PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA. BOLETIN INFORMATIVO Nro. 3- JUNIO 2012

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1 PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán BOLETIN INFORMATIVO Nro. 3- JUNIO 2012 COMENTARIOS ENCUESTA 43 Cepa Nº1: Staphylococcus aureus Esta cepa correspondía a un aislamiento de S. aureus aislado de hemocultivo. Para esta cepa, el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) recibió la respuesta de 366 laboratorios. El 93,2 % (n=341) de los laboratorios informaron correctamente género y especie. Tabla 1.a Tabla 1.a. Cepa 1: Concordancia en la Identificación bioquímica. Concordancia Nº Porcentaje (%) Género y especie correctos ,2 Género correcto 2 0,5 Género correcto y especie incorrecta 23 6,3 Género incorrecto 0 0 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 1

2 Con respecto a la sensibilidad, el desafío en la Cepa 1 era la detección de la meticilinoresistencia y el fenotipo de resistencia intermedia a vancomicina (VAN): VISA (VISA). Se trató de un aislamiento hospitalario meticilino-resistente con 6 mm de halo para oxacilina y cefoxitina, con resistencia a gentamicina y rifampicina y sensibilidad a trimetoprima/sulfametoxazol (TMS) y linezolid. Prácticamente todos los laboratorios participantes detectaron la meticilino resistencia (98,3%) y la resistencia a gentamicina y rifampicina (97,8% y 99,4%, respectivamente). Tal como les comentamos en el informe preliminar enviado los primeros días de febrero junto al resultado individual de la encuesta, debido a limitaciones en el software del Programa, se realizó una modificación en el informe: en la sección antibiograma, en la respuesta del Laboratorio de Referencia para la interpretación de cefoxitina (FOX) donde figura R debería decir meticilino resistente o resistente a oxacilina. Se recuerda que en ningún caso se deben informar los resultados de cefoxitina en Staphylococcus spp., los halos de inhibición de esta droga se deben interpretar e informar como sensibilidad o resistencia a oxacilina. Agregamos R en la interpretación de FOX en aquellos laboratorios que no interpretaron este antibiótico y colocaron en los comentarios que el aislamiento era meticilino resistente con el fin de que el software no marque error. También colocamos R a los laboratorios que no interpretaron FOX pero informaron un halo <= 21 mm aunque no hayan hecho comentarios, considerando que la recomendación general es no informar FOX como tal sino meticilino resistente o resistente a oxacilina. Se detectaron 16 errores en la interpretación (0,9%), 9 errores muy graves y 7 menores. Los errores muy graves estuvieron asociados a cefoxitina (5) y gentamicina (4) y los errores menores correspondieron a gentamicina (4), rifampicina (2) y cefoxitina (1). No hubo errores en la interpretación de TMS y Linezolid, todos los laboratorios informaron sensible, estas drogas. Tabla 1.b Tabla 1.b. Cepa 1: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y el LNR ATB Nº RESPUESTAS S I R Nº % Nº % Nº % CEFOXITINA ,4 1 0, ,3 GENTAMICINA ,1 4 1, ,8 RIFAMPICINA , ,4 TMS LINEZOLID S: sensible, I: intermedio, R: resistente. Errores muy graves Errores menores Resultado correcto PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 2

3 A nivel general, hubo un 91% de concordancia entre las zonas de inhibición de los laboratorios participantes y el rango calculado por el LNR. Los porcentajes de concordancia para cada uno de los antibióticos evaluados se detallan en la Tabla 1.c. Tabla 1.c. Cepa 1: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y el rango calculado por el LNR. ATB Nº Respuestas Dentro del rango Fuera del rango Nº % Nº % CEFOXITINA , ,6 GENTAMICINA ,8 18 5,2 RIFAMPICINA ,5 5 1,5 TMS ,3 31 8,7 LINEZOLID , ,6 Sensibilidad reducida a Vancomicina: Se han descrito tres fenotipos de resistencia o sensibilidad reducida a VAN en S. aureus: 1) VISA: CIM VAN 4-8 µg/ml (intermedio), 2) h-visa: CIM VAN < 2 µg/ml (sensible) pero capaces de seleccionar subpoblaciones VISA y 3) VRSA: CIM VAN > 16 µg/ml (resistente) por adquisición del gen vana. El método de difusión por discos detecta VRSA, pero no diferencia VISA y h-visa de las cepas VAN sensibles (VSSA). Las cepas VISA presentan CIMs a Vancomicina de 4-8 µg/ml (Intermedio) y no son detectadas por el método de difusión con discos de VAN (30 µg). En algunas cepas se observan características fenotípicas atípicas como crecimiento lento, características morfológicas heterogéneas (como las que presentaba esta cepa) o coagulasa débil. Posiblemente a ésto se deba la menor concordancia observada en la identificación con respecto a la ultima cepa de S. aureus enviada en la Encuesta 36 del año 2007 (93,2% vs 98,4%). El mecanismo de resistencia VISA se encuentra asociado a una alteración en la regulación del metabolismo de la pared celular que genera cambios evidenciados primariamente por el engrosamiento de la misma a dos veces su tamaño. El mecanismo de resistencia propuesto es el de trampas de afinidad donde la vancomicina se uniría a falsos sitios blanco en la pared celular en lugar de unirse a sus sitios blanco reales (terminal D-ala-Dala del monómero precursor). A partir del 2009 se eliminaron en la CLSI los puntos de corte para las pruebas de difusión para vancomicina y Staphylococcus spp. En esa normativa se menciona que: 1- El método de difusión no es apropiado para evaluar la sensibilidad a VAN. 2- Se debería realizar la CIM a VAN a todos los aislamientos de estafilococos. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 3

