Avances en el diagnóstico de los Sarcomas de Partes Blandas. Aportaciones de la Biología Molecular

Transcripción

1 Avances en el diagnóstico de los Sarcomas de Partes Blandas. Aportaciones de la Biología Molecular Juan A. Carrasco Oncología Médica H. Xeral-Cíes. CHUVI, Vigo

2 Los clínicos y la biología molecular

3 Los clínicos y la biología molecular error organizativo

4 Los clínicos y la biología molecular error organizativo venganza de los patólogos y BMs

5 Los clínicos y la biología molecular error organizativo venganza de los patólogos y BMs los BMs son muy técnicos y poco prácticos y al final los clínicos no nos enteramos de nada

6 Los clínicos y la biología molecular error organizativo venganza de los patólogos y BMs los BMs son muy técnicos y poco prácticos y al final los clínicos no nos enteramos de nada los clíns sin dx casi no tenemos ni por dónde empezar

7 Conceptos Avances Aplicaciones

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9 25% discrepancia entre centr ref y perifs 16% relevante para decisión terapéutica

10 Biología Molecular = Material Genético

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12 SEOM XIV 23/10/2013. Educacional 1: Sarcoma

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14 Alteraciones genómicas cromosómicas génicas

15 Alteraciones genómicas --> cariotipos complejos cromosómicas génicas

16 Alteraciones genómicas --> cariotipos complejos cromosómicas --> traslocaciones/amplificaciones génicas

17 Alteraciones genómicas --> cariotipos complejos cromosómicas --> traslocaciones/amplificaciones génicas --> mutaciones, sarcomagénesis

18 Sarcomas con cariotipos complejos La mayoría... Leiomiosarcoma, sarcoma pleomórfico, angiosarcoma Pérdida de telómeros, mutaciones del p53

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20 Cariotipos complejos En principio escaso valor diagnóstico Variantes pleomórficas con CGH y GEA "Verdaderos" pleomórficos (stem cells mesenquimales)

21 Sarcomas con cariotipo simple Translocaciones Amplificación cromosómica

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23 Translocaciones en sarcomas factor de transcripción quimérico hiperactivo (ligación) expresión génica cte (promotor unido a fact de crec) alteración de la localización de la señalización

24 Amplificación cromosómica reduplicación anómala de un fragmento cromosómico respuesta no regulada a daño en ADN cromosomas gigantes o en anillo

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26 Mutaciones cambio de base: aminoacido distinto o stop pérdida o adición de una base: cambio marco de lectura

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28 Avances de BM en sarcomas técnicos conceptuales prácticos

29 Herramientas diagnósticas Citogenética FISH PCR (RT y Q-PCR) CHG GEA

30 Citogenética Cariotipo convencional Cariotipo espectral

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33 FISH no precisa tej fresco ni metafase se puede hacer sobre áreas específicas de la muestra varios tipos de sondas (ruptura/fusión/cuantificación)

34 FISH sonda de ruptura-separación rojo en un extremo del gen y verde en otro amarillo (suma(?)): integridad del gen vs rojo y verde separados: gen fragmentado (una parte se ha traslocado)

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36 FISH sonda de fusión una sonda en 3' de un elemento y otra en 5' del otro elemento de una translocación previamente conocida si trasloc presente pto amarillo (trasloc)+ pto rojo y verde separados del alelo normal. Si trasloc no presente 2 ptos rojos y 2 verdes (2 alelos normales) Más específico pero menos sensible (falso neg si la alterac no es la que se presupone)

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39 FISH sonda de cuantificación sondas en locus de interés y centrómero sondas en telómeros ratio locus:centrómero; cell normal ratio 1-2:1

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42 PCR ptos específicos de mutación o delección cambios epigenéticos factible con mínima cantidad de adn fácil de contaminar muy versatil y sensible (en sentido técnico, no dx)

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44 PCR en tiempo real (cuantitativa (Q-PCR)) cebadores o sondas con cromóforos + inhibidor (varios tipos) fluorescencia proporcional a la frecuencia con que se expresa la secuencia

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47 FISH vs PCR en translocaciones Ninguna es 100% sensible o específica Rt-PCR más sensible en muestras pequeñas (paaf en recidivas, est méd ósea) FISH ventaja en tej antiguo con mala preservación de RNA

48 Técnicas basadas en arrays paneles/parrillas/matrices Series de sondas representando miles de oligonucleótidos panelizados en un chip Hibridación Genómica Comparativa (ultracariotipo)->subtipos Arrays de Expresión Génica (expresión de proteínas vía mrna-->cdna)->marcs pronóst y dianas

49 Técnicas basadas en arrays HGC Se basa en el supuesto de que subtipos específicos de sarcomas tienen patrones similares de ganancias y pérdidas en el nº de copias genéticas. Detecta regiones cromosómicas que están amplificadas o delecionadas. El empleo de arrays (tb se puede hacer sobre extensión de cromosomas metafásicos) permite detectar desequilibrios genómicos submicroscópicos.

