas impresiones de imágenes de alta calidad y se sigue proporcionando papel de impresión de diversas clases a usuarios y no usuarios. Estas facilidades están destinadas a generar fondos destinados a la autofinanciación. Con objeto de promocionar y rentabilizar el equipo Confocal de última generación, el Servicio ha organizado un Simposio sobre Biología Analítica y Bioimaging en Microscopía Confocal que tuvo lugar el de Junio de 2004, y que ha sido patrocinado por el CIB, la Sociedad Española de Biología Celular, Leica Microsistemas S.A. y la Rama Española de la ETCS. La acogida fue muy favorable y el número de inscritos de 110. El Simposio se dirigía a investigadores interesados en el estudio de la dinámica de moléculas y procesos en células y tejidos, con especial énfasis en células vivas. Se impartieron 10 conferencias a cargo de especialistas de relevancia sobre las últimas novedades en FRET, FRAP, uso de la GFP, localizaciones multicolores y bioimaging tridimensional, técnicas de gran relevancia en Biología Analítica y que están actualmente disponibles en el Servicio de Microscopía Confocal y CCD. Finalmente el Servicio ha colaborado en la formación de personal técnico especializado en mantenimiento, manejo de los equipos y programas de análisis de imagen, en diversos cursos de doctorado y de especialización, y muy especialmente en la organización de charlas y simposium de acercamiento a las múltiples posibilidades de estas técnicas de biología analítica. the fluorescence microscope equipped with a CCD camera for 1000 hours. The images can be retrieved either on CDs and DVDs or through the network. A low-cost fare system has been established by pre-paid blocks of a limited number of hours. The service keeps a wide range stock of fluorochromes to cover the needs of the users at a low-cost aliquots basis. Over a hundred aliquots were sold. Print-outs of high quality images are also available on quality paper provided by the service. The revenue obtained by the use of these facilities is aimed to selffunding. To promote the brand-new confocal microscope, the service organised a symposium on Analytical biology and bioimaging in confocal microscopy that was held on June 24-25, The course was sponsored by the CIB, Leica and the Spanish branch of the ETCS. The symposium was addressed to researchers interested in dynamic studies of molecules and processes and, in particular, life-imaging. 110 researchers attended. The symposium consisted in 10 lectures from relevant researchers with expertise in novel technologies for analytical biology, now available in the CIB, who presented the latest advances in FRET, FRAP, GFP imaging, multicolour localisations and 3D bioimaging. The service has contributed to the training of technicians for the maintenance and handling of the equipments and the use of image analysis software packages. Also contributes to the organisation of courses for PhD students and specialists and lectures to promote the techniques of analytical biology. 271

281 Ultracentrifugación Analítica/Analytical Ultracentrifugation DR. GERMÁN RIVAS CABALLERO Responsable Científico / Scientific Responsible CARLOS ALFONSO BOTELLO Personal Técnico / Technical Staff La ultracentrifugación analítica consiste en un importante conjunto de métodos únicos (equilibrio y velocidad de sedimentación) que permiten la determinación del tamaño y la forma aproximada de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución. Estos métodos están especialmente adaptados para la detección y el análisis cuantitativo (estequiometría, afinidad) de las interacciones reversibles que dan lugar a la formación de complejos macromoleculares, que incluyen interacciones proteína-proteína, DNA- proteína y receptor- ligando. La Unidad de Ultracentrifugación Analítica del CIB posee dos ultracentrífugas analíticas de nueva generación: la primera de ellas (modelo XL-A, adquirida en 1994) está equipada con un sistema óptico de detección UV-VIS; la segunda (modelo XL-I, instalada en 2004), cuenta con un sistema adicional de detección mediante interferencia que permite el estudio de macromoléculas en disoluciones con alta absorción en el UV-VIS. Esta Unidad recientemente ha comenzado a incorporar técnicas complementarias (en una primera fase, dispersión de luz dinámica), que permite el abordaje integral de interacciones macromoleculares en disolución, con todos los conocimientos y experiencia necesarias, y además con la colaboración de expertos internacionales en el tema. Durante el bienio , esta Unidad del CIB ha continuado dando apoyo científico-técnico en la caracterización biofísica de proteínas y sus interacciones a un considerable número (52) de grupos de investigación tanto del CIB, como de otros centros del CSIC, así como de departamentos universitarios y otros centros de investigación nacionales y extranjeros. Analytical ultracentrifugation is an important group of unique methods (sedimentation equilibrium and velocity) which allow the determination of the size and approximate shape of proteins and other biological macromolecules in solution. These methods are specially adapted for the detection and quantitative analysis (stoichiometry, affinity) of reversible interactions leading to the formation of macromolecular complexes (including protein-protein, DNA-protein, and receptor-ligand interactions). The Analytical Ultracentrifugation Facility at CIB has two modern analytical ultracentrifuges: the first one (model XL-A, acquired in 1994) has a UV-VIS optical detection system; the second one (model XL-I, installed in 2004) has an additional detection system (interference) that allows the study of systems in solutions with a high absorption in the UV-VIS. The Facility has recently begun to incorporate complementary technologies (in a first stage, dynamic light scattering) for the integral approach of macromolecular interactions in solution, with the required knowledge and expertise, and with the advice of international experts in the field. During the Analytical Ultracentrifugation Facility has given technical and scientific advice and support on the biophysical characterization of proteins and their interactions to a considerable number (52) of research groups of CIB, other CSIC institutes, as well as university departments and research centers. 272

282 Servicio de secuenciación automática de DNA Automatic DNA sequencing facility PROF. SANTIAGO RODRÍGUEZ DE CÓRDOBA PROF. JOSÉ LUIS GARCÍA LÓPEZ Responsables Científicos / Scientific Responsibles SONIA CARBAJO GARCÍA MERCEDES CASQUEIRO Mª LUISA CAYUELA DE PEDRO ASUNCIÓN DÍAZ CARRASCO Personal Técnico / Technical staff Palabras clave: Secuenciación DNA, PCR cuantitativa El Servicio de Secuenciación automática de DNA del CIB (SSAD-CIB) entró en funcionamiento en 1995 gracias a una ayuda de infraestructura mixta CICYT/CSIC, cofinanciada por la CAM y desde entonces ha venido trabajando ininterrumpidamente prestando su apoyo a numerosos grupos de investigación. Desde su puesta en funcionamiento, el SSAD ha funcionado como un servicio central del CIB gestionado de forma autónoma. La generación de recursos propios le ha permitido la contratación de personal, el mantenimiento de equipos y la adquisición de nueva instrumentación. En la actualidad el SSAD está equipado con un Secuenciador ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) de 96 capilares, un Secuenciador ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems) de 48 capilares, un equipo de PCR cuantitativa en tiempo real ABI PRISM 7700 y un robot multitarea Tecan Genesis Recientemente el SSAD ha desarrollado y puesto en marcha una aplicación informática que permite manejar el considerable volumen de solicitudes de servicio que recibe, facilita la trazabilidad de las muestras que se analizan en el SSAD y posibilita el acceso on-line ( user/) de los usuarios del servicio. Con estas infraestructuras el SSAD actualmente realiza más de secuencias de DNA anuales y da apoyo a más de 200 grupos de investigación en 50 centros o institutos distintos, incluyendo CSIC, Universidades, Hospitales y Empresas. El SSAD se encuentra en proceso de acreditación ENAC. Desde su creación, el SSAD se ha preocupado de poner a disposición de los grupos de investigación las nuevas tecnologías Key words: DNA sequencing, Quantitative PCR The DNA sequencing facility of the CIB (SSAD-CIB) started in 1995 thanks to a grant from the CICYT/CSIC/CAM and since then has provided support to many research groups in the CIB and other institutions. From the very beginning the SSAD-CIB has developed its activity as a central facility of the CIB in an autonomous way, generating its own resources to acquire new equipment, to update the existing one and to contract personnel. Nowadays, it is equipped with an ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) and an ABI PRISM 3730 (Applied Biosystems) capillary sequencers, a real time quantitative PCR instrument ABI PRISM 7700 and a Tecan Genesis 1500 multifunctional robot. The SSAD-CIB has recently developed an informatics tool to facilitate the interaction with the users and to provide full control of the sequencing procedures and traceability of the samples. The SSAD-CIB is accessible via internet at Actually it performs more than sequencing reactions per year and provide support to more than 200 research groups in 50 research centers including CSIC, Universities, hospital and private companies. The SSAD-CIB has always tried to provide to the research groups up-dated technologies in sequencing and quantitative PCR. The SSAD-CIB has participated in the sequencing of the genome of Listeria monocytogenes and of the human pathogen Aspergillus fumigatus. In addition to DNA sequencing and quantitative PCR services, the SSAD-CIB provides support to research projects in specific projects. 273

