ESCUELA DE POST GRADO

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1 1 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO ESCUELA DE POST GRADO MAESTRIA EN GANADERIA ANDINA ESPECIALIDAD EN REPRODUCCIÓN ANIMAL RESUMEN DE INVESTIGACION EFECTO DE CUATRO DOSIS DE GnRH SOBRE LA OVULACION Y EVALUACION DE OVOCITOS DE ALPACAS SUPERESTIMULADAS PRESENTADA POR: DIANA SÁNCHEZ HERENCIA PARA OPTAR EL GRADO DE: MAGÍSTER SCIENTIAE EN REPRODUCCIÓN ANIMAL PUNO PERÚ 2009

2 2 INTRODUCCION Los bajos índices reproductivos en la crianza de camélidos sudamericanos son un problema prioritario para el productor altoandino, ya que aproximadamente el 50% de hembras que son servidas en una campaña exhiben fallas para producir una cría al año (Ferandez Baca, 1970). A través de diversas investigaciones se ha logrado desarrollar la ovulación múltiple y la transferencia de embriones, provenientes de hembras con mejores características productivas y reproductivas con la finalidad de aumentar la cantidad de crías a lo largo de su vida reproductiva. A la fecha los protocolos de superovulación y transferencia de embriones continúan en investigación en los camélidos sudamericanos, a través del uso de hormonas como ecg y FSH (Correa et al. 1997). Pero sucede que luego de la inducción de la ovulación se forman folículos hemorrágicos y tiende a luteinizarse (Ginther, 1979) y se confunden con un cuerpo luteo. Según las premisas la presente investigación será útil para comparar la cantidad de ovocitos colectados del oviducto con relación directa con la formación del cuerpo hemorrágicos que indicaría la respectiva

3 3 ovulación como resultado del estimulo hormonal. CAPITULO I EL PROBLEMA DE LA INVESTIGACION 1.1 PROBLEMA OBJETO DE LA INVESTIGACION Los resultados de transferencia de embriones en camélidos hasta el momento son poco satisfactorios, atribuyendo a la escasa cantidad de embriones obtenidos cuando son comparados con el número de cuerpos lúteos formados en alpacas sometidas a superovulación (Cansino, 2002; García, 2006). Al inducir hormonalmente la ovulación de folículos múltiples, la respuesta ovárica aún merece atención por los resultados deficientes, formándose cuerpos hemorrágicos sin estigma ovulatorio provenientes de folículos que modifican su estructura al no ovular (Peiro y Col. 2001) y que posteriormente se luteinizan (Bravo, 2002). En los programas de transferencia de embriones, la presencia de los cuerpos lúteos se observa mediante ultrasonografía a los 7 días (Huanca, y Col. 2006); sin embargo, estos resultados no consideran si el cuerpo lúteo el es producto de ovulación o

4 4 luteinización folicular. La presente investigación se centrará en evaluar la dosis adecuada de GnRH como inductor de ovulación múltiple en alpacas, así como la evaluación de ovocitos colectados del oviducto describiéndose sus características morfológicas que nos indiquen su viabilidad, y la organización macro microscópica del cuerpo hemorrágico. 1.2 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Objetivo general Evaluar 4 dosis de la hormona GnRH en la ovulación y las características de los ovocitos de alpacas superovuladas Objetivos específicos - Evaluar la dosis de GnRH en la ovulación de folículos múltiples. - Verificar la formación y describir la macro y micro estructura de los cuerpos hemorrágicos post ovulación. - Evaluar la cantidad y calidad de ovocitos colectados del oviducto en diferentes horas post ovulación.

5 5 CAPITULO II METODOLOGIA 2.1. UBICACIÓN: En La Unidad Productiva Macusani, propiedad de la Empresa de Propiedad Social Rural Alianza, ubicada en el distrito de Macusani provincia de Carabaya, se efectuó el estimulo hormonal y se colecto la porción oviducto ovario (post mortem). Una segunda fase experimental se realizó en el laboratorio de Histología y Embriología Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional del Altiplano para la colección, recuento y valoración de los ovocitos, entre los meses de Setiembre y Diciembre del año SELECCIÓN DE ANIMALES:

