MODELADO MATEMÁTICO E IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER

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1 MODELADO MATEMÁTICO E IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESCUELA SUPERIOR DE INGENIEROS DE SEVILLA INGENIERÍA DE TELECOMUNICACIÓN AUTOR: JAVIER RIVERO GONZÁLEZ TUTOR: RAMÓN RISCO DELGADO DEPARTAMENTO DE FÍSICA APLICADA III

2 UNIVERSIDAD DE SEVILLA ESCUELA SUPERIOR DE INGENIEROS INGENIERÍA DE TELECOMUNICACIÓN DEPARTAMENTO DE FÍSICA APLICADA III PROYECTO FIN DE CARRERA MODELADO MATEMÁTICO E IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER AUTOR: JAVIER RIVERO GONZÁLEZ TUTOR: RAMÓN RISCO DELGADO JULIO 2012

3 Proyecto fin de carrera: MODELADO MATEMÁTICO E IMPLEMENTACIÓN PRÁCTICA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER Autor: Javier Rivero González Tutor: Ramón Risco Delgado El tribunal nombrado para juzgar el proyecto fin de carrera mencionado, compuesto por: Presidente: Vocal: Vocal secretario: Acuerda otorgarle la calificación de: Sevilla, a de JULIO de 2012

4 A mis padres Sagrario y José Luis y a mi hermano Luis Miguel, por animarme a empezar. A mi mujer Carmen, por animarme a terminar. A mi profesor Ramón por tanta paciencia. A mi hija Sara, por cada minuto de su vida. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 4

5 INDICE CAPÍTULO I. GENERALIDADES DE LA CRIOPRESERVACIÓN 1. INTRODUCCIÓN A LA CRIOBIOLOGÍA FUNDAMENTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN EL AGUA Y EL HIELO EN LA CÉLULA PRINCIPIOS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA PRESERVACIÓN EN FRÍO AGENTES CRIOPROTECTORES (ACP) AGENTE CRIOGÉNICO MECANISMOS DE DAÑO BIOLÓGICO PROTOCOLOS CONVECIONALES DE CRIOPRESERVACIÓN ENFRIAMIENTO LENTO O SLOW FREEZING VITRIFICACIÓN CAPÍTULO II. MODELADO MATEMÁTICO DEL SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO 1. INTRODUCCIÓN ECUACIÓN DE TRANSFERENCIA DEL CALOR MODELOS SISTEMA VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER UNIFORME MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER CUARÁTICO MODELO MATEMÁTICO PERFIL LASER GAUSSIANO RESULTADOS NUMÉRICOS CAPÍTULO III. IMPLEMENTACIÓN DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER 1. INTRODUCCIÓN MÉTODO PROPUESTO DE VITRIFICACIÓN ULTRARRÁPIDA MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA UTILIZACIÓN DE RODAMINA B Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 5

6 3.2. EMPLEO DE TERMOPARES ESPECTROSCOPÍA RAMAN CALENTAMIENTO DE LA MUESTRA MEDIANTE LÁSER ESQUEMA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN REALIZADO CONCLUSIONES CAPÍTULO 4. BIBLIOGRAFÍA APÉNDICES APENDICE I. CONSTANTES FÍSICAS APENDICE II. MEMORIA DE SOLICITUD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN APENDICE III. RESOLUCIÓN FAVORABLE DE INSTITUTO DE SALUD CARLOS III Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 6