283 Servicios Especiales de análisis genómico, centrándose fundamentalmente en la secuenciación de DNA y PCR cuantitativa. El SSAD-CIB ha participado en el proyecto de secuenciación del genoma de Listeria monocytogenes y en el proyecto de secuenciación del genoma completo del patógeno Aspergillus fumigatus. Actualmente el SSAD oferta servicios de secuenciación de DNA, genotipificación y PCR cuantitativa y combina esta actividad de apoyo a los grupos de investigación con el desarrollo de protocolos para la secuenciación de genes nucleares complejos. El desarrollo de este proyecto tiene importantes repercusiones en áreas como el diagnóstico molecular y la genómica funcional. Protección Radiológica (Spr) / Radioactive Protection Service (Rps) DRA. Mª LUISA BOTELLA Responsable Científica / Scientific Responsible MARTA CEBRIÁN ECHARRI Mª DEL CARMEN DOÑORO VÁZQUEZ Personal Técnico / Technical staff Durante el bienio se solapó el trabajo habitual de la Instalación Radiactiva (IR) con su cambio de emplazamiento. IR Velázquez.- Dependencias autorizadas: cámara caliente, cuarto de contadores, generador de RX, difractómetro y 16 laboratorios. Material radiactivo: entrada de 67 pedidos con una actividad total de 1517 MBq (41mCi); retirada de 346 alícuotas; eliminados por el SPR 519 l de residuos sólidos y 230 l de líquidos. Para el traslado de la IR el SPR coordinó las actuaciones de los siguientes organismos/empresas: CAM (Comunidad Autónoma de Madrid), CSN (Consejo de Seguridad Nuclear), LAINSA (Logística y Acondicionamientos Industriales S.A.), ENRESA (Empresa Nacional de Residuos Radiactivos S.A.) y NE (Nacional Express). Personal del SPR fue clausurando progresivamente los laboratorios autorizados, concentrándose el During the past two years ( ) the current work in the Radioactive Facilities (RF) was overlapped with the necessary diligencies for the change in the location of the CIB Institute. RF Velázquez.- Authorized areas: central hot room, scintillation counter room, X ray chamber, difractometer and 16 laboratories. Radioactive material: 67 orders with a total activity of 1517 MBq (41 mci), 346 aliquots were drawn, 519 l of solid residues and 230 l of liquid residues were eliminated by the RPS. For the change of the radiactive dependencies, the RPS had to coordinate the due diligencies with the following organisms/companies: CAM (Autonomous Community of Madrid), CSN (Nuclear Council of Security), LAINSA (Logistic and industrial conditioning S.A.), ENRESA (National Company of Radioactive Residues S.A.), and NE (National Express). A progressive planning to close the 16 authorized labs and the rest 274

284 Servicios Especiales trabajo en la cámara caliente. ENRESA retiró 2550 l de residuos sólidos, 425 l de líquidos, 196 g de sales de uranilo y una fuente de 63 Ni. El SPR acondicionó 999 MBq (27 mci) de compuestos marcados radiactivamente y 100 g de sales de uranilo que fueron transportados por NE al nuevo emplazamiento en Ramiro de Maeztu. LAINSA certificó la descontaminación de las dependencias de Velázquez, que quedaron clausuradas en noviembre de Ese mismo mes se abrió la IR de Ramiro de Maeztu, tras su inspección por el CSN y la autorización de puesta en marcha emitida por la CAM. IR Ramiro de Maeztu.- Dependencias autorizadas: cámara caliente, cuarto de contadores, generador de RX, difractómetro y 21 laboratorios; se efectúan controles periódicos de contaminación/radiación de todas ellas. Material radiactivo: entrada de 113 pedidos con una actividad total de 2331 MBq (63 mci); retirada de 491 alícuotas; eliminados por el SPR 233 l de residuos sólidos y 116 l de líquidos. En octubre de 2004 el CSN realizó una inspección no encontrando desviaciones. Los dos últimos años el SPR ha formado en Protección Radiológica a 75 usuarios. El control dosimétrico del personal autorizado se ha realizado mensualmente, tramitándose 63 altas, 74 bajas y sus correspondientes historiales dosimétricos. Actualmente hay 184 usuarios autorizados por el SPR, provenientes de 36 grupos de investigación; 33 licencias de Operador y 3 de Supervisor. of authorized areas within the Velázquez Service was carried out, while the work was being restricted to the main central hot room. ENRESA retired 2550 l of solid, 425 l of liquid residues, 196 g of uranile salts and a 63 Ni source. The RPS conditioned 999 MBq (27 mci) of radioactive compounds and 100 g of uranile salts, which were carried by NE to the new place of Ramiro de Maeztu. LAINSA certified the decontamination of Velázquez dependencies, which were closed in November The new dependencies of Ramiro de Maeztu were opened in this very month, after the due inspection by the CSN and the emission of the authorization to start the new service given by the CAM. RF Ramiro de Maeztu.- Authorized areas: central hot room, scintillation counter room, X ray chamber, difractometer and 21 laboratories. Controls for the absence of contamination/ radiation are made regularly in all of them. Radioactive material: 113 orders with a total activity of 2331 MBq (63 mci), 491 aliquots were drawn; and 233 l of solid residues and 116 l liquid residues were eliminated by the RPS. In October 2004 the CSN carried out a new inspection of the Service without finding any deviation. The RPS has educated in Radioactive Protection a total of 75 new users. The dosimetric control of the authorized personal was made monthly, with a total of 63 new dosimeters and 74 people who stopped working with radioactive precursors and were given their dosimetric files. At this moment there are a total of 184 authorized users belonging to 36 different investigation groups of CIB; 33 Operator licenses and 3 Supervisors. 275