6 6 Para la selección de animales se evaluó las características del aparato reproductivo de cada hembra, mediante palpación rectal, descartando aquellas alpacas preñadas Distribución de los animales: Después de haber realizado la exploración reproductiva se selecciono 40 alpacas hembras adultas, descartando la presencia de preñez. Estas fueron distribuidas en cuatro tratamientos considerando las dosis de GnRH y en cada tratamiento dos grupos determinados por toma de muestras post inducción de ovulación, siendo de 36 y 48 h (CUADRO A): CUADRO A DISTRIBUCIÓN DE ALPACAS/ DOSIS DE BUSERELINA (GnRH) Y HORA DE COLECCIÓN DE OVOCITOS Grupos G1 G2 Horas post inducción Ovocitos colectados 36 h post ovulación Ovocitos colectados 48 h post ovulación Total de animales/ tratamiento Fuente: Elaboración propia Tratamientos Dosis buserelina (µg) Total de animales por grupo Todos los animales fueron mantenidos bajo las mismas condiciones de crianza y alimentados con pasturas naturales durante los meses de Setiembre y Diciembre del año 2007.

7 Protocolo experimental: a. Inducción del desarrollo folicular: Por palpación rectal se evaluó las características morfológicas de los ovarios a las 40 alpacas y se les aplico 750 UI de ecg, con el objetivo de estimular el desarrollo folicular, considerándose como día 0 del protocolo. b. Inducción de ovulación: Transcurridos 5 días post aplicación de ecg, se indujo la ovulación a las 40 hembras, aplicando (Acetato de buserelina) un análogo a la GnRH, administrándose a concentraciones crecientes, distribuidas en 4 tratamientos de 4, 6, 8 y 10 µg. La buserelina fue aplicada por vía intramuscular solo una vez a todo lo animales. c. Colección de muestras de oviducto y ovario: Para colectar las muestras, se beneficiaron las 40 hembras según los grupos a los cuales pertenecían, a las 36 y 48 h. Se aislaron los ovarios y oviductos previamente ligados en la porción útero - tubárica de los lados correspondientes; y se colocaron independientemente dentro de una bolsa de polietileno identificado que contenía sulfato salino tamponado (PBS al 0.1 M) que fue preparado en el laboratorio con agua bidestilada, desmineralizada, desionizada, entremezclada con un agitador magnético, estandarizando su ph a 7.4, se mantuvo a temperatura de 35º C inmersos en un couler. En el laboratorio de Histología y Embriología Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia se observo cada ovario,

8 8 considerándose el tamaño y cantidad de estructuras presentes, como; folículos pequeños, folículos preovulatorios (con medidas a 7mm), cuerpos hemorrágicos, folículos hemorrágicos. Protocolo de superovulación: Inducción de desarrollo Inducción de Colección de Colección de Evaluación folicular (ecg) Ovulación (GnRH) ovocitos G1 (*) ovocitos G2 (*) microscópica (**). d 0 d 5 36 h (p.i. o.) 48 h (p.i.o.) 24 h (p.c.) d= días h= horas p.i.o.= post inducción de ovulación p. c. = post colección * = Evaluación macroscópica de cuerpos hemorrágicos in situ ** = Procesamiento de los cuerpos hemorrágicos para técnica histológica d. Colección de ovocitos por lavado oviductal: Para el lavado oviductal se debridó todo el oviducto y se infiltro desde el infundíbulo 10 ml de PBS con auxilio de una jeringa con aguja roma, dejándose fluir el líquido de lavado por gravedad, colectándose el liquido de lavado y los ovocitos en una placa petri esteril, se identificaron los ovocitos, se les traslado a otra placa para su observación. e. Evaluación de ovocitos: La evaluación de los ovocitos fue a través del estereoscopio a un aumento de 400, luego fueron trasladados a otra placa que contenía PBS al 1% y con ayuda de un microscopio a 1000 de aumento se considero el tamaño del ovocito, el espesor de

9 9 la zona pelucida, las capas de células granulosas y su estructura en general. f. Descripción microscópica de estructuras ováricas: Para la descripción microscópica se sumergieron los ovarios en una solución prefijadora de paraformaldehído al 4% diluido en PBS 0.1 M, ph 7.2 y se prosiguió con la obtención de laminas montadas con cortes histológicos de 4 µ de espesor, teñidas con Hematoxilina y eosina Diseño estadístico: La respuesta aleatoria frente a las diferentes dosis de GnRH, fue a través de la cantidad de folículos desarrollados, cuerpos hemorrágicos formados, folículos anovulatorios (folículos hemorrágicos y folículos persistentes) y colección de ovocitos, sometidos a la prueba de ji cuadrado de independencia. Se determinó el coeficiente de correlación entre: número de folículos formados y cantidad de folículos anovulatorios, entre folículos anovulatorios y folículos persistentes, cantidad de folículos y ovocitos recuperados. El tamaño de los ovocitos fue evaluado a través de la prueba de Análisis de varianza.

