Revista Médica de los PostGrados de Medicina UNAH Vol. 11 Nº 1 Enero - Abril 2008

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1 Revista Médica de los PostGrados de Medicina UNAH Vol. 11 Nº 1 Enero - Abril Caracterización Clínico-epidemiológica e Identificación Molecular del Virus Papiloma Humano en Papilomatosis Respiratoria Recurrente (Prr). Characterization Clinical-epidemiological and Molecular Identification of Human Papilloma Virus (Hpv) in Recurrent Respiratory Papillomatosis (Rrp). Marleny Margarita Bonilla- Ramírez*, Juan Carlos Barrientos- Augustinus**, Annabelle Ferrera- Boza*** Resumen Objetivo: Caracterizar clínico epidemiológicamente e identificar molecularmente el Virus Papiloma Humano en pacientes con Papilomatosis Respiratoria Recurrente (PRR). Materiales y Métodos: Se realizó un estudio descriptivo tipo serie de casos, cuyo universo fueron un total de 33 pacientes con PRR, a los que se les realizó microcirugía laríngea y al tejido obtenido se le realizó tipificación genética mediante Reacción de Cadena polimerasa (PCR). Resultados: Se clasificaron los 33 pacientes de acuerdo al inicio de los síntomas en: Papilomatosis Respiratoria Juvenil (PRRJ) y Papilomatosis respiratoria del adulto (PRRA).- El total de pacientes con PRRJ fue 26(78.8%) y 7(21.2%) con PRRA.-En PRRJ predominó el sexo femenino (58%), el promedio de edad de inicio de los síntomas fue de 4 años.-las verrugas genitales estuvieron como antecedente materno al momento del nacimiento en 3(11.5%) pacientes.-el síntoma cardinal fue la disfonía (100%).-El sitio anatómico más afectado fueron las cuerdas vocales (77%).- En PRRA predominó el sexo masculino (71%), el promedio de edad de inicio de los síntomas fue de 39.- El síntoma cardinal fue la disfonía (100%).- El sitio anatómico más afectado fueron las cuerdas vocales (86%). La presencia de VPH estuvo presente en todas las muestras siendo más frecuente el tipo 6 (54%) en PRRJ y el 6 (43%) y 11(43%) en PRRA. Conclusión: PRRJ es más frecuente en nuestra población.- PRR es causada por el VPH tipo 6 y 11. Palabras clave: Virus Papiloma Humano, Papilomatosis Respiratoria Recurrente, Reacción Cadena Polimerasa, Microcirugía Laríngea. Abstract Objective: Characterization clinical epidemiological and molecular identification of Human Papilloma Virus in Recurrent Respiratory Papillomatosis (RRP). Materials and methods: A non randomized, descriptive study of series of 33 cases with RRP, with laryngeal microsurgery, in which the result tissue was genetically tipified with PCR. Results: We classified the 33 patients according to the beginning of the symptoms in Juvenile Onset Recurrent Respiratory Papillomatosis (JORRP) and Adult Onset Recurrent Respiratory Papillomatosis (AORRP).-In JORRP female predominated (58%), the average age of beginning the symptoms was of 4 years.-genital warts were seen as maternal background at the time of birth in 3(11.5%) of the patients.-the cardinal symptom was hoarseness (100%).-The anatomical site affected were the vocal cords (77%).-In AORRP men was predominated (71%), the average age of symptomatic onset was of 39.-Cardinal symptom was hoarseness (100%).- Anatomic sites most frequently affected were the vocal cords (86%). HPV was present in all the samples, the most frequent being type 6 (54%) in JRRP, and type 6 (43%) and 11(43%) in ARRP. Conclusion: JORRP is more frequent in our population and more aggressive than AORRP. HPV was cause of RRP by type 6 and 11. Key words: Human Papilloma Virus, Recurrent Respiratory Papillomatosis, Polymerase Chain Reaction, and Laryngeal Microsurgery. Introducción Papilomatosis Respiratoria Recurrente es la neoplasia benigna más común de las vías aéreas superiores que afecta principalmente * Residente 4º. Año Postgrado Otorrinolaringología, UNAH ** Servicio de Otorrinolaringología del Depto de Cirugía del H.E. de Tegucigalpa, Honduras *** Departamento de Microbiologia Universidad Nacional Autonoma de Honduras