285 Biblioteca / The Library of CIB DR. RAFAEL GIRALDO SUÁREZ Responsable Científico / Scientific Responsible SARA MARÍA BLANCO GÓMEZ EVENCIO CABRERIZO DE LAS HERAS (Hasta III-2004) NIEVES FONTURBEL CABAÑAS Mª JESÚS GARABITO SECO Mª OLVIDO PARTEARROYO LACABA MILAGROS RODRÍGUEZ BUENO (Desde XI-2003) Mª ANGELES SACRISTÁN MARTÍN Mª TERESA SILIÓ MARTÍNEZ (Hasta VII-2003) JOSÉ MIGUEL SOTO ESTEBANEZ Mª JESÚS VILELA MANRIQUE (Hasta XII-2004) Personal Técnico / Technical staff La Biblioteca del CIB, considerada como la Biblioteca de Referencia en España dentro de su área de especialización (Biología y Biomedicina) por su excelente colección, en soporte papel, de revistas y otras publicaciones seriadas (1.302 títulos) de las cuales 371 se mantienen abiertas, y de monografías (8.206 volúmenes), está integrada en la Red de Bibliotecas del CSIC contribuyendo, por tanto, en el mantenimiento del Catálogo colectivo y en el Préstamo interbibliotecario del CSIC. Nuestra biblioteca sigue estando a la cabeza de las bibliotecas del CSIC, especialmente como proveedora de artículos científicos a otros centros, tanto del CSIC como externos. Este préstamo interbibliotecario se realiza, en su mayoría, utilizando el programa de transmisión de documentos Ariel que ha sido recientemente actualizado y optimizado por la adquisición de un nuevo escáner y ordenador. Las solicitudes del CIB, previa búsqueda documental, se tramitan a través del Programa ALEPH de Gestión de Bibliotecas. La administración del préstamo interbibliotecario de centros externos se gestiona directamente por la biblioteca mediante una base de datos propia. Los fondos de nuestra biblioteca se actualizan con las adquisiciones que decide la Comisión constituida por investigadores de los seis departamentos del CIB y representantes de la Biblioteca, después de evaluar las novedades bibliográficas. En este bienio se han incrementado en 478 monografías y títulos de serie y 17 revistas, ingresadas por adquisición, suscripción, donación o intercambio. The Library of the Centre of Biological Research (Centro de Investigaciones Biológicas-CIB) is considered as the spanish reference library in its area of specialization (Biology and Biomedicine) due to its excellent collection on paper, magazines and other serial publications (1302 titles, 371 on active and monographs). It is integrated into the CSIC Net of Libraries, contributing to the maintenance of the collective catalogue and to the interlibrary loan of the CSIC. Our library continues being at the top of the CSIC libraries, specially as supplier of scientific articles to other centres of the CSIC, as well as the external ones. This interlibrary loan carries out, in the main, using Ariel transmission of documents program, that has been recently updated and optimized by the purchase of a new scanner and computer. The requests outcoming of the CIB, after a documentary search, are processed by the Management of Libraries Program, ALEPH. The interlibrary loan administration of external centres is carrying out by the library by means of an own database. The collection of our library is bringing up to date due to the procurement decided by the Committee constituted by investigators of the six departments included in the CIB and representatives of the library after evaluating the bibliographical innovation. In this two years period they have been increased in 478 monographs and serials and 17 magazines deposited by purchase, subscription, donation or interchange. In this period 276

286 Servicios Especiales En este periodo es de destacar, debido a tres circunstancias particulares (la contratación por el CSIC de diversas plataformas editoriales, el cambio de tipo de acceso de numerosas revistas por el reconocimiento de IPs, y a la implantación del servicio PAPI de acceso remoto a las mismas), el elevado aumento de descargas de artículos de las colecciones electrónicas, tanto para uso interno como para préstamo interbibliotecario. Los enlaces a estas publicaciones están disponibles para los investigadores del CIB en el web interno de la biblioteca, que cuenta con una lista regularmente revisada de revistas, libros electrónicos y bases de datos. Asimismo se han actualizado en points out the high increase of download of articles from the electronic collections, both for internal use and for interlibrary loan, due to three individual circumstances (the purchase by the CSIC of diverse publishing platforms, the change of type of access of numerous magazines for IP s recognition and the implantation of the service PAPI (Access Point to Information Providers) of remote access to the same ones. The links to these publications are available for the CIB investigators in the library s external web, which counts on an usually revised list of magazines, electronic books and databases. Likewise the links have been updated in the above mentioned 277

287 Servicios Especiales dicho web los enlaces a catálogos bibliográficos de centros universitarios, sanitarios y tecnológicos nacionales e internacionales, así como a diversas publicaciones gratuitas, lo que ha mejorado el servicio de documentación y de búsqueda bibliográfica informatizada. Desde 2003, se viene disfrutando de una de las licencias del CSIC para el acceso a la base de datos SciFinder, cuyo cliente de acceso está instalado en uno de los ordenadores de consulta de la biblioteca. El traslado al nuevo edificio ha mejorado condiciones de la Biblioteca que se ha modificado en diferentes aspectos: se ha incrementado el espacio disponible en las salas de lectura y de consulta de lectura y en los despachos del personal, así como los metros lineales de estanterías para revistas en el depósito. La Biblioteca del CIB quiere agradecer su trabajo y dedicación a Mª Jesús Vilela y Evencio Cabrerizo que estuvieron con nosotros durante tantos años, y se jubilaron en este periodo. web to bibliographical catalogues from university, sanitary and technological national and international centres as well as to diverse free publications, which has improved the service of documentation and the bibliographical computerized search. From 2003 we enjoy one of the CSIC licenses for the access to the base SciFinder database, whose client of access is installed in one of the consulting computers in the library. During the year 2003 and 2004 the CIB library has passed for a stage of intense changes. The removal has improved the conditions of the library that has been modified in several aspects: the available space has been increased in the reading room and consultation and in the staff offices, as well as the linear meters of racks for magazines in the warehouse. The CIB Library wants to be grateful for their work and dedication to Mª Jesús Vilela and Evencio Cabrerizo, that were with us for so many years and retired in this period. 278

288 Premios y Distinciones Awards and Honours Ángela Casado Moragón Premio Internacional en Investigación sobre Termalismo Marcial Campos 2ª Edición, Influencia de la crenoterapia con aguas bicarbonatadas sulfatadas en el estrés oxidativo de una población balnearia (2003) Ángela Casado Moragón y Mª Encarnación López Fernández Premio: Pañella Casas a la mejor comunicación oral, V th European Congress of Gerontology, Minimum duration of spa treatment with bicarbonated-sulfated waters to obtain an antioxidant effect in people over 65 (2003). Premio: Mejor Comunicación, Sociedad Madrileña de Geriatría y Gerontología en el IX Congreso de la Sociedad Madrileña de Geriatría y Gerontología, Accidente cerebral agudo, deterioro cognitivo y enzimas antioxidantes (2004). Premio: Dr. Espina y Capo concedido por la Real Academia Nacional de Medicina, La biocronología de la eliminación urinaria de productos de lipoperoxidación y su dependencia con el ritmo biológico anual (2004). Pedro Castañera Domínguez Miembro de la Comisión Nacional de Biovigilancia (2004). Eduardo Díaz Fernández Miembro del Comité Editorial de la revista Journal of Bacteriology ( ). Premio Nacional de Microbiología Jaime Ferrán (Sociedad Española de Microbiología) (2003). Ramón Díaz Orejas Editor Jefe de FEMS Microbiology Reviews. Miembro de la Junta Supervisora del Centro de Excelencia BioMoBil (Bio-Safety Research and Molecular Biomedicine) de la Universidad de Gdansk (Polonia). Evaluador externo Tesis Doctoral presentada en la Universidad de Melbourne, Australia (2004). José Ramón Díaz-Ruíz Alba Miembro del Comité Editorial de la Revista Virología. Publicación Oficial de la SEV ( ). Miembro del Consejo de Redacción de la Revista Phytoma-España ( ). Flora de Pablo Dávila Académica Correspondiente de la Real Academia Nacional de Farmacia, Madrid (2004). Manuel Espinosa Padrón Evaluador invitado para Science Foundation Ireland, Argentinian National Agency for Science and Technology, EMBO, The Wellcome Trust Foundation. Miembro de la Comisión de Biología Fundamental del Plan Nacional de Ciencia y Tecnología (2003). Miembro del International Advisory Board of the Meeting Plasmid Biology, Corfu, Grecia (2004). Alicia García-Arroyo NIH Travel Award. Gordon Research Conference on MMPs. Montana, USA (Agosto, 2003). 279

