MÓDULO DE TRABAJO MÉTODOS BIOTECNOLÓGICOS

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1 UNIVERSIDAD PRIVADA JOSE CARLOS MARIATEGUI FACULTAD DE INGENIERIA AGRONÓMICA MÓDULO DE TRABAJO MÉTODOS BIOTECNOLÓGICOS CONSULTOR ING. HERNÁN ALBARRACIN MORE CIP MOQUEGUA - PERÚ

2 INDICE I. INTRODUCCIÓN 1.1. COMPETENCIAS 1.2. PRINCIPALES DEASAFÍOS 1.3. ÁREAS RELEVANTES 1.4. DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES 1.5. GLOSARIO APLICADO EN BIOTECNOLOGIA II. INTRODUCCIÓN AL CULTIVO IN VITRO 2.1. GENERALIDADES 2.2. CULTIVO IN VITRO DE MATERIAL VEGETAL 2.3. BASES BIOLOGICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS, TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR 2.4. PASOS PARA GENERAR PLANTAS A PARTIR DE EXPLANTOS AISLADOS 2.5. ELEMENTOS NECESARIOS PARA HACER CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 2.6. RELACIÓN DEL CULTIVO IN VITRO CON LA BIOTECNOLOGIA La micropropagación Ventajas de la micropropagación Cultivo de meristemos 2.7. CULTIVO DE CÉLULAS Y ORGÁNOS VEGETALES EN BIORREACTORES 2.8. ASPECTOS RELEVANTES EN EL CULTIVO IN VITRO Aplicaciones prácticas en el cultivo in vitro Equipo y material necesario empleado en el cultivo in vitro Condiciones del cultivo in vitro Subcultivos o replicado Fases del cultivo de meristemos Fases del cultivo de embriones Micropropagación Cultivo de callo in vitro Obtención de plantas haploides Problemas en el cultivo in vitro 2.9. CONSIDERACIONES METODOLÓGICAS III. OBTENCION DE SEMILLA CERTIFICADA 3.1. INTRODUCCIÓN 3.2. OBTENCIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS PARA PRODUCCIÓN DE SEMILLAS CERTIFICADAS 3.3. MULTIPLICACIÓN Y MANTENIMIENTO DE SEMILLAS 3.4. CONTROL DE CALIDAD DE SEMILLAS 3.5. ELEMENTOS DE UN PROGRAMA DE SEMILLAS

3 3.6. PRODUCCIÓN DE SEMILLA CERTIFICADA DE PAPA Producción de semilla prebásica Técnicas para la multiplicación de semilla de papa Uso de semilla de papa 3.7. PRODUCCIÓN DE SEMILLA CERTIFICADA DE ARROZ Importancia del uso de semilla certificada de arroz Fases de producción para la obtención de semilla de arroz 3.8. MICROPROPAGACIÓN DE LA YUCA Producción de estacas a partir de plantas obtenidas de embriones somáticos Sistema de inmersión temporal, una alternativa para la producción de estacas IV. EMASCULACIÓN MASCULINA 4.1. INTRODUCCIÓN 4.2. EMASCULACIÓN 4.3. EMASCULACIÓN E HIBRIDACIÓN 4.4. TÉCNICAS DE EMASCULACIÓN Y POLINIZACIÓN Técnicas de emasculación Prácticas de polinización 4.5. EXPERIENCIAS EN EMASCULACIÓN Experiencias en tomate La construcción del promotor del gen end1 barnasa produce plantas transgénicas androestériles de tomate Potencial biotecnológico del promotor del gen end1 se extiende a la producción de frutos partenocárpicos en tomate. V. CONTROL DE VIRUS, HONGOS Y BACTERIAS 5.1. NUEVOS CONCEPTOS EN EL MANEJO INTEGRADO DE PLAGAS Generalidades Medidas de control convencional contra los virus Enfermedades causadas por hongos 5.2. BIOTECNOLOGIA EN EL MANEJO INTEGRADO DE PLAGAS Introducción Los plaguicidas químicos El manejo integrado de plagas como una opción para la agricultura sustentable Manejo integrado de plagas y biotecnología Uso de agentes de control biológico en el MIP Control químico (bioderivados) Variedades resistentes

4 5.3. BACTERIAS PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO DE PLANTAS Biocontrol Biofungicidas en el cultivo de papa Prueba critica Probacil 5.4. PRINCIPALES BACTERIAS Y HONGOS PATOGENOS PARA EL HOMBRE ASOCIADOS A LOS ALIMENTOS Bacterias Hongos