2 56 Revista Médica de los Post Grados de Medicina UNAH Vol. 11 Nº 1 Enero - Abril 2008 la laringe y es producida por el Virus Papiloma Humano (VPH) con sus tipos 6 y 11, siendo el más común el tipo 6 y el que da cuadros de mayor severidad el tipo 11; también han sido implicados los tipos 16 y 18, todos invaden la mucosa respiratoria pero con mayor frecuencia la laringe, sobre (1-3) todo las cuerdas vocales. La incidencia de PRR en nuestro país no ha sido determinada, en Latinoamérica, México reporta 3,870 casos al año en la población infantil.-en Estados Unidos la incidencia estimada es de 4.3 casos por habitantes y en estudios europeos (4, 5) es de 0.8/ Existen dos formas descritas, Papilomatosis juvenil (PRRJ) en menores de 18 años y Papilomatosis del adulto (PRRA) en mayores.- PRRJ es más frecuente en un 50 a 75% de los casos, se considera más agresiva por el menor tamaño de la laringe infantil y su mayor incidencia ocurre en un rango de edad de 4 a 5 años, sin embargo, puede ser observada en adultos.-prra se presenta en pacientes en la tercera década de la vida que tuvieron la enfermedad latente y se reactiva ó se presenta como una nueva enfermedad adquirida sexualmente. (4,6,7) El % de los pacientes con PRRJ se han asociado a verrugas genitales en la madre. (6) La PRR se caracteriza por el rápido y recurrente crecimiento de lesiones exofíticas que se ubican en la mucosa respiratoria, con mayor frecuencia en la región glótica, provocando disfonía que puede progresar a la afonía, a medida que aumenta la cantidad de papilomas en la región glótica se presenta un cuadro de obstrucción respiratoria variable con disnea y estridor inspiratorio que de no tratarse progresará invariablemente a la obstrucción total de la laringe y a la muerte por asfixia lo que obliga a realizar escisiones quirúrgicas frecuentes para evitar la oclusión total de la vía aérea. (2, 3,6) La enfermedad se caracteriza por la tendencia a la recidiva, observándose un patrón particular que puede estar relacionado con el tipo de VPH, aspectos genéticos y factores inmunológicos propios en cada paciente. (8) PRR presenta un curso impredecible. Esto hace que el cuidado para el paciente sea intensivo, laborioso y a veces frustrante para el paciente y para su médico.- Algunos estudios reportan, que los costos de cuidados médicos en la población pediátrica pueden ser de 109 millones de dólares por año, distribuídos en uso de quirófanos, hospitalización y cuidados médicos. El tratamiento actual consiste en retirar quirúrgicamente las lesiones en el quirófano por uno ó varios métodos incluyendo debridamiento con micropinzas laríngeas, vaporización con laser CO2, pulsos con laser 585-nm, coagulación con Argón plasma, y un método reciente es el microdebridador.- Sin embargo, la mayoría de los pacientes requieren a lo largo de varios años varias intervenciones quirúrgicas que aseguren su vía aérea. Por esta razón, se han agregado terapias coadyuvantes como quimioterapia tópica, esteroides, Podofilina, Tetraciclina, Vacuna autógena, Aciclovir, Isotetrinoina, Interferón y recientemente Cidofovir, que no (9, 10) sustituyen el tratamiento quirúrgico. Por lo tanto, la manera práctica es manejar la papilomatosis laringea como una enfermedad crónica tratando de disminuir las visitas a quirófano manteniendo una vía aérea libre y con la mejor calidad de voz posible. El 10% de los pacientes requieren de terapia coadyuvante y uno de los criterios incluye cuando son más de cuatro cirugías por año. La Organización Mundial de la Salud ha escrito guías para el uso de la vacuna tetravalente para la profilaxis de VPH en cervix, la cual contiene virus 16,18, 6 y 11, y deben ser administradas a las muchachas púberes

