Lipotransferencia Facial Asistida con Células Madres. Eficacia del Uso Clínico de Células Madre Derivadas de Tejido Adiposo.

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1 Lipotransferencia Facial Asistida con Células Madres. Eficacia del Uso Clínico de Células Madre Derivadas de Tejido Adiposo. KOTARO YOSHIMURA, MD, KATSUJIRO SATO, MD, y NORIYUKI AOI, MD, MASAKAZU KURITA, MD, z KEITA INOUE, MD, HIROTAKA SUGA, MD, HITOMI ETO, MD, HARUNOSUKE KATO, MD, TOSHITSUGU HIROHI, MD, y AND KIYONORI HARII, MD z INTRODUCCION La lipotransferencia es un tratamiento prometedor, pero su eficacia en la remodelación de la lipoatrofia facial no está establecida. OBJETIVO El objetivo fue evaluar la eficacia y los efectos adversos de la lipotransferencia asistida con Células estromales/madre derivadas de tejido adiposo (ASCs, del inglés "adipose- derived stem/stromal cells") para injertos adiposos. MÉTODOS Para superar los inconvenientes de la lipoinyección autóloga, hemos desarrollado una novedosa estrategia denominada lipotransferencia enriquecida en células (CAL, del inglés "cell- assisted lipotransfer"). En la CAL, la fracción vascular estromal que contiene las ASCs, fue aislada en fresco de la mitad de una muestra de grasa aspirada, y añadida a la otra mitad de muestra de grasa aspirada, con la grasa actuando como estructura de soporte. Este proceso convierte la grasa aspirada relativamente pobre en ASCs en grasa rica en ASCs. Se realizó una lipoinyección convencional (no- CAL, n=3) y una CAL (n=3) en seis pacientes con lipoatrofia facial debida a lupus profundo o síndrome de Parry- Romberg. RESULTADOS Todos los pacientes obtuvieron una mejora en el contorno facial, pero el grupo CAL tuvo un mejor resultado de mejora clínica que los pacientes del grupo no- CAL, aunque la diferencia no alcanzó significación estadística (p=0,11). Fue detectada necrosis en uno de los casos no- CAL, que tomaba corticosteroides orales perioperatorios. CONCLUSIÓN Nuestros resultados sugieren que la CAL es eficaz, segura, y potencialmente superior a la lipoinyección convencional para la remodelación facial. Los autores afirman no tener ningún interés significativo con proveedores comerciales. La lipoatrofia facial es un problema que desfigura e incapacita socialmente, que acompaña a varias enfermedades hereditarias y adquiridas (ver Ascher y col. 1 para su revisión). El lupus eritematoso profundo y la esclerodermia en golpe de sable (morfea en golpe de sable) con frecuencia dan lugar a lipoatrofia facial, que suele ser la manifestación más problemática de la enfermedad para los pacientes, a pesar de que requieren medicación, como corticosteroides orales, para suprimir otros síntomas asociados con la morbilidad sistémica. La lipoatrofia facial también se observa en pacientes con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y el síndrome de Parry- Romberg (atrofia hemifacial progresiva o atrofia hemifacial idiopática), lo que implica no sólo 2 lipoatrofia facial sino también patologías óseas. Hasta el momento no existe un tratamiento médico para corregir la lipoatrofia facial. La lipoinyección se ha utilizado para el tratamiento de la lipoatrofia, como la asociada con la infección por VIH, 3,4 con un éxito moderado, mientras que la transferencia microquirúrgica de tejido ha sido el tratamiento estándar para remodelar los defectos faciales observados en el síndrome de Parry- Romberg. Sin embargo, el procedimiento quirúrgico deja cicatrices visibles en la cara y en la zona donante. 