Correlation of cyto-colpo-histology in human papillomaviruses (HPV) lesions and the use of PCR technique in determining HPV infection

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1 Hosp Aeronáut Cent 2013; 8(1): Correlación cito-colpo-histológica de lesiones causadas por el virus del papiloma humano (HPV) y la utilidad de la técnica de PCR para determinar la infección por HPV Correlation of cyto-colpo-histology in human papillomaviruses (HPV) lesions and the use of PCR technique in determining HPV infection 1er Ten. (E. Med.) María José Moreno*, Carlos E Calveiro**, Marcela Dionisi**, 1er Ten. (E. Med.) Carolina Gravina**, Cap. (E. Med.) Jorge Flores***, Marta Cabrera*** Lugar de Trabajo: Hospital Aeronáutico Córdoba. Colon 479, Ciudad de Córdoba. * Residente del Servicio de Ginecología ** Médico de planta del Servicio de Ginecología *** Médico de planta del Servicio de Anatomía Patológica Resumen Abstract Introducción: El cáncer de cuello uterino es una patología prevalente más aun en países sub-desarrollados y existe una relación causal entre la infección persistente con algún tipo oncogénico de HPV y el desarrollo de dicha neoplasia. Se cuenta con un estudio de screening mundialmente aceptado y que también previene el carcinoma cervical que es el Papanicolaou y colposcopia, y en los últimos años se han incorporado estudios de biología molecular para el estudio del ADN viral. Material y Métodos: Se estudiaron 60 pacientes. Se tomó como método gold standard a la biopsia de cuello uterino y a 29 pacientes se les realizó PCR para identificar ADN-HPV. La edad promedio de las pacientes fue de 30,95 años con mayor cantidad de pacientes en el rango etario de años. Resultados: El 70% tuvo citología negativa y 48 pacientes tuvieron biopsia positiva, 16 con resultado positivo de PCR. Obtuvimos una alta especificidad el Papanicolaou con respecto a la biopsia (90%), no así en comparación con el test de PCR (S=56% E=50%) debido al número pequeño de pacientes que se sometieron a este estudio. Discusión: Las mujeres menores de 30 años son las que más Introduction: Cervical cancer is a prevalent pathology, especially in underdeveloped countries, and there is a causal relationship between persistent infection with some type of oncogenic HPVs and the development of said neoplasia. There are two universally-accepted screening studies which also prevent cervical cancer, i.e. Pap smear and colposcopy, and, in the last few years some molecular biology studies have been adopted for the study of viral DNA. Material and methods: 60 patients were studied. Cervical biopsy was the gold standard method used and 29 patients were tested using the PCR technique to identify HPV-DNA. Patients' average age was 30.95, most of whom belonged to the years old age span. Results: 70% of patients had negative cytology test and 48 patients obtained positive biopsy results, 16 had positive results in the PCR test. The Pap smear specificity was higher as regards the biopsy (90%), unlike the PCR test (S=56% E=50%) due to the small number of patients that underwent this study. Discussion: Women younger than 30 years old have more chances of infection, but no of developing the disease considering its natural history. Therefore, we recommend continuing with the 38