3 Caracterización Clinico-Epidemiológica e identificación molecular del virus 57 antes del inicio de la actividad sexual.- Hasta el momento no ha sido indicada para la prevención de Papilomatosis Laríngea, y se desconoce si en un futuro la vacunación jugará un papel importante en su profilaxis. (11) Los papilomas son pequeños virus de ácido desoxiribonucleico (DNA), miembros de la familia Papillomaviridae.- Su genoma consiste en una doble cadena trenzada no encapsulada, de 8 Kilobases (Kb) de longitud. El genoma codifica para 6 proteínas tempranas que son las responsables de la réplica del virus, y dos proteínas tardías L1 y L2 que son las proteínas estructurales virales.- L1 es la proteína estructural principal, se asocia para formar estructuras pentaméricas llamadas capsómeros.- Las partículas maduras del virus abarcan 72 capsómeros distribuídos en forma icosaédrica.-l2 es la partícula de menor importancia y no es necesaria para la formación de la partícula. Más de 100 tipos de virus han sido identificados y caracterizados molecularmente.-los papiloma virus están presentes en todos los vertebrados y cada tipo tiene una especificidad estrecha con la especie y no se ha visto cruce de barreras de especies a seres humanos. Tienen un tropismo celular significativo produciendo la enfermedad en diferentes partes del cuerpo, y se han identificado como agentes de varias lesiones benignas, premalignas y malignas del tracto aerodigestivo, área (2, 10,13) anogenital y piel. Por esta razón pueden ser agrupados en tipo mucoso y cutáneo de acuerdo al sitio de infección. (2) Los tipos mucoso de VPH se pueden subdividir en: No oncogénico (tipo 6 y 11) Oncogénico (tipo 16 y 18) Los tipos 6 y 11 se han asociado en más de 90% a Papilomatosis Laríngea, verrugas genitales y a lesiones displásicas de bajo (2, 7) grado en cervix. La agencia internacional para investigación del cáncer (IARC), ha definido tipos del alto riesgo de VPH que se asocian a los cánceres en seres humanos. Munoz et al., clasifica en un reciente estudio epidemiológico 12 de los 15 tipos de VPH como tipos de alto riesgo, debido a su asociación con carcinogénesis cervical.- Estos son miembros de dos especies: Especie VPH 7 (HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-59, y HPV-68) y Especie VPH 9 (HPV- 16, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-52, HPV- 58, y HPV-67). (14) PRR en nuestro país es causa de morbilidad sobre todo en la población pediátrica y causa de visitas constantes al quirófano y debido a que es una enfermedad que compromete la calidad y la vida del paciente es importante caracterizar la enfermedad e identificar molecularmente el VPH, lo que realizamos en conjunto con el laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Autónoma de Honduras (U.N.A.H).- Esto es necesario para establecer normas de atención para el paciente e incluso para ofrecer nuevos esquemas terapéuticos. El Servicio de ORL del Hospital Escuela de Honduras, por ser el centro nacional de referencia para esta patología se ve en la obligación de conocer los tipos de VPH involucrados con esta enfermedad que le permitan determinar la relación entre el tipo de VPH y la agresividad de la enfermedad (número de recidivas) así como aspectos epidemiológicos (sexo, edad, procedencia, aspectos hereditarios y otros). El hecho de conocer el tipo de VPH relacionado con la población hondureña es el primer paso para integrarnos a la comunidad científica internacional y formar parte de estudios multicéntricos que se desarrollan en la actualidad en diferentes países. Esto a la vez nos permite acercarnos a las nuevas modalidades de tratamiento antes descritas, que nos conducirán a mejorar las condiciones de tratamiento y pronóstico para nuestros pacientes afectados por esta triste y cruel enfermedad.