289 Premios y distinciones/awards and Honours Concepción García Mendoza Evaluadora de la Dutch Technology Foundation STW (Agencia Financiadora de la Investigación en la Universidad en el campo de las Ciencias Aplicadas, Holanda). Ernesto García López Editor de: Microbial Drug Resistance. Miembro de la Junta Directiva de la Sociedad Española de Microbiología (SEM). Presidente del Grupo Especializado de Microbiología Clínica de la SEM. José Luis García López Miembro Comité Editorial, revista Journal of Bacteriology ( ). Vicepresidente y Presidente electo de la Sociedad Española de Biotecnología (SEBIOT) ( ). Miembro Comité Científico de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria ( ). Miembro Comisión de Área de Biología y Biomedicina del CSIC (2003). Representante español en el VI Programa Marco de la UE (2003). Subdirector General de Programación, Seguimiento y Documentación Científica del CSIC ( ). Guillermo Giménez Gallego Académico de Numero de la Real Academia Nacional de Farmacia (2004). Rafael Giraldo Suárez Editor de: FEMS Microbiology Reviews. Miembro del Comité Organizador del II Congreso de la FEMS. Aldo González Becerra Premio: Resultado Relevante XV Forum Municipal de Ciencia y Técnica, ICIDCA, González, T., González, A.E., Terrón, M.C., Yagüe, S., Zapico, E.J., Arana, A. y Carbajo, J.M. Lacasas fúngicas en el tratamiento de efluentes de destilería: la Ingeniería Genética aplicada a la protección del medioambiente San Miguel del Padrón, Cuba (2003). Distinción: Asesor Científico del Programa de Desarrollo Científico y Tecnológico de la VIII Región del Bio-Bio, Concepción, Chile ( ). Invitado por UNIDO, (Sede: Viena, Austria) Reunión Preparatoria Regional para el Global Biotechnology Forum, Brasilia, Brasil (23 a 25 julio, 2003). Jesús Jiménez-Barbero Premio de Química Orgánica Janssen-Cilag España de la Real Sociedad Española de Química (2003). Dionisio López Abella Colaborador Científico de la Dirección General de Enseñanza Superior e Investigación Científica. Secretaría Estado de Educación Universidades e Investigación del Ministerio de Educación. Rubens López García Conferencia Inaugural del XIX Congreso Nacional de Microbiología Streptococcus pneumoniae y sus bacteriófagos: La pasión por el conocimiento y el regalo de la amistad. Santiago de Compostela (Septiembre, 2003). 280

290 Premios y distinciones/awards and Honours Conferencia en la Real Academia de Ciencias Veterinarias, Bacteriófagos: de la Biología Molecular a su uso terapéutico (Septiembre, 2004). Editor de: Microbial Drug Resistance, International Microbiology y Revista Española de Quimioterapia. Francisco Javier Medina Díaz Miembro del Nomination Committee of the Maffo Vialli International Award for Histochemistry, nombrado por la Società Italiana di Istochimica, Italia (2003). Miembro del International Scientific Board de la revista Journal of Applied Biomedicine ( ). Comité Asesor del European Space Agency (ESA) Research Plan in Life and Physical Sciences and Application in Space, nombrado por la European Science Foundation (2004). Susana Moreno Díaz de la Espina Premio: Mejor trabajo científico El enigmático cromosoma de los Dinoflagelados III Seminario de Citogenética (2004). Eduardo Páez Abril Miembro del Consejo Editorial de la revista Virología (publicación oficial de la SEV). Miembro del Comité de Redacción de la Revista Oficial de la Sociedad Española de Virología. Miembro de la Junta Directiva de la Sociedad Española de Virología. Miembro del Comité Científico del VIII Congreso Nacional de Virología, Barcelona. Mª Carmen Risueño Almeida Presidente electo de la Sociedad Española de Biología Celular (SEBC) (Desde Mayo, 2001). Miembro del Editorial Board del Journal of Plant Physiology, in affiliation with the FESPP (Desde 2001). Miembro del Comité de Evaluación de Proyectos: Plant Biology Evaluation, Panel de la NASA, Washington, USA. Vocal de la Junta Directiva de la Sociedad Española de Biología del Desarrollo (SEBD) (Desde 2001). Vocal de la Junta Directiva de la Rama Española de la ETCS (European Tissue Culture Society). Miembro del Comité de Evaluación de Proyectos de la European Space Agency, ESA, ESTEC, Holanda (2004). Luis I. Rivas López Premio: Mejor comunicación, XI Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Saugar, J.M., Pachón-Ibáñez, M.E., Pichardo, C., Andreu, D., Pachón, J. y Rivas, L. Los péptidos cecropina A-melitina son activos frente a resistencias a colistina en Acinetobacter baumannii Una nueva alternativa terapeútica?, Bilbao (Mayo, 2004). Santiago Rodríguez de Córdoba Premio GlaxoSmithKline 2003, investigación científica en el área de las Ciencias Biomédicas, correspondiente a la XVI entrega de los Premios de la Fundación CEOE (2003). Pilar Sánchez Testillano: Diploma: Reconocimiento del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), San José de Lajas, Cuba (2003). Distinción del Instituto Nacional de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical Alejandro de Humbold (INIFAT), La Habana, Cuba (2003). 281

291 Organización de Congresos y Cursos Organization of Congresses and Coursers Santiago Lamas Peláez Co-organizador del Congreso New Challenges in the Understanding and Management of Chronic Renal Failure: From Bench to Patient. XI Simposio Internacional. Instituto Reina Sofía de la Fundación Renal and the European Renal Association (ERA-EDTA), Madrid, noviembre Ángela Casado Moragón Curso de Doctorado en Geriatría, Radicales Libres y Envejecimiento. Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, mayo Curso de Doctorado en Geriatría, Radicales Libres y Envejecimiento. Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, mayo Curso de Titulación propia Técnicas Inmunohematológicas y Electroforéticas aplicables al tejido sanguíneo humano. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid, septiembre-octubre Flora de Pablo Dávila Curso Salud de la mujer: Nuevas perspectivas a viejos problemas Madrid, noviembre-diciembre Co-organizadora: IV Simposio Nacional de Insulina/IGFs. Valdeganga, octubre Ángel L. Corbí Organizador del Workshop Dendritic cells: Biology and therapeutic applications, Fundación Juan March, Madrid 6-8 octubre, Eduardo Díaz Fernández Co-organizador del Curso de Doctorado Biología Molecular de Procariotas. Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid, mayo 2003 y mayo Coordinador del Simposio Biotecnología Ambiental del Congreso Nacional de Biotecnología. Biotec Oviedo, José Luis García López Miembro Comité Organizador del Congreso Current Challenges in Biomolecular Screening, organizado por la Sociedad Española de Biotecnología (SEBIOT) y la Society for Biomolecular Screening (SBS), Madrid, Miembro Comité Organizador del Congreso Nacional de Biotecnología Biotec 2004, Oviedo, José Ramón Díaz-Ruíz Alba Coordinador Curso de Doctorado Virus Patógenos de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y Departamentos de Biología Vegetal y Genética de la Facultad de Ciencias Biológicas (UCM), Ángeles García Pardo, Ángel L. Corbí, Augusto Silva y Joaquín Teixidó Organizadores del Curso de Doctorado, Migración Celular en el Sistema Inmune, Programa Interuniversitario de Inmunología, con mención de calidad, Centro de Investigaciones Bilógicas, CSIC. Madrid, mayo