4 3- El disco de VAN detecta los VRSA. Estos presentan ausencia de zona inhibición con zona de VAN = 6 mm. 4- Se desconoce la habilidad de los puntos de corte de difusión de teicoplanina (TEI) para diferenciar estafilococos I (16 µg/ml), R (>32 µg/ml), y S a teicoplanina (< 8 µg/ml). Desde M100-S S Difusión VAN CIM VAN S. aureus y Staphylococcus coagulasa neg. Sensible Intermedio Resistente S. aureus < 2 µg/ml 4-8 > 16 µg/ml Staphylococcus coagulasa negativa. < 4 µg/ml 8-16 > 32 µg/ml Para la detección de aislamientos VISA se pueden utilizar los siguientes métodos: 1) CIM en medio líquido: MH Caldo, con 24 hs de incubación. 2) CIM en medio sólido: agar MH, con 24 hs. de incubación. 3) Métodos de gradiente E-test (bio-merieux) o MICE (Oxoid): Agar MH, 0.5 Mc. Farland, 24 hs. de incubación (considerar la microcolonias en la lectura) 4) Métodos automatizados. En el siguiente cuadro se describen los distintos fenotipos de sensibilidad a vancomicina en S. aureus y su comportamiento frente a los distintos métodos de detección en el laboratorio: PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 4

5 Fenotipo de VANCOMICINA Nomenclatura CIM VAN en μg/ml Detección de Laboratorio Indistinguibles Sensible Hetero- resistente VSSA h-visa < 2 S 1-2 No se pueden diferenciar por disco ni CIM Sólo detectado x CIM Intermedio VISA 4-8 NO Disco SI CIM Fácil detección Resistente VRSA > 16 R SI Disco SI CIM Recomendamos que frente a cualquier aislamiento de S. aureus con CIM VAN > 4 µg/ml se derive al LNR para su confirmación. Esta cepa poseía una CIM a vancomicina de 4 μg/ml por los métodos de CIM en medio líquido, CIM en medio sólido, tiras de gradiente (Etest y MICE) y automatizado (Vitek2), correspondiente a la categoría de Intermedio (VISA). Decidimos, en esta oportunidad, no otorgarle puntaje a esta droga y sólo analizar los resultados con el fin de determinar el desempeño de los laboratorios en la detección de este mecanismo emergente y conocer cuantos laboratorios cuentan con los recursos necesarios para realizar CIM de VAN. Un total de 274 laboratorios informaron la CIM a VAN lo cual representó un 75 % de las respuestas recibidas para esta cepa. En la Tabla 1.d y Gráfico 1.a, se muestra la distribución de los valores de CIM obtenidos por los labs. participantes. Tabla 1.d y Gráfico 1.a. Cepa 1: Distribución de valores de CIMs a VAN informadas por 274 laboratorios participantes. Nº Laboratorios con CIM a VAN (%) CIM (µg/ml) Concordancia esencial (CIM ± 1 dilución) 1 1, SI NO (1,8) (0,4) (33,2) (14,6) (50) (0) (0) (97,8) (2,2) Resultado correcto PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 5

6 Nº Laboratorios (%) % 33,2 % 14,6% 1,8% 0,4% 0,5 1 1, CIM (μg/ml) Cuando se comparan los resultados de la CIM de VAN de los laboratorios participantes con respecto al resultado del LNR la concordancia esencial (CIM del LNR +/- una dilución) fue excelente, 97,8%, tal como queda evidenciado en el Gráfico 1.b. En 133 casos recibimos información sobre la metodología empleada para la determinación de la CIM. Debido al bajo número de aislamientos probados con metodologías distintas al método de gradiente (Etest-MICE), no pudimos analizar si hubo diferencias en las CIMs informadas por los distintos métodos. La metodología mas empleada fue la de tira de gradiente de antibiótico con el 82% de las respuestas. Tablas 1.e y 1.f Gráfico 1.b. Cepa 1: Concordancia esencial en la CIM de VAN obtenida en 274 labs participantes Nº Laboratorios (%) ,8% 0,4% 33,2% 14,6% 1 1, DIL - 1,5 DIL -1 DIL -0,5DIL CIM LNR +0,5 DIL + 1 DIL +2DIL 50% CIM (μg/ml) Concordancia Esencial: 97,8% PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 6

