MICROPROPAGACIÓN EN EL LABORATÓRIO EDUCACIONAL

Transcripción

1 MICROPROPAGACIÓN MICROPROPAGACIÓN EN EL LABORATÓRIO EDUCACIONAL MARIA ANTONIA MALAJOVICH (Doctora en Ciencias Biológicas, Genética, UFRJ) Coordinadora de Biotecnología del Instituto de Tecnologia ORT de Rio de Janeiro. VITOR SOARES MANN (Magister en Educación, UNIRIO) Jefe de los laboratorios de Ciencias y Biotecnología del Instituto de Tecnologia ORT de Rio de Janeiro. ORGANIZACIÓN DEL TEXTO FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS POR QUÉ ENSEÑAR LAS TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN? EN EL LABORATORIO DE ENSEÑANZA LOS EXPERIMENTOS Cultivo in vitro de plantas enteras Cultivo in vitro de órganos aislados Cultivo in vitro de callos Cultivo in vitro de células aisladas LOS PROCEDIMIENTOS LOS OBJETIVOS POSIBLES PRIMER OBJETIVO: ESTABELECER UN CULTIVO ASÉPTICO La obtención de explantes Desinfección de la superficie del explante Sembrado e incubación SEGUNDO OBJETIVO: REGENERAR UNA PLANTA Multiplicación Preparación de las plántulas para la transferencia a tierra Aclimatación VALE LA PENA? BIBLIOGRAFÍA BÁSICA

2 2 FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS La reproducción asexual es utilizada para obtener una gran cantidad de plantines a partir de una única planta. Dependiendo del caso, se aprovechan bulbos (cebolla), cormos (gladiolos), rizomas (helechos), tubérculos (papas), tallos (banana), raíces (batata o boniato, manzana, mora), hojas (begonia, espada de San Jorge), estacas (vid), etc. Las plantas obtenidas por propagación asexual o vegetativa son idénticas a la planta madre e idénticas entre sí. En otras palabras, son clones. Se denomina totipotencia a la capacidad de una célula de generar réplicas del organismo del cual deriva. Restringida en animales, esta propiedad característica de las plantas permite la supervivencia en condiciones ambientales desfavorables o luego del ataque de herbívoros, plagas y patógenos. El cultivo in vitro o la micropropagación se inicia con la extracción de pequeños fragmentos de tejido tomados de diversas partes de la planta, tales como hojas, raíces, segmentos nodales y gemas axilares, gemas florales y apicales (Figura 1). Una vez limpios y desinfectados, los explantes son transferidos en condiciones asépticas a un medio de cultivo adecuado. Subcultivos periódicos de dichos explantes permiten la amplificación del material y, más tarde, su diferenciación de modo de generar una planta completa. Figura 1. Las diversas partes de una planta angiosperma.

3 3 POR QUÉ ENSEÑAR LAS TÉCNICAS DE MICROPROPAGACIÓN? El cultivo in vitro puede desarrollarse inicialmente en un espacio reducido e independientemente de factores climáticos y estaciones del año. Se calcula que 10 m 2 de estantes son suficientes para el cultivo de plantines. El número de individuos que se produce por cultivo in vitro es mucho mayor al número de individuos que podría obtenerse por el método de multiplicación tradicional. El cultivo de una gema de eucalipto puede originar en un año 75 trillones de mudas en vez de las 100 o 200 que se obtienen habitualmente por estaquillado. Estos resultados son de gran interés para las industrias del papel, celulosa y maderera. El cultivo in vitro permite la producción y distribución de mudas libres de patógenos a partir de tejidos meristemáticos, que no están infectados por virus. Un ejemplo es la producción de tubérculos de papa libres de virus para la inclusión en programas de certificación de papa-semilla. También permite la producción de semillas sintéticas, que consisten en un embrioide formado a partir de una masa de tejidos obtenida in vitro, envuelta en una sustancia gelatinosa con nutrientes y cubierta por un plástico biodegradable. El conjunto constituye una semilla artificial que se desarrolla normalmente cuando se siembra en la tierra. Lanzada desde aviones, estas semillas facilitan la reforestación en regiones degradadas de difícil acceso. Las técnicas de cultivo in vitro de vegetales fueron asimiladas rápidamente por las empresas e instituciones de investigación y desarrollo, porque facilitan el mejoramiento genético de las variedades comerciales y, también, porque representan una etapa indispensable en la obtención de una planta transgénica. Siendo técnicas de dominio público, relativamente simples y de bajo costo, numerosas empresas las utilizan, en todo el mundo, para garantizar la calidad genética y fitosanitaria de las mudas y semillas comercializadas. Esta tecnología está ampliamente difundida en América Latina, donde representa el segundo producto más comercializado de la biotecnología agrícola, con una amplia difusión en la olericultura, en la horti-fruticultura, floricultura y en la propagación de plantas ornamentales, así como en la producción de plantas de interés industrial (caña de azúcar, café) y de mudas forestales para la industria del papel. EN EL LABORATORIO DE ENSEÑANZA Los complejos protocolos de investigación en micropropagación vegetal exigen reactivos o condiciones de trabajo no habituales en el laboratorio de enseñanza, pero eso no significa que sea imposible desarrollar algunas actividades. Cuáles son los requerimientos mínimos? Un espacio de laboratorio limpio, una olla a presión, numerosos frascos de mayonesa o mermelada con sus respectivas tapas, algunos reactivos para la preparación de medios, un microscopio o lupa binocular, y un lugar con iluminación directa para la incubación de los cultivos.