292 Organización de Cogresos y Cursos / Organization of Congresses and Courses Ángeles García Pardo Co-organizadora del Curso de Doctorado Temas de Investigación en Inmunología, Programa Interuniversitario de Inmunología, con mención de calidad, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC. abril-junio Aldo González Becerra Asesor Científico del Coordinador General del Global Biotechnology Forum, organizado por UNIDO y el Gobierno de Chile, Concepción, Chile, 2-6 marzo, Jesús Jiménez Barbero Miembro del Comité Científico, XII European Carbohydrate Symposium, Grenoble, julio Miembro del Comité Científico, XXXIII Congreso Spectroscopicum Internationale, Granada, septiembre Secretario, II Reunión Bienal del Grupo de RMN, Real Sociedad Española de Química, Santiago de Compostela, septiembre Miembro del Comité Científico, I Reunión de Químicos Jóvenes Aldrich, Real Sociedad Española de Química, Madrid, noviembre Santiago Lamas Moderador del Congreso Avances en Fisiopatología Vascular. XI Simposio Internacional del Instituto Reina Sofía de la Fundación Renal Iñigo Álvarez de Toledo (FRIAT), Santander, noviembre Rubens López García Profesor, 8º Curso de Iniciación a la Microbiología organizado por la SEM en Madrid. (Julio, 2004). Profesor, Curso de Microbiología Molecular organizado por la Facultad de Biología (UCM ) y CIB. (junio, 2004). Profesor, Curso Omni Cellula organizado por la Universidad de Barcelona y la Societat Catalana de Microbiología, Barcelona (julio, 2004). Francisco Javier Medina Díaz Miembro del Comité Científico de la Reunión Científica Cells V. Ceske Budejovice (República Checa), Félix Ortego Alonso Organizador de las Jornadas Científicas de Inauguración de la nueva sede del CIB, Madrid, de abril de Germán Rivas, John R. Ellis, y Allen P. Minton EMBO workshop Biological Implications of Macromolecular Crowding. Castillo de Magalia, Las Navas del Marqués, Avila, junio Mª Carmen Risueño Almeida Miembro del Comité Científico, XI International Palynological Congress, Granada, julio Organizadora de Simposio y chairperson, XI International Palynological Congress, Granada, julio Miembro del Comité Organizador del X Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular (SEBC), Santander, diciembre

293 Organización de Cogresos y Cursos / Organization of Congresses and Courses Organizadora de Simposio y chairperson, X Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular (SEBC), Santander, diciembre Mª Carmen Risueño Almeida y Pilar S. Testillano Organizadoras del Simposio sobre Biología Analítica y Bioimaging en Microscopía Confocal, CIB, CSIC, Madrid, junio Pilar Sánchez Testillano Miembro del Comité Científico, XI International Palynological Congress, Granada, julio Organizadora de Simposio y chairperson, XI International Palynological Congress, Granada, julio Gloria del Solar y Manuel Espinosa Curso Internacional: Molecular Basis of Bacterial Stress Responses, Howard Hughes Foundation y Universidad Nacional de Rosario (Argentina), 25 de octubre a 5 de noviembre, Joaquín Teixidó, Ángeles García-Pardo, Ángel L. Corbí, y Alicia García-Arroyo Organizadores del Simposio Cell Migration in Physiology and Disease, Centro de Investigaciones Biológicas, diciembre

294 Aula de Seminarios Seminars Coordinador: Dr. Felix Ortego Secretaria: Mª Victoria Lafita 2003 Haim Werner, Ph.D. Department of Clinical Biochemistry, Sackler School of Medicine, Tel Aviv University, Israel Regulación de la transcripción del gen del receptor para IGF-I por BRCA1 y p53: implicaciones en cáncer Prof. Fumio Arisaka Dept. Molecular & Cellular Assembly, Graduate School of Biosciences and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, Japón Molecular Interactions Involved in the Assembly and Infection Process of Bacteriophage T4 Dr. Diego de Mendoza Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, Universidad Nacional de Rosario, Argentina Un factor de transcripción bacteriano involucrado en la regulaciónglobal de la biosíntesis de lípidos Dr. Andrés Aguilera Departamento de Genética, Universidad de Sevilla El mrna naciente y la conexión entre inestabilidad genética y transcripción Dr Arnold Gregory Matera Case Western Reserve University, Department of Genetics, Cleveland, USA Post-translational modifications control Cajal body formation and composition John Strouboulis, PhD Department of Cell Biology, Faculty of Medicine, Erasmus University, Rotterdam, Holanda Direct purification and characterisation of hematopoietic transcription factor complexes by in vivo biotinylation tagging Dr. John Z. Kiss Department of Botany, Miami University, Oxford, Ohio, USA The use of microgravity to study the interactions between phototropism and gravitropism in plants Prof. Tim Dexter Breast Cancer Research Centre, London, Reino Unido Microarray Data Analysis: an overview of some basic methods 285

295 Aula de Seminarios/Seminars Dr. John J. Correia Department of Biochemistry, University of Mississippi Medical Center, Jackson, USA Do Tubulin Drugs Disrupt or Mimic Interactions with Regulatory Factors Through Ternary Complex Formation? Dr. Alberto Ferrús Gamero Instituto de Neurobiología Ramón y Cajal, CSIC, Madrid Prodos: un nuevo regulador transcripcional de células troncales Dr. Gideon Koren Brigham and Women s Hospital, Harvard Medical School, USA Trafficking of Potassium Channels to Caveolae: Caveolin-3, Kv1.5 and SAP97 form a Tripartite Protein Complex that Regulates Channel Function Dr. Joel F. Schildbach John Hopkins University, USA Insights into Single-Stranded DNA Binding and Cleavage by F Factor Prof Dr. Elisabeth Matthys-Rochon Ecole normale Superieure de Lyon, Reproduction et Developement des Plantes, Lyon, Francia Molecules produced by maize microspores in culture, seem to be active onembryo development: background and new results Dr. Catherine Royer Centre de Biochimie Structurale, CNRS Université Montpellier I, Montpellier, Francia Mecanismes of trancriptional regulation probed using fluorescence Miguel A. del Pozo, MD, PhD Departments of Immunology and Cell Biology,The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA Integrin regulation of Rac targeting and signaling via Caveolin-dependent Raft internalisation Prof. Yoel Kloog Department of Neurobiochemistry, The George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University, Israel Novel mechanisms controlling Ras signaling selectivity: galectin-1 and galectin-3 interact with and diverse Ras signals Dr. Francisco Javier Medrano Martín Centro de Biologia Molecular Estrutural, Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, Campinas - São Paulo, Brasil Anatomia de la Hipoxantina fosforibosiltransferasa de Trypanosoma cruzi. Implicaciones en el diseño racional de drogas basado en estructura Dra. Mercedes Rincón Associate Professor, Immunobiology Programme, University of Vermont, USA Role of p38mapk in T cell activation and development 286

296 Aula de Seminarios/Seminars Dr. Haruhiko Koseki Department of Molecular Embryology, Research Center for Allergy and Immunology, Chiba University, Japón Functional analysis of mammalian Polycomb group proteins Prof. Dr. R. Benavente Department of Cell and Developmental Biology, Biocenter of the University of Würzburg, Würzburg, Alemania Arquitectura molecular del complejo sinaptonémico Dra. Virginia A. Zakian Department of Molecular Biology, Princeton University, New Jersey, USA The yeast Rrm3p DNA helicase helps replication forks move past protein-dna complexes 2004 Dr. Roderic Guigó i Serra. Institut Municipal d Investigacio Medica, Barcelona Finding genes by comparing genomes: the case of selenoproteins Dra. Isabel Díaz Rodríguez Departamento de Biotecnología, ETSIA-UPM, Madrid Factores transcripcionales implicados en la germinación de la semilla de cebada Dr. Miguel Aranda CEBAS, CSIC, Murcia Análisis de la interacción melón-virus de las manchas necróticas del melón controlada por el gen recesivo de resistencia nsv Dr. Manuel Benito Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, UCM, Madrid Desentrañando la acción de la insulina: Especificidad tisular Dr. Joseph. M. Casacuberta Dep. Genética Molecular, Instituto de Biología Molecular de Barcelona, CSIC, Barcelona Control, evolución y impacto en los genomas de la transposición en plantas Dra. Marcela del Río Biología Molecular y Celular, CIEMAT, Fundación Botín, Madrid Nuevas estrategias terapéuticas: ingeniería tisular y terapia génica en piel Dr. Carlos López Otín Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Medicina, Instituto Universitario de Oncología, Universidad de Oviedo, Oviedo Sistemas proteolíticos tumorales: nuevas y paradójicas funciones 287

