AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE MICROORGANISMOS QUE VIVEN EN EL HOGAR 1

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1 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA DE MICROORGANISMOS QUE VIVEN EN EL HOGAR 1 Nicolás Araya (III B) Agustín Brito (III A) INTRODUCCIÓN La microbiología es el área de la ciencia que estudia a los microorganismos (también llamados microbios), seres vivos invisibles a simple vista, es decir, los que solo pueden verse con microscopio. La palabra microbiología se compone de tres partes de origen griego: micro o pequeño, bios o vida y logía o estudio (estudio de la vida pequeña). Esta ciencia ha sido muy importante en el desarrollo de la biotecnología, las industrias y la medicina, como por ejemplo el empleo de levaduras en la fabricación de cerveza y pan de manera masiva o el estudio de microorganismos patógenos, para desarrollar curas contra las enfermedades que provocan. Generalmente el campo de estudio de la microbiología está concentrado en seres compuestos de células que no están asociadas entre sí, estamos hablando de organismos unicelulares o de pequeños conglomerados de células iguales. En esta clasificación entran las especies eucariontes pertenecientes a los protistas (como las amebas), algunos hongos (como las levaduras) y plantas (algas unicelulares). Como en el estudio de todas las ciencias, la rigurosidad con la que se debe trabajar en microbiología es muy alta, pues de lo contrario cualquier experimento, estudio o actividad que se realice en general, arrojará resultados que no son fidedignos. Por ejemplo, cuando se trabaja con cultivos de una especie, la esterilización (descontaminación) de los materiales e instrumentos del laboratorio es de vital importancia, ya que un cultivo de algún microbio específico podría contaminarse con otras especies arruinando toda la muestra. Esto es más importante aun cuando 1 Investigación realizada en la mención Ciencias del Programa Interdisciplinario de Investigación Escolar SS. CC. Manquehue Profesora tutora: Pilar Rabanales. 1

2 los científicos trabajan con organismo patógenos (dañinos para la salud), por razones de seguridad. Para ello existen procedimientos establecidos que deben ser seguidos al pie de la letra si se quiere proceder de una manera seria, correcta y profesional. Es importante resaltar que los microorganismos (generalmente bacterias y hongos) están presentes en todos lados: en el aire, el piso, la comida, la suela de un zapato, un cepillo de dientes, en el agua que bebemos, en el intestino humano y, por supuesto, en todas las casas del planeta. Sin embargo no hay que preocuparse demasiado, pues la mayoría no es de carácter patógeno. Actualmente en Chile no existen estudios sistemáticos que permitan conocer la diversidad de cepas bacterianas o de levaduras que se encuentran presentes en la superficie de diversos lugares del hogar u obtener un conocimiento claro de la gran riqueza o biodiversidad que existe desde un punto de vista microbiológico. Al ser Chile un país que cubre una gran extensión de territorio, se generan en éste diversos tipos de climas y microclimas que favorecen el aumento en la abundancia y diversidad de la microflora, por ende es de gran importancia identificar y caracterizar morfológicamente parte de esta microflora nativa presente en hogares del sector oriente de Santiago. Este trabajo, al considerar lo anterior, pretende dar a conocer las características morfológicas de bacterias y levaduras presentes en la manilla del refrigerador de diferentes casas muestreadas, como así también aquella microflora existente en la superficie de controles remotos. Para ello se realizó un muestreo en 6 casas del sector oriente de Santiago, 3 ubicadas en la calle San Francisco de Asís, sector San Carlos de Apoquindo, comuna de Las Condes y 3 ubicadas en la calle Arquímides, comuna de Vitacura. ANTECEDENTES GENERALES Las Bacterias son los seres vivos más simples que existen en nuestro planeta y fueron la primera forma de vida que existió. A lo largo de la historia fueron, y hoy siguen siendo, los seres vivos más abundantes. Aunque existen muchos tipos de bacterias, todas comparten determinadas características. Las bacterias constituyen organismos unicelulares procariotas, esto significa que están formados por una sola célula que además no posee núcleo. Suele medir alrededor de un 2