5 I. INTRODUCCIÓN Las actividades de mejoramiento genético vegetal y animal se han basado tradicionalmente en el acceso a los recursos genéticos como fuente inicial de diversidad para el desarrollo de variedades y razas de plantas y animales adecuadas a las cambiantes necesidades del hombre. Numerosos materiales genéticos son evaluados para la selección de progenitores a ser utilizados en cruzamientos dirigidos para incorporar en el genoma de las variedades modernas, genes de diferentes fuentes y orígenes. En este contexto, la biotecnología y los recursos genéticos como áreas estratégicas complementarias tienen una importante aplicación en la producción primaria (el mejoramiento genético, la sanidad vegetal y la salud animal), en la agroindustria (el desarrollo de productos y protección de alimentos y la trazabilidad), y en la diversidad biológica y el ambiente (prospección de genes en recursos genéticos, bioremediación y bioseguridad). El gran avance alcanzado por la biología molecular y celular en los últimos años ha permitido el desarrollo de nuevas metodologías que se han ido integrando al mejoramiento tradicional. Al mismo tiempo estas herramientas de análisis molecular han permitido aumentar el conocimiento de los mecanismos genéticos básicos, los que aún son poco comprendidos. El desarrollo de estas tecnologías iniciadas en los 70 con el fenómeno tecnológico del ADN recombinante, avanza en los 80 con el desarrollo de la PCR y en los 90 con el diseño de numerosas e ingeniosas metodologías de análisis genómico, conocidas como los marcadores moleculares, estrechamente asociados a la genética molecular. Más recientemente el quiebre tecnológico ha sido el establecimiento de sistemas de secuenciación de genomas, que combinado al desarrollo de métodos de análisis de la información de secuencias (bioinformática), microtecnologías de análisis de ARN mensajeros (genómica funcional) y sus complementos proteicos (proteómica), constituye un panel que ha acelerado tremendamente el conocimiento del genoma completo de numerosas especies. Este desarrollo se ha traducido en la existencia de numerosos proyectos de genómica estructural y funcional, observándose un interés creciente en la aplicación de esos conocimientos para la descripción sistemática de la diversidad genética, aplicable tanto para los programas de mejoramiento como para la caracterización minuciosa de patógenos y plagas. La utilización de los nuevos recursos y herramientas biotecnológicas será clave para el estudio de los mecanismos biológicos y el establecimiento de las relaciones entre estructuras (genes) y función biológica (caracteres), en el contexto de estudios de genómica funcional, proteómica y el manejo de la información mediante avanzados protocolos de bioinformática. La intensa competencia en el campo de la biotecnología ha dado un gran impulso a la búsqueda, aislamiento, caracterización y manipulación de genes. Este desarrollo ha ido aparejado con un aumento de las iniciativas de patentamiento y otras formas de protección de propiedad intelectual asociadas a estos genes y procesos que se vinculan a los más diversos mecanismos biológicos.

6 1.1. COMPETENCIAS Con la excepción del caso de Brasil, con su iniciativa genómica en el estado de San Paulo, hay escasos ejemplos en estudios de genómica. Por ejemplo, en Argentina se ha trabajado últimamente en la secuenciación de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina. En Argentina se ha utilizado el desarrollo de marcadores de microsatélites de diversas variedades vegetales, como girasol (colaboración de INTA-Argentina con empresas semilleras locales). En varios países se han secuenciado fragmentos de genomas de virus y viroides (Argentina, Chile, Uruguay), contando con alguna capacidad de secuenciadores automáticos del tipo capilar. En Brasil se ha establecido una red de cooperación (ONSA) que inicialmente secuenció completamente la bacteria Xylella fastidiosa y posteriormente ha incursionado en el estudio de genómica funcional de células cancerosas, a la vez que se ha abocado a la caracterización del genoma de Sacharum oficinales. Es evidente que frente al estado del desarrollo de estas áreas en el mundo, en Sudamérica exceptuando a Brasil - existen serias carencias, tanto de recursos humanos bien entrenados, como de una particular infraestructura y equipamientos cuyo costo no es despreciable PRINCIPALES DESAFÍOS La situación indicada anteriormente plantea la necesidad de integrar las capacidades científicas existentes, alcanzando economías de escala que hagan redituable la asociación entre los sectores público y privado e inserten el avance tecnológico. La integración de los esfuerzos, a través del fortalecimiento de redes cooperativas, permitirá resolver problemas de productividad, sanidad, trazabilidad, sustentabilidad y agregación de valor en productos agroindustriales de importancia estratégica para mejorar la competitividad e inserción del MERCOSUR ampliado en los mercados mundiales. Los desafíos específicos se centran en aumentar la productividad (por ejemplo, identificando QTLquantitative trait loci- asociados a rendimiento o tamaño de plantas), mejorar la calidad de productos (por ejemplo, analizando la diversidad de poblaciones de patógenos e identificando genes de plantas o animales que aporten resistencia/tolerancia a ellos), así como, en disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aislados por países del primer mundo. Se deberían desarrollar las capacidades para identificar genes propios del germoplasma poseído, identificados por metodologías de análisis genómico. Además, se deberían concretar soluciones para

