Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es separar una proteína de interés de una mezcla de proteínas.

Transcripción

1

2 Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es separar una proteína de interés de una mezcla de proteínas.

3 La selección de técnicas de purificación depende de las propiedades de las proteínas. Características Procedimiento Solubilidad 1. Precipitación por ph 2. Precipitación por solventes orgánicos 3. Precipitación por salado 4. Precipitación por calor Carga eléctrica 1. Cromatografía de intercambio iónico 2. Electroforesis en una o dos dimensiones Polaridad 1. Cromatografía de adsorción 2. Cromatografía en papel 3. Cromatografía fase inversa 4. Cromatografía interacción hidrófoba Tamaño/Masa 1. Diálisis 2. Ultrafiltración 3. Cromatografía de filtración en gel (exclusión molecular) 4. Ultracentrifugación 5. Electroforesis en gel Especificidad de unión 1. Cromatografía de afinidad 2. Técnicas inmunoquímicas (ELISA, Western)

4 MASA kda Å TAMAÑO Å

5 La distribución de las cargas en la superficie de la proteína depende de la estructura.

6

7

8 Cromatografía Método de separación que se basa en el reparto de especies entre una fase estacionaria y una móvil. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificarlos. Cromatografía de exclusión molecular (o filtración en gel) Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatografía de afinidad

9 Cromatografía Muestra aplicada Eluyente Volumen de columna Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

10 Matriz. Sustancia con la que se empaqueta la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna. Fase Móvil (Eluyente). Solución tamponada (buffer) que se emplea para transportar solutos a través de una fase estacionaria. Volumen de la columna. Volumen total de la sustancia con la que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Volumen de elución de un soluto: Cantidad de solvente necesaria para eluir el soluto de la columna.

11 Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel. PRINCIPIO: El material de la columna es poroso. Las moléculas de mayor tamaño no entran a los poros por lo que eluyen primero, mientras que el material retiene partículas de menor tamaño.

12 Cromatografía de exclusión molecular TIPOS DE MATRIZ GRANULOS DE UN MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO Dextranos con enlaces cruzados Agarosa Poliacrilamida Sephadex El material debe ser: Un polímero inerte No cargado Con tamaño de poro uniforme

13

14 Cromatografía de exclusión molecular

15 Aplicaciones de la cromatografía de exclusión molecular Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación del peso molecular de las proteínas. El volumen de elución es proporcional al logaritmo del peso molecular.

16 Cromatografía de intercambio iónico Intercambiador aniónico Intercambiador catiónico La separación se logra por una interacción electrostática entre los residuos cargados de la matriz y los residuos de la proteína con carga contraria. Esta interacción se puede romper luego por cambios en fuerza iónica o de ph. Las proteínas de unen al intercambiador a través de interacciones electrostáticas reversibles.

17 Intercambio catiónico Fase estacionaria cargada negativamente Intercambio aniónico Fase estacionaria cargada positivamente

18 Punto isoeléctrico (pi) Es el ph al cual se iguala el número de cargas positivas y de cargas negativas en la proteína, por lo que la carga neta es = 0. (+) (-) Intercambiador catiónico (-) Intercambiador aniónico (+)

19 La distribución de la carga neta en la superficie de la proteína determina la interacción de la proteína con los grupos cargados en la superficie del material de empaque. La carga de las proteínas depende del ph en el que se encuentren.

20 Materiales de las columnas de intercambio iónico Intercambiador catiónico Intercambiador aniónico

21 Estructuras de grupos químicos que le dan carga a las matrices intercambiadoras de iones Grupos de intercambiador aniónico Aminas cuaternarias Dietilaminoetil (DEAE) Grupos de intercambiador catiónico Sulfopropil (S- o SP) Carboximetil

22 Para eluir a la proteína se utilizan soluciones que modifican el ph o la concentración de sales.

23 GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN

24 Monitoreo de la purificación

25 Cromatografía de Afinidad Método basado en la interacción específica con un ligando inmovilzado. Ligandos: anticuerpo, ión metálico, sustrato (análogo), cofactor.

26 Cromatografía de afinidad Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.

27

28 VENTAJAS: No hay restricción por volumen. Especificidad Pureza del producto final DESVENTAJAS: Precio (alto) Condiciones de elución drásticas Ligando específico no disponible o inadecuado

29

30

31 El experimento Objetivos: Obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Llevar a cabo el desalado de la muestra por cromatografía de exclusión molecular. Emplear las técnicas de cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de afinidad.

32 FASE ESTACIONARIA Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta G15 Hasta G G G G G G