2 Moreno et al, Hosp Aeronáut Cent 2013; 8(1): chances tienen de contraer la infección, no así de desarrollar la enfermedad debido a la historia natural de la misma, por lo que aconsejamos continuar con el screening regular de Papanicolaou/colposcopia e introducir con lapsos de 3 años o más en mujeres mayores a 30 años los estudios de biología molecular. Conclusiones: Se espera poder contar con mayores estrategias que nos permitan usar los beneficios de los test ADN-HPV sin sobre tratar a mujeres que probablemente atraviesan por una infección transitoria. Pap smear/colposcopy regular screening and introducing molecular biology studies in women older than 30 years old, every 3 years or more. Conclusions: We hope to have more strategies available which enable the use of HPV-DNA test benefits, without overtreating patients who are probably suffering from a transitory infection. Keywords: Human Papillomaviruses, PCR Palabras Clave: Papiloma Humano, PCR Recibido 16 de Noviembre de Aceptado 21 de Diciembre de Introducción En estos días, el cáncer de cuello uterino es una patología muy prevalente, especialmente en países subdesarrollados. Toda mujer sexualmente activa está en riesgo de contraer cáncer de cérvix a lo largo de su vida, por lo que se la puede considerar como una neoplasia de transmisión sexual, ya que ésta es la única forma de contraer el virus. Se sabe que existe una relación causal firme entre infección persistente con algún serotipo oncogénico de HPV y el cáncer cervical (1,2), (el 99% del cáncer se relaciona con HPV), siendo este riesgo mayor al de la asociación tabaquismocáncer de pulmón (21). Dicha infección progresa desde lesiones pre-neoplásicas (neoplasia cervical intraepitelial) hasta cáncer invasor. En el ser humano es un virus epiteliotropo que transfecta las membranas mucosas de los órganos genitales y el epitelio queratinizado de la vulva, periné, pene y área ano-rectal 1,5,18. Se han identificado más de 100 tipos de HPV, dividiéndose los tipos genitales según su supuesto potencial oncogénico: ALTO RIESGO: 16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58 y 59 RIESGO INTERMEDIO: 26, 53, 66, 68, 72 y 82 BAJO RIESGO: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 y 81. (Se relacionan con L-SIL y condilomas acuminados, no son capaces de integrarse al genoma humano) (1,18). La unión del epitelio escamoso estratificado de la vagina y ectocérvix con el epitelio columnar del conducto endocervical se denomina unión escamo-columnar original. El epitelio cilíndrico es reemplazado por epitelio metaplásico inmaduro e indiferenciado gracias a la flora vaginal y la acidez del medio, originando epitelio metaplásico escamoso estratificado maduro, casi indistinguible del epitelio original, conocido como nueva unión escamo-columnar (colposcópica) 1,5,7,18. El área entre la unión escamo-columnar original y la colposcópica se llama Zona de Transformación (donde se originan la mayoría de las neoplasias cervicales). El genoma del HPV se integra en los cromosomas del huésped por las proteínas E6 y E7 que inmortalizan los queratinocitos del epitelio cervical, lo que produce inestabilidad genómica. La proteína E6 se une al gen p53, lo que impide la apoptosis y aumenta la actividad telomerasa. La proteína E7 se une al gen del retinoblastoma Revista del Hospital Aeronáutico Central 39

3 Correlación cito-colpo-histológica de lesiones causadas por el virus del papiloma humano (HPV) y la utilidad de la técnica de PCR para determinar la infección por HPV (supresor tumoral). Son necesarias más de tres mutaciones independientes para la transformación celular maligna. 1,19 La infección por HPV es necesaria pero no suficiente para inducir un carcinoma en un huésped inmunocompetente, también influyen: anticonceptivos combinados orales, tabaquismo, infecciones con otros microorganismos, factores dietéticos. La morfología de las lesiones escamosas intraepiteliales se caracterizan por la maduración celular anormal, crecimiento nuclear, atipia y mitosis. El 60% de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) 1 regresa, el 30% persiste y el 11% progresa a carcinoma in situ. Para NIC 2, 40% regresión, 40% de persistencia, 20% progresa a carcinoma in situ y 5% a carcinoma invasor, siendo las cifras de 33% regresión, 56% persistencia y más del 12% de progresión a carcinoma invasor para NIC 3 1. Estudios prospectivos en mujeres jóvenes reportan altos índices de adquisición de HPV y el promedio de duración de estas infecciones es menor a un año. 6 En nuestro país, el cáncer de cuello uterino es el segundo cáncer más diagnosticado. Se estima que cada año se diagnostican 3000 nuevos casos y mueren aproximadamente 1800 mujeres por esta enfermedad. En 1980 la mortalidad en nuestro país por esta patología era de 7,12/ mujeres, en el ,59/ y en ,50/ mujeres. 