7 problemas propios de nuestra zona, que difícilmente pueden ser enfrentados por programas de mejoramiento genético ajenos a la misma. Otro aspecto estrechamente relacionado a la comercialización y competitividad de los productos es la disponibilidad de sistemas de identificación genética y de trazabilidad que aseguren detectar el origen de problemas específicos, a lo largo de las distintas fases de la cadena de valor. El desarrollo de las capacidades específicas deberá ser complementado por el fortalecimiento del sector de insumos y servicios que viabilicen el uso de los productos biotecnológicos, acompañado por el establecimiento de apropiados mecanismos de bioseguridad y claras reglas de propiedad intelectual ÁREAS RELEVANTES Las áreas de trabajo que debería orientar la organización de una plataforma de cooperación entre los países del MERCOSUR en Biotecnología podrían ser las siguientes: Análisis genómico funcional de plantas, animales y microorganismos de interés. Prospección génica de patógenos, plagas y malezas para desarrollar métodos de diagnóstico y control en plantas y animales. Desarrollo de reactivos biológicos para la prevención de enfermedades de animales. Identificación o diferenciación genética de cultivares o razas. Identificación de genes o formas alélicas asociados a caracteres de interés agropecuario y agroindustrial que puedan ser incorporados en programas de mejoramiento genético. Caracterización molecular de la diversidad biológica de colecciones de germoplasma de la zona que (i) faciliten su conservación y utilización, (ii) apoyen el establecimiento de colecciones núcleo, y (iii) posibiliten la ampliación del abanico de genes disponibles. Desarrollo del área de la bioinformática que respalde el proceso de identificación y selección de genes de interés. Se sugiere que el eje de la propuesta sea preparar y consensuar una estrategia regional para la aplicación de información genómica, generada por sistemas de alta productividad disponibles a nivel local e internacional, en procesos productivos basados en la expresión funcional de diferentes recursos genéticos (vegetales, animales y microbianos) en los agro-ecosistemas existentes. La armonización de procedimientos bioinformáticos que faciliten la integración de múltiples fuentes de información para la integración de emprendimientos conjuntos con la participación de socios de diferentes países (de Sudamérica y del mundo) y origen sectorial (empresas, institutos públicos de investigación, universidades y centros de excelencia), articulados en una estructura de tipo consorcio.

8 Se podrán definir proyectos específicos de genómica funcional, pero a la par establecer un proyecto de bioinformática y otro de insumos para ingeniería genética que vincularán transversalmente a cada proyecto. Los expertos en bioinformática deberán definir la naturaleza y operatividad de las posibles bases de datos que se construyan para cada proyecto (es decir, para cada especie). Por tanto, hay dos planos que se deben desarrollar paralelamente. Por un lado, los sistemas de secuenciamiento, microarreglos y proteómica y por el otro, la bioinformática y los insumos para ingeniería genética dedicados a desarrollar herramientas comunes que sirvan a los intereses de cada grupo o proyecto DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES Actualmente, las pruebas de diagnóstico se han mejorado con el desarrollo de la biología molecular. Los métodos basados en la amplificación del ADN mediante la PCR, la identificación de secuencias de ADN específicas dentro del genoma, las técnicas de purificación de ADN y el establecimiento de mapas de restricción, permiten la detección sensible y específica de microorganismos patógenos prácticamente a partir de cualquier muestra biológica. Este tipo de diagnóstico está siendo utilizado en enfermedades de gran impacto económico como la tuberculosis, la brucelosis, la babesiosis, la leptospirosis en los bovinos, la fiebre porcina clásica, la ileítis, el síndrome respiratorio y reproductivo de los cerdos (PRRS) o la influenza aviar. La técnica utilizada fue una variante conocida como "anidada" (nested PCR), la cual permite detectar el equivalente del ADN de una micobacteria. Los resultados obtenidos mostraron que la PCR puede ser de gran utilidad en el diagnóstico de la tuberculosis bovina y debería utilizarse junto con la prueba de la tuberculina, la observación de lesiones y el cultivo para lograr un diagnóstico más preciso de la enfermedad. Por otra parte, los estudios epidemiológicos de las enfermedades infecciosas han tenido gran avance en los últimos años gracias al desarrollo de técnicas de biología molecular que permiten diferenciar entre sí cepas o aislados de los distintos microorganismos. Una de estas técnicas es el análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), basado en la presencia en el genoma de secuencias específicas, las cuales pueden repetirse varias veces y localizarse en distintas regiones, lo que da origen al polimorfismo. La identificación de estas regiones se realiza mediante la hibridación con sondas específicas que las reconocen. La diferenciación de cepas también puede hacerse mediante la secuenciación de regiones específicas del genoma. Estas técnicas han sido utilizadas para establecer árboles