4 58 Revista Médica de los Post Grados de Medicina UNAH Vol. 11 Nº 1 Enero - Abril 2008 Materiales y métodos Población estudiada y recolección de especímenes. Se realizó un estudio de tipo serie de casos cuyo universo fueron todos los pacientes con Papilomatosis Respiratoria Recurrente que asistieron a la emergencia del Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Escuela en el período de julio 2006 a septiembre 2007, con agudizaciones de su enfermedad manifestadas con disfonía y disnea; luego de un consentimiento informado a cada uno de ellos se le aplico un cuestionario clínico-epidemiológico, y se les realizó examen físico completo. Posteriormente, como tratamiento y parte de la investigación se realizó escéresis quirúrgica de los papilomas, procedimiento realizado por los médicos especialistas y residentes del Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Escuela, que se encontraban de turno al momento de llegar el paciente. En sala de operaciones se les realizó microcirugía laringea, bajo anestesia general utilizándose sistema de suspensión de Kleinsasser para exponer la laringe y las pinzas de copa de Jackson para la escéresis, auxiliándose en condiciones óptimas de un microscopio Laica con lente de aumento de 400mm.-Se les proporcionaron frascos con 3 cc de solución tampón fosfatada en la cual depositaron la muestra y se mantuvo en refrigeración a 4 C. Luego fue llevada al laboratorio de biología molecular de UNAH, donde se congelaron a -20 C hasta el momento en que fueron procesadas una vez completada la recolección. Detección del VPH Se efectuó la detección de ADN del VPH por medio del ensayo de sondas por hibridación reversa (LiPA).-Se realizó utilizando iniciadores para PCR de fragmento corto SPF10 de amplio espectro que detecta una amplia gama de virus papiloma, generando un producto de 65 pb de la región L1. (HPV SPF10 Line Blot 25, Laboratorio Bio-medical products B.V. Rijswijk, The Netherlands). El set de iniciadores universal permite detectar al menos 43 tipos diferentes de VPH. Resultados Se incluyeron un total de 33 pacientes, y fueron clasificados de acuerdo a la edad de aparición de los síntomas como Papilomatosis Respiratoria Recurrente Juvenil (PRRJ) menores de 18 años y Papilomatosis Respiratoria Recurrente del adulto (PRRA) en mayores; el total de pacientes con PRRJ fue 26(78.8%) y 7(21.2%) con PRRA. La Tabla 1 muestra el sexo, la edad de inicio de los síntomas, la edad actual del paciente, el número de limpiezas quirúrgicas al que fueron sometidos, y el tipo de VPH en PRRJ, y la Tabla 2 lo muestra en PRRA.- Tabla 1. Papilomatosis Respiratoria Juvenil Sexo Edad Inicio Edad Número Síntomas actual Micro (años) (años) cirugías Genotipo M M M M M M M M M M M F F ,54,74. F ,31,39,51,52. F F F F F F F F F F F F En PRRJ, 11(42.3%) de los pacientes fueron masculinos y 15 (57.7%) femeninos, el rango inercuartílico de edad fue de 9 a 21 con una media de 15 años.- La edad de inicio de síntomas con una media de

5 Caracterización Clinico-Epidemiológica e identificación molecular del virus 59 4 años y un rango intercuartílico de 2 a 6 años.-la procedencia de los pacientes; 6(23.1%) del departamento de Cortés, 4(15.4%) de Francisco Morazán y 4(15.4%) de Copán.-En PRRJ 3(11.5%) pacientes tenían antecedentes maternos positivos de Condilomatosis vaginal al momento del nacimiento.-ninguno de los pacientes reportó PRR. dentro de su núcleo familiar.- El síntoma cardinal fue la disfonía (100%) y la disnea (57.6%).-En PRRJ los sitios anatómicos afectados fueron; cuerdas vocales (glotis) en 20 (77%) casos, supraglotis y glotis en 3 (11%), 2 (8%) ocupaban toda la laringe y 1(4%) la hipofaringe.- La media de número de microcirugías a los que fueron sometidos fue 33 con un rango intercuartílico de 4 a 37. En PRRA la distribución por sexo fue 5(71.4%) masculinos y 2(28.6%) femeninos. La media de edad era de 47 con un rango intercuartílico de 27 a 72 años.