TÉCNICAS DE TÉCNICAS REPRODUCCION DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

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1 TÉCNICAS DE TÉCNICAS REPRODUCCION DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

2 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA ESTIMULACIÓN OVÁRICA MONITORIZACION Progesterona vaginal 200mg/12h MENSTRUACION Puncion 36h post-hcg

3 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA PUNCION FOLICULAR TRANSVAGINAL

4 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA FIV: inseminación de los ovocitos en gotas de cultivo con los espermatozoides ICSI: microinyección de un espermatozoide dentro de un ovocito (indicado para factor masculino severo)

5 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA FIV Dilución n de espermatozoides ( / ml). Contacto de óvulos y espermatozoides en microgota.

6 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Decumulación de los ovocitos Hialuronidasa: 80UI/ml Batería de pipetas de diferentes diámetros

7 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ICSI ASISTIDA

8 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA FECUNDACIÓN 17-21H post-inseminación 2 CP 2 PN

9 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA fecundación Dia 3 Dia 2 Dia 4 Dia 6 Dia 5

10 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA DPI

11 CONGELACIÓN N DE ESPERMATOZOIDES CONGELACIÓN N DE OVOCITOS CONGELACIÓN N DE EMBRIONES CONGELACIÓN N DE TEJIDO OVÁRICO

12 Principios básicos b de criobiología Criopreservación n de material biológico: procesos físicof sico-químicos Cristales de hielo puro (-( 5 y 10 ºC) Intracelulares (no) Extracelulares Medio extracelular: solutos + concentrados deshidratación n celular para mantener equilibrio osmótico Velocidad de congelación: n: influencia IMPORTANTE Si es muy rápida: r hielo intracelular Si es muy lenta: colapso celular Estudiar la velocidad de enfriamiento adecuada Factores físicos. f Influencia Estrés s osmótico Fuerza física f del frente de hielo Papel de los crioprotectores

13 CRIOPROTECTORES De acuerdo a la permeabilidad a través s de la membrana celular: Agentes penetrantes Bajo Pm y permeables a través s de la membrana Desplazan paulatinamente el agua intracelular, evitando formación n de cristales de hielo Congelaciones a velocidad lenta Los más m s utilizados son: 1,2-propanodiol,DMSO,EG,Glicerol Agentes no penetrantes Alto Pm,, no entran en la célulac Promueven la rápida r deshidratación n celular Congelaciones a velocidades altas Los más m s utilizados son: Azúcares: (sacarosa, glucosa, dextrosa) Lipoproteínas de la yema de huevo, Proteinas de alto PM

14 CONGELACIÓN N DE ESPERMATOZOIDES INDICACIONES: Donantes de semen: evita transmisión n de enfermedades(hiv,hep B y C) Pacientes de TRA con disponibilidad limitada (viajes, residentes en el extranjeros (viajes, residentes en el extranjeros) Posibilidad de paternidad tras quimioterapia o radioterapia. Pacientes de TRA con dificultad para recoger la muestra. Pacientes de TRA sometidos a BT o AE.

15 MÉTODOS DE CONGELACIÓN N DE ESPERMATOZOIDES Vapores de Nitrógeno Hielo seco Descenso lento de TºC

16 Método de congelación. n. Vapores de Nitrógeno alicuotado lavado Adición crioprotector Rampa de Nitrógeno BANCO SEMEN Sumergir en N2 y guardar Vapores: 2 h 4 ºC 45 min

17 Método de congelación. n. Hielo seco lavado Adición crioprotector 4 ºC 45 min BANCO SEMEN Sumergir en N2 y guardar alicuotado Pildoras de CO2

18 Protocolo de congelación n lenta Utiliza un congelador biológico programable Equipo programable que permite un estricto control de las condiciones para bajar la Tª fracciones de grado centígrado por minuto El recipiente de congelación n donde colocamos la muestra se conecta a un tanque de nitrógeno líquidol Mediante un programa específico y sensores especiales, el ordenador registra la Tª en el interior del recipiente, y según n las indicaciones programadas, inyectará vapores de N 2 para bajar la Tª

19 Pajuelas Método de envasado. Envases Criotubos o crioviales Ampollas Gobelets o criotubos TODOS tienen sus ventajas e inconvenientes, por lo que la decisión de emplear uno u otro depende de las necesidades de cada laboratorio

20 CONGELACIÓN N DE TEJIDO OVÁRICO 1/650 niños desarrollará un cáncer. c Incidencia de cáncer c infantil está aumentando, pero también n la esperanza de vida. En 2010: 1/250 jóvenes j de años a será superviviente de cáncer c infantil. Trat. Antineoplásicos (sobre todo alquilantes y radiación n ionizante) producen gonadotoxicidad dando lugar a FOP. Gonadotoxicidad relacionada con: edad, agente terapéutico y la dosis.

