PREPARACIONES Y TINCIONES

Transcripción

1 PREPARACIONES Y TINCIONES

2 PREPARACIONES En fresco Temporales: Microcultivos de hongos, preparaciones de tejidos Fijas: Gram, Ziehl Nielsen, Sheaffer y fulton, SEM, TEM, naranja de acridina.

3 CONTRASTE DE FASES

4 PREPARACIONES TEMPORALES: microcultivo de hongos 1. Colocar en una caja de petri, un soporte para portaobjetos, un portaobjetos, 2 cubreobjetos y esterilizar a 121 C por 15 min. 2. Colocar sobre el portaobjetos un fragmento de agar papa dextrosa de 1cm Inocular con el asa micológica cada lado del cuadrito de agar con el cultivo del hongo. Colocar encima un cubreobjetos. 4. Colocar a un lado, una torunda de algodón impregnada de glicerol al 10%, estéril; incubar a 28 C durante 48 h.

5 MICROCULTIVO

6 PREPARACIONES TEMPORALES: microcultivo de hongos 5. Eliminar la torunda y agregar dos gotitas de formaldehído g.r. Dejar reposar una hora. 6. En un portaobjetos, colocar una gotita de azul de algodón y colocar el cubreobjetos superior del microcultivo, sellar con esmalte de uñas transparente. Eliminar el agar y colocar otra gotita de azul de algodón, sellar con esmalte. 7. Observar a 10X y 40 X. Realizar dibujos respetando los aumentos y colorearlos.

7 MICROCULTIVO

8 Penicillium sp.

9 Acremonium sp.

10 Preparaciones Fijas Agentes fijadores Agentes físicos.- calor, resinas Agentes químicos: Etanol al 100% Paraformaldehído Gliceraldehído tetróxido de osmio

11 Preparaciones Fijas: Transferir una pequeña porción de la colonia a un portaobjetos limpio y desengrasado, homogeneizar con una gotita de agua. Dejar secar al aire y fijar con calor suave.

12 TINCIONES TINCIONES SIMPLES TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES ESPECÍFICAS

13 Tinción de Gram Colocar una gotita de cristal violeta sobre el frotis, dejar interactuar 1 min. Enjuagar con agua Colocar una gotita de lugol durante 1 min., enjuagar con agua Colocar dos gotitas de etanol-acetona y enjuagar con agua Colocar una gotita de safranina, 30 seg., y enjuagar con agua dejar secar y observar a 10X, 40X y 100X a inmersión. Dibujar y colorear.

14 Cepas aisladas de gasoductos (Tinción de Gram)

15 TINCIÓN CON NARANJA DE ACRIDINA Transferir una gota del cultivo a un portaobjetos limpio y desengrasado, dejar secar al aire. Fijar con etanol al 100%, cubriendo el frotis durante 5 min. Eliminar el etanol y colocar 100 L de naranja de acridina durante 3 min.

16 TINCIÓN CON NARANJA DE ACRIDINA Eliminar el exceso del colorante con etanol al 70%. Observar en un microscopio de epifluorescencia con un filtro azul, emisión a 490 nm.

17 MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCENCIA

18 PREPARACIÓN FIJA: SEM Fijar una porción del cultivo con glutaraldehído al 2%, g.m. por 8 h. Eliminar el glutaraldehído lavando 3-4 veces con amortiguador de fosfatos Agregar 2 gotas de tetróxido de osmio y fijar durante 3 h. Lavar con amortiguador de fosfatos Deshidratar con etanol en concentraciones crecientes (40, 50, 60, 70, 90 y 100%) Secar al punto crítico durante 1h Cubrir con carbono y oro en polvo Observar en el microscopio electrónico.

19 Microscopía Electrónica De Barrido (SEM) biopelícula de 10 m de grosor D. alaskensis

20 TINCIÓN DIFERENCIAL TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR) Se utiliza para diferenciar las bacterias denominadas ácido alcohol resistentes de las No ácido alcohol resistentes Algunas bacterias poseen, en su pared celular, ciertos ácidos grasos de cadena larga que les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol ácido, tras haber sido teñidas con colorantes básicos. Esta tinción requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene la capa cerosa formada por ácido micólico

21 TINCIÓN DIFERENCIAL TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (AAR) Frotis bacteriano Cubrir el frotis con Fucsina fenicada y calentar hasta emisión de vapores durante 5 minutos. Lavar con agua de la llave Decolorar con alcohol ácido 1 minuto (asegurándose de que no se desprende mas color rojo). Lavar con agua de la llave para eliminar el exceso Agregar azul de metileno al 1% como colorante de contraste

22 Mycobacterium sp X Nocardia asteroides, 1000 X Los bacilos ácido alcohol resistentes aparecen coloreados en rojo sobre el fondo azul de la preparación. Este tipo de tinción se utiliza para observar los géneros Mycobacterium y Nocardia Las bacterias No ácido alcohol resistentes se tiñen con el colorante de contraste (azul)

23 Tinciones Estructurales Estructura Flagelos Esporas Cápsula Corpúsculos Gránulos Metacromáticos Método de Fontana-Tribondeau Método de Leifson Método de Moeller Método de Wirtz-Conklin Método de Hiss Tinción Método de la Tinta china Método de Albert Método de Loeffler

24 TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON Las esporas son formas de resistencia bacteriana. Tienen forma esférica u oval. Al microscopio las esporas sin teñir se observan como gránulos brillantes. Según su localización se distinguen tres tipos de esporas: Centrales, Subterminales, Terminales Realizar el frotis Cubrir el frotis con verde de malaquita Calentar 5 minutos a emisión de vapores Enjuagar con agua de la llave Cubrir con la Safranina dejar actuar 1 minuto lavar con agua de la llave y dejar secar al aire.

25 Endosporas: Técnica Schaeffer y Fulton Bacillus sp X 1250X

26 TINCIÓN DE NEGATIVA DE CAPSULA La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que envuelve la pared celular de algunas bacterias. Esta compuesta de polisacaridos, mucopolisacaridos o polipéptidos Por su alto contenido de agua se tiñen débilmente por los colorantes Prepara un frotis a partir de una suspensión densa de bacterias en solución salina al 0.85% Agregar una gotita de cristal violeta o de tinta china. Dejar secar al aire y observar