7 CAPÍTULO I GENERALIDADES DE LA CRIOPRESERVACIÓN Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 7

8 1. INTRODUCCIÓN A LA CRIOBIOLOGÍA Modelado matemático e La Criobiología es la parte de la Biología que estudia los efectos producidos por las bajas temperaturas en células, tejidos, órganos y organismos vivos. En 1940 comenzó la era moderna de la Criobiología con la publicación de la obra de Luyent Vida y muerte a bajas temperaturas. El frío tiene el poder de preservar así como el poder de destruir. Gracias a los avances científicos, se han podido extraer proteínas de mamuts con más de doce mil años de antigüedad [Prager et al., 1980] y su ADN [Jonson et al., 1985], tras más de cincuenta mil años de almacenamiento a bajas temperaturas. Estos hallazgos suponemos que posibilitarán en un futuro (cuestiones éticas aparte) la clonación y/o recuperación de numerosas especies extintas o en peligro de extinción. Hay que tener en cuenta, no obstante, que probablemente fue ese mismo frío la causa de su muerte. Un problema aún sin solventar y de vital importancia en biología y todas las disciplinas que se basan en el uso de material biológico es su almacenamiento, jugando un papel especialmente relevante dentro de muchas parcelas de la actividad humana: agricultura (semillas) y ganadería (semen), trasplantes, etc. Dicho almacenamiento a largo plazo requiere de la utilización de muy bajas temperaturas, típicamente de entre -140ºC y -180ºC. Está demostrado que existe una relación directa entre la temperatura de almacenamiento y el tiempo durante el que la muestra sigue siendo viable tras su criopreservación. Fue el premio nobel sueco Svante August Arrhenius quien en 1898 desarrolló la ecuación que establece la influencia del descenso de la temperatura en la evolución de las reacciones químicas. A temperaturas inferiores a -140 grados centígrados, la actividad metabólica se detiene, pudiendo hablar entonces de preservación efectiva. Sin embargo, el enfriamiento tradicional de material biológico hasta estas temperaturas provoca indefectiblemente la formación de cristales de hielo, letales salvo en raras excepciones. Desde que se iniciaran hace 50 años los primeros experimentos de preservación en frío se ha avanzado notablemente en el conocimiento de los procesos que tienen lugar cuando se enfría una muestra biológica consistente en un conjunto de células aisladas en suspensión (ni tejidos ni órganos), sobre todo en células reproductoras. En este caso, estas estrategias están basadas en la incorporación de agentes protectores frente al frío así como en la optimización de las velocidades de enfriamiento y recalentamiento, de tal forma que se eviten los diferentes fenómenos físicos y biológicos que puedan acarrear la muerte de la muestra. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 8

9 El problema de la preservación de material biológico de mayores dimensiones, tales como tejidos u órganos, aún no ha podido ser resuelto satisfactoriamente mediante la utilización de agentes crioprotectores. El motivo principal son las concentraciones requeridas para una preservación efectiva, en torno a 8 molar (8 moles de agente crioprotector por cada litro de disolución). Dichas concentraciones resultan con bastante frecuencia tóxicas para los organismos a criopreservar. Existen además otros muchos problemas asociados a la criopreservación, tales como: Elección de la velocidad óptima de enfriamiento. Elección del tipo de crioprotector adecuado. Conductividad térmica finita del medio. Diversidad citológica, en el caso de organismos complejos. Lenta perfusión del crioprotector. Proceso de desvitrificación (formación de hielo durante el retorno a temperatura ambiente). 2. FUNDAMENTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN 2.1. EL AGUA Y EL HIELO EN LA CÉLULA Es el agua con sus preciosas y raras características y no el ADN, la molécula fundamental de la vida [Muldrew et al., 1997]. En células animales constituye alrededor del 80% de su volumen, en vegetales como la lechuga, el 95% mientras que en el otro extremo de la escala nos encontramos algunos tipos de esporas con un 5%; por debajo de este porcentaje los organismos se encuentran en un estado inanimado en el cual se detienen sus procesos bioquímicos. Una célula es básicamente un pequeño saco que encierra una disolución de agua y sales. A este saco le rodea una membrana semipermeable, un tejido especial que solo permite el paso de agua a través de él peo no así las sales que tiene disueltas. Por ello, cuando a través de los diferentes procesos que veremos más adelante el agua entra o sale de la célula, la concentración de las sales disueltas aumenta o disminuye. En los diferentes modelos y experimentos contemplados en este proyecto la muestra considerada siempre se modelará como si de agua pura se tratase, desde el punto de vista de sus constantes físicas, tales como conductividad térmica, difusividad, etc. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 9

10 La molécula de agua está compuesta por dos átomos de hidrógeno y uno de oxígeno, unidos por dos enlaces covalentes dispuestos de tal forma que el átomo de oxígeno se rodea de ocho electrones de valencia, la cual constituye una configuración más estable. Este hecho provoca que dicho átomo disponga de una carga neta negativa, mientras que los átomos de hidrógeno una carga neta positiva. Como consecuencia de esta disposición atómica las moléculas de agua se atraen entre sí, con un enlace intermolecular conocido como puente de hidrógeno; dicho enlace se considera débil pero otorga al agua unas propiedades muy particulares, que juegan un papel esencial en el desarrollo de la vida orgánica. Figura 1. A la izquierda se muestra una representación de la disposición atómica de la molécula de agua. La derecha puentes de hidrógeno formando una estructura tetraédrica. El agua pura se cógela a presión atmosférica a 0 grados centígrados. Sus moléculas estructuradas de forma tetraédrica debido a los puentes de hidrógeno, se agrupan de manera compacta, por lo que la densidad de hielo será menor que la del agua. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 10