10 10 CAPITULO III RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Formación de folículos: Al aplicar 750 UI de ecg se logró el desarrollo de 521 folículos en 40 hembras, en ambos ovarios se desarrollo un promedio de folículos (6.85 y 6.18 en los ovarios derecho e izquierdo, respectivamente) por alpaca, observando mayor cantidad de folículos en el ovario derecho (274) que en el izquierdo (247), no existiendo diferencia estadística (p > 0.05) entre ambos. A través de laparoscopia Velasquez y Novoa (1999), mencionan el desarrollo

11 11 de 17.8 folículos luego de aplicar 1000 UI de ecg y con una menor dosis de 400 UI de ecg Aparicio, et.al. (2003) reportó el crecimiento de 2 folículos (siendo variable la respuesta de crecimiento folicular por efecto de la dosis de ecg, incluso esa respuesta es individual ya que frente a la misma dosis de ecg se formo de 0 a 26 folículos en un solo ovario, así también Hahn (1992), reporta en otras especies la respuesta variable e individual frente a la misma dosis de ecg. Se observó 2 quistes foliculares mayores a 20 mm., mientras que Bravo et al. (1995), Velasquez y Novoa (1999) reportan mayor presencia de folículos quísticos, posiblemente se deba a que las dosis de ecg fueron más elevadas y se mantuvo mayor tiempo en el organismo de animal. CUADRO 1 FORMACIÓN DE FOLÍCULOS MULTIPLES EN ALPACAS POR EFECTO DE ecg Ovarios Folículos n Promedio Rango total Derecho Izquierdo Fuente: Elaboración propia 3.2. Formación de cuerpos hemorrágicos: La presencia de cuerpos hemorrágicos nos indican que existió ovulación Arthur et al. (1982), los cuerpos hemorrágicos midieron desde 5 mm a 10 mm

12 12 El porcentaje de ovulación fue de 25.34%, sin mostrar diferencia estadística entre tratamientos (p > 0.05) indicando que dosis ascendentes (4,6,8 y 10 µg) de GnRH no aumentan el numero de ovulaciones; las horas de colección de ovarios tampoco muestran diferencia estadística (p > 0.05), entre 36 o 48 h post inducción de ovulación, demostrando que luego de 36 h de inducida la ovulación no se incrementa considerablemente la cantidad de ovulaciones. CUADRO 2 PORCENTAJE DE OVULACION EN ALPACAS POR DOSIS DE GnRH Y HORA POST INDUCCION DE OVULACION Grupos n Tratamientos por dosis de GnRH Folículos n cuerpo hemorrágicos (%) 36 h 48 h I 5 4 µg 25 6 (24.00) II 5 6 µg (27.59) III 5 8 µg (36.36) IV 5 10 µg (30.14) Sub total (31.15) V 5 4 µg (21.67) VI 5 6 µg (23.61) VII 5 8 µg (14.29) VIII 5 10 µg (21.33) Sub total (20.22) Total (25.34) Fuente: Elaboración propia Los estudios realizados por Ratto y Col. (2001) reportaron 80% de ovulaciones con 50 µg de GnRH en llamas, mientras que Ismail et al. (2008), con 20 µg de buserelina reporta el 89.52% de ovulaciones en camellos, siendo muy

13 13 superiores estos resultados comparados al presente trabajo, debido a que la inducción de ovulación fue por el factores hormonal y por estimulo del macho siendo un doble estimulo. La cantidad promedio de cuerpos hemorrágicos con diferentes dosis de GnRH fue de 3.3 por hembra, que es menor a los reportes de Bourke et al. (1995) y Cervantes, (2008), probablemente debido a que en la observación ecográfica de los cuerpos luteos los días 5 y 7 post inducción de ovulación incluyeron luteinizaciones foliculares que no corresponden a una ovulación propiamente dicha Formación de folículos anovulatorios A este grupo son considerados, folículos de tamaño preovulatorio ( 7 mm de diámetro), folículos quísticos ( 12 mm) y folículos hemorrágicos. En promedio general el 74.66% de múltiples folículos permanecen como folículos persistentes o hemorrágicos luego de realizar la inducción de ovulación con GnRH; según dosis de GnRH no se demuestra diferencia estadística (p > 0.05) entre los 4 tratamientos, de la misma manera no se observa diferencias entre la hora de colección (p > 0.05). CUADRO 3 FORMACIÓN DE FOLÍCULOS ANOVULATORIOS EN ALPACAS POR DOSIS DE GnRH Y POR HORA POST INDUCCION DE OVULACION 36 h GRUPO n Dosis de GnRH Folículos N Folículos anovulatorios (%) I 5 4 µg (76.00) II 5 6 µg (72.41)