9 genéticos de aislados de distintos microorganismos lo que facilita el realizar seguimientos epidemiológicos GLOSARIO APLICADO EN BIOTECNOLOGIA ADN (ácido desoxirribonucleico): Material genético de todas las células y de muchos virus; la molécula que codifica la información genética. El ADN es una molécula de cadena doble unida por enlaces débiles entre pares de bases de nucleótidos. Los cuatro nucleótidos del ADN contienen las bases adenina (A), guanina (G), citosina y tiamina (T). En estado natural, los pares de bases se forman sólo entre A y T, y G y C, por tanto, la secuencia de las bases de una de las dos cadenas se puede deducir de la otra. Aminoácidos: Los bloques más básicos de construcción de todas las formas de vida. Los aminoácidos son moléculas que contienen grupos funcionales de amino y carboxilo. Anticuerpo monoclonal: Anticuerpo que se produce en masa en el laboratorio a partir de un solo clon y que reconoce sólo un antígeno. Los anticuerpos monoclonales se suelen producir mediante la fusión de una célula B, de corta vida, productora de anticuerpos, con una célula de crecimiento rápido, como una célula cancerosa. La célula híbrida resultante, o hibridoma, se multiplica rápidamente y crea un clon que produce gran cantidad de anticuerpos. Antígeno: En general, proteína que se halla en la superficie del virus y que estimula la respuesta inmunitaria, en particular, la producción de anticuerpos. Autoensamblaje molecular: Ensamblaje de moléculas sin dirección o intervención externa. El autoensamblaje puede producirse espontáneamente en la naturaleza, por ejemplo en células (como el de la membrana de doble capa lipídica) y otros sistemas biológicos, así como en sistemas modificados con intervención humana. Muchos sistemas biológicos se valen de este procedimiento para ensamblar varias moléculas y estructuras. La imitación de estas estrategias y la creación de nuevas moléculas capaces de autoensamblaje supramolecular, es una importante técnica de la nanotecnología. Bioinformática: El uso de las matemáticas aplicadas, la estadística y la ciencia de la informática para estudiar sistemas biológicos. Importantes sectores de investigación incluyen alineación de secuencias, búsqueda de genes, ensamblaje del genoma, alineación de la estructura de las proteínas, predicción de la estructura de las proteínas, predicción de la expresión de genes e interacciones entre las proteínas.

10 Bioplaguicidas: Determinados tipos de plaguicidas derivados de materiales naturales, como animales, plantas, bacterias, y algunos minerales. Por ejemplo, el aceite de canola y el bicarbonato sódico se consideran bioplaguicidas. Biotecnología: Serie de técnicas biológicas obtenidas mediante la investigación básica y aplicadas a la investigación y elaboración de productos. La biotecnología se refiere al uso de ADN recombinante, la fusión de células y nuevas técnicas de bioelaboración. Cartografía genética: Proceso para determinar el lugar que ocupan los genes en un cromosoma. Célula: Unidad estructural y funcional básica de todos los organismos. Las células contienen ADN y otros muchos elementos que permiten su funcionamiento. Célula pluripotencial: Célula indiferenciada capaz de replicarse indefinidamente. Una célula pluripotencial puede también producir células especializadas para diversos tejidos del cuerpo, como músculo cardíaco, tejido cerebral y tejido hepático. Los científicos pueden mantener indefinidamente células pluripotenciales al convertirlas en las células especializadas que necesiten. Existen dos tipos básicos de células pluripotenciales. El primero es la célula pluripotencial embrionaria, que se obtiene de fetos abortados o de óvulos fertilizados sobrantes de la fertilización in vitro. Las células pluripotenciales embrionarias se usan para fines médicos y de investigación porque pueden producir células para casi todos los tejidos del cuerpo. El segundo tipo es la célula pluripotencial adulta, que no es tan versátil para fines de investigación porque sólo puede producir células para determinados tipos de material somático, como la sangre, los intestinos, la piel y los músculos. Celulasa: Complejo de enzimas que descompone la celulosa en beta glucosa. Se produce principalmente gracias a la acción de bacterias simbióticas presentes en el aparato digestivo de los herbívoros. Con excepción de los rumiantes, la mayor parte de los animales (incluidos los seres humanos) no produce celulasa, por lo que no pueden aprovechar gran parte de la energía contenida en el material vegetal. Colágeno: La proteína principal del tejido conjuntivo y la más abundante en los mamíferos. Es el componente principal de ligamentos y tendones. Corte y empalme de genes: Aislamiento de un gen de un organismo y su introducción posterior en otro organismo mediante técnicas de biotecnología. Cosecha tolerante a los herbicidas: Plantas de cosecha creadas para sobrevivir a las aplicaciones de uno o más herbicidas comerciales mediante la incorporación de determinados genes

11 por medios biotecnológicos, tales como la ingeniería genética o métodos tradicionales de selección, como la mutación natural, química o por radiación. Cromosomas: Estructura genética de las células que contiene el ADN celular capaz de replicarse a sí misma. Los seres humanos tienen 23 pares de cromosomas. Cry1A: Proteína derivada de la bacteria Bacillus Thuringiensis, tóxica para algunos insectos cuando la ingieren. Esta bacteria es muy común en la naturaleza y se ha usado durante decenios como insecticida, aunque constituye menos de dos por ciento del total de los insecticidas usados. Cultivar: En botánica, planta obtenida o seleccionada deliberadamente y mantenida mediante cultivo. Cultivo de tejidos: Proceso de obtención de una planta en el laboratorio a partir de células en vez de semillas. Esta técnica se utiliza en el cultivo tradicional de plantas y en la biotecnología agrícola. Derivado de la biotecnología: El uso de la biología molecular o tecnología de ADN recombinante, o transferencia de genes in vitro, para elaborar productos o dotar de características concretas a plantas u otros organismos vivos. Doble hélice: Estructura en forma de escalera helicoidal que adoptan dos cadenas de ADN cuando nucleótidos complementarios en cadenas opuestas se enlazan. Estudio del perfil de la expresión genética: Método de análisis de la expresión de miles de genes simultáneamente en una placa de cristal llamada micromatriz. Expresión genética: Proceso por el cual la información de un gen se convierte en las estructuras y funciones de una célula. Flujo de genes: Transferencia de genes de una población a otra de la misma especie, por migración o dispersión de semillas y polen. Gen: Unidad física y funcional fundamental de la herencia. Un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos que ocupan una posición determinada en un cromosoma que codifica un producto funcional concreto, como una proteína o una molécula de ARN. Genética: Estudio de las leyes de la herencia de determinadas características. Genoma: Todo el material genético de los cromosomas de un organismo determinado.