7 Tabla 1.e. Cepa 1: Metodologías empleadas por 133 labs participantes para determinar CIM de VAN METODOLOGIA Nº (%) E test/ MICE 109 (82) Vitek2C 15 (11,3) Phoenix 1(0,7) Otros 8 (6) Tabla 1.f. Cepa 1: Concordancia en la CIM de VAN obtenida con método de gradiente (109 laboratorios) METODOLOGIA -1dil -0,5 dil CIM LNR Tiras de gradiente n: (20,2%) 39 (35,8%) 48(44,0%) Once laboratorios probaron el disco de vancomicina, nueve de los cuales utilizaron este dato para la interpretación de la sensibilidad a vancomicina. Recordar que sólo se puede seguir probando el disco de VAN para la búsqueda de VRSA, pero no se debe informar a menos que se CONFIRME este mecanismo en un LNR. En esta Encuesta tuvimos una mejora en la cantidad de respuestas para el campo Mecanismo de resistencia sugerido incorporado en la planilla de resultados a partir de la Encuesta 43. Respondieron 339/366 laboratorios (93%): el 38% de los laboratorios informaron correctamente la opción VISA indicada en el desplegable (n: 140), 188 laboratorios indicaron METICILINO RESISTENCIA, mecanismo que poseía la cepa, pero no era el mecanismo que ofrecía mayor desafío.40 laboratorios eligieron esta ultima opción, probablemente debido a que la CIM observada no estaba dentro de la categoría intermedio. Cabe destacar que aquellos laboratorios que informaron una CIM de 2 μg/ml alertaron correctamente sobre la posible falla de tratamiento de este aislamiento con vancomicina o sobre la necesidad de monitorear la CIM en muestras posteriores del paciente o hacer el seguimiento clínico del paciente por la posible falla de tratamiento. Tres laboratorios respondieron otro mecanismo, 8 informaron NO APLICA y 27 no respondieron este ítem, por lo que les recordamos para la próxima encuesta completar este campo y en el caso de que el aislamiento no presente mecanismo de resistencia, marcar la opción No Aplica. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 7

8 Es realmente importante que todos los labs. incorporen de rutina la CIM a vancomicina para categorizar el nivel de resistencia ya que recientemente, se ha demostrado que cepas con CIM VAN > 2ug/ml responden pobremente al tratamiento con vancomicina a dosis de 3-4 g/día, por lo que se hace imprescindible evaluar la sensibilidad por CIM en pacientes donde esta droga vaya a ser utilizada como terapia. Estudios realizados en nuestro laboratorio y otros grupos de trabajo, han mostrado diferencias en los valores de CIM de acuerdo a la metodología empleada. Las tiras de gradiente Etest y MICE por lo general suelen dar CIMS entre 0,5 y 1 log superiores al método de referencia. Por el contrario el sistema automatizado Vitek2 suele dar CIMs iguales o 1 log menores a las de referencia. Ver Anexo 1 Mas allá de las diferencias obtenidas en los valores absolutos de las CIMs a VAN, hay que tener en cuenta que las nuevas guías del IDSA para tratamiento de las infecciones por SAMR publicadas por Liu y col en febrero 2011 (ver paper adjunto: CID :1-38. Clinical Practice Guidelines by the Infectiuos Diseases Society of America for the Treatment of Methicillin- Resistant Stahylococcus aureus infections in Adults and Children), recomiendan que el tratamiento empírico de las infecciones complicadas por SAMR debe seguir siendo vancomicina (siempre que la CIM a VAN: 2 μg/ml) y el uso o no de terapias alternativas dependerá principalmente de la evolución individual de cada paciente. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 8

9 Anexo1 En el LNR la CIM de VAN se evaluó por distintas metodologías en una muestra de 50 aislamientos de S. aureus meticilino resistentes: 30 cepas de referencia representantes de distintos clones internacionales y 20 de origen clínico derivadas al INEI para evaluación de sensibilidad a VAN. La CIM por dilución en agar (DA) se usó como método de referencia (CLSI). La distribución de CIMs a VAN en µg/ml (n) de las cepas fue: 0.5 (13), 1 (31), 2 (3), 4 (3). Se realizó la CIM a VAN por Etest, MICE y Vitek2. Graficos1 y 2.Tabla 1. La concordancia en la interpretación (CI) y la concordancia esencial (CE) vs agar dilución para los tres métodos fueron: CI: 98% E-test/MICE, 100% Vitek2 CE: 96 % MICE, 100% E-test/ Vitek2. Gráfico 1: Evaluación CIM VAN en S. aureus. Desplazamiento CIM Etest/MICE/VITEK 2C vs dilución en agar. N Agar dilución Vitek2 e-test Etest MICE E 5 0 0,5 0,75 1 1, CIM (µg/ml) PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 9

10 Gráfico 2 - Tabla 1: Evaluación CIM VAN en S. aureus. Concordancia esencial Etest/MICE/VITEK 2C vs dilución en agar. N CE: CIM+/- 1 dil VITEK ETEST MICE ,5 CIM 0,5 1 1, CIM VAN AD (n:50) -1log - ½ log Igual valor + ½ log +1log >1log E-test n (%) 1 (2%) MICE n (%) 2 (4%) VITEK 2C n (%) 16 (32%) 1 (2 %) 1 (2%) 17 (34%) 9 (18%) 0 30 (60%) 20 (40%) 10 (20%) 11 (22%) 26 (52%) 0 4 (8%) 0 2 (4%) 0 log Poster27630: Evaluación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) a Vancomicina (VAN) por Dilución en Agar, Vitek2, Etest y MICE en S. aureus. P. Ceriana (1), P. Gagetti (1), R. Soloaga (2), M. Rodriguez (1), A. Corso (1) 1) Servicio Antimicrobianos. Inst. Nac. de Enfermedades Infecciosas INEI- Dr. C. Malbrán;(2) Htal. Naval de Bs. As. XII Congreso Argentino de Microbiología de octubre de 2010.CABA. Argentina PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 10