297 Aula de Seminarios/Seminars Dr. Xosé R. Bustelo Centro de Investigación del Cancer, CSIC, Universidad de Salamanca, Salamanca Estrategias de señalización establecidas por la familia vav de oncoproteínas Dr. José Luis Barbero Dpto. de Inmunología y Oncología, CNB, Madrid Coesinas y segregación cromosómica en meiosis Dr. Wolfgang Schamel Max Planck-Institut fur Immunbiologie, Freiburg, Alemania New approaches to study native multiprotein complexes: the T cell antigen receptor as an example Dr. Gabriel Márquez Departamento de Inmunología y Oncología, CNB, CSIC, Madrid Efectos del bloqueo de las quimioquinas sobre el tráfico de linfocitos in vivo Dr. Juan Antonio Bueren CIEMAT, Madrid Modelos preclínicos para la terapia génica de enfermedades hereditarias de la hematopoyesis Dra. Helena Santos-Rosa Wellcome/CRC Institute and Department of Pathology, Cambridge University, Reino Unido Regulación de la transcripción via metilación de las histonas Dra. Matilde Salinas Hospital Ramón y Cajal, Madrid Papel de los factores de iniciación en la isquemia cerebral y el precondicionamiento isquémico Dr. Klaus Unsicker Anatomy and Interdisciplinary Center of Neuroscience, University of Heidelberg, Alemania The TGF-ß and FGF families of multifunctional cytokines Dr. Michelle Letarte. Cancer Research Program, Department of Immunology, The Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá Potential functions of endoglin in endothelial cells. How can reduced expression of endoglin lead to Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia? Dr. Olivier Voinnet Institut de Biologie Moleculaire des Plantes du CNRS, Strasbourg, Francia Mechanisms and roles of RNA silencing Dr. Vicente Andrés Instituto de Biomedicina, CSIC, Valencia Proliferación celular, longitud de telómeros y arteriosclerosis 288

298 Aula de Seminarios/Seminars Dr. Juan Carbonell IBMCP, CSIC, Valencia Señalizacion hormonal de la fructificacion Dr. Antonio García de Herreros Unitat de Biología Celular i Molecular, Institut Municipal d Investigació Mèdica, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona Regulación de la funcionalidad de E-cadherina en células tumorales Dra. Maria Carmo-Fonseca Instituto de Medicina Molecular, Facultad de Medicina, Lisboa, Portugal Visualizing mrna biogenesis Dr. Georg Fuchs Mikrobiologie, Institut f. Biologie II, Freiburg, Alemania Anaerobic aromatic metabolism chemical principles, biological constraints Prof. Harold P. Erickson Dept. Cell Biology, Duke University Medical Center, Durham, USA Assembly dynamics of the bacterial cell división protein FtsZ- rapid assembly and turnover Dr. José Antonio Enríquez Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza, Zaragoza Genética funcional del sistema de fosforilación oxidativa Dra. Iris Meier Plant Biotechnology Center and Department of Plant Biology, Ohio State University, Ohio, USA Developmentally and cell-cycle regulated nuclear-envelope targeting in plants Dr. Manuel Ortiz de Landazuri Hospital de la Princesa, Madrid La respuesta génica a al hiposia: Papel del factor de transcripción HIF Dr. Soren Molin Department of Microbiology, Technical University of Denmark, Lyngby, Dinamarca Bacterial biofilms-ambitious prokaryotic multicellular development or simple mechanic assemblies of single cells? Dr. Soichi Kojima Mol. Cell Pathol. Resch. Unit, RIKEN, Saitama, Japón Chemical pathobiology of cancer, and vascular and hepatic diseases using retinoids and other bioprobes Dr. Peter ten Dijke Division Cellular Biochemistry, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdan, Holanda TGF-b receptor signal transduction 289

299 Aula de Seminarios/Seminars Dr. Mariano Barbacid Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid Una nueva generación de modelos animales en cáncer diseñados mediante manipulación molecular del genoma murino Dr. Hugh Pelham MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Reino Unido Quality control of membrane proteins: the good, the bad and the ugly Dra. Angharad M. R. Gatehouse Dept. Agricultural and Environmental Sciences, University of Newcastle, Newcastle, Reino Unido The role of biotechnology in crop protection: current status and future perspectives Dr. Derek Le Roith Diabetes Branch, NIH, Bethesda, USA Mouse transgenic approach to studying the pathophysiology of type 2 Dr. Sankar Adhya Laboratory of Molecular Biology, National Cancer Institute, Bethesda, USA Structure, Assembly, and Dynamics of a Gene Regulatory Multiprotein Complex with a DNA Loop Dr. Manuel Palacín Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona y Parque Científico de Barcelona Transportadores heteroméricos de aminoácidos: fisiología, patología y estructura Dr. Tanneke den Blaauwen Dptment. of Molecular Cytology, Swammerdam Institute for Life Sciences, Faculty of Science, University of Ámsterdam, Holanda Cell division in E. coli is a two step process Dr. Felipe Moreno Herrero Unidad de Genética Molecular, Hospital Ramón y Cajal, Madrid Genes de Sordera Dr. Reuven Agami The Netherlands Cancer Institute, Ámsterdam, Holanda RNA interference approaches to study cancer Dr. Paolo Bernardi Department of Biomedical Sciences, University of Padova, Italia The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to pharmacological target in cancer and degenerative diseases 290

300 Aula de Seminarios/Seminars Dr. Joaquim Roca Bosh Instituto de Biología Molecular, Barcelona DNA topoisomerase II: An essential cell utility with promising functions Dr. Darío García de Viedma Departamento de Microbiología, Hospital Gregorio Marañón, Madrid Aportación de las herramientas moleculares en la microbiología clínica: tuberculosis Dra. Lynn Margulis University of Massachussets, Amherst, USA Integración de genomas y formación de nuevos individuos Dr. Ricardo Guerrero Departamento de Microbiología. Facultat de Biología-Principal, Barcelona Diversidad procariótica: del genoma al ecosistema Prof. Andrea Mattevi Protein Crystallography Group, University of Pavia, Pavia, Italia Monoamine oxidases: Structure and medical chemistry of drug targets for neurological disorders Prof. Alberto Ferrús Instituto de Neurobiología Ramón y Cajal CSIC, Madrid Cuando la musculatura no lo es todo en la vida Dra. Asunción de los Ríos Centro de Ciencias Medioambientales, CSIC, Madrid Combinación de distintas técnicas de microscopía para el estudio de biofilms Dr. Ernest Hamel National Cancer Institute, National Institutes of Health, Frederick, USA The pharmacology of tubulin Dra. Ana Caño IRTA, Barcelona Mecanismo de percepción de brasinosteroides y su implicacion en el desarrollo vascular de Arabidopsis 291

