11 Número de publicación: Int. Cl.: 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 47/48 (06.01) A61K 39/38 (06.01) A61P /34 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Conjugados de hapteno-transportador para usar en terapia del abuso de drogas. Prioridad: US US Titular/es: Xenova Research Limited 97 Buckingham Avenue Slough, Berkshire SL1 4NL, GB Fecha de publicación de la mención BOPI: Fecha de la publicación del folleto de la patente: Inventor/es: Swain, Philip A.; Schad, Victoria C.; Greenstein, Julia L.; Exley, Mark A.; Fox, Barbara S.; Powers, Stephen P.; Gefter, Malcolm L. y Briner, Thomas J. 74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Conjugados de hapteno-transportador para usar en terapia del abuso de drogas. Área de la invención La presente invención se refiere al tratamiento del abuso de drogas. Más específicamente, la presente invención puede ser utilizada para el tratamiento del abuso de drogas utilizando conjugados droga-hapteno transportadores que inducen respuestas de anticuerpos y/o utilizando los anticuerpos contra los conjugados droga-hapteno transportadores. Toda la materia que se refiere a la cocaína se indica sólo para fines comparativos mientras que el objeto de la invención está definido en las reivindicaciones. Antecedentes de la invención 6 La frecuencia del uso y abuso de drogas en el mundo, especialmente en los Estados Unidos, ha alcanzado niveles epidémicos. Existen multitud de drogas, tanto legales como ilegales, cuyo abuso se ha convertido en un problema público serio que afecta a todos los estratos de la sociedad con unas consecuencias médicas y sociales obvias. Algunos usuarios viven en una población con un riesgo extremadamente alto asociado a la pobreza y a las actividades ilegales. Otros usuarios, que pueden definirse a sí mismos como usuarios recreacionales, también se encuentran en riesgo debido a (a) propiedades de la(s) droga(s) que las hacen adictivas, (b) la predisposición del usuario a convertirse en usuario de gran cantidad o (c) una combinación de factores que incluyen circunstancias personales, apuros económicos, entorno y accesibilidad. El tratamiento adecuado del abuso de drogas, incluyendo el abuso de varias drogas, requiere de programas de intervención innovativos y creativos. Una droga especialmente problemática es la cocaína, un alcaloide derivado de las hojas de la planta de coca (Erythroxylon coca). Únicamente en los Estados Unidos, existen actualmente más de millones de usuarios regulares de cocaína de los cuales al menos están clasificados como adictos severos (Miller et al. (1989) N.Y. State J. Med. pp ; y Carroll et al. (1994) Pharm. News. 1:11-16). Dentro de esta población, un número significativo de adictos está buscando terapia activamente. Por ejemplo, en 1990, personas buscaron tratamiento médico para la adicción a la cocaína y este número se encuentra en aumento. En ese momento, se estimó que admisiones por año en urgencias implicaban la utilización de cocaína. Los efectos cumulativos del crimen violento asociado a la cocaína, la pérdida de productividad individual, y la muerte, constituyen un problema internacional. La ausencia de terapias eficaces para el tratamiento de la adicción a la cocaína, sugiere de manera firme que se deben desarrollar nuevas aproximaciones. Otros factores adicionales que contribuyen a la falta de éxito de los programas de tratamiento es la variación con el tiempo de los patrones del abuso de la cocaína. En un artículo titulado 1994 Chemical Approaches to the Treatment of Cocaine Abuse (Carroll et al. (1994) Pharm. News, Vol. 1, No. 2), Carroll et al. describen que desde mediados de los años 80, la administración por vía intravenosa y nasal de la sal clorhidrato (coke, snow, blow) y el fumar base libre de cocaína (crack) se han convertido en rutas comunes de administración, produciendo euforia y estimulación psicomotora que dura - minutos. Al contrario que otras drogas de abuso, la cocaína puede ser tomada en excesos que duren varias horas. Este comportamiento lleva a la adicción, y en algunos casos, a consecuencias tóxicas (Carroll et al., Pharma News, supra). Solamente existen tratamientos muy limitados para las drogas de abuso y no existe ningún tratamiento eficaz a largo plazo para la adicción a la cocaína. Los tratamientos incluyen, pero no están limitados a, asesoramiento asociado con la administración de drogas que actúan como antagonistas de los receptores de opiáceos o drogas que tratan de reducir el ansia asociada con la drogadicción. Una aproximación al tratamiento es la desintoxicación. Incluso remisiones temporales con mejoras físicas, sociales y psicológicas concomitantes son preferibles a la continuación de la aceleración progresiva del abuso y sus consecuencias médicas e interpersonales adversas (Wilson et al. en Harrison s Principle of Internal Medicine Vol ª Ed., McGraw-Hill (1991) pp. 27-8). Más específicamente, las aproximaciones farmacológicas al tratamiento del abuso de cocaína implican generalmente la utilización de drogas antidepresivas, como la desipramina o fluoxetina, que pueden ayudar en el manejo de los aspectos psicológicos del abandono pero que, en general, no afectan directamente a la fisiología de la cocaína. Aún más, su efectividad varía mucho (Brooke et al. (1992) Drug Alcohol Depend. 31:37-43). En algunos estudios, la desipramina reduce la administración propia (Tella (1994) College on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts; Mello et al. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther. 4: ; y Kleven et al. (1990) Behavl. Pharmacol. 1:36-373), pero la proporción de abstinencia después del tratamiento no supera el 70% (Kosten (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 8). También se han utilizado drogas que potencian la transmisión dopaminérgica, como la bromocriptina, pero los beneficios de estas drogas están limitados en parte por su toxicidad (Taylor et al. (1990) West. J. Med. 2:73-77). Se han utilizado también drogas nuevas con el fin de reemplazar a la metadona en la adicción opiácea, como la buprenorfina, basadas en la interferencia cruzada con el sistema dopaminérgico, sin embargo sólo se encuentra disponible una información limitada de estudios clínicos (Fudula et al. (1991) NIDA Research Monograph, :87-88). Se ha descrito que la buprenorfina disminuye la administración propia de cocaína (Carrol et al. (1991) Psycopharmacology 6: ; Mello et al. (1989) Science 2:89-862; y Mello et al. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther. 4: ); sin embargo, la proporción de abstinencia a la cocaína después del tratamiento no supera generalmente el % (Gastfried et al. (1994) College on Problems of Drug Dependence Meeting Abstracts; y Schottenfeld et al. (1993) Problems on Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 311). 2

3 6 Las terapias utilizadas actualmente para tratar a los adictos a la cocaína presentan al menos cuatro limitaciones principales que dan lugar a una alta proporción de recidivismo. Primera, y quizá la más importante, los eventos neuroquímicos que contribuyen al abuso y adicción a la cocaína son complejos (Carroll et al. (1994) supra.). Como resultado, las aproximaciones que actúan solamente a nivel neurofarmacológico, como la inhibición del transporte de dopamina, no parecen suficientes para superar la adicción. Segunda, las drogas que se utilizan actualmente en los tratamientos de adicción a la cocaína tienen efectos secundarios significativos en ellas mismas, lo que limita su utilidad. Tercera, el seguimiento de las terapias con drogas entre la población de estos pacientes es problemático. Las terapias actuales pueden requerir de visitas frecuentes al médico y/o administración propia de drogas que curan la adicción de su hábito. Al prevenir muchas de estas drogas la euforia asociada a la cocaína, existe una falta de incentivo importante para tomarlas. (Carroll, et al. (1994) supra.; Kosten et al. (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 132:8; Schottenfeld et al. (1993) Problems of Drug Dependence, NIDA Res. Monogr. 132:311). Cuarta, debido a las químicas complejas implicadas en las terapias farmacológicas, muchas de ellas pueden no ser compatibles con otras terapias actualmente en uso en los ensayos clínicos. Se han sugerido en la literatura aproximaciones y terapias de diagnóstico experimentales aunque todavía no se han llevado a la práctica. Por ejemplo, se ha descrito la vacunación como una aproximación terapéutica para la drogadicción. Bonese et al. han investigado cambios en la administración propia de heroína por un mono rhesus después de ser inmunizado contra la morfina (Bonese et al. (1974) Nature 2:708-7). Bagasra et al. han investigado la vacunación utilizando cocaína-klh para prevenir la adicción (Immunopharmacol. (1992) 23: ). Se inmunizaron ratas con un conjugado cocaína-klh lo que indujo algunos anticuerpos anticocaína. Sin embargo, estos resultados están en disputa (Gallacher (1994) Immunopharm. 27:79-81). Obviamente, si un conjugado tiene que ser eficaz en un régimen terapéutico, debe ser capaz de incitar los anticuerpos que puedan reconocer a la cocaína libre circulante in vivo. Cerny (WO 92/03.163) describe una vacuna y un inmunosuero contra las drogas. La vacuna comprende un hapteno unido a una proteína transportadora con el fin de producir anticuerpos. También se describe la producción de anticuerpos contra las drogas, y la utilización de estos anticuerpos en la desintoxicación de una persona que había tomado la droga. Se ha descrito previamente la administración pasiva de anticuerpos monoclonales para el tratamiento del abuso de drogas (véase, Killian et al. (1978) Pharmacol. Biochem. Behavior 9:347-2; Pentel et al. (1991) Drug Met. Dispositions 19:24-28). En esta aproximación, se administran pasivamente a animales anticuerpos preformados contra drogas seleccionadas. Aunque estos datos demuestran la viabilidad de las aproximaciones inmunológicas en la terapia de adicción, la inmunización pasiva como estrategia terapéutica en los seres humanos a largo plazo presenta numerosos inconvenientes. Primero, si los anticuerpos que van a ser utilizados en la terapia pasiva proceden de fuentes no humanas o son anticuerpos monoclonales, estas preparaciones van a ser reconocidas como proteínas extrañas por el paciente, y puede existir una rápida respuesta inmune contra los anticuerpos extraños. Esta respuesta inmune puede neutralizar el anticuerpo administrado pasivamente, bloqueando su eficacia y reduciendo drásticamente el tiempo de la protección posterior. Además, la readministración del mismo anticuerpo puede resultar problemática, debido a una potencial inducción de una respuesta de hipersensibilidad. Estos problemas pueden solucionarse por la producción de inmunoglobulinas en donantes humanos inmunizados con la vacuna. Esta aproximación se discute con más detalle en los Ejemplos. Segundo, los anticuerpos administrados pasivamente son eliminados rápidamente de la circulación. La vida media de un determinado anticuerpo in vivo se encuentra entre 2, y 23 días, dependiendo del isotipo. De esta manera, cuando los anticuerpos se administran pasivamente, en lugar de incitar inmunización, presentan únicamente eficacia a corto plazo. Otra aproximación inmunológica a la drogadicción ha sido la utilización de un anticuerpo catalítico que es capaz de ayudar en la hidrólisis de la cocaína en el paciente (Landry et al. (1993) Science 9: ). El anticuerpo catalítico se genera por inmunización de un animal experimental con un análogo de estado de transición de la cocaína unido a una proteína transportadora; se selecciona entonces un anticuerpo monoclonal que presenta la actividad catalítica deseada. Aunque esta aproximación es atractiva en teoría, también presenta serios problemas. Los anticuerpos catalíticos deben ser administrados pasivamente por lo que presentan todos los inconvenientes de la terapia pasiva con anticuerpos. La inmunización activa para generar un anticuerpo catalítico no es viable, porque la actividad enzimática no es común entre anticuerpos producidos frente a análogos de estados de transición, y la actividad no parece ser detectable en preparaciones policlonales. Además, la actividad semejante a la esterasa de estos anticuerpos catalíticos y la naturaleza no controlada de la respuesta inmune activa en individuos genéticamente diversos, hacen de ellos moléculas potencialmente tóxicas, particularmente cuando son producidos en un paciente humano. Yugawa et al. (EP A2) sugieren la utilización de un conjugado cocaína-proteína que contenga un derivado de la cocaína para la producción de anticuerpos para la detección de la cocaína o derivados de la cocaína en una muestra de sangre. Las patentes Syva (Patentes de EEUU No , No y No ) describen conjugados para producir anticuerpos contra la cocaína para inmunoensayos. Se describen conjugados con BSA utilizando sales de diazonio derivadas de benzoilecgonina y de cocaína. Los conjugados se preparan utilizando derivados ésteres paraimino de la cocaína y de la norcocaína para conjugar un transportador. Biosite (WO 93/12.111) describe conjugados de cocaína utilizando la posición para de un anillo de fenilo de varios derivados de la cocaína que incrementan la estabilidad frente a hidrólisis al introducir un enlace amida. Las patentes Strahilevitz (Patente de EEUU No ; Patente de EEUU No ; Patente de EEUU No : y Patente de EEUU No ) describen la utilización de conjugados de proteínas con sustancias endógenas y drogas para el tratamiento de enfermedades, para prevenir la dependencia de haptenos psicoactivos, así como para su uso en inmunoensayos, inmunodiálisis e inmunoadsorción. 3