3 micrómetro aunque se han encontrado algunas bacterias realmente gigantes, las cuales han llegado a medir cerca de un milímetro 2. Las levaduras son hongos unicelulares anaeróbicas facultativas y pueden comportarse como saprofitas o parásitas 3 donde la mayoría pertenece a la clase Ascomiceto 4 (Suárez-Lepe, 1997). Sus células son mucho más grandes que las de las bacterias y pueden distinguirse de ellas no solo por su tamaño, sino que también por poseer sistemas membranosos intracitoplasmáticos como núcleo, mitocondrias, entre otros. Normalmente poseen una forma celular oval, esférica o casi cilíndrica. Están presentes en diversos hábitats, ya sea el suelo, el ser humano, el hogar, en bayas de frutos, en diversos animales y en muchos otros ambientes, por lo que se pueden considerar organismos inmensamente ubicuos. 1.- Clasificación taxonómica En 1969, R. H. Whittaker propuso un sistema de clasificación de cinco reinos, donde los microorganismos procariotas están incluidos en el reino Mónera. En 1978 Carl R. Woese propuso elevar los tres tipos de células a un nivel por encima del reino llamado dominio y de ahí surgió el sistema de clasificación de los tres dominios que se conocen en la actualidad donde los procariotas unicelulares cuya pared contiene peptidoglicano se encuentran en el dominio Bateria 5. Para la clasificación de las levaduras se usa principalmente el enfoque clásico, centrado en la morfología comparada, la fisiología y la genética convencional, con un gran énfasis en pruebas bioquímicas de asimilación de sustratos carbonados, asimilación de nitratos y de ácidos orgánicos, los cuales son altamente variables. De acuerdo a lo propuesto por Carl Woese en sus trabajos taxonómicos, el dominio que alberga a las levaduras es el Eukarya. Este dominio incluye según el esquema taxonómico tradicional empleado por Whittaker, a los hongos como un quinto reino llamado Fungi. Estudios más específicos basados en las variaciones existentes en la reproducción sexual separan al reino Fungi en cuatro divisiones 6. 2 Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J., Biología de los microorganismos, Madrid, Brock, Pearson, Zúñiga, R., Aislamiento e identificación de Levaduras nativas etanogénicas, Santiago Universidad Metropolitana de Ciencias de la Educación. Facultad de Ciencias Básicas, Suárez-Lepe, J. A., Identificación de levaduras. Seguimiento y control de implantación de las cepas seleccionadas, en Levaduras vínicas, vol. 10, Madrid, Ed. Mundi-Prensa. 1997, pp Pedrique de Aulacio, M., Reproducción y crecimiento bacteriano. Cátedra de Microbiología, Caracas, Facultad de Farmacia UCV, Ídem. 3

4 2.- Reproducción de las bacterias y levaduras Las bacterias se reproducen por fisión binaria, un proceso en el cual de la división de una célula resultan dos células. Usualmente ambas células hijas tienen el mismo tamaño y forma. Éste es el proceso más común y sin duda el más importante en el ciclo de crecimiento de las poblaciones bacterianas 7. Las levaduras poseen un ciclo de reproducción asexual por yemación o por fisión binaria. Cuando la célula hija se separa de la célula madre, deja una cicatriz en esta última. Las yemas se pueden ubicar en un polo de la célula o a lo largo de toda la superficie de la misma y algunas presentan yemación unipolar, bipolar o multipolar. Algunas levaduras no se separan al término del proceso de yemación y originan una estructura llamada pseudomicelio. Las levaduras también se pueden reproducir de manera sexual, otorgando variabilidad genética a la especie, para ello dos diferentes tipos de células haploides ( a y α ) se fusionan, originando una célula diploide (2n), la cual entra en meiosis generando células haploides genéticamente recombinadas. 3.- Metabolismo de las bacterias y levaduras En el caso de las bacterias, como se encuentran en casi todos los ambientes, intervienen en varios procesos biológicos. El crecimiento microbiano requiere la formación de estructuras complejas como proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos a partir de elementos preformados en el medio de crecimiento o sintetizados por la propia célula. A su vez, este crecimiento necesita de una fuente de energía para ser llevado a efecto, todo este proceso se designa con el nombre de metabolismo, que se define como todas las transformaciones químicas que ocurren en una célula 8. Las levaduras poseen un metabolismo central en donde la glucosa es la fuente de carbono y de energía, el cual comienza con la glicólisis, la que corresponde al conjunto de reacciones que permiten la transformación de glucosa a piruvato (Pyr), permitiendo la obtención de energía en forma de ATP. El Pyr formado puede seguir dos rutas: ingresar al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Ciclo TCA), necesitando además oxígeno, o continuar por la fermentación de glucosa produciendo etanol. El ciclo TCA es el que genera un mayor aporte energético para la célula, mediante el consumo de los metabolitos que ingresan a dicho ciclo. Una de las etapas intermedias de la glicólisis la constituye la glucosa- 6-fosfato (G6P). Cuando no se dispone de glucosa en el medio, se 7 Ídem. 8 Madigan, Martinko y Parker, op. cit. 4