14 14 III 5 8 µg (63.64) IV 5 10 µg (69.86) Sub total 244 I 5 4 µg (78.33) II 5 6 µg (76.39) III 5 8 µg (85.71) 48 h IV 5 10 µg (78.67) Sub total 277 Fuente: Elaboración propia Melo,(1992), reporta que el 22.5% de folículos preovulatorios repercuten en fallas ovulares, luego de haber inducido ovulación a través de monta natural, bajo condiciones normales sin estimulo hormonal; Adam et al. (1992) y Fernández Baca et al. (1970) también mencionan que existen ciertas alteraciones naturales que impiden la ovulación del 100% de animales inducidos. El coeficiente de correlación (r = 0.90) demuestra que la cantidad de folículos anovulatorios esta en correlación directa a la cantidad de folículos formados, es así que en animales donde se observo mayor cantidad de folículos formados también la cantidad de folículos anovulatorios fue alta Formación de folículos anovulatorios persistentes Los folículos persistentes tienen una pared clara con contenido folicular claro-transparente que se observó posterior a la administración de GnRH, estas características son también descritas por Tibary and Anouassi, (1997) en camellos; la correlación de folículos anovualtorios y folículos persistentes es moderadamente alta (r = 0.76). Se formo un total de 266 folículos persistentes (FP) que corresponden al 68.38% de folículos anovulatorio, lo cual indica

15 15 diferencia estadística (p < 0.05) entre la cantidad de folículos persistentes y folículos hemorrágicos; pero sin mostrar diferencia estadística entre tratamientos con diferentes dosis de GnRH (p 0.05). Cervantes (2008), afirma que el 78.6% de hembras superovuladas presentaron al menos 1 folículo anovulatorio; Momiaux et al. (1983) también hallo alta frecuencia en la presentación de folículos anovulatorios en vacunos tratados con ecg, de la misma manera Bourke et al. (1995) mencionan que luego de un tratamiento de superovulación en llamas utilizando ecg observaron mayor cantidad de folículos anovulatorios que cuerpos luteos el día de colección de embriones Estos hechos se le atribuyen al efecto prolongado de la ecg sobre el crecimiento folicular que aun continua presente en el organismo del animal (Saumande y Chupin 1984), también es probable que la presencia de ecg en el organismo de la alpaca por tener mayor efecto de FSH inhiba la función preovulatoria de LH sobre las células granulosas impidiendo la ovulación Formación de folículos anovulatorios hemorrágicos Los folículos hemorrágicos son asociados a la falta de estimulación ovulatoria (Adams, 2001); considerados como estructuras de consistencia fluctuante, con una delgada pared translucida y contenido rojo oscuro, sin estigma ovulatorio (Adams, 1991). Se observo la presencia de 123 folículos hemorrágicos (FH), que representa el 31.62% de folículos anovulatorios, el 23.61%, de folículos preovulatorios pasan a ser FH; no se observo diferencia estadística de folículos

16 16 hemorrágicos entre tratamientos utilizando 4 dosis diferentes de GnRH (p 0.05); estas estructuras probablemente fueron confundidos con cuerpos lúteos posteriormente mediante el ultrasonógrafo, porque al transcurrir 7 días se transforma en folículo luteinizado (estructura similar al cuerpo luteo) que secreta progesterona (Adams et al. 1990) Colección de Ovocitos según dosis Se aprecia diferencia estadística en el porcentaje de colección de ovocitos según dosis de GnRH por tratamiento (p 0.05). Cuando se administró 8 µg de GnRH se obtuvo menor porcentaje en la colección de ovocitos, con respecto a otras dosis (4, 6 y 10 µg) de GnRH, posiblemente porque la cantidad de folículos desarrollados por alpaca en este grupo es mayor. La correlación entre tratamientos con respecto a la formación de cuerpos hemorrágicos y colección de ovocitos es baja (r = 0.26), no hallando una relación directa entre cantidad de cuerpos hemorrágicos y ovocitos colectados. CUADRO 4 PORCENTAJE DE COLECCION DE OVOCITOS RECUPERADOS SEGÚN TRATAMIENTOS Dosis Cuerpos hemorrágicos Ovocitos % de colección de ovocitos 4 µg GnRH b 6 µg GnRH b