301 Jornadas Científicas Inauguración de la nueva sede del CIB Jueves, 22 de abril de 2004 Palabras de bienvenida: Prof. Guillermo Giménez (Director del CIB) Conferencias: Prof. Margarita Salas CSIC UAM, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid El bacteriófago ø29 como modelo. De la biología molecular a la biotecnología Prof. Robert Huber Max-Planck-Institut fuer Biochemie, Martinsried, Alemania Molecular machines for protein degradation Prof. Alexander Tomasz Laboratory of Microbiology, The Rockefeller University, New York, USA Accelerated evolution: genes and phenotypes of antibiotic resistance in gram positive pathogens Prof. Francisco Sánchez Madrid Servicio de Inmunología, Hospital de la Princesa, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid Polaridad celular y molecular en la migración leucocitaria y las interacciones inmunes. Prof. Douglas T. Fearon Wellcome Trust Immunology Unit, MRC Centre, Cambridge, Reino Unido Immunological Memory Viernes, 23 de abril de 2004 Conferencias: Prof. Francisco García Olmedo Departamento de Biotecnología, ETSIA-UPM, Madrid Péptidos antibióticos vegetales Prof. Dirk Inzé Department of Plant Systems Biology, UGent VIB, Bélgica Systems biology of the plant cell cycle Prof. Antonio García Bellido Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC, Madrid Morfogénesis del ala de Drosophila 292

302 Dirección Dirección Director: GUILLERMO GIMÉNEZ GALLEGO (Hasta IX-2004) VICENTE LARRAGA RODRÍGUEZ DE VERA (Desde X-2004) Vicedirectores: PEDRO CASTAÑERA DOMÍNGUEZ (Hasta IX-2004) AUGUSTO SILVA GONZÁLEZ (Hasta IX-2004) PEDRO CASTAÑERA DOMÍNGUEZ (Desde X-2004) Mª JESÚS MARTÍNEZ HERNÁNDEZ (Desde X-2004) Secretaría: ANA CHAO VÁZQUEZ Gerencia Gerente: GERMÁN LERMA RODRIGO Personal: MANUEL MOLINA MORENTE Administración Administrador: Mª JOSÉ HERNÁNDEZ PARADELO TERESA SÁNCHEZ SAN ROMÁN ANGEL ABRIL NOVELLA JULIA ANADES BESNARD CONCEPCIÓN CHORRO DE VILLACEBALLOS FCO. JAVIER DE LA FLOR HERNÁNDEZ ESTRELLA GONZÁLEZ HERRADURA NIEVES GONZÁLEZ ESTEBAN Compras y Almacén Jefe de Compras y Almacén: Mª DOLORES MUÑOZ SAUQUILLO ELISA BALLESTEROS VILLAMAYOR MARGARITA FERNÁNDEZ GARCÍA BEATRIZ FRAILE FERNÁNDEZ Mª SOLEDAD MARTÍNEZ-VARA DEL REY ROMÁN JOSÉ MANUEL PÉREZ CABRIA Mª TERESA RAMOS JIMÉNEZ FRANCISCO SERRANO CORONADO 293

303 Dirección, Gerencia y Servicios Servicios Generales Conserjería LUCÍA GONZÁLEZ DÍAZ Mª TERESA GONZÁLEZ MESTRE CELIA LÓPEZ ADSUARA FERNANDO VÁZQUEZ FERNÁNDEZ Limpieza de Material y Lavandería BLASA CARRIÓN FERNÁNDEZ SARA FUENTES ROMERO FELICIDAD LARA MARTÍNEZ CARMEN LÓPEZ CASTELLANOS Mª JOSÉ LÓPEZ FABREGAT Vigilancia ISABEL LÓPEZ ROMERA FRANCISCA MORANTE GONZÁLEZ ÁNGELA MUÑOZ ALONSO SOLEDAD PASTOR ENCABO DOLORES PORTERO LAULA ENCARNACIÓN SÁNCHEZ RUIZ FELINA SOMOLINOS GARCÍA LORENZO MONTERO VERA ANTONIO MORENO CALLE DOMINGO MURIEL MUÑOZ Servicio Técnico Jefe Serv. Técnico: Jefe Mantenimiento: ANTONIO MANUEL J. GARCÍA ALVAREZ JOSÉ CABAÑAS OLIVARES ÁNGEL ARRANZ BOMBÍN ALEJANDRO AYUDA PASCUAL JOSÉ ÁNGEL CABALLERO GARCÍA DIEGO GARCÍA HERRANZ ÁNGEL GUERRERO RIVERO Mecánica y Delineación: Fotografía Informática Jefe Serv. Técnico: AURELIO HURTADO CARO MÓNICA Mª FONTELA LAGO VICTORIA MUÑOZ MARTÍN DR. FERNANDO DÍAZ PEREIRA JOSÉ Mª MELGUIZO SOLIER ANTONIO PÉREZ PARDO JUAN MIGUEL TIJERO PÁRAMO PALOMA VELASCO DE LA ROCA IKER VELÁSQUEZ AZA JOSÉ MANUEL ANGULO ZAPATERO MARIO GARCÍA LACOBA ANTONIO MARCOS LÓPEZ ALONSO RAMÓN TORO MONSALVE 294

304 Distribución por Sexos del Personal Científico según Categoría Profesional Distribución por Sexos del Personal Científico según Categoría Profesional Categoría MUJERES HOMBRES TOTAL Profesores de Investigación 3 (12%) 22 (88%) 25 Investigadores Científicos 5 (25%) 15 (75%) 20 Científicos Titulares 20 (51%) 19 (49%) 39 Investigadores OPI 4 (67%) 2 (33%) 6 Investigadores Contratados Ramón y Cajal 6 (37%) 10 (63%) 16 Otros Investigadores Contratados 17 (55%) 14 (45%) 31 Titulados Superiores del CSIC 2 (50%) 2 (50%) 4 Técnicos de Laboratorio 52 (80%) 13 (20%) 65 Total 109 (53%) 97 (47%) 206 Mujeres Hombres Profesores de Investigación Investigadores Científicos Científicos Titulares Investigadores OPI Investigadores Contratados Ramón y Cajal Otros Investigadores Contratados Titulados Superiores del CSIC Técnicos de Laboratorio 295

305 Organigrama CIB ORGANIGRAMA CIB DIRECCIÓN VICEDIRECCIONES GERENCIA UNIDAD DE SERVICIOS TÉCNICOS U. BIBLIOTECA DEPARTAMENTOS SERVICIOS ESPECIALES -Microscopía -Animalario -Cromatografía -Cultivo Células Animales -Química de Proteínas -Citometría de Flujo -Microscopía Confocal -Ultracentrifugación Analítica -Secuenciación Automática DNA -Aplicaciones informáticas -Espectroscopía -Biología Celular y del Desarrollo -Biología de Plantas -Estructura y Función de Proteínas -Fisiopatología y Genética Molecular Humana -Inmunología -Microbiología Molecular UNIDADES DE APOYO -Administrativa -Compras -Servicios Generales -Personal 296