5 consume primeramente el etanol y luego el glicerol, dando paso a un proceso conocido como gluconeogénesis, proceso de flujo inverso a la glicólisis Aislamiento e identificación de los microorganismos Para el aislamiento de microorganismos específicos han sido utilizadas técnicas selectivas empleando medios que permiten a dichos organismos crecer suprimiendo el crecimiento de otros microorganismos que no sean parte del estudio. La composición de tales medios son determinados por los microorganismos que se pretenden estudiar. En el caso de bacterias y levaduras, por regla general, son sensibles al crecimiento a distintos niveles de ph y concentraciones de agua, mecanismos que limitan e inhiben aún más la probabilidad de que otros microorganismos crezcan en el medio selectivo. También se emplean agentes fungicidas para la supresión de desarrollo de hongos filamentosos, los cuales deben ser utilizados con precaución, ya que tales compuestos pueden inhibir algunas levaduras 10. Otros mecanismos más específicos para la identificación de los microorganismos consideran diversas propiedades como: - Caracterización fisiológica y bioquímica, donde alcanza una importancia significativa la utilización de compuestos carbonados. - Fermentación de carbohidratos, ya que los microorganismos pueden utilizar diversas fuentes carbonadas, tales como, glucosa, arabinosa, rhamnosa, etcétera La capacidad fermentativa permite diferenciar algunos géneros de éstas, entre los cuales se ubica el género Saccharomyces y Zygosacharomyces que fermentan altamente la glucosa. Por el contrario otras como Rhodosporidium no son tan fuertes fermentadoras y por tanto se ubican en otro género. - Asimilación de compuestos carbonados y compuestos nitrogenados. 5.- Estudios previos de tipos de levaduras. Las bacterias han sido estudiadas en diversas áreas, como la medicina para conocer diversas enfermedades y lograr obtener sus tratamientos o la industria alimenticia para lograr obtener alimentos que ayuden a una mejor digestión de éstos con el apoyo de bacterias. 9 Mardones, R., Aplicación de optimización lineal multiperíodo en la producción de una proteína recombinante humana, sod, en levadura, saccharomyces cereviseae, Santiago, Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Zúñiga, R., op. cit. 5

6 Las levaduras presentan una gran importancia industrial, participando, por ejemplo, en la producción de vino, pan y cerveza. Actualmente la taxonomía reconoce la existencia de unas 500 especies de levaduras de las cuales 15 a 20 especies, pertenecientes a unos 8 géneros, son de interés para la enología. Algunos de estos géneros son: Candida, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Kloeckera, Zygosaccharomyces, Torulaspora y Saccharomyces 11 (Regodon, 1997). DISEÑO DE NUESTRO PROYECTO DE INVESTIGACIÓN. a) Pregunta: Qué tipos de microorganismos existen en la superficie de un control remoto y las manillas del refrigerador? b) Hipótesis: Si existe contacto directo con el control remoto y con las manillas del refrigerador, entonces existen diversos microorganismos en dichas superficies. c) Objetivo General: Aislar cepas de levaduras y bacterias a partir de la superficie de objetos que se encuentran en el hogar e identificar los aislados mediante caracterización morfológica. d) Objetivos específicos: Seleccionar diferentes lugares del hogar que mantengan un permanente contacto con los integrantes de la familia que allí viven, como es el caso de la superficie de la manilla del refrigerador y el control remoto de 6 casas del sector oriente de Santiago. Aislar bacterias y levaduras nativas mediante técnicas de cultivos selectivos. Identificar morfológicamente las bacterias y las levaduras nativas aisladas. e) Materiales 1.- Instrumentos de laboratorio Autoclave Hyrayama Balanza analítica Incubadora Memmert 11 Regodón, J., Obtención y caracterización de cepas autóctonas de levaduras para la elaboración estandarizada de vinos de calidad, España, Universidad de la Extremadura. Departamento de Biología y de la Producción de los Vegetales,

