CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES. Gabriel A. Bó y Paula Rodriguez Villamil Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC) Córdoba, Argentina

Transcripción

1 CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES Gabriel A. Bó y Paula Rodriguez Villamil Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC) Córdoba, Argentina

2 VENTAJAS No es necesario transferir los embriones inmediatamente después de colectados. No es necesario tener muchas receptoras sincronizadas. Permite el transporte de genética a bajo costo. Facilita la introducción de una nueva raza y la adaptación de los futuros terneros al nuevo medio ambiente.

3 VENTAJAS Disminuye el riesgo de introducir enfermedades exóticas. Los embriones pueden ser almacenados mientras se testean los padres por enfermedades o por producción. Almacenamiento de genética de razas o especies raras o en extinción. Permite mantener la diversidad genética a través de un banco de embriones.

4 CRIOPRESERVACIÓN CONGELAMIENTO VITRIFICACIÓN

5 Kasai, 2000

6 OBJETIVOS Remover gradualmente el máximo de agua posible de las células durante el procedimiento de congelamiento Evitar la formación de grandes cristales de hielo Evitar la remoción exagerada de agua de las células (Seidel Jr, 1986).

7 Medio de Congelado de embriones 1. Medio Holding (PBS o Hepes) 2. antibiótico-antimicótico 3. Sustancias surfactantes (bsa 0.4% o sintéticos) 4. Crioprotectores

8 Cryoprotectores Permeables: Glycerol or ethylene glycol Nonpermeables: Sucrosa o sacarosa

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10 Protocolo de Congelación 1. Clasificar los embriones (Grado 1). 2. Colocarlos en Glicerol o Etilenglicol1.5 M y cargar la pajuela. Tiempo Total: 5-10 minutos. 3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-5 a -7 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. 4. Realizar el seeding. Dejar 10 minutos

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13 Cotton plug Embryo Plug/label E511 SM SRN 5G DT 1 Cryoprotector

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18 Seeding *Inducción de un núcleo que cristalización Embryo E511 SM SRN 5G DT 1 Crioprotector

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20 Protocolo de Congelación 1. Clasificar los embriones (Grado 1). 2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. Tiempo Total: 10 minutos. 3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. 4. Realizar el seeding. Dejar 10 minutos 5. Congelar a 0,5 o 0,6 ºC por minuto hasta - 35ºC. 6. Sumergirlas en N 2.

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22 DESCONGELACION Convencional (Glycerol) Descongelamiento 3 a 5 pasos. 1 Paso (Glycerol) Descongelamiento en la pajuela (Gly + sacarosa) Transferencia directa (Etilenglicol) Descongelamiento a T.

23 Relative Cell Volume Cell Volume Changes with Addition and Removal of Glycerol vs Ethylene Glycol Influx Efflux 1 0 Diluent Added Time in Permeating Additive

24 Comparación de las tasas de preñez entre EG y GLY Glicerol Etilenglicol No. % Pre. No. % Pre. Autores Lange (1995) Hinshaw et al. (1996) Looney et al. (1996) Arreseigor et al. (1998) Holland Gen. (unpub.) Leibo & Mapletoft (1998) Hasler (2002)

25 Embriones Brahman vs Bos Taurus (Looney et al., 2004) Biotipo Glicerol Etilenglicol Total N Pre. % N Pre. % % Británicas Continentales Sintéticas con Brahman Brahman Totales

26 Tiempo TETF P/total Valor P % 3 minutos 251/385 55,84 >3 6 minutos 372/655 56,79 >6 min 16 min 42/82 0,42 51,22 Total 1122 Bo et al., 2012

27 Estado embrión P/total Valor P % Mórula 259/468 ab 55,40 Blastocisto 275/463 temprano a 59,39 0,004 Blastocisto 179/344 bc 52,03 Blastocisto expandido Total /58 c 39,66 Bo et al., 2012