5,6 La lipoinyección autóloga es un tratamiento prometedor para el aumento de tejido blando, porque no lleva asociadas cicatrices por la incisión o complicaciones asociadas con el uso de materiales extraños. Aunque se han reportado muchos esfuerzos innovadores para perfeccionar la lipoinyección autóloga, 7-14 problemas como la imprevisibilidad y una baja tasa de supervivencia del injerto debido a necrosis parcial permanecen. Para superar estos problemas, hemos desarrollado una nueva estrategia, denominada lipotransferencia celular asistida (CAL; Figura 1). Dado que se ha encontrado que una fracción de células estromales derivadas del tejido adiposo tienen la capacidad de diferenciarse en diferentes linajes de células,15 las células progenitoras estromales han sido designadas como "células madre/estromales derivadas de tejido adiposo" (ASCs) y se espera que se conviertan en una herramienta valiosa en una amplia gama de terapias basadas en células. El concepto terapéutico de la CAL fue descrito en un informe anterior de nuestros estudios preclínicos.16 En la CAL, la grasa pobre en ASCs es convertida en grasa rica en ASCs mediante la *Department of Plastic Surgery, University of Tokyo School of Medicine, Tokyo; y Cellport Clinic Yokohama, Yokohama; z Department of Plastic Surgery, Kyorin University School of Medicine, Tokyo; y Ritz Cosmetic Surgery Clinic Tokyo, Tokyo, Japan 2008 by the American Society for Dermatologic Surgery, Inc. Published by Wiley Periodicals, Inc. ISSN: Dermatol Surg 2008;34: DOI: /j x

2 adicción de células recién aisladas de tejido adiposo durante la preparación del material inyectable (Figura 1). Se presentan los resultados clínicos preliminares de los pacientes que se sometieron a CAL para la remodelación de lipoatrofia facial adquirida. Este es el primer informe del uso clínico de las ASCs para el aumento de tejidos blandos de la cara. entre los 9 y 13 meses como se describe más adelante. Uno de los tres pacientes en cada grupo era varón, y las edades de los pacientes oscilaban entre 33 y 55 años (edad media ± SD, no- CAL 46,3 ± 7,8, CAL 38,7 ± 8,1). El volumen medio de grasa inyectada fue de 133 ± 104 ml en el grupo no- CAL y de 100 ± 10 ml en el grupo CAL. Los datos de los pacientes se resumen en la Tabla 1. Técnica Quirúrgica Figura 1. Estrategia CAL. La mitad del volumen de la grasa aspirada es procesado para el aislamiento de las SVF. Durante el proceso de aislamiento, la otra mitad de la grasa aspirada es preparada para el injerto. Las ASCs recién aisladas que contiene SVF son añadidas a la grasa aspirada, actuando la grasa como una estructura viva de soporte. Finalmente, la grasa suplementada con SVF es inyectada en los sitios diana. Por lo tanto, la grasa aspirada, que es originalmente relativamente pobre en ASCs, se convierte en grasa rica en ASCs. Materiales y Métodos Pacientes Analizamos los resultados de seis pacientes con lipoatrofia facial que se sometieron a lipoinyección para remodelación de defectos faciales: tres pacientes fueron sometidos a lipoinyección convencional (no- CAL), mientras que tres pacientes fueron sometidos a CAL. Ningún paciente fue sometido a más de un procedimiento CAL o no- CAL. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes. El protocolo del ensayo clínico se ajustaba a las directrices de la Declaración de Helsinki de 1975 y fue aprobado por los comités éticos de las instituciones. Uno de los seis pacientes habían sido diagnosticado con el síndrome de Parry- Romberg; los otros cinco pacientes habían sido diagnosticados de lupus eritematoso profundo por sus dermatólogos. Dos de los casos de lupus (uno en el grupo no- CAL y uno en el grupo CAL) estaban tomando esteroides orales (prednisolona) en el momento de la cirugía. El grado de severidad de la lipoatrofia facial se determinó de acuerdo con la escala de calificación (graduada de 1 a 5, siendo 5 el más grave) desarrollada por el Facial Lipoatrophy Panel.1 Los pacientes fueron evaluados Antes de la aspiración, la pared abdominal fue infiltrada con solución salina con epinefrina diluida (0,001%), con el paciente bajo anestesia general. El tejido adiposo fue succionado usando una cánula de 2,5 mm de diámetro interior y una máquina convencional de liposucción. En el grupo CAL se utilizó aproximadamente la mitad del aspirado de liposucción recogido para el aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF, del inglés "stromal vascular fraction"). La SVF se aisló tanto a partir de la porción adiposa como de la porción líquida de los aspirados de liposucción, como se describió previamente.17 De forma resumida, la porción adiposa del aspirado de liposucción se digirió con colagenasa al 0,075% en solución