11 2.2. PRINCIPIOS FÍSICO-QUÍMICOS DE LA PRESERVACIÓN EN FRÍO Bastan dos principios físicos para explicar lo que tiene lugar en la célula mientras se produce el proceso de enfriamiento: el principio de descenso crioscópico y el principio de ósmosis. DESCENSO CRIOSCÓPICO El descenso crioscópico es una propiedad coligativa, es decir, depende únicamente de la concentración de soluto, y no de la naturaleza del mismo y establece que si se tiene agua pura y disolvemos sales en ella, entonces el agua no se congelará a 0ºC, sino por debajo de esta temperatura, tanto más baja cuanto mayor es la cantidad de sal que se haya disuelto en ella. Consiste pues, en la disminución del punto de fusión de la disolución con respecto al del disolvente puro, y es consecuencia directa de la disminución de la presión de vapor por parte del disolvente al agregarle un soluto. Esta propiedad explica la razón por la cual el agua disuelta con sales, en fase líquida, a temperaturas inferiores a 0 grados centígrados sigue encontrándose en una fase estable. El descenso crioscópico es directamente proporcional a la molalidad (número de moles de soluto por kg de disolvente) y para una solución ideal y diluida, dicho descenso en la temperatura de congelación se puede expresar como: Donde T es el descenso crioscópico, T f es la temperatura de fusión, H la entalpía de fusión y x B la fracción molar del soluto presente. En la figura siguiente se muestra el efecto del descenso crioscópico,, de tal forma que para una misma presión la temperatura del punto de fusión para una solución acuosa es menor que para el agua pura. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 11

12 Figura 2. Diagrama P-T del agua. Descenso crioscópico PRINCIPIO DE ÓSMOSIS El principio de ósmosis establece que cuando se tiene una célula semipermeable sumergida en una disolución salina, entonces el agua empieza a fluir en un sentido tal que tiende a igualar las concentraciones de las disoluciones. Es decir, si se sumerge la célula en una disolución de sales más concentrada que el interior celular, entonces el agua (y sólo el agua) sale de la célula, a consecuencia de lo cual ésta se encoge y reduce su volumen. Si por el contrario, se sumerge la célula en una disolución más diluida que el interior celular, entonces empezará a entrar agua dentro de la célula intentando diluir la disolución salina de su interior; a consecuencia de esto la célula se hincha. La ósmosis, en resumen, es una difusión pasiva a través de una membrana semipermeable, en la cual, las partículas de soluto se dirigen desde la solución más concentrada a la menos concentrada, con una determinada tasa, hasta alcanzar el equilibrio. La presión osmótica es la diferencia de presiones que sufre una membrana semipermeable que separa dos sistemas con distintas concentraciones de soluto. Las membranas biológicas se comportan como membranas semipermeables. La ósmosis se debe a que la membrana semipermeable impide el paso de soluto, del medio más concentrado al menos concentrado, por lo que en el caso de la célula, al introducirla en un medio con una concentración de sales superior al interior celular, medio hipertónico, la célula expulsará agua, Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 12

13 por lo que se encoge y consecuentemente se reduce su volumen. Por otra parte, en el interior de la célula, la concentración de sales será mayor, por lo que desciende el punto de congelación. La figura siguiente muestra las variaciones de volumen que experimentan los glóbulos rojos debido al principio de ósmosis anteriormente descrito. Cuando se sumerge en un medio hipotónico, es decir, con una menor concentración de soluto extracelular, la célula incrementa su volumen al absorber disolvente procedente del medio exterior. En cambio, si la solución extracelular es hipertónica, la célula experimentará una retracción. En el caso de medio isotónico, no se produce difusión, puesto que se encuentra en equilibrio. Figura 3. Consecuencia de la ósmosis en los glóbulos rojos FUENTE: [Osmosis and redblood cells teachers.org] Basándonos en estos dos principios la cadena de eventos que tiene lugar durante la criopreservación es la que se describe a continuación. Cuando se tiene un conjunto de células que se quiere conservar en frío inicialmente las células se tienen sumergidas en el interior de un recipiente que contiene una solución salina isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior celular. Basándonos en estos los principios de descenso crioscópico y de ósmosis la cadena de eventos que tiene lugar durante el proceso de criopreservación es por tanto la que se refiere a continuación. Cuando se empieza a enfriar el preparado celular, el frío alcanza antes la solución exterior que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el medio extracelular cuando no se ha formado aún hielo dentro de la célula. A medida que se forma el Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 13