4 Sin embargo, no se ha desarrollado ninguna terapia eficaz para la drogadicción, especialmente, para la adicción a la cocaína. Existe, por lo tanto, una necesidad de desarrollar una aproximación a largo plazo para el tratamiento de la drogadicción, en particular para la adicción a la cocaína, que no dependa totalmente del seguimiento y administración propia del individuo adicto. Compendio de la invención El objeto de la invención aparece definido en las reivindicaciones. La presente invención supera los inconvenientes descritos anteriormente y proporciona métodos para el tratamiento del abuso de drogas. Utilizando composiciones terapéuticas, en particular conjugados hapteno-transportadores, la presente invención induce una respuesta inmune contra las drogas en el adicto en la forma de anticuerpos antidroga, que en una exposición posterior a la droga en un individuo vacunado neutraliza la droga por lo que los efectos farmacológicos esperados disminuyen, si no se eliminan. La presente invención proporciona una terapia para la drogadicción basada en la vacunación de sujetos con un conjugado droga/hapteno-transportador. La presente invención proporciona la utilización de un conjugado terapéutico hapteno-transportador que comprende (a) al menos un hapteno derivado de la nicotina y (b) un transportador que contiene una proteína, cuyo transportador contiene al menos un epítopo de célula T y es seleccionado de: productos bacterianos, subunidades víricas, lectinas, antígeno de la proteína de la malaria, péptidos multi-antigénicos sintéticos y modificaciones, análogos y derivados de éstos, y alergenos proteicos y derivados, fragmentos y análogos de alergenos. siendo dicho conjugado terapéutico hapteno-transportador capaz de incitar anticuerpos antinicotina cuando se utiliza para la vacunación de sujetos, en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de drogadicción en un ser humano. Las composiciones terapéuticas de la invención constan al menos de un hapteno y al menos de un transportador que contenga un epítopo de célula T que cuando se conjuga para formar el conjugado hapteno-transportador es capaz de estimular la producción de anticuerpos antihapteno. El hapteno puede ser una droga o un derivado de una droga. Según la invención como se reivindica, al menos un hapteno deriva de la nicotina. Cuando la composición terapéutica que contiene el conjugado droga/hapteno transportador se administra a un individuo adicto, se inducen anticuerpos específicos antidroga contra la droga. Un régimen de inmunización terapéutica induce y mantiene una titulación de anticuerpos antidroga lo suficientemente alta como para que en cada exposición posterior a la droga durante el periodo de protección que proporciona la terapia, los anticuerpos antidroga neutralicen una cantidad suficiente de droga con el fin de disminuir, si no eliminar, el efecto farmacológico de la droga. Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención aparecerán más aparentes y mejor explicados en relación con los dibujos siguientes, descripción, y reivindicaciones adjuntas. Toda la materia que se refiere a la cocaína se indica sólo para fines ilustrativos. Breve descripción de los dibujos 6 La Figura 1a es una representación esquemática de la fórmula estructural de la cocaína. La Figura 1b es un diagrama que representa sitios de variabilidad cuando se prepara un conjugado de cocaína. Los sitios de variabilidad se asignan arbitrariamente para designar fácilmente el compuesto y los conjugados y no son necesariamente sitios de reacción. La Figura 2a es una representación de un número de posibles ramificaciones, marcadas arbitrariamente, de un conjugado hapteno-transportador identificadas para facilitar la comprensión de compuestos apropiados y conjugados utilizados en la práctica de la presente invención. La Figura 2b es una representación de un número de posibles ramificaciones, marcadas arbitrariamente, de un conjugado hapteno-transportador identificadas para facilitar la comprensión de compuestos apropiados y conjugados utilizados en la práctica de la presente invención, donde Q es un transportador modificado que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador de proteína modificado. La Figura 3a es una representación de 6 conjugados de cocaína (PS-2, PS-3, PS-4, PS-, PS-6, y PS-9) de la presente invención, donde Q es un transportador que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador de proteína o un transportador modificado que contiene un epítopo de célula T, como por ejemplo un transportador de proteína modificado. La Figura 3b es una representación de ramificaciones en los sitios de variabilidad fuera del anillo de tropano de la cocaína de los conjugados de cocaína e intermediarios. La Figura 4 es una representación de las ramificaciones en los sitios de variabilidad fuera del anillo de tropano en la Figura 1b de cuatro compuestos útiles en la preparación de conjugados. 4

5 La Figura es una representación de las estructuras de cinco reactivos útiles en la práctica de la presente invención. La Figura 6 es una representación de las estructuras de cuatro drogas de abuso alternativas apropiadas para conjugación y administración. La Figura 7 es un diagrama esquemático que representa dos posibles reacciones de conjugación para la preparación de un único conjugado de cocaína (PS-). La Figura 8 es una representación de las estructuras de norcocaína succinilada y norcocaína succinilada preactivada. La Figura 9a es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado de cocaína (PS-,1/,6 + CFA i.p.) de la presente invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante unión in vitro del conjugado HEL apropiado, preparado utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones recibieron 2 inyecciones de g por inyección. Las curvas representan la respuesta de ratones individuales por grupo. La Figura 9b es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado de cocaína (PS-, Alumbre i.p.) de la presente invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante unión in vitro del conjugado HEL apropiado, preparado utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones recibieron 2 inyecciones de g por inyección. Las curvas representan la respuesta de ratones individuales por grupo. La Figura 9c es un gráfico que muestra la respuesta de anticuerpo IgG en ratones inmunizados con el conjugado de cocaína (PS-9,2 + CFA i.p.) de la presente invención. La respuesta de los anticuerpos se detecta mediante unión in vitro del conjugado HEL apropiado, preparado utilizando HEL en lugar de BSA como transportador. Los ratones recibieron 2 inyecciones de g por inyección. Las curvas representan la respuesta de ratones individuales por grupo. La Figura a es un gráfico que demuestra que la unión del antisuero al conjugado cocaína-proteína puede equilibrarse utilizando cocaína libre. La Figura b es un gráfico de barras que muestra que el antisuero inmune puede unir 3 H-cocaína. La Figura 11a es un gráfico de barras que muestra que un conjugado cocaína-bsa preparado de acuerdo con el método descrito en la presente memoria proporciona una protección de dos veces utilizando una dosis alta de cocaína DL. La Figura 11b es otro gráfico de barras que muestra que un conjugado cocaína-bsa preparado de acuerdo con el método descrito en la presente memoria proporciona una protección de dos veces utilizando una dosis alta de cocaína DL. La Figura 12a es un gel que muestra los pesos moleculares relativos de la toxina B del cólera (CTB) nativa (monómero y pentámero) y recombinante (monómero). La Figura 12b es un gel que muestra la estabilidad de los pentámeros CTB en un intervalo de ph de 3-9. La Figura 12c es un dibujo de un gel de Western Blot que muestra las fracciones de los picos CTBr#32 y CTBr#3 que se obtuvieron por expresión periplasmática que dio lugar a CTB pentámerica. 6 La Figura 13a es un gráfico que representa un ELISA donde el anticuerpo antictb detecta la capacidad de CTBr de unirse al gangliósido G M1 en la placa ELISA. La Figura 13b es un escaneo que representa un ensayo de unión de citometría de flujo en el que CTBr se une a células eucariotas que expresan el gangliósido G M1. La Figura 14a es un gráfico que representa un ELISA en el que se muestra que la CTB nativa y el conjugado cocaína-ctb CTB-,8 (PS-,8 conjugado con CTB) son pentaméricos, en base a su capacidad para unirse al gangliósido G M1. La Figura 14b es un gráfico que representa un ELISA en el que CTB-,8 (PS-,8 conjugado con CTB) se une al gangliósido G M1 y el conjugado se detecta con un anticuerpo monoclonal anticocaína (antibenzoilecgonina). La Figura es una representación esquemática de otra reacción útil en la preparación de conjugados de la presente invención, en particular, del éster 3 benzoato aducto 4. La Figura 16 es una representación esquemática de la síntesis de un conjugado marcado con carbono 13.