-la edad de inicio de los síntomas con una media de 39 con un rango intercuartílico de 23 a 50 años. La procedencia de los pacientes fue; 2 (28.6%) del departamento de Cortés, 1(14.3%) de Copán, 1(14.3%) de Francisco Morazán, 1(14.3%) de Intibucá, 1(14.3%) de la Paz y 1(14.3%) de Valle.- Ninguno de los pacientes reporto PRR en su núcleo familiar. El síntoma cardinal fue la disfonía (100%) y disnea (28.5%).-Los sitios anatómicos afectados fueron; 6(85.7%) en la glotis y 1 (14.2%) ocupaba toda la laringe. Tabla 2 Papilomatosis Respiratoria del adulto Edad de Edad Número de Sexo inicio actual microcirugías Genotipo M M M M M ,31 F ,11,16 F La media de microcirugías a los que fueron sometidos fue 9 con un rango intercuartílico entre 1 y 8. El DNA fue positivo por virus en las 33 muestras de los pacientes con PRR. Los tipos de VPH en PRRJ fueron: 14 (54%) muestras positivas por tipo 6 y 12 (46%) por tipo 11.- De las muestras positivas por tipo 6 dos marcaron otros tipos; una marcó tipo 54 y 74, y otro marcó tipo 31, 39,51 y 52, este último era paciente VIH positivo. Los tipos en PRRA fueron: 3(43%) tipo 6, 3(43%) tipo 11, y 1(14%) tipo 31, de las muestras positivas por tipo 6, dos marcaron también otros tipos; una marcó tipo 31 y el otro tipo 11 y 16, este último era paciente con tuberculosis laríngea concomitante. No se encontró relación entre genotipo y edad de inicio de los síntomas en PRRJ (p 0.62) y en PRRA (p 0.30). No se encontró relación entre genotipo y número de microcirugías en PRRJ (X2 0.74) ni PRRA (p 0.6). El sexo en PRRA, en comparación con PRRJ; mas no se encontró relación entre el sexo y el tipo de VHP en PRRJ (X2 0.54), ni en PRRA (p 0.8). Discusión En este estudio al igual que en la literatura internacional PRRJ es más frecuente que PRRA. 6 La media de edad de inicio de síntomas fue de 4 años en PRRJ como lo descrito por Kimberlin et al, y en PRRA está entre la (5, 6) tercera y sexta década de la vida. Coope reporta un 30% de antecedentes maternos de verrugas genitales en pacientes con PRRJ, en nuestro estudio se presentó solo en 3(11.5%) pacientes, este dato puede estar influenciado por la falta de revisión ginecológica a las madres, sería adecuado en investigaciones posteriores evaluarlas para descartar esta posibilidad.- (3,6) El síntoma cardinal fue la disfonía (100%) ya (1, 2,3) reportado en la literatura estudiada. Draganov et al, reporta la localización de

6 60 Revista Médica de los Post Grados de Medicina UNAH Vol. 11 Nº 1 Enero - Abril 2008 PRR en laringe con mayor frecuencia en la glotis, al igual que en nuestro estudio donde los dos grupos presentaban los papilomas (1, 2,3) en la glotis. La media de cirugías a los que han sido sometidos fue mayor en PRRJ (33), esto se puede explicar por la presencia de la patología aún en la edad adulta de los pacientes que iniciaron síntomas alrededor de los 2 a 6 años, tal como lo describe Derkay et al. (4) Todas las muestras en su totalidad dieron positivas para VPH, lo que lo convierte en su agente etiológico, y al igual que en la literatura los tipos más frecuentes en ambos (4, 6,1) grupos son el tipo 6 y 11. Este estudio alcanza un propósito largamente buscado en el Servicio de Otorrinolaringología del Hospital Escuela, y habiendo superado muchísimos obstáculos nos ofrece la lista de VPH responsables de PRR en los pacientes atendidos en nuestro centro nacional de referencia en Honduras.