14 hielo extracelular el agua líquida va desapareciendo. Al disminuir la cantidad de agua exterior, en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a salir agua de la célula para compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares. Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a estar más concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua se expulsa; es aquí cuando interviene el principio de descenso crioscópico dado que a pesar de estar más concentrada la disolución salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. Así, mientras se enfríe poco a poco, el proceso continuará indefinidamente: crecerá el hielo extracelular, saldrá agua de la célula para compensar las concentraciones salidas dentro y fuera, se concentrará la sal dentro de la célula y descenderá aún más la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro. Por ello, con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por completo la formación del dañino hielo intracelular. No obstante conviene mencionar que la no formación de hielo mediante este procedimiento no es sinónimo de supervivencia celular dado que aún cuando no llegue a formarse aparecen dos nuevos factores que pueden perjudicar gravemente a la célula. Por una parte está el hecho de que en cierto instante la concentración de sales dentro de la célula llega a ser tan alta que resulta muy tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la célula su volumen disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales irreversibles. Estos dos factores son tanto o más perjudiciales si cabe que la formación de hielo intracelular; es por ello que en los protocolos de preservación de células aisladas hay que enfriar a una velocidad que sea lo suficientemente lenta como para evitar en lo posible la formación de hielo intracelular, pero a su vez, lo suficientemente rápida como para no producir una deshidratación excesiva que conlleve una destrucción irreversible de la estructura celular AGENTES CRIOPROTECTORES (ACP) Los agentes crioprotectores son sustancias hidrosolubles en agua capaces de modificar las propiedades fisicoquímicas de las soluciones acuosas presentes en la materia viva. La función de los crioprotectores variará dependiendo del tipo elegido. No obstante sus funciones principales son promover una rápida deshidratación celular, y amortiguar el efecto de la alta concentración de solutos en el interior de la célula u organismo a criopreservar. Tras añadir los agentes crioprotectores, se produce la cadena de eventos detallada anteriormente. En resumen, al existir una diferencia de concentración, por el fenómeno de ósmosis, el agua fluye a través de la membrana semipermeable hasta el exterior celular, aumentando la concentración de sales en el interior. Como consecuencia, al estar más concentrada la Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 14

15 disolución salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. El problema reside en que las altas concentraciones requeridas para criopreservar de forma efectiva pueden resultar tóxicas para el organismo a criopreservar. Bioquímicamente es posible distinguir tres tipos de crioprotectores: los alcoholes, azúcares y el dimetilsulfóxido (DMSO). No obstante los crioprotectores se catalogan en base a diversos criterios, especialmente de acuerdo al grado de protección al cristal de agua, a la toxicidad química que pueden tener sobre las células y a la velocidad para penetrar los tejidos. El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes. Las concentraciones crioprotectoras son lamentablemente tóxicas para el tejido a temperatura ambiente, por lo cual en el procedimiento de congelado se deben respetar ciertos tiempos de exposición del material a 4ºC, para que el producto protector penetre el tejido sin alcanzar los niveles tóxicos referidos, antes del inicio del proceso de congelación propiamente dicho. En el mismo sentido, cuando se procede a la técnica de descongelado, previamente al uso del material, se le debe someter a un lavado minucioso con medios nutritivos a concentraciones decrecientes del crioprotector, para su total eliminación evitando de esta forma los efectos tóxicos. A este respecto fue el profesor David Pegg de la Universidad de York, quien descubrió que los cambios bruscos en la concentración de una solución lleva aparejada una disminución de la supervivencia de las células suspendidas de tal forma que incluso bajas concentraciones a temperatura ambiente llegan a ser letales para el material biológico a criopreservar. La recuperación de dicho material está estrictamente vinculada no sólo con la temperatura, sino también con el tiempo de exposición al crioprotector. La relación que muestra esta dependencia es exponencial y fue presentada por Gregory Fahy en 2005, a través de la expresión siguiente: 100 Donde t es el tiempo y β una constante que depende del crioprotector empleado y de la temperatura. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 15