6 Descripción detallada de la invención 6 La literatura de patentes y científica a la que se refiere la presente memoria contienen la información que se encuentra disponible para aquellas personas especializadas en el tema. La presente invención utiliza una terapia para la drogadicción, basada en la vacunación de un individuo adicto con un conjugado droga hapteno-transportador. Las composiciones terapéuticas de la invención comprenden al menos un hapteno y al menos un transportador que contenga un epítopo de célula T que cuando se conjuga para formar el conjugado hapteno-transportador es capaz de estimular la producción de anticuerpos antihapteno. Cuando se utilice en la presente memoria, el término epítopo de célula T se refiere al elemento básico o a la unidad más pequeña de reconocimiento por parte de un receptor de la célula T, donde el epítopo comprende aminoácidos esenciales para el reconocimiento por el receptor. Las secuencias de aminoácidos que mimetizan las de los epítopos de la célula T y que modifican la respuesta alérgica a alergenos proteicos, se encuentran en el ámbito de esta invención. Un péptido mimético se puede definir como una estructura química derivada de péptidos bioactivos que mimetiza las moléculas naturales. El hapteno puede ser una droga o un derivado de droga. Según la invención como se reivindica, al menos un hapteno deriva de la nicotina. Cuando se administra la composición terapéutica que contiene el hapteno/droga (o derivado) a un individuo adicto, se producen anticuerpos antidroga específicos contra la droga. Un régimen de inmunización terapéutica produce y mantiene titulaciones de anticuerpos antidroga lo suficientemente altas, de manera que en exposiciones posteriores a la droga los anticuerpos neutralizantes se unen a una cantidad suficiente de la droga como para disminuir, si no eliminar, los efectos farmacológicos de la droga. No se esperan efectos secundarios por la administración terapéutica de la presente invención. Por ejemplo, la droga de abuso es pequeña y monovalente y por tanto no es capaz de entrecruzar el anticuerpo. Por lo tanto, no se espera que se produzca la formación de complejos inmunes y las patologías asociadas, después de la exposición a la droga de abuso. Es, y se espera que sea, compatible con terapias farmacológicas actuales y futuras. Es más, la neutralización efectiva es de larga duración. Por ejemplo, se sabe que las respuestas de neutralización de los anticuerpos contra patógenos duran años. De acuerdo con esto, se espera que los anticuerpos antidroga producidos en alta titulación utilizando la composición terapéutica de la presente invención puedan ser mantenidos durante largos periodos de tiempo y posiblemente, al menos durante un año. Este efecto a largo plazo de la composición terapéutica, que reduce los problemas del seguimiento, reduce el recidivismo que es un problema de las terapias actuales. Lo que sigue son términos que se utilizan en la presente memoria, cuyas definiciones se proporcionan como orientación. Cuando se utilice en la presente memoria hapteno, es un compuesto orgánico de bajo peso molecular que reacciona específicamente con un anticuerpo y que no es capaz de producir una respuesta inmune por sí mismo pero que es inmunogénico cuando forma un complejo con un transportador que contenga un epítopo de célula T formando un conjugado hapteno-transportador. Es más, el hapteno se caracteriza por ser la porción que determina la especificidad del conjugado hapteno-transportador, esto es, es capaz de reaccionar con un anticuerpo específico del hapteno en su estado libre. En un sujeto adicto no inmunizado, no se produce la formación de anticuerpos frente al hapteno. La composición terapéutica se utiliza para vacunar individuos que buscan tratamiento para su adicción a las drogas. En la presente invención, el término hapteno puede incluir el concepto de droga/hapteno más específico, como una droga, un análogo de una parte de la droga, o un derivado de la droga. La composición terapéutica, o vacuna antidroga terapéutica, cuando se administra inicialmente da lugar a un resultado deseado perceptible. Inicialmente, el resultado deseado perceptible es la producción de una alta titulación de anticuerpos antidroga (aproximadamente 0,1 mg/ml a 1 mg/ml del anticuerpo específico en suero). Sin embargo, la manipulación del régimen de dosis adecuado para cada individuo da lugar y mantiene un efecto terapéutico deseado y mantenido. El efecto terapéutico deseado es la neutralización de una fracción suficiente de la droga de abuso libre con anticuerpos específicos contra la droga después de una posterior exposición a la droga, con el fin de reducir o eliminar los efectos farmacológicos de la droga dentro de un tiempo de terapia aceptable. La determinación del tiempo de terapia aceptable en base al tiempo que se tarda en obtener una respuesta de anticuerpo suficiente y al tiempo que se mantiene esta respuesta de anticuerpo y la fracción suficiente de droga libre, puede hacerse por una persona especializada en el tema, mediante el estudio de las características del sujeto que va a ser inmunizado, la droga de abuso que se va a neutralizar, así como la ruta de administración. Utilizando éste y otros protocolos de vacunación como modelos, una persona especializada en el tema esperaría que la inmunidad o el periodo de protección durase varios meses, hasta más de un año. La inmunización pasiva se describe como la administración de o la exposición a un anticuerpo antidroga o a un anticuerpo policlonal o a un fragmento de anticuerpo monoclonal (como Fab, Fv, (Fab ) 2 o Fab ) preparados utilizando conjugados nuevos de la presente invención. Como se ha descrito arriba, la inmunización pasiva de seres humanos con un anticuerpo anticocaína puede resultar, como tratamiento único, menos eficaz que la inmunización activa. La inmunización pasiva sería particularmente útil como cotratamiento inicial y/o como tratamiento complementario suplementario (por ejemplo, durante el periodo de tiempo posterior a la administración inicial de vacuna pero anterior a la producción de anticuerpos propios por el cuerpo) o en situaciones graves para evitar la muerte (por ejemplo, cuando se presente una persona con sobredosis de drogas). En algunas situaciones, la terapia pasiva sola puede ser preferible, como cuando el paciente está comprometido inmunológicamente o necesita de un tratamiento rápido. La composición terapéutica de la presente invención, y más específicamente, la vacuna antidroga terapéutica, es una composición que contiene al menos un conjugado droga/hapteno-transportador capaz de incitar la producción de una titulación suficientemente alta de anticuerpos específicos contra la droga/hapteno como para que una posterior exposición a la droga de los mencionados anticuerpos contra la droga/hapteno sean capaces de reducir las propiedades adictivas de la droga. La respuesta inmune esperada contra un conjugado hapteno-transportador es la formación de 6

7 anticuerpos tanto antihapteno como antitransportador. El nivel terapéutico se alcanza cuando se induce y se mantiene una cantidad suficiente de anticuerpos específicos antidroga capaces de organizar un ataque de neutralización de la droga introducida después de la vacunación. Los regímenes terapéuticos de la presente invención proporcionan el tiempo suficiente para la producción de anticuerpos después de la vacunación inicial y de cualquier refuerzo. Es más, la vacuna antidroga óptima contiene al menos un conjugado droga/hapteno transportador que comprende una combinación óptima de la droga como hapteno y de un transportador, de manera que la producción de anticuerpos antidroga es capaz de alcanzar un nivel terapéutico óptimo, esto es, permanecer a una titulación lo suficientemente alta in vivo como para resistir una exposición a la droga seleccionada en los meses posteriores. Más particularmente, la titulación de anticuerpos permanece lo suficientemente alta como para proporcionar una respuesta eficaz después de una exposición posterior a la droga, durante aproximadamente dos meses hasta aproximadamente un año o más dependiendo del individuo, más habitualmente al menos tres meses. Esta composición óptima consiste en un conjugado hapteno-transportador, excipientes y, opcionalmente, adyuvantes. La vacunación inicial con la composición del conjugado terapéutico hapteno-transportador de la presente invención crea una alta titulación de los anticuerpos específicos contra el hapteno in vivo. Resulta útil la realización de ensayos periódicos del plasma de los sujetos vacunados para determinar las dosis individuales eficaces. Los niveles de titulación se elevan y se mantienen durante las dosis de refuerzo periódicas. Se anticipa que esta terapia se utilizará en combinación con programas de rehabilitación utilizados actualmente, incluido el asesoramiento. Es más, las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden estar dirigidas a una sola droga, a varias drogas simultáneamente o en sucesión y puede ser utilizada en combinación con otras terapias. Por ejemplo, las composiciones del conjugado terapéutico hapteno-transportador y los métodos de la presente invención son utilizados sin interacciones adversas en combinación con aproximaciones farmacológicas convencionales y con la anteriormente descrita inmunización pasiva a corto plazo e inmunización activa frente a estados de transición para aumentar el efecto global de la terapia. La composición del conjugado terapéutico hapteno-transportador de la presente invención se prepara por acoplamiento de una o más moléculas de hapteno a un transportador que contiene proteína que comprende un epítopo de célula T para obtener un conjugado hapteno-transportador capaz de estimular a las células T (inmunogénico) lo que da lugar a la proliferación de células T y a una liberación característica de mediadores que activan a las células B relevantes y que estimulan la producción de anticuerpos específicos. Los anticuerpos de interés son aquellos específicos para la porción de hapteno del conjugado hapteno-transportador (también llamado complejo hapteno-transportador). Se describen las composiciones terapéuticas que contienen una combinación de conjugados bien de la misma droga (inmunización cruzada) o de múltiples drogas (coinmunización). Estas comezclas de conjugados de múltiples drogas resultan particularmente útiles en el tratamiento del abuso de varias drogas. En la selección de una droga adecuada para conjugación, una persona especializada en el tema seleccionará una droga que sea capaz de producir una alta titulación de anticuerpos. Sin embargo, si la molécula elegida es similar a las moléculas endógenas del individuo, los anticuerpos producidos frente a esta molécula reaccionarán de manera cruzada con varias moléculas diferentes en el cuerpo dando lugar a un efecto no deseado. De esta manera, la droga seleccionada como hapteno (droga/hapteno) debe ser lo suficientemente extraña y de un tamaño suficiente como para evitar la producción de anticuerpos frente a moléculas encontradas habitualmente en el cuerpo humano. Por estos motivos, el alcohol, por ejemplo, no sería adecuado para la terapia de la presente invención. Los anticuerpos creados frente a la composición terapéutica son muy específicos y son inducidos en una cantidad suficiente como para neutralizar la droga tanto en el torrente sanguíneo como en la mucosa o en ambos. Las drogas apropiadas para la composición terapéutica (no presentadas en orden de importancia) son: Alucinógenos, por ejemplo mescalina y LSD; Cannabinoides, por ejemplo THC; Estimulantes, por ejemplo anfetaminas, cocaína, fenmetrazina, metilfenidato; Nicotina; Depresivos, por ejemplo, no barbitúricos (por ejemplo, bromuros, hidrato de cloral etc.), metacualona, barbitúricos, diazepam, flurazepam, fenciclidina, y fluoxetina; y Opio y sus derivados, por ejemplo, heroína, metadona, morfina, meperidina, codeína, pentazocina, y propoxifeno; Drogas de diseño como el éxtasis. La Figura 6 muestra la estructura de 6 drogas apropiadas para la conjugación. Según la invención como se reivindica, al menos un hapteno deriva de la nicotina. 6 El transportador de la presente invención, es una molécula que contiene al menos un epítopo de célula T que es capaz de estimular las células T del sujeto, que a su vez ayudan a las células B a iniciar y mantener la producción de anticuerpos contra fracciones del conjugado entero, incluyendo la porción hapteno. De esta manera, como el transportador se selecciona porque es inmunogénico, es de esperar una potente respuesta inmune a la vacuna en una 7