10 Según la OMS, en su reporte de junio de 2010 en Argentina hay una prevalencia de infección por HPV 16/18 con citología normal del 6,8%, 37,6% con L-SIL y 67, % para H-SIL contra el 3,8%, 24,3% y 51,1% para todo el mundo en las mismas categorías. 20 Actualmente contamos con un método de screening mundialmente aceptado y que a su vez ayuda a la prevención del cáncer de cuello como es el Papanicolaou y la colposcopía, métodos que en nuestro ámbito se usan en conjunto. En los últimos años se han implementado técnicas de biología molecular para el estudio del ADN del HPV. Objetivos Los objetivos del presente trabajo son los siguientes: 1. Conocer la sensibilidad y especificidad de los métodos de screening disponibles en nuestro medio para la determinación de infección por HPV. 2. Correlacionar la citología e imágenes colposcópicas sospechosas de infección por HPV con los resultados de histología. 3. Evaluar la sensibilidad y especificidad de la PCR para determinar la presencia de ADN viral en pacientes seleccionadas. 4. Determinar la prevalencia de infección según el rango etario. Material y Métodos Estudio descriptivo (serie de casos) retrospectivo, no aleatorio para evaluar la presencia de lesiones cito-colpo-histológicas relacionadas con infección por HPV en mujeres que concurren al consultorio de Tracto Genital Inferior del Hospital Aeronáutico de Córdoba. Se evaluaron a 60 pacientes de sexo femenino que concurrieron al Departamento de Tracto Genital Inferior del Servicio de Ginecología del Hospital Aeronáutico de Córdoba entre marzo del 2010 a diciembre de 2011 que concurrieron a 40

4 Moreno et al, Hosp Aeronáut Cent 2013; 8(1): realizar el screening de rutina de citología y colposcopía. Se incluyeron en el trabajo a todas aquellas mujeres entre los 18 y 55 años de edad con lesión colposcópica sugestiva de infección por HPV al momento del examen sin antecedentes previos de infección por dicho virus. Se realizó el Papanicolaou tomando con espátula de Ayre una muestra del ectocérvix y con citobrush una muestra del endocérvix (girando el elemento recolector 360 en ambos casos) se fija la muestra en alcohol al 96%, se colorea según técnica de Papanicolaou y luego se observa al microscopio. Luego de extraída la muestra para la citología, se limpia el cuello uterino y se colorea primero con ácido acético al 5% con una torunda de algodón y luego se observa con el colposcopio; se realiza el mismo procedimiento con solución de Lugol. Se consideraron como anormalidades citológicas la presencia de 18 : Koilocitos Ascus (células epiteliales con significado incierto) Displasia leve, moderada o grave (CIN I-II-III) Se consideraron anormalidades colposcópicas la presencia de 14 : Epitelio acetoblanco Base Mosaico Combinación de cualquiera de las anteriores. fija en formol al 40% y según el tamaño de la muestra se cortó en dos o más mitades, se realizó taco en parafina, corte con micrótomo, tinción con hematoxilina/eosina y visualización con microscopio óptico. Los resultados se informaron como lesión sugestiva de HPV a la sola presencia de koilocitos, SIL de bajo grado a la displasia leve y SIL de alta grado a la displasia epitelial moderada o severa, en casos de carcinoma in situ, se informo como tal. En caso de solicitar test ADN-HPV, antes de realizar la biopsia se tomó la muestra correspondiente para dicho test y se envió la misma para ser estudiada en laboratorio especializado. Se utilizó