16 De acuerdo a la permeabilidad celular se pueden considerar dos tipos de crioprotectores: Crioprotectores no penetrantes Son sustancias de alto peso molecular, efectivas a velocidades altas de congelación, caracterizadas por ejercer su acción protectora promoviendo la rápida deshidratación celular, por lo que suelen utilizarse asociados a los agentes penetrantes. Los más utilizados son: sacarosa, dextrosa, glucosa, polivinilpirrolidona (PVP), dextrano y polietilenglicol. Crioprotectores penetrantes Son sustancias de bajo peso molecular que penetran en el interior de la célula y actúan deshidratando la célula por sustitución del agua intracelular, amortiguando el incremento de concentración de solutos en el medio extracelular, impidiendo la formación de cristales en el interior y evitando el estrés osmótico. Los más empleados son el 1-2 propanodiol, dimetilsúlfóxido (DMSO), etilenglicol y glicerol. Figura 4. A la izquierda se muestra una representación tridimensional del propanodiol. A la derecha se representa modelo tridimensional del Dimetilsulfóxido (DMSO). Los crioprotectores que penetran la célula reemplazan el agua, es decir, entra el agente crioprotector y sale el agua. El no penetrante, en cambio, evita el arrugamiento excesivo de la membrana plasmática, que ocurre cuando entra crioprotector y sale agua, ya que las velocidades son diferentes (sale más rápido el agua). Por lo tanto, en criopreservación, se utiliza una mezcla de crioprotectores penetrantes y no penetrantes. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 16

17 Numerosos estudios ponen de manifiesto la dependencia de la velocidad de enfriamiento de algunos crioprotectores, como el 1-2 propanodiol, con la concentración de crioprotector, demostrándose que éste aumenta de forma logarítmica al disminuir la cantidad de crioprotector. Esto supone que podremos disminuir la cantidad de crioprotector necesaria hasta unas concentraciones que no resulten tóxicas para el organismo a criopreservar, aumentando la velocidad de enfriamiento. En la siguiente gráfica podemos observar como disminuye la cantidad de hielo formado al aumentar la cantidad de crioprotector, en este caso, dimetilsulfóxido (DMSO). [Fuller et al., 2004]. Figura 5. Cantidad de hielo formado en una solución 0.5M de NaCl con diferentes concentraciones de DMSO. Fuente: Fuller et al, AGENTE CRIOGÉNICO Tradicionalmente se han empleado como contenedores de muestras a criopreservar pajuelas de 0.25 ml de capacidad. Para conseguir un descenso rápido de la temperatura, la técnica más utilizada es la inmersión de dicha pajuela en nitrógeno líquido (-196 ºC). Es un error pensar que las temperaturas alcanzadas con este procedimiento, son siempre capaces de vitrificar las muestras [Risco et al, 2007]. La transferencia de calor en las mismas presenta numerosos problemas, entre ellos el efecto Leidenfrost, que consiste en la formación de una capa de vapor alrededor de la muestra durante la inmersión en el líquido criogénico desde temperatura ambiente. Si disminuye este efecto, se reduce la capa de vapor aislante y conseguimos un incremento en la tasa de enfriamiento. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 17

18 Con objeto de solventar este problema durante la ejecución de los experimentos se plantearon dos opciones: Emplear como agente criogénico nitrógeno slush es decir nitrógeno líquido subenfriado (-210ºC) con partículas solidas en él, que es una mezcla bifásica entre sólido y líquido cuya principal ventaja no solo reside en la diferencia de temperatura con respecto al nitrógeno líquido sino en la reducción del efecto Leidenfrost. Figura 6. Efecto Leidenfrost. Fuente: The modernist cuisine Utilizar nitrógeno gaseoso como método para actuar sobre la muestra. Para ello se parte del nitrógeno gaseoso almacenado en condiciones adecuadas de presión y temperatura en su recipiente contenedor. A través de una unión T en los conductos de salida, ésta se bifurca ofreciendo dos caminos para el gas, uno de los cuales se hará pasar por un serpentín inmerso en nitrógeno líquido, logrando un descenso de temperatura notable del propio gas. Los trayectos seguidos por el gas a diferentes temperaturas terminan cada uno de ellos en una electroválvula gestionada por el sistema de control que permite obtener una mezcla a la salida con una temperatura controlada de forma que se puede implementar una rampa de descenso de temperatura acorde con el funcionamiento del láser con objeto de lograr una temperatura estable de 37ºC en la muestra de una forma suave mientras que el Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 18