8 población diversa de pacientes. El transportador, como el hapteno, debe ser lo suficientemente extraño como para producir una respuesta inmune potente a la vacuna y para evitar el fenómeno de supresión de la inducción del epítopo por el transportador. Una aproximación conservadora, pero no imprescindible, es la utilización de un transportador al que la mayoría de los pacientes no hayan sido expuestos. Sin embargo, aunque se produzca la supresión de la inducción del epítopo por el transportador, la situación es manejable al haber sido superada por cambios en la dosis (DiJohn et al. (1989) Lancet ) y por otros cambios en el protocolo (Etlinger et al. (1990) Science 249:423-4), incluyendo la utilización de CTB (Stok et al. (1994) Vaccine 12:21-26). Aún más, los transportadores que contienen un alto número de lisinas son particularmente apropiados para la conjugación de acuerdo con los métodos de la presente invención. Son numerosas las moléculas transportadoras apropiadas e incluyen, pero no están limitadas a: Toxinas bacterianas o productos, por ejemplo, toxina B del cólera-(ctb), toxina de la difteria, toxoide del tétanos, y toxina pertussis y hemaglutinina filamentosa, toxina shiga, exotoxina de pseudomonas; Lectinas, por ejemplo, subunidad B de la ricina, abrina y lectina de guisante dulce; Fracciones subvirales, por ejemplo, nucleoproteína de retrovirus (retro NP), ribonucleoproteína de la rabia (rabia RNP), virus de plantas (por ejemplo, TMV, virus de mosaico de fréjol de vaca y coliflor), proteína de la nucleocápside del virus de la estomatitis vesicular (VSV-N), vectores del virus de la sífilis y vectores del virus del bosque Semliki; Vehículos sintéticos, por ejemplo, péptidos multi-antigénicos (MAP), microesferas; Partículas semejantes a virus de levaduras (VLPs); Antígeno de la proteína de la malaria; 6 y otros como proteínas y péptidos y cualquier modificación, derivados o análogos de las moléculas listadas arriba. Para determinar las características de los transportadores apropiados, se llevaron a cabo experimentos iniciales utilizando albúmina de suero bovino como proteína transportadora. La proteína resultó perfecta en experimentos con animales, al ser barata y contener un alto número de lisinas para la conjugación. Sin embargo, resulta menos apropiada para la vacunación en los seres humanos porque la producción de anticuerpos antibsa tiene el potencial de producir respuestas adversas. Así, utilizando los resultados de estos experimentos, los criterios descritos más arriba se aplicaron a un gran número de transportadores potenciales. El resultado es la lista de transportadores apropiados para la práctica de la presente invención descrita arriba. El transportador de una realización preferida es una proteína o un péptido ramificado (por ejemplo, péptidos multiantigénicos (MAP)) o un péptido de una cadena única. Un transportador perfecto es una proteína o péptido que no se utiliza habitualmente en los procesos de vacunación del país en el que se vaya a utilizar la terapia, evitando de esta manera el potencial de supresión de la inducción del epítopo por el transportador. Por ejemplo, en los EEUU, donde la inmunización estándar de los niños incluye difteria y tétanos, las proteínas como el toxoide del tétanos y el toxoide de la difteria, si no se modifican, resultan poco deseables como transportadores apropiados. Además, la proteína transportadora no debe ser una proteína a la que uno es tolerante. En los seres humanos, esto excluiría a la albúmina de suero humano sin modificar. Además, muchas proteínas alimenticias deben ser examinadas cuidadosamente antes de ser utilizadas como transportadores. También en los seres humanos, la albúmina de suero bovino sería poco deseable como transportador debido a la presencia de bovino en la dieta de la mayoría de las personas. Aún más, resulta altamente ventajoso que el transportador tenga una inmunogenicidad/adyuvanticidad inherente. Se debe conseguir un equilibrio entre el deseo de inmunogenicidad del transportador y el deseo de maximizar el anticuerpo antihapteno. Aún más, el transportador preferido debería ser capaz de producir tanto una respuesta sistémica como una respuesta en el lugar de la exposición. Esto resulta particularmente aplicable a la cocaína que es administrada frecuentemente a través de las membranas mucosas. La velocidad de la respuesta es especialmente crítica cuando la cocaína se fuma. De acuerdo con esto, en el caso de la cocaína, un transportador preferido produciría no solo una respuesta sistémica sino también una respuesta de anticuerpo preexistente en la mucosa. En dicha respuesta mucosal la reacción de los anticuerpos con la cocaína ocurriría lo suficientemente rápida como para contrarrestar a la droga antes de que ésta empiece a circular en el torrente sanguíneo. Un transportador perfecto, la toxina B del cólera (CTB), es una subunidad proteica altamente inmunogénica capaz de estimular respuestas de anticuerpos sistémicas y mucosales (Lycke (1992) J. Immunol. 1: ; Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med. Hyg. :42-4; Silbart et al. (1988) J. Immun. Meth. 9:3-112; Katz et al. (1993) Infection Immun. 61: ). Esta respuesta combinada antihapteno IgA e IgG es altamente deseable para bloquear a la cocaína que es administrada nasalmente o por inhalación. Además, mediante ensayos clínicos con vacunas del cólera, se ha demostrado que CTB es segura para ser utilizada en los seres humanos (Holmgren et al., supra; Jertborn et al. (1994) Vaccine 12:78-82: The Jordan Report, Accelerated Development of Vaccines 1993., NIAID, 1993). Más aún, la mayoría de los adictos a la cocaína en los EEUU, no se han expuesto al cólera y por lo tanto no son inmunes a CTB. Otros transportadores útiles incluyen aquellos con capacidad para aumentar una respuesta mucosal, más particularmente, la familia LTB de toxinas bacterianas, nucleoproteína de retrovirus (retro NP), ribonucleoproteína de la rabia (rabia RNP), proteína de la nucleocápside del virus de la estomatitis vesicular (VSV-N), subunidades recombinantes del virus de la sífilis, y péptidos multi-antigénicos (MAP). 8

9 6 En otra realización, se utilizan como transportadores varios fragmentos de péptidos derivados de proteínas o análogos, de alergenos. Estos transportadores son elegidos porque inducen una respuesta de célula T capaz de proporcionar ayuda a la iniciación de la producción de anticuerpos antihapteno por las células B. Ejemplos y métodos para producir proteínas y péptidos alergénicos así como sus secuencias aparecen descritos en WO 9/ publicado el 19 de Octubre de 199. Utilizando los métodos y las composiciones de la presente invención, y más particularmente, las técnicas listadas en los Ejemplos que aparecen más abajo, una persona especializada en el tema puede unir la droga/hapteno seleccionado con el transportador seleccionado para producir el conjugado hapteno-transportador de la presente invención. Un alergeno particularmente apropiado como transportador es Cryptomeria japonica, más particularmente, Cry j 1 recombinante, cuya secuencia ha sido publicada con una pequeña variación. Por lo tanto, el alergeno Cry j 1 cumple de manera general uno de los criterios de un transportador apropiado, esto es, un transportador al cual el sujeto no ha sido previamente expuesto. En una realización de la presente invención, los anticuerpos inducidos por la composición terapéutica actúan en el tiempo que tarda la droga en viajar desde los pulmones a través del corazón hasta el cerebro. La capacidad de producir esta respuesta de anticuerpos requiere de la selección cuidadosa de la molécula transportadora. Producción de la Subunidad B Recombinante de la Toxina del Cólera La toxina del cólera es una enterotoxina producida por Vibrio cholerae y consta de cinco subunidades B idénticas teniendo cada subunidad un peso molecular de 11,6 KDa (3 aminoácidos) y una subunidad A de 27,2 KDa (2 aminoácidos) (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. 8-2). La subunidad de unión, CTB, se une al gangliósido G M1 en la superficie celular (Sixma et al. (1991) Nature 1:371-37; Orlandi et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: ). CTA es la subunidad enzimática que entra en la célula y cataliza la ADP-ribosilación de una proteína G, activando de manera constitutiva la adenilato ciclasa (Finkelstein (1988) Immunochem. Mol. Gen. Anal. Bac. Path. pp. 8-2). En ausencia de la subunidad A, la toxina del cólera no es tóxica. Otros autores han descrito la producción de altos niveles de la expresión recombinante de pentámeros CTB (L hoir et al. (1990) Gene 89:47-2; Slos et al. (1994) Protein Exp. Purif. :18-26). Aunque la CTB nativa se encuentra disponible comercialmente, aparece contaminada frecuentemente con CTA (aproximadamente un 0,1%). Por este motivo, la CTB recombinante ha sido expresada en E. coli y se han desarrollado ensayos para su caracterización. La construcción coleragenoide se adquirió de la American Type Culture Collection (conforme a la Patente de EEUU ). La CTB recombinante se clonó del vector original (prit8) en un plásmido de expresión (pet11d, Novagen) con una secuencia N-terminal extra que contenía un marcador His6 y fue expresada en E. coli en una cantidad de hasta mg/litro de cultivo. La proteína se purificó a través de una columna de Ni 2+ utilizando técnicas estándar y se analizó mediante SDS-PAGE (véanse las Figuras 12a, b y c). La CTB recombinante es monomérica en este ensayo y es mayor que el monómero CTB nativo debido a la extensión N-terminal. La CTB pentamérica recombinante fue producida tanto en ausencia como en presencia del marcador His utilizando el ADNc modificado por PCR para incluir la secuencia líder Pel b. Se insertó un codón de parada en el C-terminal para eliminar el marcador His. Ambas construcciones se expresaron en E. coli del vector pet22b (Novagen). La proteína marcada en His se purificó mediante cromatografía de afinidad Ni 2+, como se ha descrito más arriba (13 mg/l). La CTB recombinante sin marcar se purificó por cromatografía de afinidad con el gangliósido G M1 como se ha descrito (Tayot et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113:249-8). Se demostró que el pentámero recombinante de la CTB se unía al gangliósido G M1 en un ELISA y que reaccionaba con anticuerpos específicos de pentámero en Western blots y en ELISA. La CTB recombinante puede ser obtenida también de otras fuentes. La estructura pentamérica de la CTB puede ser preferida para la unión al gangliósido G M1. El pentámero es estable frente al SDS si las muestras no son hervidas, permitiendo que la pentamerización sea evaluada por SDS-PAGE. El gel de la Figura 12b demuestra que la CTB nativa es un pentámero y que es fácilmente distinguible de la CTB monomérica desnaturalizada. La estructura pentamérica se mantiene en un intervalo de ph de 4 a 9 (véase la Figura 12b), lo que facilita una gran variación de químicas conjugacionales. La CTB recombinante expresada inicialmente es monomérica. Una manera de obtener CTB pentamérica es haciendo ajustes para expresar la CTB pentamérica apropiadamente plegada. Se ha visto que la expresión citoplasmática proporciona unos niveles de CTB monomérica mucho mayores. Una persona especializada en el tema conoce métodos para el plegamiento de la CTB monomérica en CTB pentamérica (véase, por ejemplo L hoir et al. (1990) Gene 89:47-2). Una alternativa al replegamiento de la CTB monomérica para obtener la CTB pentamérica es la expresión periplasmática que resulta en una CTB pentamérica recombinante capaz de unir gangliósido G M1 por ELISA, las Figuras 13a y 13b muestran los datos que apoyan esta afirmación. Una persona especializada en el tema descubrirá que se han descrito numerosas aproximaciones para la obtención de CTB pentamérica recombinante, incluyendo la expresión periplasmática al. (1993) BioTechnol. 11:74-78) o con replegamiento post-translacional (L hoir et al., supra; con un líder (Slos et al., supra; Sandez et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:481-48; Lebens et Jobling et al. (1991) Mol. Microbiol. : ). Otro transportador útil es la toxina del cólera que proporciona una respuesta mucosal mayor que la de CTB. Se ha descrito que la subunidad A activa desde un punto de vista enzimático utilizada como adyuvante aumenta la actividad (Liang et al. (1988) J. Immunol. 141:149-11; Wilson et al. (1993) Vaccine 11: ; Snider et al. (1994) J. Immunol. 3:647). 9