como prueba diagnóstica Gold Standard a la biopsia de cuello uterino. Se analizaron los datos epidemiológicos recopilados para todas las variables mediante gráficos de Microsoft Excel y se analizaron estadísticamente mediante el programa OpenEpi (www.openepi.com) Resultados La edad promedio de las pacientes estudiadas fue de 30,95 años con una desviación estándar de 10,42 años. El rango fue de 37 años con una edad mínima de 18 años y una edad máxima de 55 años. Gráfico N 1: Distribución de pacientes según la edad Toda paciente con lesión colposcópica sugerente de infección por HPV fue citada nuevamente para la realización de una biopsia y 29 pacientes fueron referidas para la realización de test ADN- HPV (en nuestro caso se realizó PCR) Para la evaluación histológica se realizó la biopsia con pinza sacabocados de la región afectada, se Revista del Hospital Aeronáutico Central 41

5 Correlación cito-colpo-histológica de lesiones causadas por el virus del papiloma humano (HPV) y la utilidad de la técnica de PCR para determinar la infección por HPV El histograma muestra la distribución de las pacientes con respecto a la edad, resultando con asimetría izquierda. El 70% de las pacientes (42) con imagen colposcópica sospechosa de infección por HPV tuvo citología negativa para dicha infección y solo el 30% (18) fue positiva. y el estudio de biología molecular y luego los métodos de screening disponibles en nuestro centro de estudio con el test ADN-HPV. Gráfico N 4: Proporción de pacientes según resultado PCR Gráfico N 2: Proporción de pacientes según citología Los resultados obtenidos se expresan en las siguientes tablas: Tabla N 1: Sensibilidad y especificidad del Papanicolaou respecto al Gold Standard De las 60 pacientes estudiadas, solo 48 tuvieron histología positiva para infección por HPV. Gráfico N 3: Distribución de pacientes según resultado de histología IC 95% SENSIBILIDAD 34.95% ESPECIFICIDAD 90.91% VPP 94.44% VPN 23.81% PRECISIÓN DE DIAGNÓSTICO 45% Tabla N 2: Sensibilidad y especificidad del test ADN-HPV (PCR) respecto al Gold Standard. IC 95% SENSIBILIDAD 56% ESPECIFICIDAD 50,00% VPP 87.5% VPN 15.38% PRECISIÓN DE DIAGNÓSTICO 55.17% pacientes fueron remitidas para evaluación de ADN-HPV, de las cuales 16 (55,17%) tuvieron un resultado positivo y en 13 (44,83%) no se detectó ADN viral. Una vez seleccionadas las pacientes y con los resultados definitivos de los estudios realizados a cada una de ellas (citología, colposcopía, biopsia, PCR) se procedió a calcular la sensibilidad, especificidad, VPP y VPN comparando al método que se utilizo como gold standard con la citología Tabla N 3: Sensibilidad y especificidad del Papanicolaou + Colposcopía con respecto al test ADN-HPV (PCR) IC 95% SENSIBILIDAD 66.67% ESPECIFICIDAD 64.29/ VPP 66.67% VPN 64.29% PRECISIÓN DE DIAGNÓSTICO 65.52% De las 16 pacientes con test ADN-HPV positivo, el 50% fue para HPV de bajo riesgo, el 37,5% 42

6 Moreno et al, Hosp Aeronáut Cent 2013; 8(1): para alto riesgo (prevaleciendo el sub tipo 58) y el 12,5% para riesgo intermedio Gráfico N 5: Cantidad de pacientes según tipo de HPV Todas las pacientes infectadas con HPV de alto riesgo eran menores de 30 años al momento del estudio. Discusión Los test utilizados para determinar la presencia de ADN viral tienen mayor sensibilidad y no sólo identifican mujeres con enfermedad cervical, sino también a aquellas con riesgo de desarrollar CIN en los próximos 10 años y combinados con la citología, en pacientes con ambos test negativos hay mayor probabilidad de que no exista riesgo de cáncer cervical. 