11 Cepa Nº 2: Enterobacter cloacae Se trataba de un aislamiento de hemocultivo de un paciente con diagnóstico de bacteriemia. E. cloacae es un germen relativamente común en el ambiente hospitalario, cada vez más involucrado en brotes y con un perfil de resistencia preocupante. La identificación bacteriana fue realizada por 366 laboratorios. El 87,7% de los laboratorios (321/366) informaron correctamente género y especie, el 3 % (11/366) informaron género correcto y omitieron especie y el 4,1% (15/366) identificaron correctamente el género, pero reportaron especie incorrecta. Diecinueve laboratorios (5,2%) informaron género incorrecto (Tabla 2.a). En la Tabla 2.b se detallan los errores en la identificación bacteriana. Tabla 2.a. Cepa 2: Concordancia en la Identificación bioquímica. Concordancia Porcentaje Nº (%) Género y especie correctos ,7 Género correcto 11 3 Género correcto y especie incorrecta 15 4,1 Género incorrecto 19 5,2 Tabla 2.b. Cepa 2: Errores en la Identificación Genero y especie Nº laboratorios E. aerogenes 14 K. pneumoniae 12 Enterobacter sp. 11 Sin Datos 3 Empedobacter cloacae 2 C. freundii 2 Enterococcus sp 2 E. georgiae 1 Klebsiella sp. 1 Este germen presentaba mecanismos de resistencia a cefalosporinas y carbapenemes: una ß-lactamasa de espectro extendido (BLEE) del tipo PER (fuerte ceftacidimasa) y una carbapenemasa del tipo metalo-beta-lactamasa (MBL), de la familia IMP, ubicada en el grupo 3b de la clasificación de Karen Bush. Cabe recordar que estas MBLs presentan actividad enzimática sobre carbapenemes (junto con carboxi-, ureido-penicilinas y cefalosporinas de espectro reducido y extendido). Solo el monobactam aztreonam (AZT) evade la acción hidrolítica de estas carbapenemasas, PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 11

12 siempre que se encuentre como mecanismo único. En presencia de BLEE su suma al perfil de MBL la resistencia a AZT. De manera distintiva, las MBLs requieren de metales divalentes (Zn 2+ ) en su sitio activo, indispensable para su capacidad hidrolítica. Es por ello que en presencia de EDTA u otros quelantes de metales divalentes, como la combinación de EDTA+SMA (ácido etilendiaminotetraacético/mercaptoacetato de sodio, concentración final 750 μg/ 1900 μg), estas MBLs presentan una característica inhibición. Cepa 2 - Enterobacter cloacae Detección de carbapenemasas del tipo MBL (grupo 3b de Karen Bush.) Con esta cepa se pretendía evaluar la capacidad de los laboratorios para detectar carbapenemasas de trascendencia epidemiológica, como las MBLs. Este punto es de suma importancia, porque la presencia de carbapenemasas involucradas en procesos infecciosos severos, determina alta probabilidad de falla de tratamiento a aquellas drogas incluidas en el espectro de sustratos de estas enzimas. Mas aún, estas carbapenemasas tienen una gran capacidad de diseminación, por lo que su hallazgo, debe acompañarse con los mayores esfuerzos del equipo de salud a fin de contener una posible diseminación del microorganismo o de la carbapenemasa. La CIM a imipenem y meropenem de este aislamiento por distintas metodologías se presenta en la Tabla 2.c PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 12