10 Un aspecto de conseguir el conjugado de la presente invención implica modificar el hapteno lo suficiente como para convertirlo en capaz de ser conjugado o unido a un transportador manteniendo su estructura lo suficiente como para que sea reconocido como el hapteno en estado libre (por ejemplo, como cocaína libre). Resulta esencial que los individuos vacunados tengan anticuerpos que reconozcan al hapteno libre (cocaína). Experimentos de radioinmunoensayo y ensayos de ELISA de competición (Figuras a y b), explicados con más detalle en los Ejemplos, pueden medir las titulaciones del anticuerpo contra el hapteno libre. Los anticuerpos de interés son anticuerpos específicos contra el hapteno que, en algunas realizaciones, son anticuerpos específicos contra la cocaína. Debe ser entendido que los principios y métodos utilizados para describir las realizaciones preferidas pueden aplicarse, partiendo de esta descripción, a un amplio rango de conjugados hapteno-transportador útiles en el tratamiento de numerosas adicciones a drogas y de respuestas tóxicas. Conjugados Los conjugados cocaína-transportador se derivan de la cocaína y de los metabolitos de la cocaína, sobre todo derivados de la norcocaína, benzoilecgonina y éster metílico de ecgonina. La Figura 4 muestra una representación de la molécula de cocaína comparándola con estas otras moléculas. En el caso de la norcocaína y del éster metílico de ecgonina, los grupos funcionales amina secundaria y alcohol secundario presentes en los dos compuestos respectivamente, son modificados con el fin de proporcionar un anclaje químico que permita la unión a una proteína transportadora. En el caso de la benzoilecgonina, el ácido libre se utiliza directamente para la unión a la proteína transportadora o se modifica con un anclaje para permitir esta unión. La longitud y naturaleza del anclaje debe ser tal que el hapteno sea desplazado a una distancia suficiente del dominio del transportador como para permitir un reconocimiento óptimo por los anticuerpos producidos contra él. La longitud del anclaje se optimiza variando el número de grupos -CH 2 - que se encuentran estratégicamente situados en la ramificación seleccionada del grupo que consiste en: CJ 0 Q CJ 1 CJ 1,1 CJ 1,2 CJ 2 CJ 2,1 (CH 2 ) n Q CO 2 Q COQ OCO(CH 2 ) n Q OCOCH=Q CJ 2,2 OCOCH(O)CH 2 CJ 2,3 OCO(CH 2 ) n CH(O)CH 2 CJ 3 CJ 3,1 CJ 4 CJ 4,1 CJ CJ,1 CJ 6 CJ 7 CJ 7,1 CJ 8 CJ 8,1 CO(CH 2 ) n COQ CO(CH 2 ) n CNQ OCO(CH 2 ) n COQ OCO(CH 2 ) n CNQ CH 2 OCO(CH 2 ) n COQ CH 2 OCO(CH 2 ) n CNQ CONH(CH 2 ) n Q Y(CH 2 ) n Q CH 2 Y(CH 2 ) n Q OCOCH(OH)CH 2 Q OCO(CH 2 ) n CH(OH)CH 2 Q 6 CJ 9 OCOC 6 H CJ aparece en la Figura 2b

11 y que se muestran en las Figuras 2a y 2b de la presente memoria. Respecto a las ramificaciones anteriores, n es un número entero seleccionado entre aproximadamente 3 y aproximadamente, más particularmente de aproximadamente 3 a aproximadamente 6; Y se selecciona preferentemente de un grupo que consiste en S, O, y NH; y Q se selecciona preferentemente de un grupo que consiste en: (1) -H (2) -OH (3) -CH 2 (4) -CH 3 (4a) -OCH 3 () -COOH (6) halógeno (7) proteína o péptido transportador (8) proteína o péptido transportador modificados (9) ésteres activados, como éster 2-nitro-4-sulfofenilo y éster N-oxisuccinimidilo () grupos reactivos frente a transportadores o transportadores modificados, como anhídridos mixtos, halogenuros de acilo, acilazidas, halogenuros de alquilo, N-maleimidas, iminoésteres, isocianato, isotiocianato; u (11) otra ramificación identificada por su número de referencia CJ. El transportador que contiene el epítopo de célula T (por ejemplo, una proteína o péptido transportador de la presente invención) puede ser modificado para facilitar su conjugación con el hapteno (por ejemplo, por tiolación) mediante métodos conocidos por una persona especializada en el tema. Por ejemplo, con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) o por succinilación, etc. Para simplificar, (CH 2 ) n Q, donde Q=H, puede ser referido como (CH 3 ), metilo o Me, sin embargo, se entiende que se corresponde con el grupo según se identifica en las ramificaciones que se muestran en las Figuras 2a y b. En las abreviaturas de compuestos utilizados en la presente memoria que se obtienen comercialmente se incluyen: BSA= DCC= DMF= EDC (o EDAC)= EDTA= HATU= NMM= HBTU= TNTU= PyBroP = HOBt= Albúmina de suero bovino Diciclohexilcarbodiimida N,N-Dimetilformamida Clorhidrato de N-Etil-N -(3-(dimetilamino)propil)carbodiimida Ácido etilendiamínico tetraacético, sal disódica Hexafluorofosfato de O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio N-Metilmorfolina Hexafluorofosfato de 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio Tetrafluoroborato de 2-(-Norborneno-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio N-Hidroxibenzotriazol 6 11

12 La nomenclatura IUPAC para muchos de los compuestos que se mencionan es: Norcocaína: Éster metílico del ácido 3-(Benzoiloxi)-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico. Benzoil ecgonina: Ácido 3-(Benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico. Cocaína: Éster metílico del ácido 3-(Benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico. Éster metílico de la ecgonina: Éster metílico del ácido 3-(Hidroxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico. El grado de haptenación puede ser determinado por absorción UV o análisis espectral de masas de tiempo de vuelo (TOF). La Tabla 2 muestra que la haptenación se logró utilizando numerosos conjugados (algunos con CTB como transportador) producidos siguiendo los métodos descritos en la presente invención. Los diferentes lotes lotes se indican por la adición de un decimal a un número, por ejemplo, el lote 6 de PS- es PS-,6. Los conjugados hapteno-transportador de la invención pueden ser haptenados a diferentes grados utilizando los métodos descritos en el Ejemplo, así como utilizando métodos de conjugación conocidos por las personas especializadas en el tema, por ejemplo, diferentes posibilidades de agentes activadores, diferentes tampones, diferentes tiempos de reacción, etc. La cantidad de haptenación del conjugado está sin embargo limitada por el número de grupos nucleófilos que contenga el transportador. TABLA

13 6 Esta lista de conjugados no es limitante. Se han producido otros conjugados con más de un hapteno acoplado al transportador que contiene el epítopo de célula T. Preferentemente, se acoplan de 1 a 0 haptenos al transportador que contiene el epítopo de célula T. Más preferentemente, se acoplan de 1 a 70 haptenos al transportador que contiene el epítopo de célula T. Los métodos para sintetizar los compuestos PS-2, PS-3, PS-4, PS- y PS-6 aparecen descritos en los Ejemplos. Siguiendo los métodos descritos, por ejemplo utilizando agentes activadores en condiciones acuosas, una persona especializada en el tema puede sintetizar los compuestos PS- a PS-26 (véase la Figura 3b(1) y (2)). La hidrólisis del éster metílico de los conjugados PS-2, PS-4 y PS- da lugar a la producción de anticuerpos específicos contra la benzoil ecgonina, convirtiendo de esta manera el conjugado en esencialmente inactivo como vacuna terapéutica. Para una conjugación óptima y para prevenir una hidrólisis extensiva del éster metílico de la norcocaína succinilada y de los conjugados PS-, durante la conjugación el ph del tampón se mantiene entre ph 7,6 y 7,8, con unos tiempos de reacción limitados a 1, horas. Además, la purificación después de la conjugación del conjugado PS- se lleva a cabo idealmente a ph 6, utilizando tampón succinato de sodio mm. Con el fin de evaluar la estabilidad del éster metílico, se pueden utilizar técnicas tanto inmunológicas como fisicoquímicas. Se ha generado un anticuerpo monoclonal específico de la cocaína que puede discriminar entre cocaína y sus metabolitos cuando se une a una proteína transportadora. La reactividad frente a los metabolitos inactivos fue veces menor que frente a la cocaína. Se pueden generar anticuerpos monoclonales específicos contra la benzoilecgonina utilizando una tecnología similar. Cualquiera de los dos anticuerpos monoclonales o preferiblemente los dos pueden utilizarse para determinar los niveles de conjugados intactos e hidrolizados comparados con mezclas estándar. Esta diferenciación depende de la reactividad relativa de cada anticuerpo monoclonal frente al conjugado hidrolizado e intacto. En otra realización, se puede sintetizar un análogo éster metílico de la norcocaína succinilada enriquecido en carbono-13 (Figura 16). Cuando se conjuga con una proteína transportadora para formar PS-, se puede utilizar la espectroscopía de resonancia magnética nuclear de carbono-13 ( 13 C NMR) para evaluar la presencia del éster metílico y como el grupo metilo está enriquecido con el isótopo, la señal que corresponde al éster metílico se distinguirá por encima de las señales de proteína. Se puede sintetizar un conjugado que contiene un éster metílico marcado radiactivamente. Esto podría incluir un análogo éster metílico de la norcocaína succinilada que contenga carbono-14 o tritio. Cuando se conjuga con una proteína transportadora para formar PS-, la pérdida de radiactividad con el tiempo de cualquiera de los dos análogos se puede evaluar utilizando técnicas conocidas para una persona especializada en el tema. La evaluación de la pérdida de radiactividad indicará los niveles residuales del éster metílico intacto. El grupo éster benzoato de los conjugados PS- es estable esencialmente en las condiciones de conjugación y purificación, y por lo tanto no requiere de una evaluación de la retención de su integridad estructural. Si, sin embargo, se desea una biodisponibilidad incrementada se puede incorporar en el conjugado un enlace amida u otro grupo estable metabólicamente, conocidos para una persona especializada en el tema. De manera similar, el éster metílico de los conjugados PS- se puede estabilizar utilizando la ramificación CJ6 donde Q=H, es decir, un enlace amida. Esta incorporación incrementaría la estabilidad de los conjugados tanto in vitro como in vivo. Los compuestos PS-27 a PS- se sintetizan a través de una serie de reacciones que permiten una entrada nueva en la clase tropano de alcaloides. Esta nueva ruta, implica una ciclación intermolecular mediada por radicales libres tipo 1,6 dieno (March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, (1992) 4ª ed., Wiley-Interscience, p. 744, y las referencias citadas en ese trabajo). Los alcaloides tropano, en particular la cocaína y sus análogos, han sido previamente sintetizados; sin embargo, estas rutas están compuestas de múltiples etapas y normalmente con la producción de un intermediario (Wilstatter et al. (1923) Ann. Chem. 434: ; Tufariello et al. (1979) J. Am. Chem. 1: ; Lewin et al. (1987) J. Heterocyclic Chem. 24:19-21; y Simoni et al. (1993) J. Med. Chem. 36: ). Aunque limitados a la síntesis de derivados 3-ariltropano Davies et al. (Patente de EEUU ), sintetizaron análogos de la cocaína por descomposición de vinildiazotanos en presencia de pirroles para formar un anillo tropano que es seguido de una adición Grignard para producir los análogos de la cocaína. En esta realización alternativa, se sintetizan nuevos conjugados cocaína-transportador con ramificaciones en sitios remotos. Cuando se utilice en la presente memoria los sitios remotos se marcarán con C, D y E en la Figura 1. Estos sitios presentan un especial reto para el químico debido a la naturaleza del anillo de tropano y son posiciones especialmente difíciles para ramificaciones necesarias para los conjugados de la presente invención. Una realización, añade las ramificaciones y por último construye el anillo de tropano. Como aparece representado en la Figura, existe una adición nueva en una sola etapa del radical 2 y la ciclación, a baja temperatura, del compuesto general 1. El resultado estereoquímico se define por la forma semejante a nave del intermediario 3 en el que la adición del radical 2 se produce de manera ecuatorial a la posición 3 seguida del cierre del anillo mediante el mecanismo pronosticado lo que da lugar al aducto 4 del éster 3-benzoato (análogo de la cocaína). La orientación de C, D, E y CO 2 R vendrán predefinidas en 1. Se ha desarrollado un amplio rango de compuestos para facilitar el entrecruzamiento de proteínas/péptidos o la conjugación de proteínas con moléculas derivatizadas, por ejemplo, haptenos. Estos incluyen, pero no están limitados a, ésteres activos derivados de ácidos carboxílicos (compuestos activados), anhídridos mixtos, halogenuros de acilo, acilazidas, halogenuros de alquilo, N-maleimidas, iminoésteres, isocianatos e isotiocianatos, que resultan conocidos para las personas especializadas en el tema. Estos compuestos son capaces de formar un enlace covalente con un grupo reactivo de una molécula de proteína. Dependiendo del grupo activador, el grupo reactivo será el grupo amino de un 13