28 EFFECTS OF ETHYLENE GLYCOL TIME EXPOSURE ON SURVIVAL OF FROZEN-THAWED BOVINE EMBRYOS

29 EXPERIMENT 1 In vitro assessment of 5, 10 or 20 min exposure interval times into Etilenglicol (EG) Morulas and blastocyst Grade 1 (n=200) Distributed into the three different groups at room temperature. Group 1: embryos exposed into EG (Vigro Ethylene glycol, Bioniche Animal Health) for 5 min Group 2: embryos exposed into EG for 10 min Group 3: embryos exposed into EG for 20 min. Embryos were loading into 0.25 ml straws Freezing control machine (Freezing control 5500, Cryologic ) Cooling rates -0.5 C/min until 37 C Stored at least for one week Thawing: At 30 C for 12 sec, following embryos were placed into Holding media After 5 minutes, thawed embryos were translated for culture into SOF media. In vitro survival rates evaluation: Re-expansion (24h) Hatching(72h)

30 RESULTS Table 1. In vitro survival rates of cryopreservation embryos exposed 5, 10 and 20 min into Ethyleneglicol. Exposure interval time Total embryos Re-expansion rates n (%) Hatching rates (n) % 5min (91) 41 (62) 10min (91) 41 (61) 20min (85) 34 (51)

31 EXPERIMENT 2 In vitro assessment of 10, 20 or 30 min exposure interval times into Etilenglicol Morulas and blastocyst Grade 1 (n=467) Distributed into the three different groups at room temperature. Group 1: embryos exposed into EG for 10 min Group 2: embryos exposed into EG for 20 min Group 3: embryos exposed into EG for 30 min. Embryos were loading into 0.25 ml straws Freezing control machine (Freezing control 5500, Cryologic, Australia) Cooling rates -0.5 C/min until 37 C Stored at least for one week Thawing: At 30 C for 12 sec, following embryos were placed into Holding media After 5 minutes, thawed embryos were translated for culture into SOF media. In vitro survival rates evaluation

32 RESULTS Table 2. In vitro survival rates of cryopreservation embryos exposed 10, 20 and 30 min into Ethyleneglicol. Exposure interval time Total embryos Re-expansion rates n (%) Hatching rates (n) % 10 min (89) 105 (69) 20 min (82) 107 (66) 30 min (82) 101 (66)

33 EXPERIMENT 3 In vitro assessment of exposure interval times into EG at different temperature The effect of used two exposure times (4 or 30 min) x the effect of different temperature (24 C or 37 C) during the embryos exposure into EG. A 2x2 factorial design was used. Morulas and blastocyst Grade 1 (n=127) Distributed into the three different groups at room temperature. Group 1: embryos exposed into EG for 5 min at 24 C Group 2: embryos exposed into EG for 5 min at 37 C Group 3: embryos exposed into EG for 30 min at 24 C Group 4: embryos exposed into EG for 30 min at 37 C After EG exposure the embryos were loading into 0.25 ml straws Freezing control machine (Freezing control 5500, Cryologic, Australia) Cooling rates -0.5 C/min until 37 C Stored at least for one week Thawing: At 30 C for 12 sec, following embryos were placed into Holding media After 5 minutes, thawed embryos were translated for culture into SOF media. In vitro survival rates evaluation

34 RESULTS Table 3. In vitro survival rates of cryopreservation embryos exposed 5 or 30 min into Ethylene glicol at two different temperatures. Exposure interval time Temperature ( C) Total embryos Re-expansion rates n (%) Hatching rates (n) % 5 min 30 min (85) 19 (73) (75) 22 (69) (82) 22 (65) (77) 20 (65)

35 EXPERIMENT 4 In vivo Assessment of Ethylene glycol toxicity during post-thawed period before direct transfer. Commercial cryopreserved Bonsmara embryos into EG (Vigro Ethylene glycol, Bioniche Animal Health ) (n=1122) Thawed at 30 C for 12 sec Loaded into embryo transfer guns Placed into synchronized bovine recipients with the same protocol. The interval periods between thawing and transfer into uterine horn were classified transfers in three different groups: Group 1: embryos transfer in a period of 3 min Group 2: embryos transfer in a period between 3 to 6 min Group 3: embryos transfer in a period higher than 6 min. In vivo evaluation: Pregnancy rates were evaluated by ultrasound on Day 30.