-Este dato, las conclusiones y recomendaciones que del mismo se originan, marcan un punto de inflexión en el manejo de esta enfermedad que nos acercará a nuevas modalidades y a esquemas complementarios de tratamiento, poniendo una bandera de salida para futuros trabajos de investigación de esta patología en Honduras. Conclusión PRRJ es más frecuente en nuestra población que PRRA., y es causada por el Virus Papiloma Humano con sus tipos 6 y 11. Se observó que el 51% de los pacientes procedían de la zona nor-occidental, por lo que, se solicita a las autoridades de salud del país, el equipamiento del principal Hospital de especialidades de la zona norte, para que personal entrenado les proporcione tratamiento quirúrgico adecuado a los pacientes.- Esto ayudaría a disminuir los costos de los pacientes al desplazarse al Hospital Escuela, la estadía hospitalaria, descongestionar el Hospital y sobre todo disminuiría el tiempo de atención al paciente que puede tener complicaciones que pueden conducirlo a la muerte por asfixia. Agradecimientos A Dios que nos concede el milagro de la vida, a mi madre quien ha inspirado mi vida y me ha apoyado sin reservas, a mi esposo por su amor y apoyo incondicional, a mi pequeña hija que tuvo que prescindir de mi presencia en muchas ocasiones, a la Dra. Nelba Tábora quien proceso todas las muestras de VPH. Bibliografía 1. Gerein V, Soldatski LL, Babkina N, Onufrieva EK, Barysik N, Pfister H. Children and partners of patients with recurrent respiratory Papillomatosis have no evidence of the disease during long-term observation. International Journal of Pediatric. 2006: 70; Draganov P, Todorov S, Todorov I, Karchev T, Kalvatchev Z., Identification of HPV DNA in patients with juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis using SYBR1 Green real-time PCR, International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 2006: 70; Coope G, Connett G., Juvenile Laryngeal Papillomatosis, Primary Care Respiratory Journal.2006:15; Peñaloza M, Montoya H, Flores SE, Fierro FJ, Peñaloza JM, Sánchez J, Molecular identification of Human Papillomavirus Types in Recurrent Respiratory Papillomatosis, Arch Otolaryngol Head and Neck Surg. 2000:126; Freed G, Derkay CS, and Prevention of Recurrent Respiratory Papillomatosis: Role of HPV vaccination, International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology 2006: 70; Kimberlin DW, Current status of antiviral

7 Caracterización Clinico-Epidemiológica e identificación molecular del virus 61 therapy for juvenile-onset Recurrent Respiratory Papillomatosis, Antiviral Research 2004: 63; Silverberg MJ, Thorsen P, Lindeberg H, Grant LA, Shah KV. Condyloma in Pregnancy Is Strongly Predictive of Juvenile-Onset Recurrent Respiratory Papillomatosis. Obstetrics & Gynecology, 2003:101(4); McKenna M., Brodsky L, Extraesophageal acid reflux and Recurrent Respiratory Papilloma in children. Internacional Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 2005: 69; Shirley WP, Wiatrak B., Is Cidofovir a useful adjunctive therapy for recurrent respiratory papillomatosis in children? Internacional Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 2004: 68; Pontes P, Avelino M, Pignatari S, Weckx LLM. Effect of local application of Cidofovir On the control of recurrences in Recurrent Laryngeal Papillomatosis. Otolaryngology Head and Neck Surgery, 2006: Vol 135; World Health Organization. WHO Guidelines to assure the quality, safety and efficacy of recombinant Human Papillomavirus Virus-like particle vaccines In: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Geneva, World Health Organization, 2006; Cason J, Mant CA. High-risk mucosal human papillomavirus infections during infancy & childhood. Journal of Clinical Virology, 2005: 32; Einstein MH, Kadish AS, Burk R D, Kim MY, Wadler S, Streicher H, etal. Heat shock fusion protein-based immunotherapy for treatment of cervical intraepithelial neoplasia III.Gynecologic Oncology, 2007:106; Bernard H., The clinical importance of the nomenclature, evolution and Taxonomy of human papillomaviruses. Journal of Clinical Virology. 2005:32; 1-6.

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