21 Indicaciones Mujeres con cáncer, c enf autoinmune,, cirugía Mujeres sin pareja (jóvenes) Parejas que no quieren congelar embriones evitar conflictos éticos con embriones congelados

22 Ovocitos FIV Criopreservación Ovario Ovocitos MII Embriones Corteza Ovárica Ovario entero Congelación FIV ICSI Transplante Transferencia Embrionaria Heterotopico FIV-ICSI Ortotopico Concepcion Natural

23 Gran cantidad de folículos primordiales en la corteza ovárica Se cree que los folículos primordiales son menos sencibles a la criopreservación por su bajo metabolismo (profase de meiosisi) Flujo vascular garantizado por la arteria ovárica. Al descongelar y reinsertar se restaura la función endócrina y la fertilidad ( a diferencia de la congelación n de ovocitos o embriones) No depende del ciclo menstrual ni requiere estimulación n ovárica La médula m jugaría a un papel en el desarrollo folicular y esteroidogénesis

24 Los trasplantes restauran la fertilidad pero tienen una duración n limitada, por tanto, aconsejan que los trasplantes se hagan justo cuando se tengan deseos reproductivos. La pérdida p folicular es debida a: proceso de congelación-descongelaci descongelación 7% proceso de re-vascularizaci vascularización 65 %

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26 CONGELACIÓN N LENTA: T ª inicio: 18 ºC 0 º C 2-3 º C/min T ª seeding: -7 º C 0.3 º C / min hasta 30 ó -40 º C Descenso rápido r hasta 150 º C Intercambio agua-crioprotector (dmso + sac, proh + sac) DESHIDRATACIÓN N CELULAR TEMPERATURA TIEMPO

27 VITRIFICACIÓN: TEMPERATURA Altas concentraciones de crioprotectores que inducen la solidificación de la muestra, SIN formación de cristales, por elevación de la viscosidad durante el enfriamiento( DMSO, PROH, EG, SAC) Ultrarrápida, por inmersión directa en N2 líquido. Entre y º C/min TIEMPO Alta conc crioprotectores con muy poco volumen

28 Técnica de crioopreservación basada en el enfríamiento rápido de las soluciones crioprotectoras, sin formación n de cristales de hielo. Requiere una alta concentración n de crioprotectores. VITRIFICACIÓN Las mejoras de esta técnica t se logran disminuyendo el volúmen de medio en el que se vitrifica, permitiendo disminuir notablemente la concentración n de los crioprotectores

29 CONGELACIÓN VITRIFICACIÓN

30 Hovatta Newton Gook Slow freezing Slow freezing Slow freezing PROH-sacarosa DMSO Glicerol, PROH, DMSO, EG PROH Hreinsson 2003 Slow freezing PROH Schmidt 2004 Slow freezing EG-Sacarosa Ramihi, Isachenko 2004 Vitrificacion Glicerol, EG, DMSO

31 Ovocitos FIV Criopreservación Ovario Ovocitos MII Embriones Corteza Ovárica Ovario entero Congelación FIV ICSI Transplante Transferencia Embrionaria Heterotopico FIV-ICSI Ortotopico Concepcion Natural

32 INDICACIONES Conservación n de la fertilidad en mujeres con riesgo de perder su función n gonadal (quimio// radioterapia, cirugía) Prolongación n de la fertlidad en mujeres que postergan la maternidad Facilidad en la gestión n de donación n de ovulos Alternativa para pacientes que por distintos motivos (éticos,( morales, religiosos) no quieren congelar embriones Solución n al problema del alto nº n de embriones almacenados en bancos Salvar y rentabilizar un ciclo en el que se detecte cualquier incidencia que impida la transferencia de embriones( SHO, imposibilidad de recoger semen, etc)

33 HISTORIA La experiencia con congelación n se remonta a mediados de los años a 80 Chen y cols , 1988 Van Uem y cols 1987 Tucker y cols Porcu y Fabbri 1997, 1998,1999 Marina y cols Fossas y cols

34 Célula grande (130um) Distribución n y organización n de organelas citoplasmáticas ticas Gran área superficie/ volumen Célula detenida en MII con organización característica de los cromosomas Célula con alto contenido de agua intracelular

35 CAMBIOS MORFOLOGICOS ZP Gránulos corticales Membrana plasmática CAMBIOS EN EL CITOESQUELETO Huso meiótico Microfilamentos de actina Alteración n en el transporte de calcio

36 METODOLOGIA Y PROTOCOLOS CONGELACIÓN N LENTA DESCONGELACIÓN RAPIDA CONGELACIÓN N LENTA DESCONGELACIÓN LENTA VITRIFICACIÓN

37 vitri Sup Fec Trans Gestac Implant RNV Kuwayama % (58) 89,7% (52) 29 41,4% (12) 41,4% (transfer de 1 emb) en curso Lucena % (120) 87,2% (105) 23 56,5% (13)? 13 en curso Antinori % (330) 92,9 (305) ,5% (39) 13,2% en curso

38 Lübeck Results (till 07/2006) Survival Rate 50% Pregnancy Rate 100% 80% 91% 40% 34% 60% 40% 59% n=752 n=155 30% 20% 10.2% 20% 10% 0% Slow-cooling Vitrifikation 0% Slow-cooling Vitrifikation

39 VENTAJAS TECNICAS Buenos resultados Rápida No necesita congelador biológico DESVENTAJAS TECNICAS Soportes y almacenamiento Criotubo Pajuelas abiertas Hemistraw system Cryoloop Cryotop

40 HTF Equilibrio Vitri N2 N2

41 CONCLUSIONES Slow freezing vs Vitrificación Tiras de corteza ovárica Duración n limitada del transplante Auto transplante Ortotópico Baja eficacia hasta el momento

42 CONCLUSIONES Vitrificación n ofrece excelentes tasas de supervivencia, es rápido r y barato, pero requiere experiencia y falta estandarizar Será el procedimiento de elección n en el futuro

43 MUCHAS GRACIAS Lic. Florencia Gimenez Dr. Ramiro Quintana