2,9,11 La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica de biología molecular con la cual se obtienen grandes números de copias de un fragmento de ADN en particular; se basa en la propiedad natural que las polimerasas de ADN tienen para replicar las hebras de ADN para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas para separar dichas hebras y luego dejar que vuelvan a unirse, esta vez con un cebador (secuencia complementaria en el ADN molde). Es una técnica muy sensible ya que se necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias. Para la detección de HPV se utilizan los primers GP5+/GP6+ que amplifican aproximadamente 150 pares de bases de la región L1 de 22 tipos de HPV ( ) y si da positivo se utilizan primers para la detección de E6 de los HPV El resultado obtenido se expresó según el número de HPV implicado en la lesión en caso de ser positiva la presencia de ADN viral o por la no detección de ADN en la muestra analizada. Los test de detección de material genómico son recomendados en las pacientes con hallazgos anormales en la citología y/o colposcopía. También se recomiendan para screening primario de cáncer de cuello uterino en mujeres mayores de 30 años, ya que su uso en adolescentes es controversial debido a que esta población manifiesta infecciones nuevas y transitorias, pero no una patología maligna debido al largo período de latencia entre la infección y el desarrollo del carcinoma, por lo que se puede rotular a mujeres de estar en alto riesgo cuando la infección esté destinada a resolverse. 11,21 En mujeres de más de 30 años que se sometieron al screening de citología/colposcopía y test ADN HPV tuvieron una disminución del riesgo de CIN 2-3 del 40% aproximadamente y una disminución similar con respecto al carcinoma. 11 En nuestro centro, se utiliza el Papanicolaou y la colposcopía como método de screening para la detección de carcinoma cervical, estudios que combinados tienen una sensibilidad de 91% y una especificidad del 96%, pero en la mayoría de los centros ginecológicos se utiliza solo la citología como método de tamizaje, que tiene una sensibilidad de 48%, mucho menor que la de los test de ADN HPV (95%). 14 Revista del Hospital Aeronáutico Central 43

7 Correlación cito-colpo-histológica de lesiones causadas por el virus del papiloma humano (HPV) y la utilidad de la técnica de PCR para determinar la infección por HPV La PCR para HPV es muy sensible, ya que la sola presencia de 10 copias de genoma viral hace la prueba positiva, comparada con las 5000 copias que se necesita para la positividad de la captura híbrida. 17 En nuestro estudio se consideró la biopsia de cuello uterino el método gold standard utilizado en la población estudiada para determinación de la presencia de lesión por HPV o no, siendo la sensibilidad de 34,69% y la especificidad del 90,91% del Papanicolaou y colposcopía con respecto a la biopsia, con una precisión diagnóstica de 45% y un VPP de casi el 95%, datos que se corresponden con la bibliografía mundial. En cuanto a la sensibilidad y especificidad del test de ADN HPV con respecto a la biopsia fue de 56% y 50% con una precisión diagnóstica de 55% y un VPP del 87,5% con resultados similares de sensibilidad y especificidad para el Papanicolaou y la colposcopía con respecto a la PCR, motivo por el cual no se considera pertinente el tamaño muestral de este estudio preliminar, ya que no todas las pacientes fueron sometidas a estudios de ADN viral. Conclusiones La infección por HPV es un mal que aqueja a nuestra sociedad aumentando el riesgo de neoplasia cervical con la consecuente alta tasa de mortalidad, más aun en países en sub desarrollo. Las mujeres menores de 30 años son las que tienen mundialmente mayores probabilidades de estar infectadas, pero dicha infección suele ser transitoria, por lo que solo se recomiendan los controles de tamizaje (Papanicolaou y colposcopía con eventual biopsia) en forma frecuente, ya que como se expresó anteriormente debido al largo período de latencia entre la infección y la manifestación de la enfermedad pasan varios años. Sí se recomienda en mujeres de más de 30 