14 6 residuo de lisina en una molécula de proteína o el grupo tiol en una proteína transportadora o una proteína transportadora modificada que, cuando reacciona, resulta en la formación de una enlace amida, amina, tioéter, amidina, urea o tiourea. Una persona especializada en el tema, puede identificar otros grupos activadores apropiados, por ejemplo, en textos de referencia como Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking (Wong (1991) CRC Press, Inc., Boca Raton, FL). Idealmente, la conjugación se realiza a través de un grupo amino de una lisina en la cadena lateral. La mayoría de los reactivos reaccionan preferentemente con lisina. Un transportador especialmente apropiado es CTB por tener 9 residuos de lisina por monómero en su forma nativa. Para determinar si la CTB conjugada retiene su estructura y actividad, se puede evaluar su unión al gangliósido G M1. Distintos investigadores han expresado y purificado cantidades de CTB recombinante que, una vez optimizado, son producidas en grandes lotes de fermentación. Los procesos para expresar y purificar proteínas recombinantes son conocidos en éste ámbito, por ejemplo, USSN 07/ CTB puede ser purificada, por ejemplo, por cromatografía de afinidad (Tayor et al. (1981) Eur. J. Biochem. 113:249-8), puede ser conjugada con derivados de la cocaína, y el conjugado puede ser entonces purificado adicionalmente. Se analiza la pureza de CTB purificada y del conjugado resultante y el mantenimiento de la estructura pentamérica de CTB. Las técnicas incluyen SDS-PAGE, cromatografía de filtración en gel, Western blotting, ELISA directo y de captura de G M1, y ELISA de competición con CTB biotinilada. El grado de haptenación se determina por espectrometría de masas y por análisis del incremento de la absorción UV que resulta de la presencia del hapteno. Tanto la solubilidad como la estabilidad del conjugado se optimizan en la preparación para la formulación a gran escala. Los detalles de algunos de estos análisis aparecen en los Ejemplos. Se han producido numerosos conjugados con análogos de la cocaína y con BSA, HEL o CTB como proteína transportadora. En la Figura 3a se muestran seis BSA, HEL o CTB como proteína transportadora. Seis análogos de la cocaína representativos se muestran en la Figura 3a. De estos seis, PS-2, PS-4, PS-, PS-6 y PS-9 se conjugaron con BSA o HEL, mientras que PS- se conjugó también con CTB (véase la Tabla 2 más arriba). Con el fin de variar el grado de haptenación, se pueden adoptar aproximaciones alternativas. En una realización, el transportador es haptenado con una construcción de cocaína multivalente. Esta idea está basada en el concepto de péptidos multi-antigénicos (MAP) (Lu et al. Mol. Immunol. 28:623-6 (1991)). En este sistema, los residuos de lisina muy ramificados son utilizados para maximizar la densidad y valencia del hapteno. La premisa de esta aproximación es que la respuesta inmune se incrementa si existen múltiples copias del hapteno unido a la misma molécula de péptido o proteína. Por lo tanto, se prepara un hapteno multivalente que necesita unirse únicamente a uno o dos sitios del transportador CTB pentamérico como se describe en la presente memoria. El núcleo de este hapteno antigénico múltiple es un núcleo de polilisina ramificado como sugiere Tam (Lu et al., supra). Se conserva un anclaje químicamente reactivo por la inclusión de un residuo de Cys protegido. Después de la haptenación de la cocaína de todos los grupos amino disponibles, el grupo sulfhidrilo de Cys se desprotege y aparece disponible para el acoplamiento con la proteína que presente alguno o numerosos grupos de entrecruzamiento específicos bifuncionales sulfhidril/amino (Yoshitake et al. (1979) Eur. J. Biochem. 1: Como núcleo se utiliza un número de estructuras dendriméricas. Adyuvante Cualquier adyuvante que no enmascare el efecto del transportador se considera útil (véase, Edelman (1980) Rev. Infect. Dis. 2: ). En experimentos iniciales con el objetivo de demostrar la viabilidad de una vacuna terapéutica frente a la adicción a la cocaína se utilizó el potente adyuvante CFA (Figuras 9a y c). Sin embargo, CFA no es preferido en los seres humanos. Un adyuvante útil que está actualmente permitido para su uso en los seres humanos es el alumbre, incluyendo hidróxido de aluminio (Spectrum Chem. Mtg. Corp., New Brunswick, NJ) o fosfato de aluminio (Spectrum). Típicamente, la vacuna se adsorbe en el alumbre, que presenta una solubilidad muy limitada. Los datos preliminares en el modelo murino sugieren que el alumbre es capaz de incitar una respuesta potente de anticuerpo anticocaína (Figura 9b), y el adyuvante RBI también resulta apropiado. La inmunización eficaz utilizando CTB como proteína transportadora no requiere de un adyuvante potente. Como se muestra en los Ejemplos, se indujeron respuestas con alta titulación de anticuerpos anticocaína por inmunización con el conjugado CTB-cocaína utilizando alumbre como adyuvante o en ausencia de adyuvante añadido. Excipientes y Agentes Auxiliares Las composiciones terapéuticas pueden contener opcionalmente uno o más excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico que incluyen, pero no están limitados a, agua estéril, disoluciones de sales como, disolución salina, fosfato sódico, cloruro sódico, alcohol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicol, gelatina, manitol, carbohidratos, estearato de magnesio, parafina viscosa, ésteres de ácidos grasos, hidroximetil celulosa y tampón. Las personas especializadas en el tema pueden utilizar otros excipientes apropiados. La composición terapéutica puede contener opcionalmente al menos un agente auxiliar, por ejemplo, medio de dispersión, envolturas, como lípidos y liposomas, surfactantes como agentes humidificantes y emulsionantes, lubricantes, conservantes como agentes antibacterianos y agentes antifúngicos, estabilizantes y otros agentes conocidos para personas especializadas en el tema. La composición de la presente invención puede contener adyuvantes adicionales, agentes y/o excipientes inertes aceptables desde un punto de vista farmacéutico que pueden ser añadidos para incrementar las propiedades terapéuticas del medicamento o para permitir medios de administración alternativos. 14

15 6 Los conjugados hapteno-transportador altamente purificados producidos tal y como se discute arriba, pueden ser formulados en composiciones terapéuticas de la invención adecuadas para terapia en los seres humanos. Si una composición terapéutica de la invención va a ser administrada por inyección (es decir, inyección subcutánea), es preferible que el conjugado hapteno-transportador altamente purificado sea soluble en una solución acuosa a un ph aceptable desde un punto de vista farmacéutico (es decir, en un intervalo de aproximadamente 4-9) de manera que la composición sea líquida y permita una administración fácil. La composición también incluye opcionalmente excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico, adyuvantes y agentes auxiliares o compuestos suplementarios activos. Dependiendo del modo de administración, la inclusión de ingredientes opcionales asegurará las propiedades deseadas de la composición terapéutica, por ejemplo, fluidez adecuada, prevención de la acción de microorganismos no deseados, incremento de la biodisponibilidad o absorción prolongada. Una composición terapéutica de la invención debe ser estéril, estable en las condiciones de fabricación, almacenamiento, distribución y uso, y debe ser preservada de la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. Con el fin de mantener la integridad de la composición, una forma preferida de fabricación de la composición terapéutica de la invención es preparar la formulación del conjugado y del excipiente farmacéutico de manera que la composición esté en la forma de un polvo liofilizado que se reconstituya en excipientes o agentes auxiliares, por ejemplo, agua estéril, justo antes de su utilización. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío, secado por liofilización o secado por centrifugación que dan lugar a un polvo del ingrediente activo además de cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolución estéril previamente filtrada. Los compuestos activos de la invención pueden ser procesados de acuerdo con métodos convencionales de farmacia galénica para la producción de composiciones terapéuticas que van a ser administradas a pacientes, por ejemplo, mamíferos incluyendo los seres humanos. Los medios preferidos de administración son intranasal, intratraqueal, oral, dérmico, y/o inyección. Una combinación particularmente apropiada de medios de administración comprende una inyección inicial con dosis de refuerzo intranasales. Para aplicaciones parenterales, resultan particularmente apropiadas las disoluciones estériles, inyectables, preferentemente disoluciones aceitosas o disoluciones acuosas, así como suspensiones, emulsiones, o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son convenientes para dosificaciones unitarias. Para aplicaciones entéricas, resultan particularmente apropiadas las pastillas, grageas, líquidos, gotas, supositorios, o cápsulas. Se puede utilizar un jarabe, elixir o semejante cuando se utilice un vehículo endulzado. Se pueden formular composiciones de liberación dirigida o sostenida, por ejemplo, liposomas o aquellas donde el compuesto activo (conjugado) se protege con diferentes envolturas degradables, por ejemplo, mediante microencapsulación, múltiples envolturas, etc. También es posible liofilizar los nuevos compuestos y utilizar los liofilizados obtenidos, por ejemplo, para la preparación de productos para inyección. Para una aplicación tópica, se utilizan en forma no pulverizable, en forma viscosa a semisólida o sólida que contenga un transportador compatible con la aplicación tópica y que tenga una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del agua. Las formulaciones apropiadas incluyen, pero no están limitadas a, disoluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, etc., que son, si se desea, esterilizadas o mezcladas con el agente auxiliar. Para una aplicación tópica son apropiadas las preparaciones en aerosol pulverizables en las que el compuesto activo, preferiblemente en combinación con un excipiente o agente auxiliar apropiados, se empaqueta en una botella comprimida o se mezcla con un propelente presurizado, volátil, normalmente gaseoso. Un anticuerpo producido utilizando la presente invención puede tener un peso molecular que varía entre 1 KDa y KDa. Si el sujeto se expuso a la cocaína libre después de la vacunación con el conjugado optimizado en la composición terapéutica, la cocaína libre será detectada por el o los anticuerpos específicos de la cocaína. No se necesitan cambios en la forma o estructura de la droga para que el anticuerpo reconozca a la droga in vivo. Se piensa que después de la exposición de un individuo vacunado a la cocaína, los anticuerpos antidroga bloquearán los efectos de la cocaína. Se piensa que al menos tres mecanismos contribuyen a la actividad bloqueante. Primero, los anticuerpos no son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, se cree que la cocaína, cuando se una al anticuerpo anticocaína, no cruzará la barrera hematoencefálica y no será capaz de ejercer su efecto en los transportadores de dopamina. Segundo, el anticuerpo impide que la droga se una a su receptor por un simple bloqueo estérico. Se espera que este mecanismo sea operativo en el bloqueo de algunos de los efectos de la cocaína no localizados en el SNC (por ejemplo toxicidad cardiaca) y en la actividad de los anticuerpos contra otras drogas que no tengan como blanco el SNC. Tercero, la cocaína tiene una vida media relativamente corta in vivo debido a hidrólisis enzimática y no enzimática, que dan lugar a metabolitos inactivos. En particular, la cocaína es una droga lo suficientemente pequeña como para no ser capaz de entrecruzar anticuerpos, por lo que no se producirá la formación de complejos inmunes. En la práctica de la presente invención se utilizan realizaciones de aplicaciones mucosales. Por ejemplo, se utilizan microesferas de copolímero para incitar o incrementar una respuesta inmune mucosal. Estas microesferas pequeñas y biodegradables encapsulan y protegen al conjugado y facilitan su captación por el sistema inmune mucosal. Aunque se utilizan preferentemente para inmunización oral, también se ha descrito su eficacia en la inmunización intranasal (Walker (1994) Vaccine 12: ). Resultan particularmente útiles para esta aplicación los polímeros inertes como el poli(láctido-coglicolido) (PLG) de diámetro 1- µm (Holmgren et al. (1994) Am. J. Trop. Med. Hyg. :42-4; Serva (1994) Science 26:22-24).

