TP2: Extracción y cuantificación de proteínas

Transcripción

1 Objetivo TP2: Extracción y cuantificación de proteínas Comparar métodos de extracción de proteínas a partir de distintos organismos. Cuantificar las proteínas resultantes de cada extracto. Introducción Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en la célula, ellas constituyen más del 50% del peso seco de la célula. Cada tipo celular, tiene un rol específico determinado por su composición proteica. Con la posibilidad de que 20 (o 22) aminoácidos diferentes puedan estar unidos en cualquier orden para conformar polipéptidos de cientos de aminoácidos, tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes en su conformación. Esta variedad permite a las proteínas funciones tan refinadas como las de las enzimas que permiten el metabolismo celular. Una bacteria puede tener cerca de 1000 proteínas diferentes, en una célula humana puede haber más de clases de proteínas distintas. Esta composición depende del conjunto de genes que se estén activando y esto está relacionado directamente con las señales que recibe la célula, de su micro ambiente y de las características celulares que le son propias. Es decir que el patrón proteico de una célula vegetal será distinto al de una célula animal y a su vez una célula hepática de un ratón, por ejemplo, será distinta de una célula hepática de un humano. Esta expresión diferencial de proteínas puede ponerse en evidencia mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida. Para esto es necesario extraer las proteínas a partir de las células que constituyen los tejidos u órganos. Los métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos mecánicos y/o químicos. Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo, si es necesario se pueden realizar centrifugaciones diferenciales para obtener fracciones subcelulares o para aislar organelas específicas. Básicamente, las proteínas asociadas a membrana quedarán en el pellet y las solubles en el sobrenadante. Partiendo del extracto celular, existen varios métodos que permiten purificar una o más proteínas. Para ello, se somete al extracto a tratamientos que separan las proteínas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamaño o carga, proceso denominado fraccionamiento. Las primeras fases en este proceso utilizan diferencias en la solubilidad que depende del ph, la temperatura, la fuerza iónica entre otros factores. Para la obtención del extracto crudo, al momento de elegir el protocolo a seguir es importante tener en cuenta: Material biologico de partida-tipo de organismo: En el caso de órganos u otros tejidos animales, es necesario disgregarlos antes de proceder a la lisis celular, ya que las células se encuentran rodeadas de tejido conectivo. En general estas técnicas involucran una ruptura mecánica grosera. Para esto pueden utilizarse morteros, homogeneizadores eléctricos, tijeras o tamices metálicos. 1

2 Cuando el material es un cultivo celular, la extracción puede realizarse adicionando un detergente, realizando un shock osmótico, o por sonicación. Finalidad del extracto proteico: esto determinará el buffer de extracción que se utilizará dependiendo se desea o no que las proteínas conserven su actividad biológica, su conformación nativa, su interacción con otras proteínas u otras moléculas. Algunos protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de todas las membranas; otros en cambio permiten fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares (núcleos, mitocondrias, etc). En este trabajo práctico se obtendrán los extractos proteicos crudos a partir de distintos sistemas biológicos que serán comparados mediante geles SDS-PAGE. Para que la comparación semicuantitativa entre los distintos perfiles obtenidos sea válida, es necesario utilizar la misma cantidad (masa, concentración) de proteínas. Existen distintos métodos que permiten medir el contenido de proteínas de una muestra. Las proteínas absorben a 280 nm, y a bajas concentraciones de manera proporcional con su concentración. Este es un método rápido y sencillo que puede ser utilizado cuando la concentración es de más de 4 mg/ml. La desventaja de este método es que la muestra debe estar pura, ya que otras moléculas no-proteicas como el DNA, también absorben a esa longitud de onda. Además este método es menos sensible que los colorimétricos, Los ensayos colorimétricos involucran la adición de un reactivo químico que es capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacídicos. El resultado de estas reacciones es el cambio de color en la solución, que es medido utilizando un espectrofotómetro. Para determinar la concentración de proteínas totales de la muestra a analizar los resultados de absorbancia se interpola a un curva de calibración construida utilizando una proteína estándar, por lo general albúmina sérica bovina (BSA bovine seric albumin), cuya concentración es conocida. Los ensayos colorimétricos más utilizados son: Ensayo de Lowry (750 nm): se trata de una reacción de redox con los enlaces peptídicos y con los los aminoácidos Tyr, Trp y Cys. Es rápido, sencillo y relativamente sensible. Como desventaja, es afectado por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio, Tritón X-100. Sin embargo existen variables que pueden realizarse para evitar estas interferencias Ensayo BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): es más sensible que Lowry y puede realizarse en un amplio rango de temperaturas. También es sencillo, pero requiere de tiempos de incubación un poco más largos. Los complejos coloreados son muy estables. Aunque es altamente susceptible a interferencias, no interfiere con detergentes y lípidos. Ensayo de Bradford (595nm): es el doble de sensible que los dos anteriores. Es un método rápido y muy sencillo y además no presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el ß-mercaptoetanol, que sí interfieren con los anteriormente mencionados. La desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lípidos. 2

