ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS PROBABLE

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1 CUARTA PARTE ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS PROBABLE EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililística. Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros. En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.

2 EL NUMERO MAS PROBABLE 2 Materiales & Equipos: Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.) Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro) Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl Micropipetas de 20 µl Puntas para micropipeta Incubadora a 25 C Vortex METODOLOGIA 1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas. 2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex. 3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la dilución. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente. 4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa petri en cinco zonas de igual tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inculado:

3 EL NUMERO MAS PROBABLE 3 5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita esta operación cinco veces por cada dilución: 6. Permita que el incóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un tirillade parafina. Invierta la placa e incube a 25 C por 7 días. 7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en asendencia evalue el crecimiento o no crecimiento sobre cada réplica incoculada. Reporte los resultados como se indican en el ejemplo a continuación: Datos & Análisis: Diluciones :: Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para su muestra (ej., : 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla, promedie el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., no está en la tabla, entonces promedie (169) y (216) como el resultado más apropiado: = ( )/2 = 193). Este valor obtenido es el NMP sin ajustar. Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el NMP sin ajustar por el factor de correción de volumen (ver nota Tabla 1) por el recíproco del factor de dilución menor inoculado en la placa (ej., : 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 10 8 células/g de suelo).

4 EL NUMERO MAS PROBABLE 4 Tabla 1. Núm. Respuestas Pos. por Nivel de Dilución El número más probable para series de diluciones en réplicas de cinco por nivel de dilución (Woomer, 1994)*. Población estimada Núm. Respuestas Pos. por Nivel de Dilución Poblaciónestimada * Esta es la densidad poblacional estimada asumiendo 1 ml de inóculo. Este valor debe ser ajustado por el factor de dilución y el volumen de inóculo (por ejemplo, si usted inoculó en cada placa un volumen de 10 µl, entonces el valor de la tabla debe ser correjido multiplicándolo por 100 [10 X 100 = 1,000 µl ó 1 ml]).

5 EL NUMERO MAS PROBABLE 5 Observaciones: PREGUNTAS Qué tiempo de incubación de sería el más apropiado? 2. Cuáles son algunas desventajas del método de NMP? 3. Qué otras aplicaciones tiene este método? 4. Si luego de preparar diluciones en serie de 10-2 hasta de una muestra de una laguna usted obtuvo un patrón de respuestas positivas , Cuál es la densidad poblacional en la laguna? 5. Qué tendría usted que hacer si luego de incubar los resultados son ?

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