SOBREEXPRESIÓN DEL GEN WT1 PARA LA MONITORIZACIÓN DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL MÍNIMA EN LA LEUCEMIA MIELOBLÁSTICA AGUDA

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1 SOBREEXPRESIÓN DEL GEN WT1 PARA LA MONITORIZACIÓN DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL MÍNIMA EN LA LEUCEMIA MIELOBLÁSTICA AGUDA Investigador principal: Dr. David Gallardo Giralt Institut Català d Oncologia Duración: 3 años

2 1. Resumen A) Objetivos 1. Correlacionar los niveles de expresión de WT1 en pacientes con leucemia aguda al diagnostico con la evolución clínica (supervivencia global, tasa de remisión completa, recaída o mortalidad relacionada con el tratamiento). 2. Determinar el número de copias de WT1 residuales en médula ósea después de la quimioterapia que sean predictivas de recidiva. 3. Evaluar la utilidad de la monitorización de WT1 en sangre periférica para identificar pacientes con alto riesgo de recaída. 4. Comparar los niveles de expresión de WT1 obtenidos con Light Cycler PCR v2.0 (Roche Molecular Biochemicals) o con Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR System, utilizando el mismo protocolo de RT-PCR cuantitativa en tiempo real y las mismas muestras. B) Diseño y métodos Se incluyen en el estudio todos aquellos pacientes diagnosticados de leucemia aguda durante tres años en 4 hospitales catalanes integrados en el grupo CETLAM. Todos los pacientes deberán ser tributarios de tratamiento con quimioterapia y aceptar su participación con un consentimiento informado. Se obtendrán muestras de médula ósea y sangre periférica en el momento del diagnóstico y después de cada ciclo de quimioterapia. Las muestras serán analizadas mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de WT1 se normalizará utilizando los niveles de expresión de beta-2 microglobulina. C) Plan de trabajo Durante el primer año del proyecto, se clonará el fragmento de WT1 en un plásmido. Esta estrategia nos permitirá obtener diluciones de un número conocido de copias del gen para poder realizar la cuantificación de la expresión de WT1 en los pacientes. 2

3 Durante este primer año, los investigadores involucrados en el proyecto en cada centro se encargarán de identificar los pacientes candidatos a entrar en el estudio, obtener el consentimiento informado de los pacientes, obtener les muestras de médula ósea y de sangre periférica y reportar los datos clínicos correspondientes al seguimiento de los pacientes. También se creará una base de datos protegida por contraseña en la que cada paciente estará identificado con un único número. En esta base de datos constarán los resultados de la RT-PCR cuantitativa para cada muestra y los datos clínicos que muestren la evolución de los pacientes. Durante el segundo y tercer años se actuará con la misma metodología: inclusión de nuevos casos y determinación del nivel de expresión de WT1 de forma prospectiva. Al final del segundo y tercer años se hará un análisis estadístico para determinar el impacto de la sobreexpresión de WT1 al diagnóstico en la evolución clínica y la utilidad de la monitorización de WT1 en médula ósea y en sangre periférica para detectar pacientes con alto riesgo de recidiva. 2. Resultados Como resultados finales del proyecto, cabe destacar: - Se han reclutado muestras biológicas (sangre periférica y médula ósea) de 110 pacientes diagnosticados de leucemia aguda. Este reclutamiento ha sido inferior al previsto inicialmente, pero nos permite realizar el análisis deseado. -RT-PCR cuantitativa en tiempo real para WT1: hemos detectado que hay tres tipos de perfil de expresión de WT1: aquellas muestras con positividad intensa para WT1 (más de 100 copias de WT1 por cada 10 5 copias de beta-2 microglobulina), las que tienen positividad intermedia (entre 10 y 100 3