12 Gestión de la resistencia: Estrategias que se pueden emplear para retrasar la aparición de la resistencia. En el caso de los insectos, estas estrategias incluyen el uso de un "refugio" en el que el insecto no está sometido a los efectos del pesticida usado en el resto del campo. Hélice alfa: Estructura común de proteína que se encuentra, en particular, en el pelo, la lana, las uñas y los cuernos de los animales, y que se caracteriza por una cadena espiral única de aminoácidos estabilizados por enlaces de hidrógeno. Híbrido: Semilla o planta producida como resultado de polinización cruzada controlada, a diferencia de la resultante de la polinización natural. Las semillas híbridas se seleccionan para que tengan características de mejor calidad (por ejemplo, mayor rendimiento o tolerancia a las plagas). Ingeniería genética: Técnica para eliminar, modificar o agregar genes a una molécula de ADN con objeto de cambiar la información que contiene. Al cambiar esta información, la ingeniería genética cambia el tipo o la cantidad de proteínas que puede producir un organismo, y de este modo le permite hacer nuevas sustancias o realizar nuevas funciones. Línea germinal: Línea (secuencia) de células germinales que contienen material genético que se puede transmitir a un hijo. Maíz Bt: Planta de maíz obtenida mediante biotecnología para que sus tejidos expresen una proteína tóxica para algunos insectos, pero inocua para los seres humanos y otros mamíferos. Máquina molecular: Ensamblaje de un número diferenciado de componentes moleculares destinados a realizar una función concreta. Cada componente molecular realiza un solo acto, mientras que la estructura supramolecular total realiza una función más compleja, resultante de la cooperación de diversos componentes moleculares. Mejora genética tradicional: Modificación de plantas y animales mediante la mejora selectiva. Las prácticas usadas en la mejora genética tradicional de plantas pueden incluir aspectos de biotecnología tales como cultivo de tejidos y mejora por mutación. Mejora selectiva: El cruce o apareamiento deliberado de organismos con objeto de que la progenie tenga una característica deseada derivada de uno de los progenitores. Moléculas de ADN recombinante (ADNr): Combinación de moléculas de ADN de origen diverso, enlazadas mediante tecnologías de ADN recombinante. Mutación: Todo cambio en la secuencia del ADN que se pueda heredar.

13 Nanomedicina: Campo médico que está avanzando rápidamente, en el que los científicos elaboran una gran variedad de nanopartículas y nanodispositivos, de apenas una millonésima de pulgada de diámetro, para mejorar la detección del cáncer, fortalecer las respuestas inmunitarias, reparar tejidos dañados y evitar la arteriosclerosis. A principios del 2005, la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos aprobó una nanopartícula fusionada al medicamento contra el cáncer Taxol, para el tratamiento del cáncer de mama avanzado. En Estados Unidos se está usando con carácter experimental otra nanopartícula en pacientes cardíacos, para mantener abiertas las arterias coronarias después de una operación de angioplastia. Nanómetro: Milmillonésima parte de un metro. Nanotecnología: Sistema para transformar la materia, la energía y la información, basado en componentes a escala nanométrica, con características moleculares definidas con precisión. También, las técnicas que producen o miden características de menos de 100 nanómetros de tamaño. Nucleótido: Componente celular que es uno de los bloques fundamentales de los ácidos ribonucleico (ARN) y desoxirribonucleico (ADN). En los sistemas biológicos, los nucleótidos se enlazan mediante enzimas para formar largos polinucleótidos semejantes a cadenas de secuencia definida. Organismo modificado genéticamente (OMG): Con frecuencia, la etiqueta OMG y el término "transgénico" se emplean para referirse a organismos que han adquirido genes nuevos de otros organismos mediante métodos de transferencia genética en laboratorios. Patógeno: Agente causante de enfermedades, en particular un microorganismo vivo, como una bacteria o un hongo. Péptido: Fragmentos de una proteína, de dos o más aminoácidos en una cadena, semejante a brazaletes de cuentas. Cuando se digieren las proteínas de la carne animal, se descomponen primero en péptidos y luego en sus aminoácidos constitutivos. Plaguicidas microbianos: Plaguicidas cuyo ingrediente activo es un microorganismo, por ejemplo una bacteria, un hongo o un protozoo. Los plaguicidas microbianos pueden controlar muchos tipos de plagas distintas, aunque cada ingrediente activo está relativamente dirigido contra una plaga concreta. Por ejemplo, algunos hongos controlan determinados tipos de malas hierbas y otros matan a determinados insectos. Los plaguicidas bacterianos más usados son subespecies y cepas del Bacillus thuringiensis, o Bt. Polen: Células portadoras del ADN masculino de una planta de simiente.