4 4 Un aparato de flujo laminar es bienvenido, pero también se puede trabajar dentro de una caja plástica (50cm x 40cm x 40 cm) previamente desinfectada. Con estos materiales y sabiendo mantener la asepsia, es posible dar inicio a varios experimentos simples de cultivo de tejidos vegetales (Figura 1). Diferentes de las técnicas de propagación vegetativa, las técnicas de cultivo de tejidos vegetales representan, en el laboratorio de enseñanza, un desafío considerable para el Profesor: baja repetitividad, mucho trabajo de preparación y numerosas contaminaciones. La lentitud del crecimiento de los explantes puede ser decepcionante para quien está acostumbrado a lidiar con resultados inmediatos. De todos modos, son esas mismas dificultades las que las vuelven más interesantes. Con cierta dedicación, los experimentos pueden desarrollarse con éxito. Gracias a un movimiento del tipo DIY (Do-it yourself) conducido por personas amantes de las plantas y la jardinería, hoy en día podemos encontrar en Internet protocolos simples y videos entusiastas que muestran cómo proceder para el cultivo in vitro casero de algunas plantas (Kitchen experiments). Figura 2: El trabajo en el laboratorio de enseñanza, la mesada (a la izquierda) y el flujo laminar (a la derecha). LOS EXPERIMENTOS Cultivo in vitro de plantas enteras Las semillas germinan y se desarrollan en le medio de cultivo hasta el momento de la transferencia a tierra. Esta técnica es aplicada comercialmente en la producción de orquídeas, pero en el laboratorio de enseñanza conviene comenzar con simientes mayores y que germinen más rápido. Tuvimos bastante éxito con el cultivo in vitro de embriones de maíz. Dentro de esta modalidad, se trata de separar los embriones del resto de la semilla y transferirlos al medio de cultivo.

5 5 Cultivo in vitro de órganos aislados El explante puede ser extraído de un tejido (meristemas) o de un órgano (gemas o brotes, raíces, anteras, etc.). La capacidad de regeneración disminuye con la edad de la planta y también depende del genotipo y de las condiciones ambientales. Mayor en las plantas herbáceas que en las leñosas, dicha capacidad está distribuida en forma desigual dentro de algunas familias de Solanáceas, Crucíferas, Geraniáceas, Compuestas y Liliáceas. En la literatura correspondiente, la violeta africana (Saintpaulia) figura como una planta modelo, por ser fácil de cultivar mediante propagación vegetativa y adecuada para los estudios morfológicos. Sin embargo, encontramos que las hojas son muy difíciles de desinfectar y tuvimos mejores resultados con las hojas de los embriones foliares de Kalanchoe daigremontiana (Bryophyllum). También obtuvimos resultados satisfactorios con brotes de papa, raíces de arvejas, gemas de repollo y flores de coliflor y brócoli. Cultivo in vitro de callos Un callo es una masa de células indiferenciadas que crece a partir de un explante. Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede ser subdividido cada tres o cuatro semanas y mantenido indefinidamente en un medio nutritivo de igual composición. Su transferencia a medios de cultivo con diferentes concentraciones de hormonas induce la embriogénesis y/o la organogénesis. En el laboratorio de enseñanza, zanahorias y batatas (boniatos) produjeron callos espectaculares. Cultivo in vitro de células aisladas Los cultivos de células aisladas en medio líquido apuntan a la producción de metabolitos secundarios en fermentadores industriales (alcaloides, perfumes, enzimas, hormonas, etc.). Hasta el momento no realizamos ningún experimento de este tipo, pero ya obtuvimos protoplastos por digestión enzimática de la pared celular. LOS PROCEDIMIENTOS Un entrenamiento básico en técnicas microbiológicas evita numerosas decepciones. Antes de iniciar cualquier procedimiento es necesario preparar el medio de cultivo (Guía 96: Micropropagación- Los medios de cultivo). Además de medios complejos existen medios alternativos de formulación simple y bajo costo (Guía 111: Micropropagación- La desinfección de los instrumentos). Se debe desinfectar el lugar de trabajo con alcohol 96º. También es recomendable lavarse bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, y finalmente, pasarse alcohol 70º.