salina tamponada, durante 30 minutos en un agitador a 37 C. Los adipocitos maduros y tejido conectivo fueron separados del SVF que contiene las ASCs por centrifugación (800g, 10 minutos), y luego se lavaron tres veces con solución salina tamponada. La porción líquida se centrifugó (800g, 5 minutos), y los sedimentos se resuspendieron en agua hipotónica para lisar los eritrocitos. El procedimiento de procesamiento de las células llevó unos 90 minutos. Durante el período de procesamiento, la otra mitad de lipoaspirados fue preparada como material de injerto. La cirugía se realizó en un quirófano estéril, y el aislamiento de las células se realizó en una sala estéril de procesamiento de células. La porción adiposa de los aspirados de liposucción se centrifugó a 700g durante 3 minutos, sin lavado y puesta en un frasco de metal (500 ml), que se colocó en agua con hielo picado. En el grupo no- CAL, la grasa centrifugada se inyectó sin suplementación de SVF. En el grupo CAL, los frescos de SVF aislados, tanto del tejido adiposo como de la porción de fluido, fueron añadidos al material de injerto, tras mezclar suavemente y esperar durante 10 a 15 minutos para la

3 adherencia de las células a la grasa aspirada. La grasa suplementada con células fue luego puesta en una jeringa de inyección. Como jeringa de inyección, se utilizó un inflador de 10 cm3 (LeVeen, Boston Scientific Corp., Boston, MA) porque son jeringas de tipo tornillo (con un émbolo roscado) y conexiones roscadas que se ajustan tanto al tubo de conexión como a la jeringa, para permitir un control preciso durante la inyección. Se utilizó para lipoinyección una aguja de calibre 18 (25 o 60 mm de largo) y se insertó en varias capas (en la capa de grasa subcutánea y en la capa muscular) y direcciones para lograr una distribución difusa de los materiales de injerto. La cantidad de tejido adiposo trasplantado se determinó tratando de ajustar en exceso en aproximadamente un 20%. Evaluación de la Mejora Clínica Las fotografías de cada paciente fueron tomadas antes y después del tratamiento, con una cámara digital de alta resolución (Modelo D30, Canon, Tokio, Japón). El porcentaje de mejora volumétrica de los defectos faciales se determinó a través de la evaluación de las fotografías preoperatorias y postoperatorias, por cuatro cirujanos plásticos certificados que desconocían los datos clínicos. Los datos medios de la mejora volumétrica de cada paciente fueron clasificados en cuatro categorías: excelente (con mejora del 80% o más), buena (del 60% a menos del 80% de mejora), razonable (del 40% a menos del 60% de mejora), y pobre (mejora inferior al 40%). Resultados El trasplante de tejido adiposo se realizó de forma exitosa en todos los casos. Se observó sangrado subcutáneo en algunas partes de la cara, que se resolvió en un periodo de 1 a 2 semanas. Los pacientes generalmente se recuperaron de la inflamación postoperatoria en aproximadamente 4 semanas. El tejido adiposo trasplantado fue absorbido gradualmente durante los 2 primeros meses del postoperatorio. El volumen continuó reduciéndose en el grupo no- CAL, mientras que mostró un cambio mínimo a partir de entonces en el grupo CAL. Los datos de los pacientes se resumen en la Tabla 1, y se muestran las fotografías de dos casos representativos de cada grupo en las figuras 2 a 5. Todos los pacientes mostraron mejoras estéticas, pero el grado varió entre los pacientes. Los pacientes CAL tuvieron una mejor puntuación en la mejora clínica que los no- CAL, aunque la diferencia no alcanzó significación estadística (p = 0,11). El tejido reconstruido fue generalmente suave y con textura natural, aunque algunos tejidos fibrosos que existían antes de la cirugía parecían permanecer. En un caso del grupo no- CAL (no- CAL- Caso 2; Figura 3), se detectaron enrojecimiento y fluctuación en la mejilla izquierda 1 mes después de la cirugía y los fluidos adiposos necrosados se drenaron mediante una pequeña incisión. Cultivamos este fluido, pero no se detectó ninguna bacteria. En los otros casos, no se observaron efectos adversos y no se palparon nódulos o quistes.