17 17 8 µg GnRH a 10 µg GnRH b Total Letras diferentes indican diferencia estadística (p 0.05) Se logro colectar 47 ovocitos que corresponden al 35.61% de colección con relación al número de cuerpos hemorrágicos formados (47/132); asumimos que el 64.39% de ovocitos no son atrapados por la fimbria y por ende no son conducidos hacia el interior del oviducto, posiblemente debido a la excesiva distención de la fimbria que recubre el ovario (Bourke et al. 1995). Garcia (2006), mediante lavado de oviductos por laparotomía, colectó % de embriones los días 3 y 4, resultado mayor al presente estudio; así también Cervantes, (2008), reporta 47.3% de ovulaciones y la presentación de 8.3 cuerpos lúteos por alpaca, probablemente debido al efecto adicional de la inducción de ovulación por la monta del macho; mientras que Novoa et al.(1999), mencionan haber colectado el 25% de embriones del oviducto, el tercer día post monta cantidad inferior al presente trabajo Colección de ovocitos según hora En el grupo1 (36 h post inducción de ovulación) se colectaron 24 ovocitos que corresponde al 31.58%, en cambio en el grupo 2 (48 h post inducción de ovulación) fueron observados 23 ovocitos que representa el 41.07% de colección. No se observa diferencia estadística (p 0.05) entre la cantidad de ovocitos colectados a las 36 h y 48 h post inducción de ovulación, a pesar de que se

18 18 observa mayor porcentaje de colección transcurridas 48 h, posiblemente porque la ovulación se registra hasta las 48 h (Tibary and Memon, 1999). En una hembra que se aplico 8 µg de GnRH se colectó 4 ovocitos provenientes de 2 cuerpo hemorrágicos a las 48 h, probablemente es resultado de folículos polioociticos, estas referencias también son reportadas por Perez (1995) que realizo lavado uterino no quirúrgico para la colección de embriones Características de ovocitos de alpaca. El tamaño del ovocito corresponde a la medida del diámetro interno del ovocito y el espesor de la zona pelúcida; el tamaño promedio de los ovocitos fue de y µm, luego de 36 y 48 h post inducción de ovulación, sin manifestar diferencia estadística en el tamaño de los ovocitos en ambos grupos (p 0.05). Adam et al. (1989), reportan el llamas un diámetro de ovocito 112 µm y el espesor de la zona pelúcida de 5.6 µm, medidas que son menores al presente resultado, probablemente porque la colección de ovocitos se realizó mediante aspiración folicular; en cambio Nakagawa et al.(1990) menciona que el tamaño de los ovocitos colectados de vaca son similares a nuestros resultados tanto en tamaño de ovocito y zona pelúcida. En ambos grupos los ovocitos se observaron denudados o con la presencia de 2- a mas capas de células de corona radiata, pero sin continuidad en todo el contorno, por lo tanto se consideran denudados, ello es debido a la tracción

19 19 realizada para aislar el ovocito de la sustancia fibrinosa que lo recubre Descripción histológica de cuerpo hemorrágico de 36 h post inducción de ovulación En un cuerpo hemorrágico de 36 h post ovulación se observa la invasión del estrato granuloso hacia el lumen disponiéndose a manera de cordones, las paredes del cuerpo hemorrágico se pliegan hacia el interior; procesos también descritos por Dellmann y Brown, (1976) y Amsterdam et al. (1975) que se sucede posterior a la ovulación en animales; en base a estos cambios adquiere una forma triangular, las células de la teca interna y de la granulosa están en proceso de invasión con ligeras interdigitaciones. Las células del estrato granuloso que poseen escaso citoplasma mutan a células con mayor volumen citoplásmico tomando una forma globosa, se observa también la formación de una capa de células pavimentosas a manera de cordón que limitan el lumen con los estratos y la hemorragia generada en el interior. Se diferencian las células de la teca interna en forma de huso que van migrando hacia el lumen y atraviesan el estrato granuloso (EG),acompañadas de vascularización, la migración celular de la teca es preparada horas antes de la ovulación (Hafez y Hafez, 2000) y la teca externa (TE) compuesto por células en forma de uso que componen varios estratos y están en contacto con el estroma ovárico que no mutan Descripción histológica de cuerpo hemorrágico de 48 h post inducción de ovulación