14 Polimorfismos de nucleótido único (SNP): Relaciones entre genes y poblaciones de prueba para conseguir variaciones en el código genético que puedan aumentar el riesgo de una enfermedad o respuesta determinada a un medicamento. Productos basados en la biología: Combustibles, productos químicos, materiales de construcción, energía eléctrica o térmica, derivados de materiales biológicos. El término puede incluir cualquier producto energético, comercial o industrial, distinto de alimentos o piensos, que utilice material biológico o materiales agrícolas (vegetales, animales y marinos) o forestales, domésticos renovables. Protectores para las plantas (PIP): Anteriormente conocidas como plaguicidas vegetales, son sustancias que actúan como plaguicidas producidos o usados por una planta para protegerse de plagas tales como insectos, virus y hongos. Proteína de la membrana celular: Molécula proteínica adherida o asociada a la membrana de una célula. Proteína: Molécula de gran tamaño, compuesta por una o más cadenas de aminoácidos en un orden concreto. El orden está determinado por la secuencia de bases de nucleótidos en el gen que codifica la proteína. Las proteínas son necesarias para la estructura, función y regulación de las células, los tejidos y los órganos del cuerpo, y cada proteína desempeña una función singular. Ejemplos de proteínas son las hormonas, las enzimas y los anticuerpos. Proteómica: Uso de tecnologías como la espectrometría en masa para detectar marcadores biológicos proteínicos en la sangre que pueden indicar señales tempranas de enfermedades, incluso antes de que aparezcan los síntomas. Uno de estos marcadores es la proteína C reactiva, indicadora de cambios inflamatorios en las paredes de los vasos sanguíneos que presagian arteriosclerosis. Reacción en cadena de polimerasa (PCR): Técnica para copiar y ampliar las cadenas complementarias de una molécula determinada de ADN. Es un método in vitro que amplía en alto grado o hace millones de copias de secuencias de ADN que, de otro modo, no podrían ser detectadas o estudiadas. Recombinación: Proceso por el cual la progenie hereda una combinación de genes distinta de la de sus progenitores. Resistencia a los plaguicidas: Cambio genético en respuesta a la selección por un plaguicida que da por resultado la formación de cadenas capaces de sobrevivir a una dosis letal a una mayoría de individuos en una población normal. La resistencia se puede producir en insectos, malas hierbas y patógenos.

15 Selección natural: Concepto ideado por Charles Darwin, según el cual, los genes que producen las características más favorables en un entorno determinado serán más abundantes en la generación siguiente. Tecnología de ADN recombinante: Procedimiento usado para unir segmentos de ADN en un sistema acelular (entorno situado fuera de una célula u organismo). En condiciones apropiadas, una molécula de ADN recombinante puede entrar en una célula y replicarse allí, bien sea de manera autónoma o después de haberse integrado en un cromosoma celular. Terapia genética: Técnica médica experimental consistente en la inserción de genes en las células y los tejidos de un individuo para tratar una enfermedad. Normalmente, un gen defectuoso se reemplaza por otro que funciona normalmente. En la mayoría de los casos, el gen normal se introduce en los tejidos mediante un adenovirus alterado genéticamente para asegurar su inocuidad. Transferencia de genes: Técnica común en biología molecular para provocar un cambio genético mediante la toma y recombinación de ADN. Transgénico: Organismo que contiene genes modificados por la inserción de ADN de un organismo extraño. Se produce cuando genes extraídos de una especie se insertan en otra especie para obtener una característica determinada expresada en la progenie. Variedad: Subdivisión de una especie para su clasificación taxonómica. Usado como sinónimo del término "cultivar", designa a un grupo de individuos genéticamente distinto de otros grupos de individuos de la misma especie. Una variedad agrícola es un grupo de plantas similares que, por sus características estructurales y comportamiento, pueden distinguirse de otras variedades de la misma especie. Virus: Entidad biológica no celular que sólo puede reproducirse dentro de una célula huésped. Los virus consisten en ácido nucleico recubierto de proteína. Algunos virus animales también están recubiertos de una membrana. Dentro de la célula infectada, el virus se vale de la capacidad sintética del huésped para su replicación.

16 II. INTRODUCCIÓN AL CULTIVO IN VITRO 2.1. GENERALIDADES El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotos, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción. El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones controladas y asépticas. El cultivo in vitro, constituye un paso fundamental en la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas o transgénicas, mediante técnicas de ingeniería genética. Es decir que existe una estrecha relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la biotecnología moderna. Normalmente se utilizan cultivos de tejidos, seguido de la regeneración de la planta completa, y la subsiguiente expresión de los genes introducidos o transgenes CULTIVO IN VITRO DE MATERIAL VEGETAL Cultivo de tejidos vegetales, es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo las de protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. Las primeras experiencias relacionadas al cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer experimento exitoso: germinación in vitro de semillas de orquídeas. Luego