16 6 Además de los conjugados preferidos, se lleva a cabo una inmunización cruzada con diferentes conjugados con el fin de minimizar la reactividad cruzada del anticuerpo. Se administran conjugados a ratones, más particularmente los conjugados PS- o PS-9, y se administran dosis de refuerzo en el día 14 de los conjugados recíprocos PS-9 o PS- acoplados al mismo transportador, BSA. Únicamente se estimulará y expandirá el subconjunto de células B secretoras de anticuerpos que reconozca a los dos conjugados de cocaína. Se piensa que al diferenciarse los dos conjugados en el punto de unión a la molécula de cocaína, la especificidad del reconocimiento se ve incrementada. La especificidad del antisuero inducido se confirma entonces por ELISA de competición. Aún más, las composiciones terapéuticas que contienen más de un conjugado estimulan la producción de anticuerpos policlonales aumentando de esta manera la respuesta de anticuerpo en una exposición posterior. Dosis Se sabe que las respuestas de neutralización de los anticuerpos frente a patógenos duran años, y debería ser posible alcanzar una respuesta de anticuerpo anticocaína con una alta titulación que se mantenga durante al menos un año. Sería posible, en base a los valores obtenidos con vacunas convencionales, alcanzar las concentraciones de anticuerpo específico requeridas para neutralizar las concentraciones de cocaína en plasma (1- µm); los datos farmacocinéticos en ratón, descritos en los Ejemplos, demuestran claramente que se pueden alcanzar concentraciones del anticuerpo neutralizante relevantes desde un punto de vista fisiológico. Finalmente, la capacidad de los anticuerpos maternales de cruzar la placenta en mujeres adictas a la cocaína, protegiendo de esta manera al feto, representa un efecto deseado adicional de la vacunación terapéutica de la cocaína. La optimización de la terapia para que sea eficaz en una población amplia supone un reto, por lo que las personas especializadas en el tema valoran cuidadosamente varios factores con el fin de determinar la dosis terapéutica apropiada. Aún más, las respuestas de anticuerpo pueden ser evaluadas utilizando ELISAs específicos como se describe en los Ejemplos, y otros ensayos basados en anticuerpos. La variación genética en las tasas de eliminación, las interacciones con otras drogas, las alteraciones en la eliminación y la distribución inducidas por enfermedades, y otros factores combinados, dan lugar a un amplio espectro de respuesta a los niveles de vacunación en pacientes a los que se administra la misma dosis. Los indicadores clínicos ayudan en la titulación de algunas drogas en el intervalo deseado, y ninguna determinación química puede sustituir una observación cuidadosa de la respuesta al tratamiento. Debido a la eliminación, la vida media de la acumulación y los niveles en plasma permanentes resultan difíciles de predecir, la valoración de la producción del anticuerpo antidroga de abuso resulta útil como guía para obtener la dosis óptima. En los Ejemplos aparecen más detalles acerca de los efectos de los transportadores y adyuvantes en la inducción de una respuesta de anticuerpo. Así, se aprecia que las cantidades realmente preferidas del compuesto activo para un caso específico variarán de acuerdo con el conjugado específico que vaya a ser utilizado, las composiciones formuladas, el modo de aplicación, y el organismo tratado. Por ejemplo, en una realización, la composición terapéutica que contiene un transportador apropiado, se administra en primer lugar por vía parenteral y se administra una dosis de refuerzo por vía mucosal. Como se discute con más detalle en la presente memoria, este tipo de inmunización con la combinación óptima hapteno-transportador resulta muy eficaz para generar en primer término IgG de manera sistémica y en primer término IgA de manera local. Como se muestra en los Ejemplos se han utilizado modelos murinos para demostrar y determinar las diferentes características de la respuesta de anticuerpos con referencia particular a la cocaína. Éstas incluyen titulación de anticuerpos, capacidad para reconocer cocaína libre, capacidad de unión a la cocaína, afinidad por la cocaína, especificidad de la respuesta de anticuerpos, isotipo de los anticuerpos, localización tisular de los anticuerpos, y los efectos fisiológicos del anticuerpo después de la administración de cocaína. Titulación de Anticuerpo La primera valoración de una vacunación consiste en evaluar si el conjugado de interés induce una alta titulación de la respuesta de anticuerpo. Las titulaciones de anticuerpo se determinan utilizando un ensayo ELISA como se describe en los Ejemplos más adelante. Las placas se recubren con el conjugado cocaína-hel, se lavan, y se incuban con diferentes diluciones del suero que se quiere valorar. Las placas se lavan de nuevo y se revelan con un segundo anticuerpo contra IgG de ratón marcado enzimáticamente. Las titulaciones se definen como el inverso de la dilución de suero que produce un % de la respuesta máxima. La titulación de anticuerpo depende de la concentración del anticuerpo y de la afinidad del anticuerpo. Como se detalla en los Ejemplos, antisueros con aproximadamente 0,7 mg/ml de anticuerpo específico contra la cocaína de afinidad media de aproximadamente 2 x 8 M (ó x 7 M 1 ) tienen una titulación en ELISA de En la estimación de la titulación de anticuerpo requerida, una persona especializada en el tema considera tanto la concentración como la afinidad de los anticuerpos. Aunque las personas especializadas en el tema conocen otros métodos para calcular la concentración apropiada de anticuerpo, sin intención de limitar la invención, se describe un método para predecir los requerimientos de la concentración del anticuerpo anticocaína. El pico de los niveles de cocaína en plasma en adictos se encuentra en el 16

17 intervalo 0,3-1, g/ml (Ambre et al. (1991) J. Anal. Tox. :17-; Cone (199) J. Anal. Tox. 19:9-478; y Cone et al. (1989) J. Anal. Tox. 13:6-68). Por lo tanto, 0,07-0,37 mg/ml de anticuerpo se corresponde aproximadamente con la equivalencia molar (La proporción en peso anticuerpo monoclonal/cocaína = aproximadamente 1.000/3= aproximadamente 0 pero al existir dos sitios de unión en cada anticuerpo, la proporción molar por cada sitio de unión a la cocaína es aproximadamente 2). Es posible alcanzar este nivel en la respuesta de anticuerpo con un transportador haptenado, como se demuestra en los Ejemplos. Sin embargo, si se induce en la mucosa una respuesta específica de IgA dimérica secretada contra una droga de abuso, como se describe en al menos una de las realizaciones de la presente memoria, el requerimiento de la concentración de anticuerpo es dos veces menor en comparación con la droga de abuso. No se quiere indicar con esto que se necesite un exceso molar de anticuerpo respecto a la droga de abuso para conseguir una terapia con éxito. En una composición terapéutica el anticuerpo específico contra la cocaína (anticuerpo monoclonal) bloquea los efectos de un exceso molar de cocaína en un modelo de adicción en ratas. Se inyectaron a las ratas 4 mg de anticuerpo monoclonal antes de la infusión de la cocaína (1 mg/kg; 0 g/rata). La concentración de anticuerpo monoclonal determinada en las ratas fue de aproximadamente g/ml. El anticuerpo se encontraba por debajo de la equivalencia molar a la cocaína cuando se comparó en el animal completo o en el plasma. La afinidad del anticuerpo refleja la cantidad del complejo anticuerpo-droga en equilibrio con anticuerpo no unido y droga de abuso no unida, de esta manera: K eq = [complejo Ab + droga]/[ab] x [droga] donde [Ab] = concentración molar de los sitios de unión del anticuerpo no unidos; [droga] = concentración molar de droga no unida; [Ab+droga] = concentración molar del complejo anticuerpo-droga. Por ejemplo, en base a diferentes cálculos, los anticuerpos con afinidad por la cocaína por encima de 6 M se encuentran en su mayoría unidos a la cocaína y los anticuerpos con afinidades de aproximadamente 7 M están prácticamente todos unidos a la cocaína a las concentraciones plasmáticas esperadas de anticuerpo y cocaína. Capacidad Para Reconocer a la Cocaína Libre Una vez que un conjugado es capaz de incitar una alta titulación de respuesta de anticuerpo en suero, el suero también se chequea mediante un ELISA de competición para valorar su capacidad de reconocer a la cocaína libre como se describe en los Ejemplos. Se pone a punto un ensayo ELISA utilizando una dilución subóptima de suero. Se añaden diferentes concentraciones de cocaína libre junto con el antisuero, y el ELISA se revela como se ha descrito más arriba. Los datos se expresan como la concentración de cocaína libre requerida para competir al % en la unión al anticuerpo, una medida aproximada de afinidad. La lidocaína, entre otras, se utiliza como control negativo en los experimentos de competición, y el conjugado cocaína-transportador utilizado en la inmunización se utiliza como control positivo. Además del ensayo ELISA de competición la unión se evalúa utilizando cocaína marcada radiactivamente. Los datos que resultan de estos ensayos indican si el suero inmune se está uniendo a la cocaína libre. Este punto se discute con más detalle en los Ejemplos. Especificidad de la Respuesta de Anticuerpo Con el fin de tener la máxima eficacia en bloquear la actividad de la cocaína, los anticuerpos inducidos deben tener una afinidad mínima por los metabolitos de la cocaína inactivos desde un punto de vista farmacológico. La unión de los anticuerpos a los metabolitos de la cocaína inactivos desde un punto de vista farmacológico reduciría la potencia de la vacuna. Los metabolitos inactivos principales son el éster metílico de ecgonina, norcocaína y benzoilecgonina, estando todos disponibles comercialmente. La especificidad de los antisueros para cada uno de estos metabolitos se determina en un ELISA de competición y por inmunoensayo con marcaje radiactivo. Estos puntos se discuten con más detalle en los Ejemplos, más adelante. Adicionalmente, debe ser minimizada la interacción de los anticuerpos producidos por otras drogas utilizadas en la terapia de adicción y en otros procedimientos médicos. En particular, se evita la reacción cruzada con drogas prescritas habitualmente para los adictos a la cocaína y a varias drogas. Aunque la naturaleza única de la estructura del anillo de tropano de la cocaína minimiza las reacciones cruzadas, éstas pueden ser valoradas en un ELISA de competición. Así, la lidocaína se utiliza como control negativo en nuestro ELISA de competición. Las siguientes moléculas resultan útiles como cotratamiento, buprenorfina, desipramina, naloxón, haloperidol, clorproazina, y bromocriptina, así como otras que pudieran resultar relevantes. Efecto en la DL de la Cocaína 6 Los conjugados y los protocolos de inmunización que resultan más eficaces para incitar respuestas de anticuerpo específicas con alta titulación se evalúan adicionalmente para valorar su capacidad de desviar la DL de la cocaína. En estos experimentos, a los ratones inmunizados con la cocaína e inmunizados con el transportador (control) se les inyecta por vía intravenosa dosis de cocaína cercanas a la DL definida previamente. Se utilizan diez ratones para cada punto, y los datos se analizan utilizando un test de chi-cuadrado de Cochran-Mantel-Haenzel. 17