4 copias de WT1 por cada 10 5 copias de beta-2 microglobulina) y las que son negativas para WT1 (menos de 10 copias de WT1 por cada 10 5 copias de beta-2 microglobulina). También se analizaron muestras de sangre de individuos controles para confirmar la negatividad de expresión de WT1 en les células hematopoyéticas normales. Hemos obtenido fragmentos clonados de WT1 y del gen control que nos permiten cuantificar la expresión de estos genes mediante Q-RT-PCR. -Datos obtenidos: se ha podido realizar el análisis de la intensidad de expresión de WT1 al diagnóstico en 98 pacientes (en 12 casos no se pudo obtener RNA de calidad). La sobreexpresión de WT1 se detectó en un 82,6% de los casos, lo cual confirma la utilidad de WT1 como marcador molecular de leucemia aguda. Se han identificado dos patrones de positividad para WT1: un 24,4% de los pacientes mostraban positividad débil (de 10 en 100 copias de WT1 por 10 5 copias de beta-2 microglobulina), mientras que la mayoría (58,1%) presentaban una expresión intensa (más de 100 copias de WT1 por 10 5 copias de beta-2 microglobulina). No hemos encontrado ninguna asociación entre los niveles de expresión de WT1 al diagnóstico (o el grado de positividad) con la supervivencia global, supervivencia libre de enfermedad o índice de recidivas, por lo que parece que el nivel de expresión de WT1 al diagnóstico no es un factor pronóstico de la evolución de la enfermedad. En cambio, sí se detectó un potencial valor pronóstico en los niveles de expresión de WT1 después de la primera quimioterapia de inducción. Cuando analizamos los resultados, se observa que aquellos pacientes que recayeron, tenían niveles más altos de expresión de WT1 que los que no lo hicieron, y esto se detecta tanto en médula ósea (mediana: 44,3 versus 1,8 copias de WT1 por cada 10 5 copias de beta-2 microglobulina; p: 0,013) 4

5 como en sangre periférica (mediana: 7,3 versus 0,2 copias de WT1 por cada 10 5 copias de beta-2 microglobulina; p: 0,003). La persistencia de más de 10 copias de WT1 por cada 10 5 copias de beta-2 microglobulina en médula ósea se asoció con recaída. La figura 1 muestra la supervivencia libre de enfermedad según la expresión o no de WT1 después de la primera quimioterapia de inducción: 1,0 Supervivencia libre de enfermedad 0,9 0,8 0,7 WT1 negativo postinducción: 64.3% 0,6 0,5 0,4 0,3 WT1 positivo postinducción: 0% 0,2 0,1 p: , meses Evidentemente, estos resultados también se detectan al realizar un análisis de las recidivas según el perfil de expresión de WT1 después de la inducción, como se observa en la figura 2: 0,6 0,5 Probabilidad de recidiva 0,4 WT1 positivo postinducción: 40% 0,3 WT1 negativo postinducción: 25.7% 0,2 0,1 p: , meses A pesar de que no encontramos significación estadística, todo hace pensar que el nivel de expresión de WT1 después de recibir la primera 5

6 quimioterapia de inducción puede ser un factor pronóstico. Sería necesario aumentar el número de casos para poder confirmarlo. Nuestra conclusión es que la determinación del nivel de expresión de WT1 después de haber recibido la primera quimioterapia de inducción parece un buen método para detectar pacientes con una elevada probabilidad de recaída, y esta determinación se podría realizar tanto en médula ósea como en sangre periférica. La identificación de estos pacientes con alto riesgo de recaída puede favorecer que se desarrollen protocolos terapéuticos ajustados al riesgo y que ofrezcan más intensidad de tratamiento para estos enfermos. En cuanto a la comparación entre los resultados obtenidos con la plataforma Light Cycler PCR v2.0 (Roche Molecular Biochemicals) y la Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR System, no hemos hallado diferencias entre ambas. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Pensamos que nuestros resultados pueden tener implicaciones clínicas, ya que la identificación de pacientes de alto riesgo de recaída de forma precoz, justo después de finalizar la primera quimioterapia de inducción a la remisión nos puede permitir planificar tratamientos más agresivos para estas personas, tanto respecto a la quimioterapia de intensificación como para poder iniciar una búsqueda de donante no emparentado para aquellos pacientes que no dispongan de un donante familiar HLA-idéntico. Nuestros resultados son similares a los que ha obtenido el grupo italiano (Cilloni D et al., Early prediction of treatment outcome in acute myeloid leukemia by measurement of WT1 transcript levels in peripheral blood 6

7 samples collected after chemotherapy. Haematologica Jun;93[6]:921-4). En este sentido, aunque este grupo se haya adelantado a publicar los resultados, los hallazgos son similares y sus resultados validan los nuestros. A partir de ahora, y a la vista de estos resultados, quedará en manos de los laboratorios que se dedican a hacer seguimiento de enfermedad mínima residual en leucemia aguda la decisión de aplicar esta técnica en la rutina diaria. Evidentemente, nosotros somos partidarios de ello, si las condiciones técnicas y de personal disponible lo permiten. 4. Publicaciones M. Hoyos, R. Guardia, A. Oriol, M. Rodríguez-Luaces, M. Hermosilla, J.M. Ribera, L. Font, J. M. Pujal, A. Pérez, D. Gallardo. Sobreexpresión de WT1 posquimioterapia de inducción como marcador pronóstico en leucemia aguda mieloblástica (comunicación oral). XLIX Reunión Nacional de la Asociación Española de Hematología y Hemoterapia (AEHH). Haematologica 2007; 92 (Extr 2): pag

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