13 Tabla 2.c. Cepa 2: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas metologías A.dilución (μg/ml) Microdilución (μg/ml) Vitek2C (μg/ml) Phoenix (μg/ml) Etest (μg/ml) MICE (μg/ml) Rango LNR(mm) MEROPENEM ,5 ND IMIPENEM 4/8 4 8 />16 4 1, Sospecha carbapenemasa( según Anexo 2) SI SI SI SI SI SI SI El aislamiento presentaba además resistencia a ertapenem (CIM= 2µg/ml), gentamicina (CIM 16µg/ml), cloranfenicol ( 128µg/ml) trimetoprima /sulfametoxazol (CIM= 32µg/ml), fosfomicina i.v, a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactames por la portación de BLEE (ver cuadro) y sensibilidad a colistín (CIM 0.5µg/ml) y tigecilina (CIM = 0,5µg/ml). Este aislamiento presentaba además dos mecanismos plasmídicos de resistencia a fluorquinolonas (qnr b+ y aac (6 )-Ib-cr+) con CIM a ciprofloxacina de 2 µg/ml (halo=18 mm) y a ácido nalidíxico de 16 µg/ml (halo=18 mm). En el siguiente cuadro, se detallan las CIMs a distintos ß-lactámicos determinada por agar dilución: CIM (µg/ml) CTX CTC CAZ CAC AZT FEP FEC PIP TAZ 128 (R) 128 (R) 1024 (R) 1024 (R) 1024 (R) 64 (R) 32 (R) 64 (R) 64 (R) CTX: cefotaxima, CTC: cefotaxima/clavulánico, CAZ: ceftacidima, CAC: ceftacidima/clavulánico, AZT: aztreonam, FEP: cefepime, FEC: cefepime/clavulánico, PIP: piperacilina, TAZ: piperacilina/tazobactam. La resistencia a carbapenemes y la sospecha de presencia de una carbapenemesa se podría haber intuido por la zona de inhibición de imipenem 22 mm (Rango de referencia del LNR para imipenem: mm). Debido a la presencia de carbapenemasa se consideró como categoría de interpretación correcta, resistente. A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de sensibilidad de esta cepa. Se detectaron 3,5% de errores en la interpretación (n=83), de los cuales 27 fueron errores menores (32,5%) y 56 muy graves (67,5%). La mayoría de los errores menores estuvieron asociados a meropenem (16/27) y los muy graves se distribuyeron principalmente entre imipenem (22 errores), meropenem (19 errores) y ertapenem (10 errores). Prácticamente el total de laboratorios interpretaron como resistente cefotaxima y ceftacidima (99,4% y 99,2%, respectivamente). (Tabla 2.d.) Para amicacina no hubo errores de interpretación ya que el rango de referencia fue mm correspondiéndose con la categoría de R, I o S del CLSI. De los 356 laboratorios que reportaron zonas de inhibición para este antibiótico, 327 (92,6%) informaron este PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 13

14 antimicrobiano dentro del rango de referencia. 252 laboratorios (70,8%) lo interpretaron como S, 56 (15,7%) I y 48 (13,5%) R. La cepa presentó un valor de CIM de 16 ug/ml cuando se ensayó por los métodos de macrodilución y microdilución en caldo, correspondiéndose con la categoría sensible del CLSI (la CIM borderline que presenta este aminoglucósido sería responsable del comportamiento descripto en el método de difusión). Tabla 2.d. Cepa 2: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los labs. del PCC-NAC y el LNR. Nº S I R Respuestas Nº % Nº % Nº % Cefotaxima , ,4 Ceftacidima , ,2 Ertapenem ,2 3 1, ,5 Imipenem ,2 8 2, ,5 Meropenem ,4 16 4, ,1 Amicacina , , ,5 S: sensible, I: intermedio, R: resistente Resultado correcto Errores menores Errores muy graves Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos establecidos por el LNR con una concordancia entre 87 y 97% para meropenem, imipenem, amicacina, cefotaxima y ceftacidima y de 76,5% para ertapenem.(tabla 2.e) Tabla 2.e. Cepa 2: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y el rango calculado por el LNR. Nº Dentro del rango Fuera del rango Respuestas Nº % Nº % Cefotaxima ,6 19 5,4 Ceftacidima ,4 9 2,6 Ertapenem , ,5 Imipenem , ,0 Meropenem , ,9 Amicacina ,6 25 7,1 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 14

15 Basados en la capacidad de las MBLs de ser inhibidas por quelantes de zinc, el empleo de discos de EDTA+SMA entre ambos carbapenemes (ver Foto), mostró la típica sinergia o huevo. El hallazgo de estas sinergias con EDTA, convierte a esta técnica en un excelente método fenotípico confirmatorio para detectar aislamientos portadores de carbapenemasa del tipo MBL sobre todo en aquellos aislamientos (como la cepa enviada) que presentan halos de inhibición o CIMs dentro de la categoría intermedio o sensible del CLSI. La sinergia con EDTA es útil no solo en gérmenes donde el método de difusión se encuentra estandarizado sino también en aquellos grupos bacterianos de rápido crecimiento donde el antibiograma no esta recomendado por el CLSI (ej. P. putida). Con respecto al item Mecanismo de resistencia sugerido fue respondido por 348/366 laboratorios (95,1%). Se consideraron como respuestas correctas el informe de carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL) + BLEE, carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL) y carbapenemasa. 315 laboratorios (86,1%) informaron correctamente alguna de estas opciones. La presencia de MBL también se confirmó con el método de discos combinados: Meropenem: 20 mm Meropenem + APB (600ug/disco): 20 mm Delta: 0 mm Interpretación: Negativo. Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 21 mm Delta: +1 mm Interpretación: Negativo Meropenem + EDTA (75ug/disco): 26 mm Delta: +6 mm Interpretación: Positivo Tabla 2.e. Cepa 2: Mecanismo de resistencia sugerido. Mecanismo de referencia inferido Nº Respuestas % CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE 42 11,5 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) ,5 CARBAPENEMASA 15 4,1 BLEE 8 2,2 BLEE+ IMPERMEABILIDAD 6 1,6 HIPERPRODUCCION/DERREPRESION DE AMPC 6 1,6 CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras) 4 1,1 AMPC+ IMPERMEABILIDAD 4 1,1 BETALACTAMASA (Haemophilus spp./ Enterococcus spp. / Moraxella spp.) 3 0,8 NO APLICA 2 0,5 SIN DATO 18 4,9 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 15