18 Además, se utiliza un modelo del tiempo de fallo para analizar el tiempo hasta la muerte inducido por la cocaína. La magnitud en la que los anticuerpos anticocaína incrementan tanto (a) la dosis de cocaína requerida para producir letalidad como (b) el tiempo hasta la muerte, son medidas de la eficacia en este modelo. Estos datos resultan en una evaluación rápida y rigurosa de la eficacia de los anticuerpos in vivo. Observando el Efecto Fisiológico en Seres Humanos Una persona que busca atención médica durante un episodio de abuso puede presentarse con un pulso rápido, una tasa respiratoria aumentada y una temperatura corporal elevada. A altos niveles de sobredosis, se pasa a convulsiones, presión sanguínea marcadamente elevada, y una temperatura corporal muy alta, todos estos factores pueden resultar en shock cardiovascular. Además de los niveles en sangre, todos estos factores serán evaluados y se establecerán criterios específicos cuando se contemple la administración de inmunización activa por medio de una vacuna o la administración pasiva por medio de anticuerpos. Cuando se ensayó en ratones, la inmunización con un conjugado proteína-cocaína indujo una respuesta de anticuerpo que varió la DL de la cocaína (Figuras 11a y b). Se establece la hipótesis de que la relativamente pequeña desviación observada con dosis muy altas de cocaína se traduce en una desviación mayor a concentraciones de cocaína más bajas; el dramático efecto del anticuerpo monoclonal anticocaína en la administración propia de cocaína es consistente con esta hipótesis. A no ser que se indique otra cosa en los Ejemplos, en estos estudios se utilizaron ratas hembra BALB/c de 2-3 meses de edad. Estos animales presentan una respuesta reproducible a los antígenos utilizados en esta investigación. Los animales se inmunizaron bien por vía intramuscular, subcutánea, intratraqueal, o intranasal con un conjugado proteína-cocaína bien en disolución salina, o en alumbre, o en CFA. A no ser que se indique otra cosa, los ratones BALB/c se inmunizaron por vía subcutánea con µg del conjugado a ensayar. Después de 14 días, se administró a los ratones la misma dosis de refuerzo. En los ratones inmunizados utilizando CFA, se utilizó IFA para las inmunizaciones posteriores. Las respuestas de anticuerpo en el suero se determinaron después de 14 días adicionales. Se utilizaron cinco ratones por grupo y todos los sueros fueron ensayados de manera individual. La CTB utilizada en los siguientes ejemplos se encuentra disponible comercialmente, por ejemplo, de List o Sigma. Se sobreentiende que el ejemplo y las realizaciones descritas en la presente memoria tienen un propósito únicamente ilustrativo, y que las personas especializadas en el tema podrán sugerir varias modificaciones. De acuerdo con esto, los siguientes Ejemplos, no limitantes, se ofrecen como guía en la práctica de la presente invención. Ejemplo 1 Síntesis de PS-2 Se trata una disolución de clorhidrato del éster metílico de ecgonina ( mg, 0,21 mmol), diisopropiletilamina (80 l, 0,46 mmol) en DMF (3 ml) con bromuro de bromoacetilo (22 l, 0, mmol) y se calienta a ºC durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (con 9:1 cloroformo:metanol como eluyente), dando lugar al compuesto bromado (67 mg, 96%) como un polvo amarillo claro (éster metílico de ácido 3-(Bromoacetiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico). A una disolución del compuesto bromado (17 mg, 0,03 mmol) en PBS (0, ml), se añade BSA tiolada ( mg) en PBS (0, ml) y se agita de manera continua a temperatura ambiente durante 3 días. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se analiza entonces por análisis espectral de masas. Ejemplo 2 Síntesis de PS-4 6 A una disolución del éster metílico de ecgonina (32 mg, 0,16 mmol) en DMF (2 ml), se añade trietilamina (22 1, 0,16 mmol) seguida de anhídrido succínico (16 mg, 0,16 mmol) y la disolución se calienta a ºC durante 2 horas. El disolvente se elimina bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (con 9:1 cloroformo:metanol como eluyente). Mediante este proceso se obtiene el deseado hemisuccinato (21 mg, 44%) como un polvo blanco (éster metílico de ácido 3-(Succinoloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico). A una disolución del hemisuccinato (2,4 mg, 7,69 mol) en agua destilada (0, ml) a 0ºC, se le añade EDC (1, mg, 7,69 mol). Después de minutos, se añade BSA (2 mg en 0, ml de PBS) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas. 18

19 Ejemplo 3 Síntesis de PS- Método A Se trata una disolución de clorhidrato de norcocaína (1 g, 3,07 mmol), trietilamina (0,86 ml, 6,14 mmol) en DMF ( ml) con anhídrido succínico (614 mg, 6,14 mmol) y la mezcla se calienta a ºC durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (con 2:1 cloroformo:metanol como eluyente). Esto da lugar a la norcocaína succinilada (1,0 g, 84%) en forma de un jarabe espeso (éster metílico de ácido 3-(Benzoiloxi)-8-succinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico). A una disolución del ácido (14 mg, 0,036 mmol) en agua destilada (1 ml) a 0ºC, se añade EDC (,4 mg, 0,0 mmol). Después de minutos se añade gota a gota una disolución de BSA (14 mg) en PBS (1 ml) y la mezcla se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. El conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de conjugación por análisis espectral de masas. Método B A una disolución de BSA (0 mg) en tampón borato 0,2 M (80 ml), se añade anhídrido succínico (270 mg, 2,70 mmol) en 1,4-dioxano ( ml) en alicuotas de 0 l durante minutos. Se mantiene el ph en 9,3 por adición de una disolución de hidróxido sódico 3 N. La disolución se guarda a temperatura ambiente durante 18 horas, se dializa frente a trietilamina 0,01 M y se liofiliza para obtener un polvo blanco. El análisis espectral de masas del producto indica grupos succinoilo por cada molécula de BSA. Se trata una disolución de BSA succinilada (72 mg) en tampón bicarbonato sódico 0,1 M, ph 8,8 ( ml) a 0ºC con EDC (88 mg, 0,46 mmol). Después de minutos, se añade clorhidrato de norcocaína (0 mg, 0,31 mmol) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas. Ejemplo 4 Síntesis de PS-6 A una disolución de benzoilecgonina (276 mg, 0,96 mmol) en DMF ( ml) a -ºC, se añade gota a gota complejo borano-sulfuro de dimetilo (disolución 1,0 M en cloruro de metileno; 1,0 ml, 1,01 mmol). La mezcla se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche, después de lo cual la reacción se para por la adición de THF:agua (proporción 1:1 v/v) seguido de agitación durante minutos adicionales. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (cloroformo seguido de metanol como eluyentes). Esto da lugar al alcohol deseado (246 mg, 93%) como un polvo blanco (3-(Benzoiloxi)-2-(hidroximetil)- 8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano). A una disolución del alcohol (190 mg, 0,69 mmol) en DMF ( ml) se añade trietilamina (0,19 ml, 1,38 mmol), seguida de anhídrido succínico (138 mg, 1,38 mmol) y se calienta a ºC durante toda la noche. Los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía flash con gel de sílice (1:1 cloroformo:metanol como eluyente). Esto da lugar al hemisuccinato (123 mg, 48%) como un polvo blanco (3-(Benzoiloxi)-2-(hidroximetil succinoil)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano). A una disolución del hemisuccinato (16 mg, 0,043 mmol) en agua destilada (0, ml) a 0ºC se añade EDC (12 mg, 0,064 mmol). Después de minutos, se añade gota a gota BSA (16 mg) en PBS (0, ml) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución del conjugado se purifica por diálisis frente a PBS y se determina el grado de haptenación por análisis espectral de masas. Ejemplo Síntesis de PS-9 A una disolución de benzoilecgonina ( mg, 0,0 mmol) en agua destilada (1,0 ml) a 0ºC, se añade EDC ( mg, 0,02 mmol). Después de minutos, se añade gota a gota BSA ( mg) en PBS (0, ml) y la disolución se deja templar a temperatura ambiente durante toda la noche. El conjugado de proteína se purifica por diálisis frente a PBS. El grado de haptenación determina por análisis espectral de masas. 6 19

20 Ejemplo 6 Síntesis de CTB-PS- Método A A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg,,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,,3 mol) seguida de HATU (2 mg,, mol). Después de minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0, mg en 0,9 ml de tampón borato mm, ph 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1, horas. El ph de la disolución del conjugado se ajusta a ph 6, añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico mm, ph 6,. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV. Método B A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg,,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,,3 mol) seguida de HBTU (1,9 mg,, mol). Después de minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0, mg en 0,9 ml de tampón PBS, ph 7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1, horas. El ph de la disolución del conjugado se ajusta a ph 6, añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico mm, ph 6,. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV. Método C A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg,,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,,3 mol) seguida de TNTU (1,9 mg,, mol). Después de minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0, mg en 0,9 ml de tampón PBS, ph 7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1, horas. El ph de la disolución del conjugado se ajusta a ph 6, añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico mm, ph 6,. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV. Método D A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg,,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,,3 mol) seguida de TNTU (1,9 mg,, mol). Después de minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0, mg en 0,9 ml de tampón borato mm, ph 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1, horas. El ph de la disolución del conjugado se ajusta a ph 6, añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico mm, ph 6,. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV. Método E A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg,,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,,3 mol) seguida de PyBroP (2,4 mg,, mol). Después de minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0, mg en 0,9 ml de tampón PBS, ph 7,6) y se agita a temperatura ambiente durante 1, horas. El ph de la disolución del conjugado se ajusta a ph 6, añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico mm, ph 6,. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV. Método F A una disolución de norcocaína succinilada (2 mg,,14 mmol) en DMF (0,1 ml), se añade diisopropiletilamina (2 l,,3 mol) seguida de PyBrop (2,4 mg,, mol). Después de minutos, la disolución de color amarillo pálido se añade gota a gota a una disolución de CTB (0, mg en 0,9 ml de tampón borato mm, ph 7,8) y se agita a temperatura ambiente durante 1, horas. El ph de la disolución del conjugado se ajusta a ph 6, añadiendo cuidadosamente HCl 1 N, seguido de purificación por diálisis frente a succinato sódico mm, ph 6,. El dializado se filtra a través de un filtro 0,2 m y el grado de haptenación se determina por análisis espectral de masas o absorción UV. Ejemplo 7 6 Síntesis Alternativa de CTB-PS- Método A Se agita una disolución de norcocaína succinilada ( mg, 0,39 mol), cloruro de tionilo (28 l, 0,39 mmol) en DMF (2 l) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de que la reacción se estime terminada (por análisis por CCF), los disolventes se eliminan bajo presión reducida y el derivado clorado resultante (éster metílico de ácido 3-(Benzoiloxi)-8-clorosuccinoil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboxílico) se pasa a la siguiente etapa sin purificación adicional.