años agregar el estudio genómico al screening habitual con lapsos de por lo menos 3 años, ya que existen mayores probabilidades de que un resultado de ADN viral positivo se correlacione con la infección persistente en dicho rango etáreo con las consecuencias que se mencionaron antes. Queda pendiente aumentar el número de pacientes sometidas a estudios de ADN viral para obtener una mejor correlación de nuestros resultados con los de la bibliografía consultada y re evaluar a las pacientes ya estudiadas, sobre todo a las que mostraron un estudio de biología molecular positivo ya sean menores o mayores de 30 años para poder tener un seguimiento del comportamiento de la enfermedad según su historia natural. El desafío es desarrollar estrategias clínicas que nos permitan usar los beneficios del test ADN- HPV sin alarmar ni sobre tratar a un gran número de mujeres, utilizando también de forma eficaz y eficiente los medios de screening con los que contamos ya que como se demostró son de gran utilidad en pacientes de todas las edades y tienen una relación costo/beneficio aceptable y están a disposición de la población entera. Referencias 1. Berek J, Hacker N. Ginecología oncológica y práctica. Cuarta edición Ed Mc Graw- Hill Panamericana. Capítulos 6, 8 y Bhatla N, Moda N. The clinical utility of HPV DNA testing in cervical cáncer screening strategies. Indian J Med Res, 2009; 130:

8 Moreno et al, Hosp Aeronáut Cent 2013; 8(1): Clinicians educational pamphlet on genital human papillomavirus. 4. Deblina Datta S, Dunne E. Human papillomavirus. UPD Survillance Manual, 4 th edition, Chapter Gori J, Lorusso A y col. Ginecología de Gori. Segunda edición Ed El Ateneo. Capitulo Grainge M, Seth R. Cervical Human Papillomavirus screening among older women. Emerging Infectious Diseases 2005; Vol 11 Num Jhon Jones R III Howard. Te Linde Ginecologia Quirurgica. Novena edición, Ed Panamericana. Capitulo 45. Tomo II. 8. Manejo de las citologías anormales. Sociedad Argentina de Patologia del Tracto Genital Inferior y Colposcopia. Sociedad de Ginecologia y Obtetricia de Buenos Aires Mayrad MH, Duarte Franco E. Human Papillomavirus DNA versus Papanicolaou screening tests for cervical cáncer. N ENGL J MED, 2007; 357:16: Ministerio de Salud de la Nación. Programa nacional de prevención de cáncer cervico-uterino Naucler P, Ryd W. Human Papillomavirus and Papanicolaou tests tos creen for cervical cáncer. N ENGL J MED 2007; 357:16: Peralta P. Infección por HPV y su relación con el cáncer de cuello uterino. Hospital Shcestakow Ponencias y curso de colposcopia. XIX congreso anual de la asociación española de patología cervical y colposcopia Rumowicz C. molecular screening for cervical cáncer- Time to give up Pap tests?. N ENGL J MED 2007; 357:16: Sawaya G. Cervical cáncer screening. New guidelines and the balance between benefits and harms. N ENGL J MED 2009; 361:26:2503: Tcherneu G. Sexually transmited papillomavirus infections: epidemiology, pathogenesis, clinic, morphology, important differential diagnostic aspects, current diagnostic and treatment options. An Bras Dermatol 2009; 84: Tsiodras S et al. Hybrid capture versus PCR screening of cervical human papillomavirus infections. Cytological and histological associations in 1270 women. BMC Cancer 2010; 10: Vanier O, Audisio T. tracto genital inferior: actualizaciones diagnosticas y terapéuticas Universidad Nacional de Cordoba. Capitulos 3 y World Health Organization. International agency for research on cáncer. IARC Monoghraphs on the evaluation of carcinogenic risk to humans Volume World Health Organization. Weekly epidemiological record N 15: 84: Wrigth N, Schiffman M. Adding a test for Human Papillomavirus DNA to cervical cáncer screening. N ENGL J MED. 2005; 348:6: Revista del Hospital Aeronáutico Central 45

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