16 Pérdida de MBL: De acuerdo a los resultados hemos identificado que siete laboratorios han informado la cepa 2 con BLEE + pero con ausencia de MBL. En estos laboratorios el perfil de sensibilidad era idéntico al que presentaba la cepa 2 para todas las drogas excepto los carbapenemes. Esto pudo haberse debido a la pérdida del plásmido de MBL por los sucesivos repiques que podría haber recibido la cepa después de la apertura. La ausencia de la MBL se puede intuir al observar el tamaño de la zona de inhibición de los carbapenemes para estos siete laboratorios (imipenem, IMP= mm y meropenem, MER= mm). Estos laboratorios no fueron tenidos en cuenta cuando se evaluaron los rangos y la interpretación de ertapenem, imipenem y meropenem. Tampoco se evalúo el mecanismo de resistencia sugerido. Nota: En el informe individual (enviado en febrero) de aquellos laboratorios en los que se detectó la posible pérdida del plásmido, se eliminó el valor de los halos de carbapenemes con el fin de que el software no lo compute como error. Las evidencias recientes sugieren que el tratamiento óptimo para infecciones causadas por cepas productoras de carbapenemasas (MBL, KPC) resulta en la terapia combinada (Daikos CMI 2011, Qureshi AAC 2012). Debido la multiresistencia asociada a cepas productoras de MBL, tigeciclina, colistina y fosfomicina i.v. resultan los antimicrobianos con mayor actividad in vitro. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 16

17 A continuación se detallan los puntos de corte para las pruebas de sensibilidad por difusión y dilución para estas drogas: COLISTIN: Puntos de corte CIM EUCAST 2012 para Enterobacterias: 2 μg/ml Sensible, 4 μg/ml Resistente TIGECICLINA 1 : Puntos de corte CIM EUCAST 2012 para Enterobacterias: 1 μg/ml Sensible, 2 μg/ml Intermedio, 4 μg/ml Resistente Los puntos de corte del EUCAST para el método de CIM (S <=1.0 µg/ml; R >=4.0 µg/ml) se ajustan más apropiadamente a los parámetros PK/PD de esta droga y por ello actualmente cuentan con una amplia aceptación en la literatura. Puntos de corte de Difusión 2012: S>=21 mm R<=16 mm. Halos intermedios confirmar con CIM FOSFOMICINA IV 1 : Puntos de corte CIM EUCAST 2012 para Enterobacterias: 32 μg/ml Sensible, 64 μg/ml Resistente Puntos de corte de Difusión 2012 (Establecidos a nível Nacional): Discos de 50μg de fosfomicina + 50μg de glucosa-6-fosfato o de 200μg de fosfomicina + 50μg de glucosa-6-fosfato Fosfomicina (50μg) Puntos de Corte S>=15mm R<=12 mm. Confirmar por CIM los halos I Fosfomicina (200μg) Puntos de Corte S>=17mm R<=15 mm. Confirmar por CIM los halos I 1. Pasteran y cols. Tigecycline and intravenous fosfomycin zone breakpoints equivalent to the EUCAST MIC criteria for Enterobacteriaceae. J Infect Dev Ctries : PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 17

18 Anexo 2 Figura 2a. Algoritmo para la búsqueda de carbapenemasas. Actualización 2012 ** * Categorias de acuerdo al CLSI 2012 IMP: imipenem. APB: acido 3 aminofenil boronico. CLOXA: cloxacilina **Para Salmonella utilizar para el tamizaje un valor de imipenem <=24mm Para tribu Proteae (Proteus spp., Morganella morganii y Providencia spp.) utilizar un tamizaje combinando imipenem <=22 mm + meropenem <=27 mm, o bien, imipenem <=22 mm + ertapenem <=21mm Servicio Antimicrobianos, INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbràn. Adaptado de Pasteran F y cols. CMI 2011 y JCM 2011 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 18

19 Cepa Nº3: Plesiomonas shigelloides Se trataba de un aislamiento de P. shigelloides aislada de una herida de miembro inferior. El género Plesiomonas fue clasificado inicialmente como perteneciente a la familia Vibrionaceae, sin embargo los datos filogenéticos recientes indican una divergencia evolutiva entre Plesiomonas y los géneros Vibrio/Photobacterium y Aeromonas. La secuencia de los genes 5S ARNr, 16S ARNr/ADNr y 23S ARNr demuestra una relación filogenética cercana entre el género Plesiomonas y la familia Enterobacteriaceae, especialmente con el género Proteus. El género Plesiomonas está formado por bacilos gram negativos, móviles, anaerobios facultativos con ambos tipos de metabolismo, respiratorio y fermentativo. Produce ácido a partir de d-glucosa sin gas y fermentación anaerogénica de un número limitado de carbohidratos incluyendo m-inositol. Los marcadores fenotípicos más importantes son: oxidasa y catalasa positiva, lisina, ornitina decarboxilasa y arginina dehidrolasa positivas. La mayoría de los aislamientos son sensibles a las concentraciones de 10μg y 150 μg del agente vibriostático O129 (2,4 diamino-6,7-diisopropilpteridina). Las colonias en agar sangre son: no hemolíticas, lisas, grises, convexas y opacas con bordes lisos. Pueden presentar múltiples morfotipos a partir de una única colonia. La identificación bacteriana fue realizada por 353 laboratorios. El 81,6% de los laboratorios (288/353) informó correctamente género y especie, el 4,2 % (15/353) informó género correcto y omitió especie y el 14,2% (50/353) informó género incorrecto (Tabla 3.a). Los participantes que informaron Plesiomonas spp. debieron informar Plesiomonas shigelloides, ya que es la única especie del género. En la Tabla 3.b se detallan los errores en la identificación bacteriana. Tabla 3.a. Cepa 3: Concordancia en la Identificación bioquímica. Concordancia Nº Porcentaje (%) Género y especie correctos ,6 Género correcto 15 4,2 Género correcto y especie incorrecta Género incorrecto 50 14,2 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 19