3 Procedimiento PRECAUCIONES PARA EL USO DE LAS MICROPIPETAS 1) Las micropipetas tienen en la parte superior del émbolo su dentificación: P20, P200, P1000, etc. La pipeta P20 sólo puede ser utilizada para medir volúmenes comprendidos entre 1 y 20 ul. La pipeta P200 para los volúmenes comprendidos entre 20 y 200 ul. La pipeta P1000 para volúmenes entre 200 y 1000 ul. 2) Para ajustar el volumen que se desea utilizar, debe girarse la rueda que se encuentra detrás del visor que indica el volumen. La rueda debe ser girada suavemente, NUNCA FORZARLA. NUNCA EXCEDER LOS VALORES ESTABLECIDOS EN EL PUNTO 1, YA QUE SE DESCALIBRA O SE ROMPE. El valor de estas pipetas es aproximadamente u$s 250 Dependiendo la marca y el modelo, los volúmenes se indican de distinta manera, pero en general: a. Para la pipeta P20 los dos superiores indican la decena y la unidad (en microlitros µl ), el tercer número (que está en otro color) indica la primer cifra después de la coma. b. Para la P200 los tres números indican centena, decena y unidad (en µl) respectivamente. c. Para la P1000 que solo tienen tres cifras en el visor, el primer número (en otro color) corresponde a la unidad de mil µl, los otros dos la centena y la decena. Otros modelos tiene los cuatro dígitos correspondientes al millar, centena, decena y unidad. SIEMPRE TRABAJAR CON LAS MUESTRAS EN HIELO PARA EVITAR LA DEGRADACIÓN DE LAS MUESTRAS POR ACCIÓN DE LAS PROTEASAS Extracción de proteínas: Tejido animal 1) Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo. 2) Agregar 200 µl buffer RIPA. 3) Homogeneizar con el vástago hasta disgregar el tejido. 4) Centrifugar 15 minutos a rpm a 4 C 5) Colocar el sobrenadante en un eppendorf y conservar en hielo. Buffer RIPA: Tris-HCl ph mm; EDTA 1 mm; NaCl 100 mm; NP-40 1 % Cultivo celular eucariota: 1) Lavar la monocapa con PBS. 3

4 2) Agregar 1 ml por placa de Petri de TNE, levantar la monocapa con escobilla y pasar a un eppendorf. Incubar 10 minutos en hielo. 3) Centrifugar 2 minutos a 6000 rpm. 4) Resuspender en 40 µl de buffer RIPA, mantener en hielo durante aprox. 30 minutos. 5) Centrifugar 15 minutos a rpm a 4 C 6) Colocar el sobrenadante en un eppendorf y conservar en hielo. TNE: Tris-HCl ph mm; EDTA 1 mm; NaCl 150 mm Buffer RIPA: Tris-HCl ph mm; EDTA 1 mm; NaCl 100 mm; NP-40 1 % Cultivo de bacterias: 1) Colectar 1,5 ml de bacterias de un cultivo líquido por centrifugación a 5000 rpm por 3 minutos y descartar el sobrenadante 2) Repetir el paso 1 en el mismo tubo (para duplicar la cantidad de material de partida) 3) Resuspender en aproximadamente 500 ul de PBS. 4) Sonicar la muestra. (3 ciclos de segundos cada uno, intercalando con 2 minutos de incubación en hielo. Potencia: 3 Watts) 5) Centrifugar 15 minutos a rpm a 4 C. 6) Colocar el sobrenadante en un eppendorf y conservar en hielo. Cuantificación de proteínas: Se utilizará el reactivo de Bradford (Bio-rad) para cuantificar el extracto de proteínas bacterianas: 1) Preparar el reactivo diluyendo una parte del concentrado en 4 partes de agua desionizada. (Una vez diluído puede conservarse a temperatura ambiente hasta 2 semanas) 2) Preparar 5 diluciones de la proteína estandar (BSA) entre 0,05 mg/ml a 1 mg/ml. 3) Para cada realizar la curva del estándar, colocar 200 µl del reactivo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos (microplaca). Agregar 10 ul de cada dilución del estándar (por duplicado) 4) Para las muestras, Realizar primero 2 diluciones seriadas 1/10 en PBS. Colocar 200 µl del reactivo y 10 ul de cada muestra y sus diluciones en los pocillos, también por duplicado. CAMBIAR EL TIP AL AGREGAR CADA MUESTRA. 5) Realizar un blanco utilizando PBS en vez de la muestra de proteínas. 6) Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos (hasta no más de 1 hora). 7) Medir la absorbancia a 595 nm en un lector de microplacas. Se utilizará el reactivo de Lowry modificado (Bio-rad) para cuantificar los extractos de tejido animal y cultivo celular, que contienen detergente: 1) Reactivo A : mezclar 20 µl de reactivo S con 1 ml de reactivo A (Esta modificación se realiza cuando la muestra de proteínas a medir contiene detergentes) 2) Preparar 5 diluciones del estándar de BSA (en un rango entre 0,2 y 5 mg/ml) en buffer RIPA 4

5 3) Agregar 25 µl de reactivo A a cada pocillo 4) Realizar 2 diluciones seriadas 1/10. Sembrar 5 µl de cada muestra y de la curva por duplicado. Mezclar bien con la micropipeta luego del agregado de cada muestra y CAMBIAR EL TIP ENTRE MUESTRAS. 5) Agregar 200 µl de reactivo B, y agitar la placa por 5 segundos. 6) Incubar 15 minutos y medir absorbancia a 750 nm (la reacción es estable por una hora) 5