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51 Técnicas basadas en arrays GEA Se emplea mrna (cdna) asumiendo que variaciones de mrna reflejan variaciones de expresión proteica. Se analizan genes "expresados" -que han dado origen a un mrna-> proteína- (vs CGH secuencias -o genes- localizadoras de regiones cromosómicas) Especialmente útil en investigación de biomarcadores pronósticos y dianas terapéuticas

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53 A considerar... No hay eficacia probada dx en ausencia de dx previo por mo/ihq de sarcoma. Muchas transloc son compartidas por t. mesenquimales, epiteliales y linfoides

54 Avances conceptuales estadificación molecular firma genética dianas terapéuticas

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57 NATURE MEDICINE VOLUME 16 NUMBER 7 JULY 2010

58 Firma de expresión génica Alteración de la expresión de uno o varios genes con especificidad validada en términos de diagnóstico, pronóstico o predicción de respuesta a un tratamiento

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62 técnicas científico/ estadísticas médicas

63 Avances en la práctica (ya era hora...)

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66 SEOM XIV 23/10/2013. Educacional 1: Sarcoma Group 1: nonpleomorphic tumors with pathognomonic molecular events. Group 2: nonpleomorphic tumors for which pathognomonic molecular events have yet to be identified. Group 3: sarcomas with pleomorphic histology and some defined molecular events alongside complex karyotypic changes. Group 4: pleomorphic sarcomas with complex karyotypes and expression profiles.

67 SEOM XIV 23/10/2013. Educacional 1: Sarcoma The Current State of Molecular Pathology in Diagnosing Sarcomas An ESUN Article by Elizabeth Demicco MD, PhD and Alexander Lazar MD, PhD Copyright 2012 Liddy Shriver Sarcoma Initiative.

68 SEOM XIV 23/10/2013. Educacional 1: Sarcoma

69 Ejemplos Mutaciones GIST mut activadora de c-kit o PDGFA Fibromatosis desmoide esporádica CTNNB1 Id familiar mut inactivadora de APC (regulador negativo de beta-catenina) Importancia especial en recurrencias vs cicatrices. Más valor que ihq+ para expr nuclear de b-cat.

70 Ejemplos Translocaciones. FISH sonda ruptura S Sinov basta fish en SS18 (SYT), que se recombina con SSX1, 2 ó 4 (fish en 3 locs del crx no sería coste efectivo). Se desconoce así el 2 locus, que puede tener tb valor dx Liposarc mix/cell redondas FUS-DDIT3: el reordenamiento de DDIT3 es dx de M/RCLS; FUS es inespecífico

71 Ejemplos Translocaciones. FISH sonda fusión Tumor desmoplásico de células redondas pequeñas: marca y fusión de EWSR1 y WT1 (se precisa conocimiento previo de la trasloc específica)

72 Ejemplos Translocaciones. FISH sonda cuantificación Liposarcoma bien dif/t lip atíp o liposarc desdif: alta amplific de 12q15. Angisarc radioinducido MYC (8q24) altamente amplificado (vs de novo o prolif atípicas vasc no sarc)

73 Ejemplos FISH vs PCR FISH ventaja en confirmar Ewing clásico (múltiples traslocs asoc al EWSR1) vs dx dif con t desmoplásico de crp, más rentable rt-pcr para las trasloc más frecs de Ew y tdcrp Condrosarcoma mixoid extraesq dx NR4A3-EWSR1 por RT-PCR es dx pero no disponible habitualmente y se realiza FISH para EWSR1 que es de amplio uso aunque poco sensible y específico

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75 Conclusiones En el diagnóstico de sarcomas la BM es actualmente un elemento más con un papel definitivo en la práctica Los avances técnicos facilitarán la generalización de firmas genéticas como instrumentos integradores de carácter diagnóstico, pronóstico y terapéutico La perspectiva del oncólogo clínico debe incluir la asimilación de la BM en el dx, pronóstico (estadificación molecular) y, por supuesto, el tratamiento.

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