36 RESULTS Table 4. Pregnancy rates of post-thawed embryos with different interval time during embryo transfer Interval time post-thawing Total of embryos Pregnancy rates n (%) 3 min (55,84) >3 6 min (56,7) > 6 min (51,2) Total (59,2)

37 IN VITRO VS IN VIVO

38 COMPARACION DE LA SUPERVIVENCIA A LA CONGELACION CONVENCIONAL DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VIVO E INVITRO Embryo Cryopreservation No. Hatching Production System Embryos n (%) In vivo Slow Freezing (81) In vitro Slow Freezing (24) Rodriguez Villamil et al., 2011

39 VITRIFICACIÓN Transformación de un liquido en estado vítreo, producido no por la cristalización sino por la extrema elevación de la viscosidad durante el enfriamiento.

40 CONDICIONES Densidad / Viscosidad Velocidad de enfriamiento

41 ASOCIACIÓN DE CRIOPOTECTORES CRIOPROTECTOR FUERTE CRIOPROTECTOR DEBIL

42 AUMENTO DE LAS TASAS DE ENFRIAMIENTO Reducción del tamaño de las muestras Reducción del aislamiento térmico ALTERNATIVAS Modificación de los tipos de Envase. Eliminación de los vapores de N2. (Slush de Nitrógeno).

43 ENVASES Contacto directo de las muestras con el N2

44 ENVASES Disminución del tamaño de la muestra MACROVOLUMEN (>50uL) C/min MICROVOLUMEN (<20uL) C/min

45 VITRIFICACIÓN OPS (Vajta et al, 1997) interno = 1,7 mm Grosor de pared = 0,15 mm cm interno 1,7 mm interno 0,8 mm Pared 0,15 mm Pared 0,07 mm cm

46 PROCEDIMIENTO SOLUCIONES DE VITRIFICACIÓN PBS ES ES3=10% PROH + 10% EG+ 0.25M Sacarosa VS3= 20% EG + 20% PROH ES VS

47 PROCEDIMIENTO Vajta et al, 1997

48 PROCEDIMIENTO INMERSION EN EL NITROGENO LIQUIDO

49 Solid Surface Vitrification Dinnyes et al. 2000

50 Solid Surface Vitrification

51 COMPARACION DE LOS METODOS DE CRIOPRESERVACION EN LOS EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VIVO E INVITRO Embryo Cryopreservation No. Hatching Production System Embryos n (%) In vivo In vitro Slow Freezing (81) Vitrification (71) Slow Freezing (24) Vitrification (62) Rodriguez Villamil et al., 2011

52 DILUCIÓN DE LAS SOLUCIONES CRIOPROTECTORAS DENTRO DE PAJUELAS DE EMBRIONES PRODUCIDOS IN VITRO VITRIFICADOS EN CVM

53 JUSTIFICACION Uno de los mayores problemas es la remoción de las altas concentraciones intracelulares de los crioprotectores intracelulares del crioprotector después del descongelamiento (Seidel, 1996).

54 JUSTIFICACION El-Gayar et al. 2008

55 DILUCION DE LOS CRIOPROTECTORES Soluciones de Dilución 0.25M Sacarosa Vigro Holding medium

56 VITRIFICACIÓN Vitrification Solution Drop (0.6µL) 200µL of Warming Solution Fyberplug Cottom

57 IN-STRAW DILUTION 5 sec (air) 37 C

58 EVALUACIÓN IN VITRO

59 RESULTADOS Re-expansion and hatching rates of blastocysts embryos diluted in-straw in two different warming solutions Vitrification Solution Warming Solution No. Embryos % Re- expansion % Hatching VS1 VS3 Sucrose ± 2.3 b 47.0 ± 1.7 c Holding ± 1.0 c 27.7 ± 3.1 d Sucrose ± 1.3 a 57.2 ± 2.2 b Holding ± 1.4 a 58.0 ± 2.5 b Control ±1.2 a VS1= 10% EG + 10% PROH (1 min) followed by 20% EG + 20% PROH+ 0.25MTr (30sec); VS2= 15% EG +0.25MTr (1min) followed by 30% EG +1MTr (30sec) a,b Rates at the same column with different superscript significant differ, P<0.05

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