17 de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones asépticas y así se mantuvieron protegidas del ataque de patógenos (hongos, virus y bacterias). Esta técnica tiene numerosas aplicaciones: - Propagación masiva de plantas, especialmente beneficiosa para especies de difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción. - Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año - Obtención de plantas libres de virus. - Producción de semillas sintéticas. - Conservación de germoplasma: material de un conjunto de individuos que representa la variabilidad genética de una población vegetal. - Obtención de metabolitos secundarios. - Producción de nuevos híbridos. - Mejora genética de plantas, incluyendo obtención de plantas transgénicas. - Germinación de semillas. - Producción de haploides. - Estudios fisiológicos diversos. Algunas de estas aplicaciones se ilustran en la Figura 1. Figura 1. Aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagación de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha, semillas sintéticas formadas por embriones somáticos, obtenidos por cultivo de células, encapsulados en una matriz inerte (como alginato de calcio). Fotografía tomada de BASES BIOLÓGICAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS, TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR Antes de comenzar con la descripción del cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones, se muestra la anatomía de una planta en la figura 2.

18 Figura 2: las partes de una planta angiosperma. Adaptado del Libro Biotecnología, UNQ Respecto del proceso de transformación vegetal, existen distintas técnicas para la transferencia de genes a las células vegetales, siendo las principales la interacción con bacterias del género Agrobacterium y el método de Biobalística. Una vez realizada la transformación genética por alguno de estos dos métodos, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de regenerar plántulas a partir del explanto inicial transformado, proceso que se sustenta en el principio de totipotencialidad celular. De aquí la importancia del cultivo in vitro como paso fundamental para la obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas (ver figura 3). Figura 3. Cultivo de tejidos y transformación vegetal. En la figura se observan explantos que luego del proceso de selección han perdido coloración y aquellas células transformadas exitosamente se han desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote. La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. Básicamente, la reproducción asexual se puede realizar debido a que las células vegetales poseen un

19 mecanismo de división mitótico, al igual que las células animales, mediante el cual cumplen sucesivas etapas de crecimiento y desarrollo. La división celular mitótica implica una replicación de los cromosomas de las células hijas, por lo que las mismas poseen un genotipo idéntico al de la célula madre. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. Así, las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta: - Una desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a un embrión pero que no se originaron por unión de gametos). - Una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o embriones (embriones somáticos). La primera respuesta se conoce como órgano génesis o embriogénesis indirecta (mediada por un estado de callo), mientras que la segunda respuesta se considera órgano génesis o embriogénesis directa. Como se comentó previamente, el cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (a la que se denomina explanto, como por ejemplo el ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas. La formulación del medio cambia según se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y raíces u obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales. El éxito en la propagación de una planta dependerá de lograr la expresión de la potencialidad celular total, es decir, que algunas células recuperen su condición meristemática. Para lograrlo debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. Un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogenética deseada, es la composición del medio de cultivo.

20 En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación depende del genoma de la especie y está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, también se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta PASOS PARA GENERAR PLANTAS A PARTIR DE EXPLANTOS AISLADOS En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las siguientes etapas, sintetizadas en la figura 4: - Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. - Establecimiento: desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. - Multiplicación: generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias. - Enraizamiento: formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. - Rusticación: aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones medioambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte) Figura 4. Etapas de la regeneración in vitro de maíz. Fuentes: y

21 El éxito de la técnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneración), el genotipo y las condiciones medioambientales. Entre las ventajas del cultivo in vitro de material vegetal se pueden incluir los tiempos más cortos y la posibilidad de ocupar un espacio mucho más pequeño que si se desea propagar material in vivo ELEMENTOS NECESARIOS PARA HACER CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Para llevar adelante este trabajo se necesitan equipamientos que generen las condiciones necesarias de esterilidad como los flujos laminares, que son estaciones de trabajo que hacen circular aire filtrado y estéril, protegiendo así a la muestra con la que se desea trabajar (figura 5). Figura 5. Flujos laminares para el cultivo de tejidos. Se observa uno de los modelos de flujo laminar que puede usarse para preservar la esterilidad de las muestras. Imagen: Además, se necesita un soporte para el explanto, que puede ser sólido o líquido y que está conformado por algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.), macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales (ver Tabla 1), que ayudarán a obtener una planta completa o un órgano vegetal en particular, a partir del explanto elegido (en condiciones de esterilidad). Algunos de los elementos mencionados pueden ser reemplazados por mezclas poco definidas en su composición (jugo de tomate, agua de coco, etc.), que pueden dar buenos resultados y generalmente resultan más económicas. La acidez de los medios de cultivo para plantas suele variar entre ph de 5 y 6,5. Luego, se regulan las condiciones de temperatura y de fotoperíodo (relación de horas luz y horas oscuridad). Según sea el balance hormonal y otras condiciones de cultivo se puede propiciar la regeneración de distintos órganos o formaciones vegetales. Por ejemplo, si el balance de citoquininas/auxinas (ver Tabla 1) es mayor a 1, se favorece la generación de brotes, si es menor a 1, la generación de raíces, si es igual a 1, la formación de callos.