7 Lupa electrónica Refrigeradores 2.- Material de laboratorio Lupas Mechero Placas de Petri Tubos de ensayos 3.- Medios de cultivo Agar agar Agua destilada Glucosa Peptona 4.- Otros Bolsas de papel Cámara fotográfica digital Fujimil Guantes estériles Lápices marcadores Tórulas estériles f) Métodos. 1.- Recolección de muestra. Las muestras fueron obtenidas bajo estricta esterilidad del material utilizado, pues con guantes se tomaron las tórulas estériles que fueron las que tuvieron contacto con la superficie de cada control remoto de las seis casas muestreadas, siendo guardadas en pequeños tubos de ensayo igualmente estériles que fueron sellados al introducir la muestra y rotulados para evitar confusión en las muestras obtenidas. De la misma forma se procedió para tomar las muestras de las manillas de cada refrigerador, obteniendo así un material libre de contaminación de otros microorganismos que no sean parte de esta investigación. 2.- Aislamiento de microorganismos bacterianos y levaduriformes. Con estricto cuidado se tomaron las tórulas estériles que transportaban la muestra obtenidas de las superficies del control remoto y de las manillas del refrigerador y fueron 7

8 sembradas de forma separada en las placas con medio de cultivo YM para levaduras y medio de cultivo AN para bacterias 12. Ambos medios de cultivo son selectivos, es decir, permiten el crecimiento sólo de levaduras en el caso del medio YM y sólo de bacterias para el medio AN, restringiendo el crecimiento de otros microorganismos. Estas placas obtenidas fueron incubadas por 2 días a una temperatura adecuada para el crecimiento de bacterias y levaduras, siendo estas placas evaluadas de forma periódica y constante para supervisar el crecimiento de contaminantes en el medio. Una vez incubadas las placas de Petri con las siembras hechas a partir de las muestras obtenidas, descritos en el protocolo anterior, se tiene como producto una microflora diversa, la cual fue evaluada y analizada bajo lupa manual, y a través de un criterio uniforme se realizó la caracterización morfológica. 3.- Caracterización morfológica. Para efectuar una caracterización morfológica en esta investigación se utilizaron los siguientes criterios de selección que fueron discutidos en el equipo de trabajo una vez observados los resultados obtenidos del crecimiento tanto de bacterias como de levaduras. Estos criterios se caracterizaron por estar muy bien definidos e identificables para cada uno de los integrantes de esta investigación, lo que hace objetivo el análisis de dichos resultados. Estos criterios son: a. Color de la cepa b. Tamaño de la cepa c. Forma de la cepa d. Contorno de la cepa RESULTADOS 1. Caracterización morfológica de bacterias y levaduras La gran similitud observada que presentan algunas colonias de levaduras y bacterias obtenidas a simple vista, hace imperante la necesidad de realizar un análisis morfológico en el que se consideren características visibles utilizando lupa electrónica. Las características que se consideraron para este análisis fueron: color, tamaño, forma y características del contorno de la cepa. Todos los criterios mencionados se resumen en la tabla N 1 en donde se pueden apreciar la diversidad de cepas descritas (25 cepas en total). De ellas, las cepas 2 (blanca brillante), Al respecto véase Anexo N 1. 8