19 entorno de la misma puede alcanzar los -150ºC. Este sistema fue el que finalmente se utilizó dado que ofrece un mayor control del enfriamiento del entorno de la muestra. Figura 7. Montaje sistema actuación agente criogénico Fuente: Grupo Cryobiotech MECANISMOS DE DAÑO BIOLÓGICO Citando al profesor M. Kasai, sobre los daños durante el proceso de criopreservación, [Kasai et al., 1996]: Típicamente podemos encontrarnos seis tipos de daños durante el proceso de criopreservación: - Hielo intracelular - Excesiva toxicidad del crioprotector - Incremento de la presión osmótica - Reducción de la presión osmótica - Daño de fractura - Hielo extracelular Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 19

20 Durante la vitrificación es fundamental controlar las condiciones de manipulación del embrión, ya que una leve diferencia en la misma puede suponer una gran disminución de la tasa de supervivencia obtenida tras la criopreservación, [Kasai et al, 2002]. Además la concentración de la solución de vitrificación que rodea cada embrión variará dependiendo de la manipulación al usar los diferentes instrumentos, como por ejemplo la pipeta. Para encontrar las condiciones óptimas en la criopreservación de un embrión, es fundamental identificar el mecanismo por el cual se produce el daño en cada protocolo o procedimiento. Los embriones corren el riesgo de sufrir varios tipos de daño durante la criopreservación. Los principales daños son el hielo intracelular y los relativos a un exceso en la concentración de soluto, dada su elevada toxicidad. La velocidad de enfriamiento, nos determinará a qué tipo de daño estamos más expuestos. Por ejemplo, si criopreservamos embriones mediante slow freezing, la principal causa de daño es el hielo intracelular, esto es consecuencia del proceso de ósmosis y el principio del descenso del punto de congelación, [Wittingham et al, 1972]. Por otra parte en vitrificación el efecto de la toxicidad en una alta concentración de crioprotector es el mayor obstáculo [Rall and Fahy, 1985]. Por otro lado, es importante considerar que la estrategia para disminuir estos daños, es completamente distinta según el tipo de daño. La introducción del crioprotector en la célula puede producir un tercer tipo de daño, el aumento de la presión osmótica. Durante el proceso de recalentamiento, en el proceso de extracción del crioprotector, el agua entra más rápidamente de lo que sale el crioprotector. Para prevenir esto, empleamos una solución decreciente con sacarosa, junto con soluciones decrecientes de crioprotector [Kasai et al, 1980; Leibo, 1983]. No obstante una solución con demasiada sacarosa, puede producir una reducción de la presión osmótica [Pedro et al, 1997]. Además las células corren el riesgo de sufrir hielo extracelular y fractura plana. El daño de fractura es la disección física de los embriones, el cual se produce por un cambio no uniforme en el volumen del medio, originado durante un cambio rápido de fase [Kroener and Luyet, 1996; Rall and Meyer, 1989]. Las células pueden sufrir daños físicos extracelulares, si durante el proceso de descongelación, existe una parte localizada, que posee una temperatura muy inferior al resto [Schneider and Mazur, 1987]. La formación de hielo comienza en el exterior celular (de -2ºC a -5ºC). Tras este hecho, dependiendo de la velocidad de enfriamiento, se producirán distintas consecuencias. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 20

21 a) Si el proceso de enfriamiento es suficientemente lento, entonces no se forma hielo intercelular. Si embargo, una excesiva pérdida de agua por parte de la misma puede resultar letal, ya que da lugar a una reducción de volumen, que en algunos casos resulta irreversible y a un aumento del hielo extracelular. b) Si se enfría a una velocidad intermedia entonces sí se produce hielo intracelular y extracelular, ya que la célula no se deshidrata suficientemente y por tanto el descenso del punto de congelación no llega a ser el necesario para conseguir un resultado óptimo. c) Cuando se enfría a velocidades muy altas se produce vitrificación, evitando la formación de hielo intracelular y disminuyendo el hielo extracelular. Figura 8. Esquema de los sucesos físicos que ocurren durante el enfriamiento Fuente: Grupo Cryobiotech. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 21