4 Discusión En la estrategia con CAL, las ASCs autólogas se utilizan para aumentar la angiogénesis, mejorar la tasa de supervivencia de los injertos, y reducir la atrofia postoperatoria. En la CAL, la mitad del volumen de la grasa aspirada se procesa para el aislamiento de las ASCs que contiene el SVF (Figura 1). Durante el proceso de aislamiento, la otra mitad de la grasa aspirada se prepara para el injerto. El SVF recién aislado, que contiene las ASCs, así como células endoteliales vasculares, pericitos, células sanguíneas (glóbulos blancos y glóbulos rojos), y otras células como se describió anteriormente,17 es añadido antes del trasplante a la grasa aspirada, actuando la grasa como estructura de soporte/andamiaje. Finalmente, el tejido progenitor de grasa enriquecida se inyecta en los sitios diana. Usando nuestra técnica, la grasa aspirada se extrae con una cánula de succión de tamaño relativamente grande, es centrifugada a 700g, y mantenida fría hasta el trasplante. Creemos que la centrifugación de la grasa aspirada afecta sustancialmente a la tasa de supervivencia de la grasa inyectada porque la centrifugación a 1200g disminuye experimentalmente el volumen de grasa en un 30%, daña al 12% de los adipocitos, y al 0% de las ASC, lo que concentra el número de células por volumen en un 25% para los adipocitos y un 43% para las ASCs. 18 Preferimos una aguja de punta afilada de calibre 18 o 16 para la inyección de grasa porque hemos encontrado que una aguja afilada facilita la colocación de injertos de grasa de forma más difusa y con mayor precisión, incluso en tejido fibroso o relativamente duro y en el músculo a través de una fascia, en comparación con una aguja de punta roma. El tejido adiposo contiene no sólo las células progenitoras de tejido adiposo, sino también células madre multipotentes que pueden diferenciarse en grasa, hueso, cartílago, y otros tipos de tejido.15,19 Anteriormente, hemos encontrado que la grasa aspirada pierde un número significativo de estas células precursoras durante la liposucción con una máquina de succión y los procesos de preparación, y que la grasa aspirada tiene aproximadamente la mitad del número de ASCs de las que tiene la grasa entera extirpada.16 Parece que hay dos razones principales para esta deficiencia relativa de ASCs. En primer lugar, una parte importante de las ASCs se encuentran alrededor de los grandes vasos y se quedan en la zona donante después de la liposucción;16 hemos confirmado este fenómeno mediante análisis histológico (manuscrito en preparación). En segundo lugar, algunas ASCs se liberan en la porción líquida de los aspirados de liposucción.17 La deficiencia relativa resultante de las células precursoras en la grasa aspirada puede contribuir a la baja tasa de supervivencia y la atrofia a largo plazo de los lipoaspirados trasplantados. Figura 2. Vistas clínicas del Caso 1 de no-cal (hombre de 25 años de edad): vista preoperatoria (lipoatrofia Grado 3; A) y vistas postoperatorias a 1 mes (B) y 10 meses (C). El paciente fue diagnosticado como LEP a la edad de 21 años y comenzó tratamiento con corticosteroides orales. Se detuvo la medicación hace 1 año y ha experimentado un cambio significativo en los últimos 12 meses. La lipoinyección convencional (100 ml) se realizó para remodelar el defecto de la mejilla izquierda, que fue aumentada con éxito en 1 mes (B), pero la incorporación sustancial fue observada a los 10 meses (C).

5 contenido de agua en el injerto, que puede perturbar la adherencia de las ASCs añadidas al tejido adiposo. Figura 3. Vistas clínicas del Caso 2 no-cal (mujer de 42 años de edad): vista preoperatoria (lipoatrofia Grado 5; A) y vista postoperatoria a los 9 meses (B). La paciente ha estado tomando corticosteroides por vía oral ya que había sido diagnosticada con LEP a la edad de 20 años. La lipoinyección convencional (250 ml) se llevó a cabo para aumentar los defectos faciales en ambas mejillas, y continuó la medicación durante el período perioperatorio. El enrojecimiento y la fluctuación fueron detectados en la mejilla izquierda al mes 1, y el líquido adiposo necrótico fue eliminado mediante una pequeña incisión en la piel. Sin embargo, el defecto facial se mejoró relativamente a los 9 meses (B). Con la CAL, compensamos este déficit en ASCs complementando la grasa aspirada destinada a lipoinyección con SVF recién aislado que contienen ASCs. Para maximizar la función biológica y evitar comportamientos inesperados de las ASCs, creemos que es importante garantizar la adherencia de las ASCs a los adipocitos o tejido conectivo.20 La centrifugación de los injertos