Reproducción n Asistida en Bovino. Fecundación In Vitro. Dpto. de Reproduccion Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos.

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Yolanda Duarte Jiménez
hace 8 años
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1 Reproducción n Asistida en Bovino usando Ovum Pick-Up (OPU) y Fecundación In Vitro Dpto. de Reproduccion Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos INIA - Madrid

2 INDICE Introducción Aplicación n del Ovum Pick-Up Problemas asociados Intervalo de sesión Pre-estimulaci estimulación Equipo para el OPU Técnica de recogida de ovocitos

3 Impacto de las Tecnologías de Reproducción Asistida Transgénesis nesis I.A. 5 transferable embryos/ flush= 50 freezable embryos/ donor/year=30 calves born after ET MOET Mejora Reproducti va Clonación FIV Sexaje OPU 2 OPU/week=150 embryos/year=70 calves Can be used different each batch of oocytes Embryos can be produced during 2 nd and 3 rd month of pregnancy

5 transferable embryos/ flush= 50 freezable embryos/ donor/year=30 calves born after ET

4 FIV/Ovum pick up Obtención de ovocitos de ovarios de animales vivos. Se puede acceder a animales de alta calidad. Podemos colectar ovocitos repetidamente, incluso en estado de preñez. Cuando la alta calidad genética del donante está unida a un buen laboratorio de FIV podemos producir alta cantidad de embriones de alta calidad. Eficaz en mejora genética.

Podemos colectar ovocitos repetidamente, incluso en estado de preñez.

5 OPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproductivo normal. Cuando se usa conjuntamente con técnicas de FIV, se acorta el intervalo generacional y aumenta la mejora genética maternal produciendo más progenie que por métodos convencionales. El éxito del OPU se mide mediante la tasa de recuperación de ovocitos expresando el porcentaje sobre el total de folículos aspirados. La tasa de recuperación está influenciada por: Aspiración al vacío Pre-tratamiento hormonal de animales Frecuencia de punción Estado del ciclo: estro Experiencia del operador Ovum Pick Up

progenie que por métodos convencionales.

6 Etapas del Ovum Pick Up Anestesia local Técnico con equipo de OPU Colecta OPU FIV Aisla y clasifica ovocitos y embriones TE el día 7

7 OPU Obtención de ovocitos

11 Diagrama de OPU Grado 1-2 Grado 3-4

12 Adaptado de Rizos, 2007

13 Recuperación n de ovocitos y clasificación Los complejos cúmulos-ovocito (COCs) se clasificaron en 4 categorías morfológicas: (1) Rodeados de numerosas capas de células del cúmulo compactas (2) Rodeados de 2 a 3 capas de células del cúmulo compactas (3) Ovocitos denudados (4) Capas celulares expandidas Adaptado de Rizos, 2007

células del cúmulo compactas (2) Rodeados de 2 a 3 capas de células del cúmulo

14 Morfología de los ovocitos División % Blastocistos % 20 0 Ward et al. (1999) Adaptado de Rizos, 2007

15 Producción de Embriones In Vitro maduración fecundación? Blastocisto Desarrollo embrionario División Adaptado de Rizos, 2007

16 Maduración (MIV) Espontánea in vitro Maduración nuclear Reanudación de la meiosis Profase I - Metafase II (=ovulación) Maduración citoplásmica Migración de gránulos corticales (bloquean la poliespermia) Redistribución de orgánulos 24 h en 5% CO 2 en aire, 39 C Adaptado de Rizos, 2007

citoplásmica Migración de gránulos corticales (bloquean la

17 Grado 1 y 2 Grado 3 y 4

18 MIV durante 24 h 39 o C, 5% CO 2 Antes de la maduración Después de la maduraci ón 1 er corpúsculo polar Adaptado de Rizos, 2007

19 Fecundación (FIV) Descongelar el semen Capacitación - heparina Selección espermática Swim-up Gradiente de densidad de Percoll millón spz/ml Co-cultivo durante 24 h en 5% CO 2 en aire Adaptado de Rizos, 2007

20 Separación espermática con Swim-up Con Percoll 0.25 ml semen + 1 ml medio Antes de centrifugar Después de centrifugar Adaptado de Rizos, 2007

21 FIV durante 24h 39 o C, 5% CO 2 Zigoto Adaptado de Rizos, 2007

22 Cultivo (CIV) Determina la calidad embrionaria: Atmósfera de humedad saturada Medio definido vs co-cultivo vs cultivo in vivo Suero 5% CO 2 + 5% O % N 2 Período más largo in vitro (~7 días) Adaptado de Rizos, 2007

23 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8-9 Adaptado de Rizos, 2007

24 El origen de los ovocitos en OPU-IVF Ovocitos de folículos de tamaño >2mm Intervalo de sesión de OPU Ovocitos más homogéneos que con MOET o FIV, debido a las sesiones repetidas se eliminan los folículos dominantes y atrésicos Los ovocitos de FIV se recogen de folículos en cada fase del desarrollo. Los ovocitos de MOET han sufrido una fase dominante y un desarrollo preovulatorio final.