22 Tabla 1. Composición de medios de cultivo para células vegetales. COMPONENTES Agua destilada CARACTERÍSTICAS Y EJEMPLOS Representa el 95% del medio nutriente Fuente de carbono Generalmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque los explantos no son completamente autótrofos y no pueden cubrir sus necesidades con la fotosíntesis que pueden realizar in vitro. Sustancias inorgánicas Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), en una proporción adecuada para la planta elegida. Vitaminas Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras. Hormonas y reguladores del crecimiento Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, a veces, inhiben la embriogénesis. Citoquininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales Otras: giberalinas, ácido absícico, etileno. Mezclas de sustancias poco definidas Ejemplos: extracto de levadura, extractos vegetales. Materiales inertes Usados como soporte. Incluyen agar, azarosa, otros polisacáridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena. Adaptada del Libro Biotecnología, UNQ RELACIÓN DEL CULTIVO IN VITRO CON LA BIOTECNOLOGÍA La Micropropagación La propagación de plantas in vitro es una técnica de la biotecnología muy utilizada en cultivos de importancia económica. Como fue mencionado anteriormente permite cultivar células, tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado, con agentes específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.) y en condiciones ambientales controladas

23 (temperatura, humedad y luz) (figura 6). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a escala industrial. La micropropagación (propagación clonal por cultivo in vitro) constituye uno de los métodos biotecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de la agricultura. Se aplica en la producción masiva de especies hortícolas, aromáticas, medicinales, frutícolas, ornamentales y forestales Ventajas de la micropropagación - Posibilita incrementar rápidamente nuevos materiales. - Permite controlar las condiciones ambientales. - Permite estudiar diversos procesos fisiológicos. - Evita el riesgo de que proliferen agentes patógenos (se realiza en medios esterilizados). - Se pueden obtener gran cantidad de individuos en espacios reducidos. - Permite la obtención de individuos uniformes. - Facilita el transporte del material. Figura 6. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales o similares a la planta original, permitiendo su multiplicación. Adaptado de Biotecnología, UNQ 2006.

24 Cultivo de meristemos En la yema apical se encuentra un grupo de células que conforman el meristemo apical (con un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas (figura 7). Figura 7. Cultivo de meristemos. A partir de un meristemo aislado se puede obtener una planta completa. Adaptado de Biotecnología, UNQ El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las más importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona de tejido generalmente no está afectada por estos patógenos vegetales. Otra aplicación es la multiplicación vegetal de enorme potencial. A partir de una yema apical se pueden obtener 4 millones de claveles en un año. La técnica permite multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como las orquídeas) o acelerar la producción de plantas bianuales CULTIVO DE CÉLULAS Y ÓRGANOS VEGETALES EN BIORREACTORES Una vez obtenidos los callos a partir de algún explanto, los mismos pueden disgregarse para obtener una suspensión de células. La misma puede utilizarse para generar embriones somáticos (la base de las semillas sintéticas) o puede directamente cultivarse para producir metabolitos secundarios, que son compuestos químicos sintetizados por las células vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad para las industrias farmacéutica y alimenticia, entre otras. Por ejemplo, son metabolitos secundarios el mentol y las drogas anticancerígenos vincristina y taxol, algunos edulcorantes, entre otros. Los cultivos celulares se llevan a cabo en biorreactores, que son recipientes de distinta capacidad (de unos pocos a miles de litros) diseñados para propiciar el crecimiento y/o la multiplicación de distinto tipo de células y/u órganos (figura 8).

25 . Figura 8. Cultivo de células y órganos vegetales. A partir de un explanto se pueden establecer cultivos de células para producir compuestos de interés o para obtener embriones somáticos y semillas artificiales, entre múltiples aplicaciones. Adaptado de Biotecnología-UNQ, Las raíces vegetales también pueden ser cultivadas en biorreactores, especialmente aquellas transformadas por Agrobacterium rhizogenes, que producen un aumento abrupto en el tamaño y ramificación de la raíz, aumentando así la biomasa, y por ende la cantidad de producto deseado. Un ejemplo de compuesto farmacológico producido por cultivo de raíces es el paclitaxel o taxol, que es utilizado como anticancerígeno ASPECTOS RELEVANTES EN EL CULTIVO IN VITRO El cultivo in vitro es muy costoso, entre otros detalles porque no se puede mecanizar. Sólo son rentables aquellos laboratorios grandes y con mercado. La planta ya desarrollada en el cultivo in vitro necesita una primera aclimatación en el laboratorio; en el invernadero y después una segunda aclimatación en el campo. Los viveros grandes realizan ambas operaciones; otros sólo se encargan del primer paso.

26 Figura 9. Fase de aclimatación en invernadero Aplicaciones prácticas en el cultivo in vitro Propagación vegetativa. Esto es lo más práctico. Dos técnicas: - Micropropagación de estaquillas - Organogénesis de callos Producción de plantas libres de virus mediante dos técnicas: - Cultivo de meristemos - Microinjerto in vitro Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro. Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión. Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos. Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc. Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados. Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Teniendo ventajas como la obtención rápida de homocigotos y producción de híbridos.