306 Jubilaciones, Altas y Bajas de Personal ALTAS JOSÉ ÁNGEL CABALLERO GARCIA TÉCNICO ESP. GRADO MEDIO OPI OLGA CRIADO GARCÍA AYUDANTE DE INVESTIGACIÓN OPI EDUARDO ESPESO FERNÁNDEZ CIENTÍFICO TITULAR PEDRO HERNÁNDEZ CRESPO CIENTÍFICO TITULAR ANTONIO MARCOS LÓPEZ ALONSO AYUDANTE DE INVESTIGACIÓN OPI Mª TERESA RAMOS JIMÉNEZ AUXILIAR ADMINISTRATIVO MATILDE SÁNCHEZ AYUSO INVESTIGADOR CIENTÍFICO TERESA SÁNCHEZ SAN ROMÁN AYUDANTE DE INVESTIGACIÓN OPI FRANCISCO TENLLADO PERALO CIENTÍFICO TITULAR EXCENDENCIAS Y TRASLADOS CARMEN ALBO CASTELLANOS 30/06/2003 ROSARIO DE ANDRÉS MONTES 01/10/2003 JOSÉ RAMÓN DÍEZ BUENO 06/03/2003 BEGOÑA GRANADINO GOENECHEA 22/11/2004 Mª CARMEN PÉREZ LAMIGUEIRO 01/10/2003 RAQUEL SÁNCHEZ GARCÍA 04/11/2003 RAMÓN SERRANO CORONADO 21/04/2003 ANTONIO VALLEJO DOMÍNGUEZ 30/04/2004 JUBILACIONES JOSÉ ANTONIO ABRISQUETA ZARRABE 22/08/2003 LORENZO ALONSO MACARRÓN 30/04/2004 EVENCIO CABRERIZO LAS HERAS 03/05/2004 MANUEL CARRASCO FERNÁNDEZ 07/10/2003 LUIS GARCÍA TRUJILLO 02/10/2003 DIONISIO LÓPEZ ABELLA 21/06/2003 Mª ÁNGELES OLLACARIZQUETA DONAZAR 02/08/2004 MIGUEL GONZALO PÉREZ SILVA 25/11/2004 Mª JESÚS VILELA MANRIQUE 24/12/2003 FALLECIMIENTOS: JOSÉ MANUEL GORDILLO RODRÍGUEZ 14/11/

307 RESUMEN DE LOS DATOS ECONÓMICOS PRESUPUESTO DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS Concepto Presupuesto Ordinario , ,57 Inversiones , ,93 Apoyo a la infraestructura Ingresos en el año , ,72 Remanente años anteriores , ,84 Varios , ,44 TOTAL INFRAESTRUCTURA DEL CENTRO , ,50 Proyectos y Contratos de Investigación Ingresos en el año , ,54 Remanente años anteriores , ,84 Asistencia Técnica Ingresos en el año , ,88 Remanente años anteriores , ,44 TOTAL PROYECTOS, CONTRATOS Y ASISTENCIA TÉCNICA , ,70 PERSONAL , ,91 TOTAL , ,11 AÑO 2003 AÑO ,05% 37,42% Personal 13,24% 37,25% Proyectos y contratos Infraestructura 45,53% 49,51% 298

308 EVOLUCIÓN DEL NÚMERO DE PUBLICACIONES Y SU IMPACTO 299

309 Publicaciones Evolución del Factor de Impacto medio de las revistas utilizadas 300

310 Índice de Investigadores en Plantilla NOMBRE CATEGORÍA TLF.. -EXT. PÁGINA Aller Tresguerres, Patricio Investigador C Andreu Morales, J. Manuel Profesor I Aparicio Alonso, Pedro J. Profesor I Barasoain Blasco, Isabel Científico T Bernabeu Quirante, Carmelo Profesor I Botella Cubells, Mª Luisa Científico T Cañada Vicinay, Javier Científico T Casado Moragón, Angela Científico T Castañera Domínguez, Pedro Profesor I Colmenares Brunet, María Científico T Corbí López, Angel Profesor I De Pablo Dávila, Flora Profesor I Del Mazo Martínez, Jesús Científico T De La Rosa Cano, Enrique Investigador C De La Torre García-Quintana, Profesor I Díaz Fernández, Eduardo Científico T Díaz Orejas, Ramón Profesor I Díaz Pereira, José F. Científico T Díaz-Ruiz Alba, J. Ramón Profesor I Díez Cortés, José Luís Investigador C Espeso Fernández, Eduardo Científico T Espinosa Padrón, Manuel Profesor I Esponda Fernández, Pedro Investigador C Fernández Tresguerres, Mª Elena Científico T García González, Pedro Investigador C García Hermida, Ofelia Científico T García López, Ernesto Profesor I García López, J.Luis Profesor I García Luque, Isabel Científico T García Mendoza, Concepción Investigadora C. csic.es García Pardo, Angeles Investigadora C

311 Índice de Investigadores Actuales en Plantilla NOMBRE CATEGORÍA TLF.. -EXT. PÁGINA Giménez Gallego, Guillermo Profesor I Giraldo Suárez, Rafael Científico T Goday Baylina, Clara Científico T González Becerra, Aldo Científico T González Manchón, Consuelo Científico T Hernández Crespo, Pedro Científico T Hernández Valenzuela, Pablo Científico T Jiménez Barbero, Jesús Profesor I. jjbarbero@cib.csic.es Krimer Smunis, Dora B. Científico T. dbkrimer@cib.csic.es Lamas Peláez, Santiago Profesor I. slamas@cib.csic.es Larraga Rodríguez de Vera, Vicente Profesor I. vlarraga@cib.csic.es Leal Ojeda, J. Antonio Investigador C. aleal@cib.csic.es López Abella, Dionisio Profesor I. dlabella@cib.csic.es López García, Paloma Investigadora C. plg@cib.csic.es López García, Rubens Profesor I. ruben@cib.csic.es Lozano Puerto, Mª Rosa Científico T. rlozano@cib.csic.es Llave Correas, César Científico T. cesarllave@cib.csic.es Llorca Blanco, Oscar Científico T. ollorca@cib.csic.es Martín Requero, Mª Angeles Científico T. amrequero@cib.csic.es Martínez Ferrer, Angel T. Profesor I. atmartinez@cib.csic.es Martínez Hernández, Mª Jesús Científico T. mjmartinez@cib.csic.es Medina Díaz, F. Javier Investigador C. fjmedina@cib.csic.es Moreno Díaz de La Espina, Susana Investigador C. smoreno@cib.csic.es Ortego Alonso, Felix Investigador C. ortego@cib.csic.es Páez Abril, Eduardo Científico T. epaez@cib.csic.es Parrilla Sánchez, Roberto Profesor I. rparrilla@cib.csic.es Peñalva Soto, Miguel A. Profesor I. penalva@cib.csic.es Pérez Prieto, Sara Isabel Tit. Sup. OPI saraip@cib.csic.es Pérez-Sala Gozalo, Mª Dolores Científico T. dperezsala@cib.csic.es Prieto Jiménez, Mª Auxiliadora Científico T. auxi@cib.csic.es Prieto Orzanco, Alicia María Tit. Sup. OPI aliprieto@cib.csic.es Ramírez de Verger, Juan M. Profesor I. jmramirez@cib.csic.es Rial Zueco, Eduardo Científico T. rial@cib.csic.es

312 Índice de Investigadores Actuales en Plantilla NOMBRE CATEGORÍA TLF.. -EXT. PÁGINA Risueño Almeida, Mª Carmen Profesor I Rivas Caballero, Germán Científico T Rivas López, Luis Científico T Rodríguez de Córdoba, Santiago Profesor I Rodríguez Martínez, Ramón B. Científico T Rodríguez Saint-Jean, Sylvia Tit. Sup. OPI Rojo Hernández, José Mª Investigador C Romero Garrido, Antonio Investigador C Sánchez Ayuso, Matilde Investigador C Sánchez Rodríguez, Lucas Profesor I Sánchez Testillano, Pilar Científico T Schvartzman Blinder, J. Bernardo Investigador C Serra Yoldi, Mª Teresa Científico T. mserra@cib.csic.es Silva González, Augusto Investigador C. asilva@cib.csic.es Solar Dongil, Gloria Científico T. gdelsolar@cib.csic.es Suárez Gónzalez, Mª Teresa Científico T. teresa@cib.csic.es Teixidó Calvo, Joaquín Investigador C. joaquint@cib.csic.es Tenllado Peralo, Joaquín Científico T. tenllado@cib.csic.es Vega Palacios, Miguel Angel Científico T. mavega@cib.csic.es Vidal Caballero, Miguel Ángel Científico T. mvidal@cib.csic.es (NOTA: El listado telefónico incluye los cuatro dígitos de la extensión cuando se marca la centralita del CIB, salvo líneas directas indicadas por siete dígitos) 303

313