6 6 Salvo que se tenga una buena práctica microbiológica, hay que evitar el flameado por el mechero de Bunsen (el alcohol es inflamable) sustituyendo la desinfección de los instrumentos por la inmersión en alcohol o agua sanitaria (lavandina, o agua jano, según su denominación en distintos países). Antes de iniciar los procedimientos, recogerse el cabello además de quitarse relojes o anillos. Una buena organización del lugar de trabajo es determinante para el éxito de las actividades. Durante los procedimientos, usar guantes descartables sobre los cuales eventualmente se pasará alcohol y una máscara quirúrgica y, fundamentalmente no hablar ni pasar los brazos sobre los explantes o por encima de los frascos abiertos que contienen medio. Evitar también abrir y cerrar las puertas y la circulación de personas en el laboratorio. Todo el material contaminado será esterilizado y posteriormente, eliminado. LOS OBJETIVOS POSIBLES PRIMER OBJETIVO: ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ASÉPTICO Los pasos necesarios para el establecimiento de un cultivo aséptico son los siguientes: Obtención de los explantes Desinfección de la superficie del explante Lavado en agua destilada estéril Disección final y transferencia al medio de cultura Incubación Obtención de los explantes Limpiar cuidadosamente con agua y jabón el material elegido (hojas, tallos, raíces, etc.) dando preferencia a las partes jóvenes y saludables.

7 7 Desinfección de la superficie del explante Sumergir el material retirado de la planta madre en etanol 70º, durante uno a dos minutos, antes de desinfectarlo con un agente químico como el hipoclorito de sodio (NaClO con 0,5-1% de principio activo) en solución, a la que se agregará una gota de detergente. La concentración de la solución de hipoclorito y el tiempo necesario para la desinfección varía con el tipo de explante. La función del detergente es disminuir la tensión superficial, favoreciendo el contacto entre el explante y el desinfectante. La agitación suave y continua durante el proceso cumple la misma función. El hipoclorito de sodio será eliminado mediante tres lavados con agua destilada estéril (Guía 90: Micropropagación- La desinfección de los explantes). A continuación, puede ser necesaria una disección en condiciones asépticas para eliminar las partes dañadas de los explantes. Transferencia al medio de cultivo El medio de cultivo puede estar distribuido en tubos de ensayo, en placas de Petri o en frascos de diverso tamaño. Transferir los explantes en condiciones asépticas, semejantes a las utilizadas para el cultivo de microorganismos. Debido a la composición del medio, ni la humedad ni la disponibilidad de agua son factores limitantes. Para garantizar la aireación del cultivo y una buena oxigenación, se sustituyen las tapas de los frascos por PVC. Figura 3. Sustitución de las tapas por film de PVC. Incubación En temperatura entre 23 C e 28 C, con luz durante 12 a 14 horas diarias o en la oscuridad, dependiendo del explante.

8 8 SEGUNDO OBJETIVO: REGENERAR UNA PLANTA Una vez dominada la técnica para el establecimiento de cultivos asépticos, los tres próximos pasos para regenerar una planta son la multiplicación de los propágulos, la preparación de las plántulas para la transferencia a tierra y la aclimatación. Multiplicación Al observarse crecimiento y propagación, dividir el material y transferirlo a un medio fresco, de modo de obtener numerosos subcultivos. En algunos casos, basta alterar la composición del medio para estimular la diferenciación. Siempre en condiciones asépticas. Preparación de las plántulas para la transferencia a tierra En condiciones asépticas, transferir las plántulas de los subcultivos a un medio de enraizamiento donde, además de desarrollar las raíces, se fortalecerá y comenzará a fotosintetizar. En algunos casos se elimina el azúcar del medio. Aclimatación Cuando el desarrollo de la planta justifica su traspaso a tierra, se elimina el agar y los restos de azúcar por lavado. Se transfiere la planta primero a tierra o a algún otro sustrato, más tarde a un ambiente protegido. Protegidas de la iluminación solar directa, aumentarán su capacidad fotosintética adaptándose lentamente a las condiciones ambientales. VALE LA PENA? Por supuesto

9 9 BIBLIOGRAFIA BÁSICA DODDS J.H E ROBERTS L.W. Experiments in Plant Tissue Culture. Cambridge, Cambridge University Press, FAO FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION / IAEA -INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY Low cost options for tissue culture technology in developing countries, PB.pdf HOME TISSUE CULTURE GROUP. KYTE L. E KLEYN J. Plants from test tubes 3 th edition. Portland, Timber Press Inc., MANTELL S.H., MATTHEWS J.A. E McKEE R.A. Princípios de biotecnologia em plantas. Ribeirão Preto, Sociedade Brasileira de Genética, PIERIK R.L.M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa, RAVEN, et al. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, SMITH R.A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, National Association of Biology Teachers, TORRES A.C. ET AL. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Vol.1. Brasília, EMBRAPA-CNPH, AGRADECIMIENTOS A los técnicos que a lo largo de veinte años colaboraron en la preparación y armado de los experimentos de micropropagación. A los profesores y alumnos.