9 (blancas en el centro y transparentes en su contorno), 19 (blancas amarillentas) y 24 (naranjas) no poseen similitudes en cuanto a su color con ninguna de las otras cepas. Por otro lado existen grupos similares en cuanto a color y forma de la cepa, donde encontramos que las cepas 1, 8, 10, 13 y 25 poseen características morfológicas similares entre sí (blancas redondas), de igual manera las cepas 14, 18, 20, 22 y 23 (blancas opacas redondas), las cepas 3, 4, 9, 15 y 16 (amarillas redondas), las cepas 5 y 17 (rosadas redondas) y, por último, las cepas 6, 7, 12 y 21 (transparentes redondas). Lo anterior, no significa necesariamente que los resultados arrojen de forma inmediata las diferentes especies, ya que, células de diferentes especies pueden presentar igual morfología celular de acuerdo a las condiciones ambientales en que se desarrollen o la etapa de desarrollo en que se encontrase cuando se hizo la observación Zúñiga, R., op. cit. 9

10 Tabla 1: Caracterización morfológica de cada cepa tanto bacteriana como de levadura. Número de colonia Color cepa Tamaño cepa Forma de la cepa Características del contorno de la cepa 1 Blanca Pequeña Redonda Regular 2 Blanca brillante Mediana Redonda Regular con volumen 3 Amarilla Pequeña Redonda Regular 4 Amarilla Mediana Redonda Bordes irregulares 5 Rosada Pequeña Redonda Regular 6 Transparente Pequeña Redonda Regular 7 Transparente Grande Redonda 8 Blanca Pequeña Redonda Centro oscuro y contornos irregulares Centro blanco con bordes irregulares 9 Amarilla fuerte Pequeña Redonda Regular 10 Blanca Grande Redonda Rugosa con contornos irregulares Blanca en el 11 centro, transparente su Grande Redonda Centro blanco con contorno irregular peludo contorno 12 Transparente Grande Redonda Regular 13 Blanca Grande Redonda Regular plana 14 Blanca opaca Mediana Redonda Regular plana 15 Amarilla Mediana Redonda Regular 10

11 Número de colonia Color cepa Tamaño cepa Forma de la cepa Características del contorno de la cepa 16 Amarilla Grande Redonda Mucosa de bordes irregulares 17 Rosada Mediana Redonda Regular 18 Blanca opaca Muy grande Redonda Bordes irregulares con pelos sobre otras colonias 19 Blanca amarillenta Mediana Redonda Regular 20 Blancas opaca Pequeña Redonda Plana e irregular 21 Transparente Grande Redonda Bordes irregulares y plana 22 Blanca opaca Mediana Redonda Bordes irregulares y plana 23 Blanca opaca Mediana Redonda Regular peluda 24 Naranja Pequeña Redonda Regular 25 Blanca Mediana Redonda Mucosa regular 11

12 Muestra casa 5 Control remoto Medio AN - YM Imagen N 1: Cepas presentes en la superficie del control remoto (muestra casa 5) Muestra casa 2 Refrigerador Medio AN - YM Imagen N 2: Cepas presentes en las manillas del refrigerador (muestra casa 2) Tabla 2.1: Caracterización morfológica de bacterias en control remoto. 12

13 N de colonia Casa 1 Casa 2 Casa 3 Casa 4 Casa 5 Casa

14 Tabla 2.2: Caracterización morfológica de bacterias de manillas del refrigerador. N de colonia Casa 1 Casa 2 Casa 3 Casa 4 Casa 5 Casa

15 Tabla 3.1: Caracterización morfológica de levaduras en control remoto. N de cepa Casa 1 Casa 2 Casa 3 Casa 4 Casa 5 Casa

16 Tabla 3.2: Caracterización morfológica de levaduras de manillas del refrigerador N de cepa Casa 1 Casa 2 Casa 3 Casa 4 Casa 5 Casa