20 20 En el folículo preovulatorio el estrato granuloso es compacto, con células basófilas, que se encuentran delimitadas claramente con células de la teca interna que son más pequeñas y tienen forma de huzo acompañadas de vasos sanguíneos y la teca externa posee células mas alargadas y poco notorias; cuando el folículo ovula se suceden cambios en toda la estructura del folículo, trasncurridas 36 h de la inducción de ovulación las células de la granulosa van tomando la forma globosa y se tornan mas basófilas así también tienen una disposición mas organizada a manera de cordones verticales con dirección al lumen, comparado a un cuerpo hemorrágico de 36 h que tiene menor número las células que toman la forma globosay se hallan mas desordenadas y en proceso de invasión; las células granulosas limitan su extensión hasta la capa de células pavimentosas, que se formo sobre el filamento hialino que se observo a las 36 h; de manera similar las células de la teca interna cambian de su forma alargada a una mas redondeadas con aumento del volumen del citoplasma, invaden el estrato granuloso en los espacios que existe entre cordones (conformado por células granulosas), con neoformación de vasos sanguíneos, que es en mayor cantidad comparado al proceso de formación a las 36 h; mientras que las células de la teca externa no muestran cambios en su disposición ni en su forma, y continúan en su posición periférica. Bravo (2002), describe que el cuerpo lúteo de 3 días se halla mas irrigado que la descripción a las 48 h, con vasos sanguíneos en dirección al lumen que aun se halla con sangre, con gran actividad mitótica de células de la teca y granulosa, con predominancia de células pequeñas pero también se observan células

21 21 grandes luteales, a diferencia del actual trabajo donde las células pequeñas aun están en migración hacia el lumen Descripción histológica de folículo hemorrágico El folículo hemorrágico viene a ser un folículo anovulatorio, que en su interior se encuentran alteraciones como, el escaso espesor del estrato granuloso y la desorganización de sus células. así también la escasa presencia de la teca interna y externa aparenta su desaparición; limitando con el lumen se observa una capa hialina de gran espesor que probablemente limito la migración de las células de la granulosa hacia el lumen. El efecto de ecg para inducir desarrollo folicular, probablemente incentivo el crecimiento abrupto de folículos antrales, por lo cual no prosiguió la proliferación de las células de la granulosa, para una producción creciente de estrógenos (Hafez y Hafez, 2000) y conlleve a una baja descarga LH.

22 22 CONCLUSIONES PRIMERA :Las dosis evaluadas de GnRH no influyen en la tasa de ovulación de folículos superestimulados en alpacas. SEGUNDA :El 25.43% de folículos múltiples llegan a ovular con dosis de 4, 6, 8 y 10 µg de GnRH. TERCERA :La recuperación de ovocitos en relación a la cantidad de cuerpos hemorrágicos es de 35%. CUARTA :No existe diferencias en las características de ovocitos colectados a las 36 y 48 horas post inducción de ovulación. QUINTA :La arquitectura histológica del cuerpo hemorrágico de 36 y 48 h

23 23 post inducción de ovulación es similar, pero ambas estructuras difieren con las características histológicas del folículo hemorrágico. RECOMENDACIONES PRIMERA :Es necesario realizar investigaciones con dosis variadas de ecg y GnRH, verificando su efecto en ovulaciones múltiples en alpacas. SEGUNDA :Probar protocolos de superovulación con ecg y GnRH en diferentes condiciones nutricionales. TERCERA :Realizar dosajes de las hormonas de estradiol, FSH y LH para conocer cuál es el desbalance que causa la aplicación de ecg y GnRH. CUARTA :Describir la formación del cuerpo luteo en alpacas macro y

24 24 microscópicamente inmediatamente post ovulación. QUINTA :Describir las características de ovocitos colectados post ovulación. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Adam, C.; Moir, C. and Shiach, P. (1989). Plasma Progesterone concentration in pregnant and non-pregnant llamas (Lama glama). Veterinary record Adam, C.; Bourke, D.; Kyle, C.; Young, P. and McEvoy, T. (1992). Ovulation and embryo recovery in the llama. In: Allen WR, Higgins AJ, Mayhew IG, Snow D, Wade JF (eds): Proceedings of the first International Camel Conference. R & W Publications, Newmarket, UK. Adams, G.; Sumar, J. and Ginther, O. (1990). Effects of lactational and reproductive and reproductive status on ovarian follicular waves in llamas (Lama glama), Reprod. Ford. 90.

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