de tejido adiposo parece ser importante también para reducir el Estudios preclínicos han confirmado en parte algunos beneficios potenciales del uso de ASCs en la CAL.16,21,22 Las ASCs pueden diferenciarse en adipocitos y contribuir a la regeneración del tejido adiposo. Además, las ASCs pueden diferenciarse en células endoteliales y probablemente también en células murales vasculares,16,23,24 lo que resulta en la mejora de la angiogénesis y de la supervivencia del injerto. Las ASCs son conocidas por liberar factores de crecimiento angiogénicos en respuesta a la hipoxia y a otras condiciones, 25,26 y estos factores pueden promover la angiogénesis del tejido huésped circundante. El papel más influyente que consideramos es que las ASCs permanecen como ASCs indiferenciadas originales en el tejido adiposo sobreviviente. 16 Las ASCs se encargan de participar en el recambio tisular adiposo, y el recambio es conocido por ser muy lento, llevando 2 años o más. 27 Sin embargo, el tejido adiposo trasplantado experimenta isquemia temporal seguido por reperfusión y por tanto, el injerto adiposo, probablemente, se estanca en la etapa temprana (hasta 3 meses) después del trasplante. Nosotros postulamos que la deficiencia relativa de ASCs en la grasa aspirada puede afectar el proceso de recolocación y dar lugar a la atrofia postoperatoria de grasa injertada, que se produce comúnmente durante los primeros 6 meses después de la lipoinyección. En nuestra serie, no se observaron efectos secundarios adversos o complicaciones, a excepción de un caso de lupus eritematoso profundo en el grupo no- CAL que tomaba corticosteroides orales antes de la operación. El paciente mostró necrosis de una parte del tejido adiposo trasplantado y los fluidos necróticos fueron drenados. Un paciente en el grupo CAL, que había tomado corticosteroides orales, mostró una puntuación clínica menor en comparación con los pacientes que no tomaban esteroides, lo que sugiere que los esteroides tomados durante el período perioperatorio, o posiblemente la actividad del lupus que requiere la medicación, tiene efectos negativos sobre la angiogénesis y la supervivencia del injerto. Por lo tanto, se puede recomendar que la lipoinyección, ya sea no- CAL o CAL, se lleve a cabo en un período de mínima actividad lupus y después que la terapia haya sido discontinuada

6 Figura 4. Vistas clínicas del Caso 1 de CAL (hombre de 35 años de edad): vista preoperatoria (lipoatrofia Grado 4; A) y vista postoperatoria a los 13 meses (B). El paciente detectó el defecto facial derecho a sus 20 años, fue diagnosticado con PRS, y no tiene antecedentes de uso de corticosteroides orales. La CAL (110 ml) se llevó a cabo para corregir el defecto facial, que mejoró, y el contorno facial se mantenía en la visita de seguimiento a los 13 meses (B). La mejilla es suave y de apariencia natural, sin cicatrices visibles. Hubo diferencias notables entre los dos grupos en las edades de los pacientes y en los volúmenes de inyección, en este ensayo preliminar. No obstante, los datos sugieren que la lipoinyección es una herramienta eficaz para la remodelación de la lipoatrofia facial, y sugieren que la suplementación con ASCs aumenta la eficacia. Nuestra experiencia clínica utilizando CAL para el aumento estético del tamaño de las mamas, con 1 a 4 años de seguimiento, también sugiere que la CAL es segura y puede ser superior a lipoinyección convencional. 20 Creemos que la CAL puede mejorar la desfiguración y discapacidad social de los pacientes con lipoatrofia facial y que tiene algunas ventajas sobre los métodos quirúrgicos convencionales: ausencia de cicatrices faciales y en el sitio donante, ausencia de complicaciones derivadas de materiales extraños, y la aplicabilidad a cualquier forma de defectos faciales. Se necesitan estudios más completos y períodos de seguimiento más prolongados, para establecer la superioridad y la durabilidad de las mejoras mediadas por la CAL en pacientes con lipoatrofia facial.

7 Figura 5. Vistas clínicas del Caso 3 CAL (mujer de 48 años de edad): vista preoperatoria (lipoatrofia Grado 4; A) y vista postoperatoria a los 13 meses (B). La paciente notó el defecto facial derecho a los 20 años y fue diagnosticada con LEP. Tiene un historial de uso de corticosteroides orales, pero no los toma desde hace varios años. La CAL (100 ml) fue realizada para corregir el defecto facial, que estaba mejorado a los 9 meses de seguimiento (B). Para Mayor información o Certificaciones favor de contactarse con: Global Stem Cell Group: info@stemcelltraining.net

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