25 15 Tamaño del folículo (mm) Folículo preovulatorio 8 7 OPU SOV 2 Matadero Fase folicular

26 Procesos que afectan a OPU-IVF Intervalo de sesión Pre-estimulación con FSH Equipo de OPU Técnica de recogida de ovocitos

27 Intervalo de sesiones Efecto del intervalo entre las sesiones de OPU en la calidad del ovocito y la posterior tasa de producción in vitro de embriones (Merton et al. 2003). Esquema Intervalo (días) Sesiones 1 (n) Ovocitos/ sesión (n) Índice calidad ovocito Embriones/ ovocitos (%) a a b b a c a 14.1 a b 10.5 b

28 Pre-estimulación con FSH Efecto de la pre-estimulación con FSH en los resultados de OPU-IVP (Merton 2003) Periodo Trata. FSH 1 Ovocitos/ Sesión (n) División (%) Embriones/ Ovocitos (%) Embriones por sesión (n) 2 veces/semana Lunes-Jueves No 7.8 a a 1 vez/2 semanas b a 3.3 b 2 veces/semana Lunes-Jueves No 5.9 c b 1.0 c

29 Colectas ultrasonogr áficas sobre vacas gestantes SOV (P<0.001) Tratamiento % Colectados Ovocitos/vaca % División +40 mg FSH a +20 mg FSH b Control c

30 Equipo de OPU La técnica de OPU es realizada por una o dos personas. Técnico manipula el ovario Asistente realiza la punción folicular Ambas personas afectan significativamente a la cantidad de COCs recogidos

31 Técnica de recogida de ovocitos El número de ovocitos recogidos por animal dependen del técnico y la ruta utilizada. mediante aspiración: 32 ovocitos GI y II mediante OPU: 8 ovocitos GI y II Estas diferencias son principalmente debidas a la baja resolución del ecógrafo para OPU comparado con el ojo humano.

32 Efecto del tamaño folicular en la tasa de producción in vitro de embriones usando OPU seguida de la aspiración de los ovocitos restantes después de morir el donante (Merton, 2003). Método de colecta de ovocitos (n=6) Tamaño del Folículo (mm) Numero total de ovocitos Tasa de división % Obtención de blastocistos % In vivo por OPU Ex vivo por aspiración

33 Observaciones finales Tratamiento antes de la colecta de ovocitos Número de embriones Por sesión Por semana Ciclo natural, IA y flushing el Día 7 MOET, superovulación normal MOET, superovulación retirando el Fol Dominante OPU (2/semana) a intervalos de 3 y 4 días OPU (2/semana) a intervalos de 2 y 3 días OPU después de pre-estimulación (FSH) a 2-semanas de intervalo

34 Diámetro folicular y tasa de recuperación de ovocitos después de repetidas sesiones de OPU en vacas lecheras (Rizos et al. Datos no publicados) Diámetro Folicular (mm), (%) Grado Ovocitario (%) Número de Ovocitos >17 n Total ZV* Por novilla Total * zona pelúcida vacía

35 La aspiración al vacío se expresa nor malmente en milímetros de mercurio y varia ent re 40 y 400 mm Hg. La aspiración exacta en la punta de la aguja depende de: la construcción del dispositivo de OPU la longitud y el di ámetro del sistema de tubos el diámetro de la aguja

36 Diseño Experimental Seleccionamos cuatro presiones al vacío diferentes Como control tomamos la aspiración manual con una aguja y una jeringa Los parámetros registrados para evaluar la capacidad de desarrollo de los ovocitos fueron: Tasa de recuperación Grado de ovocitos recuperados Nº de blastocistos obtenidos

37 El aumento de presión al vacío baja la tasa de recuperación a a b c a 50 % Manual % Recovered

38 La producción de blastocistos decrece con el grado de los ovocitos % Class 1 Class 2 Class 3 Class 4 Bl. Yield /22/2009

39 Ovocitos de Grado 1 70 a a b % of total recovered c d 10 5/22/ Manual Class

40 Ovocitos de Grado % of total recovered a b ab a a Manual Class

41 Ovocitos de Grado d % of total recovered c a b b Manual Class

42 Ovocitos de Grado % of total recovered a a a a a Manual Class

43 Nº Blastocistos/Ovario decrece con la presión excepto a 50mm Hg 2 a 1.5 a a Blastocysts /ovary b b Manual Day 8 bl/ovary

44 Resumen Presión de 30-50mm Hg: Aumenta la calidad del ovocito Aumenta la producción de blastocistos Presión de 70-90mm Hg: Disminuye la tasa de recuperación Disminuye la producción de blastocistos

45 Conclusiones Intervalo de sesiones: 3 4 días Pre estimulación con FSH: incrementa el numero de embriones obtenidos por sesión. Pre estimulación en gestantes: + 40 mg de FSH Técnico y técnica: incrementa la colecta de ovocitos Tamaño folicular mas adecuado: de 2 a 10 mm de diámetro Presión de aspiración óptima: de mm Hg

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