20 Tabla 3.b. Cepa 3: Errores en la Identificación Género y especie Nº laboratorios E. coli 22 A. hydrophila 4 Aeromonas sp. 3 E. cloacae 2 S. sonnei 2 Pseudomonas sp. 2 H. alvei 2 P. multocida 2 A. veronii 1 C. koseri 1 Citrobacter sp. 1 E. aerogenes 1 E. fergusonii 1 Escherichia sp. 1 E. meningoseptica 1 V. damsela 1 Vibrio sp. 1 S. liquefaciens 1 S. haemolyticus 1 Dentro de las respuestas incorrectas el error mas destacable fue el informe de enterobacterias, lo cual hace pensar que los participantes no realizan la prueba de la citocromo oxidasa en la apertura de la identificación de un bacilo gram negativo fermentador. Aunque el género Plesiomonas ha sido transferido a la familia Enterobacteriaceae basada en la relación filogenética, la confusión con Vibrio y Aeromonas puede ocurrir en virtud de la producción de citocromo oxidasa. Las pruebas diferenciales que separan estos géneros se indican en el Anexo 3. Algunos participantes de la encuesta encontraron que el cultivo de la cepa 3 presentaba en los medios con lactosa, colonias fermentadoras y no fermentadoras, lo cual hacía suponer que el cultivo estaba contaminado. Los cultivos de Plesiomonas en agar MacConkey, xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), CLDE, producen colonias transparentes después de 24h de incubación. Sin embargo, la fermentación tardía de la lactosa por algunas P. shigelloides lleva a la aparición de variantes lactosa positiva, después de una incubación prolongada, lo cual sugeriría una población mixta. Los medios más selectivos como Salmonella-Shigella (SS), agar Levine y agar verde brillante pueden ser inhibitorios para algunos aislamientos de Plesiomonas. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 20

21 Para evaluar los resultados de las pruebas de sensibilidad de esta cepa, se debe utilizar el documento M-45-A2 (2010) Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline (distribuido por el PCC en octubre de 2010). Plesiomonas shigelloides se debe interpretar con la Tabla 2 de este documento y NO con CLSI-M100. Este documento contiene las normativas para la realización e interpretación de las pruebas de difusión y dilución para el Complejo Aeromonas spp y Plesiomonas shigelloides. Recordar que las pruebas de sensibilidad para este microorganismo generalmente se limitan a infecciones extraintestinales. Plesiomonas shigelloides es resistente a penicilinas por producción de penicilinasas. Hay datos conflictivos sobre la resistencia a ampicilina los cuales podrían estar relacionados con el medio de cultivo y el efecto inóculo. En base a esto ultimo, CLSI no recomienda ensayar ampicilina en P. shigelloides. Las drogas que tienen buena actividad son amoxicilina/ac.clavulánico (AMC), cefalosporinas, de 3º y 4º generación, fluorquinolonas y trimetoprima/sulfametoxazol (TMS). Tiene sensibilidad variable a aminoglucósidos y tetraciclinas. Las drogas de elección para el tratamiento de infecciones extraintestinales serían cefalosporinas de 3º y 4º generación. En la literatura se describieron casos de sepsis y meningoencefalitis tratadas con éxito con carbapenemes. El aislamiento enviado en la presente encuesta presentó sensibilidad a amoxicilina/ac. clavulánico (CIM = 2 μg/ml), cefotaxima (CIM 1 μg/ml), ciprofloxacina (CIM 0.25 μg/ml), gentamicina (CIM = 2 μg/ml) y trimetoprima/sulfametoxazol (CIM 2 μg/ml). A nivel general no se observaron dificultades en la interpretación de las pruebas de sensibilidad de esta cepa excepto para gentamicina. El rango de referencia para gentamicina fue mm correspondiéndose con la categoría de I o S del CLSI. 283 (81.8%) laboratorios informaron este antimicrobiano dentro del rango de referencia y 271 (79.5%) lo interpretaron como S, 36 (10.6 %) laboratorios lo interpretaron como I y 34 (12.5%) como R. La cepa presentó un valor de CIM de 2 ug/ml correspondiéndose con la categoría sensible del CLSI. Hubo un 3,5% de errores en la interpretación (n=60), de los cuales 38 fueron errores menores (63,3%) y 22 graves (36,7%). La mayoría de los errores menores estuvieron asociados a gentamicina (34/38) y los graves se distribuyeron entre AMC (12 errores), cefotaxima (5 errores) y TMS (5 errores). PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 21