17 DISCUSIÓN Para poder aislar la diversidad levaduriforme y bacteriana existente en diversos lugares del hogar seleccionados (superficie del control remoto y superficie de las manillas del refrigerador), se utilizaron los procedimientos anteriormente descritos en los métodos. Una vez aisladas cada una de las cepas se procedió a identificar morfológicamente, donde se describieron 25 cepas distintas entre sí, de acuerdo a los criterios mencionados de color, forma, tamaño y características del contorno de las cepas obtenidas por observación macroscópica del cultivo y con el apoyo de lupa electrónica. Esta caracterización de las 25 cepas también arrojó diversos resultados de semejanzas y diferencias que permite agrupar a las cepas, formando así 5 grupos basados en la similitud del color y la forma de la cepa, quedando 4 cepas totalmente distintas a las anteriores. En cuanto a las bacterias, las cepas que más se repiten en las 6 casas muestreadas son la cepa 1 y 6. La muestra obtenida de la casa 2 es la que muestra mayor diversidad bacteriana en el control remoto y la muestra obtenida de la casa 5 es la que muestra mayor diversidad bacteriana de las manillas del refrigerador. En cuanto a las levaduras, la cepa 1 es la que más se repite en las 6 casas muestreadas, donde la mayor diversidad de levaduras ubicadas en el control remoto fue en la muestra obtenida en la casa 5 y la mayor diversidad de levaduras ubicadas en la superficie de las manillas del refrigerador fue en las muestras de las casas 2 y 4. CONCLUSIONES La flora bacteriana y levaduriforme presente en la superficie del control remoto y en las manillas del refrigerador de las 6 casas muestreadas se resumen en 25 cepas diferentes descritas de manera morfológica con la utilización de 4 criterios (color, forma, tamaño y contorno de las cepas), donde la casa 2 (perteneciente a San Carlos de Apoquindo, comuna de Las Condes) y la casa 5 (perteneciente a la calle Arquímides, comuna de Vitacura) son las que presentan mayor diversidad tanto bacteriana como de levaduras en el hogar. Considerando los objetivos planteados para el desarrollo de esta investigación es posible identificar, de manera global, que existen resultados concretos después de un riguroso trabajo en donde se realizaron diversos procedimientos y metodologías experimentales, otorgando una cierta validez a los resultados obtenidos, los cuales permiten observar el aislamiento de bacterias y 17

18 levaduras extraídos de la superficie del control remoto y de las manillas del refrigerador de las 6 casas muestreadas, microorganismos que fueron caracterizados morfológicamente. En relación a la hipótesis que enmarca el presente trabajo investigativo, es posible validarla, ya que se logra confirmar la existencia de bacterias y levaduras tanto en la superficie del control remoto como en las manillas del refrigerador, todo esto realizado mediante estrictas metodologías de aislamiento e identificación de dichos microorganismos. Por último, cabe mencionar que esta investigación, en términos cuantitativos es estadísticamente inválida, ya que los muestreos realizados no contaron con las suficientes replicas como la estadística las requiere. Sin embargo, se debe aclarar que la presente investigación nunca persiguió objetivos que involucrarán validaciones de tipo estadísticas, si no que sentar las bases cualitativas que siempre deben existir para investigaciones futuras, como una caracterización más detallada de los microorganismos aislados. FUENTES Y BIBLIOGRAFÍA Madigan, M; Martinko, J y Parker, J., Biología de los microorganismos, Madrid, Brock. Pearson. España, Mardones, R., Aplicación de optimización lineal multiperíodo en la producción de una proteína recombinante humana, sod, en levadura, saccharomyces cereviseae, Santiago Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Pedrique de Aulacio, M., Clasificación de los microorganismos. Cátedra de Microbiología, Caracas, Facultad de Farmacia UCV, Pedrique de Aulacio, M., Reproducción y crecimiento bacteriano. Cátedra de Microbiología, Caracas, Facultad de Farmacia UCV, Regodón, J., Obtención y caracterización de cepas autóctonas de levaduras para la elaboración estandarizada de vinos de calidad, España, Universidad de la Extremadura. Departamento de Biología y de la Producción de los Vegetales, Suárez-Lepe, J.A., Identificación de levaduras. Seguimiento y control de implantación de las cepas seleccionadas, en Levaduras vínicas, vol. 10, Madrid, Ed. Mundi-Prensa, Zúñiga, R., Aislamiento e identificación de Levaduras nativas etanogénicas, Santiago, Universidad Metropolitana de Ciencias de la Educación, Facultad de Ciencias Básicas,

19 ANEXOS -ANEXO 1- Medios de cultivo Medio YM Agar agar 2% Extracto de levadura 0,3% Extracto de malta 0.3% Peptona 0,5% Glucosa 1% Agua destilada Medio AN Agar agar 2% Glucosa 2% Peptona 2% Agua destilada 19

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