22 Tabla 3.c. Cepa 3: Concordancia en la interpretación de las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y el LNR S I R Nº Respuestas Nº % Nº % Nº % AMC ,5 3 0,9 12 3,8 CEFOTAXIMA , ,6 CIPROFLOXACINA ,7 1 0,3 0 0,0 GENTAMICINA , , ,5 TMS , ,5 Resultado correcto Las zonas de inhibición informadas se encontraron, en su mayoría, dentro de los rangos establecidos por el Laboratorio de Referencia con una concordancia entre 80 y 92% para AMC, gentamicina, ciprofloxacina y trimetoprima/sulfametoxazol y de 77% para cefotaxima. Para cefotaxima se obtuvo un 23 % de respuestas fuera del rango de referencia probablemente debido a las distorsiones que pueden generarse en la lectura de zonas de inhibición superiores a 35 mm. Tabla 3.d. Cepa 3: Concordancia en las zonas de inhibición entre los labs del PCC-NAC y el rango calculado por el LNR Nº Respuestas Dentro del rango Fuera del rango Nº % Nº % AMC , ,4 CEFOTAXIMA , ,2 CIPROFLOXACINA , ,9 GENTAMICINA , ,2 TMS ,2 27 7,8 Esta cepa no presentaba ningún mecanismo de resistencia relevante. 250 laboratorios respondieron el campo de mecanismo sugerido. El 97,2% de los laboratorios respondió correctamente No aplica, 2 laboratorios (0,8%) indicaron como mecanismo sugerido Betalactamasa (Haemophilus spp/enterococcus spp/ Moraxella spp) posiblemente porque evidenciaron la presencia de la penicilinasa descrita en P. shigelloides, 5 laboratorios (2 %) informaron otros mecanismos. 94 laboratorios no respondieron este item. Posiblemente al no observar mecanismo de resistencia, muchos laboratorios decidieron no responder en lugar de elegir la opción No aplica como se había mencionado en el instructivo para completar la planilla. Les recordamos para la próxima encuesta completar este ítem y en el caso de que el aislamiento no presente mecanismo de resistencia, marcar la opción No Aplica. Dentro del rango PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 22

23 Anexo 3 Características diferenciales de Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas Características Crecimiento en caldo ó agar nutritivo con: 0% NaCl 6% NaCl Sensibilidad a O g 150 g V. cholerae V. mimicus + + S b S b Otros Vibrio spp. - + S / R S Aeromonas Plesiomonas + - R R + - S S Sensibilidad a ampicilina (10 g) S / R S c R f R Test de la cuerda + + c - - Gas de glucosa - - d + / - - Fermentación de: m-inositol L-Arabinosa e - / / Lisina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Ornitina decarboxilasa Desarrollo en agar TCBS colonias amarilla o verdes colonias amarilla o verdes no desarrolla no desarrolla +, > 90% positivo; -. >90% negativo + / -, variable > 50% positivo; - / +, variable, < 50% negativo. S sensible R resistente b Muy inusualmente aparecen algunos aislamientos resistentes de V. cholerae serogrupo O1 pero todos los aislamientos del serogrupo O139 son resistentes. c Excepto algunas cepas de Vibrio parahaemolyticus. d Excepto V. furnissii. e Excepto V. cincinnatiensis y algunas cepas de V. metschnikovii. f Excepto Aeromonas trota. PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 23

24 Pregunta Nº20. Pseudomonas aeruginosa e imipenem: El alto nivel de resistencia a IMIPENEM (ausencia de zona de inhibición en el método de difusión o CIM >=64 ug/ml) en Pseudomonas aeruginosa es indicativo de la presencia de: a) mecanismos no enzimáticos de resistencia como eflujo y/o deficit de oprd b) carbapenemasas del tipo KPC y/o MBL. c) BLEE + impermeabilidad. Recibimos 361 respuestas. 319 (88,4%) laboratorios informaron la opción correcta: b) carbapenemasas del tipo KPC y/o MBL, 31 (8,6%) optaron por la Rta a y 11 (3%) laboratorios respondieron c. Nueve laboratorios no enviaron respuesta a la pregunta (88,4%) Nº de Laboratorios (8,6%) 11 (3%) 9 B A C S/D Rta S/D: sin dato El alto nivel de resistencia al imipenem (ausencia de zona de inhibición en el método de difusión o CIM >=64 ug/ml) es indicativo de la presencia de carbapenemasas del tipo KPC y/o MBL. Este alto nivel de resistencia al imipenem logra distinto valor predictivo positivo dependiendo de la naturaleza de la carbapenemesa: 100% para KPC y 85% para las MBLs. Es decir, KPC en P. aeruginosa siempre cursa con alto nivel de resistencia al imipenem, mientras que para las MBLs, un 15% de las cepas pueden presentar zona de inhibición para este carbapenem. Los mecanismos de resistencia no enzimáticos como déficit de oprd y/o eflujo, casi sin excepciones, no son capaces de alcanzar el alto nivel de resistencia a imipenem. Ver BOLETIN INFORMATIVO Nro. 3- OCTUBRE 2011.COMENTARIOS ENCUESTA Nº 42 PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán 24