22 3. PROTOCOLOS CONVECIONALES DE CRIOPRESERVACIÓN Hay dos enfoques tradicionales para la criopreservación de material biológico: el slow freezing y la vitrificación siendo esta última la más extendida. Se clasifican según la velocidad de enfriamiento empleada ENFRIAMIENTO LENTO O SLOW FREEZING Para emplear este método de criopreservación se emplean velocidades de enfriamiento bajas y consiste en someter al organismo biológico a un descenso de temperatura programado, controlando las velocidades de enfriamiento, las cuales variarán entre -2ºC/min y -50ºC/min. De esta forma, se consigue una nucleación controlada formándose hielo extracelular, pero evitando la formación de hielo intracelular que resulta letal para el organismo. DAÑOS POR ENFRIAMIENTO LENTO (SLOW FREEZING) Durante el slow freezing la temperatura disminuye lentamente. El agua intracelular abandona la célula evitando la formación de hielo intracelular, pero obteniéndose como consecuencia el aumento del hielo extracelular. La célula se deshidrata, por lo que disminuye su volumen bruscamente; esto puede provocar deformaciones críticas en la muestra biológica. Otra consecuencia de la disminución de agua en el medio intracelular, es el aumento de la concentración de soluto, especialmente de electrolitos Na +, K +, Ca +, Cl +, etc, tóxicos para nuestro organismo. Lovelock propuso en la década de 1950 que son precisamente estos electrolitos los responsables de los daños en las células. También expuso que los crioprotectores al encontrarse disueltos en el interior celular, disminuían la concentración de los electrolitos, protegiendo al material biológico de la toxicidad de los mismos. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 22

23 Figura 9. Deshidratación de un espermatozoide humano a distintas velocidades de enfriamiento. Según la ecuación de Arrehnius la conductividad decrece con la temperatura, por lo que la deshidratación es mucho menos acusada con el incremento de la velocidad de enfriamiento [Mazur et al, 1996] 3.2. VITRIFICACIÓN La vitrificación es la solidificación amorfa debido a un enfriamiento ultrarrápido de la muestra evitando la formación tanto de hielo intracelular como extracelular. Esta técnica fue descubierta hace 50 años por C. Polge [Polge et al, 1949] y J. Lovelock [Lovelock, 1953]. La no formación de hielo mediante este procedimiento no es sinónimo de supervivencia celular, ya que a pesar de no formarse hielo, existen otros factores que perjudican gravemente la célula. Por una parte está el hecho de que en cierto instante la concentración de sales dentro de la célula llega ser tan alta que resulta muy tóxica. Por otra parte, al salir tanta agua de la célula su volumen disminuye peligrosamente, produciendo deformaciones estructurales irreversibles. Existen diferentes estrategias para lograr la vitrificación, pasando todas ellas por la utilización de una alta concentración de agentes crioprotectores (etilenglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) o 1,2 propanodiol), hasta 8 M en algunos casos [Kasai et al, 2002]. Además, para conseguir una adecuada vitrificación se necesitan generalmente velocidades de enfriamiento muy elevadas, del orden de decenas de miles de grados por minuto. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 23

24 Generalmente se emplea nitrógeno líquido como solución criogénica. Las modificaciones en dicha solución también incrementan de forma notable la tasa de enfriamiento. Como alternativa al nitrógeno líquido, se ha explotado también el uso de propano como solución criogénica [Steponkus et al, 1990], sin embargo, la permeabilidad de las células a esta molécula limita su utilización. Otra posibilidad es el uso de mezclas criogénicas como slush (nitrógeno líquido subenfriado procedente del cambio de fase de nitrógeno líquido) o slurry (mezla de nitrógeno líquido con diferentes partículas como cobre en polvo o cloruro de sodio, dependiendo de las características de la muestra a criopreservar). La utilización del nitrógeno slush reduce el efecto Leidenfrost, es decir disminuye la formación de la capa de vapor que se forma alrededor de la muestra e impide una transferencia de calor eficiente [Mazur et al, 2004]. La gráfica siguiente muestra la dependencia de la tasa de supervivencia con la velocidad de enfriamiento. No obstante, la forma de las curvas, el nivel de supervivencia y la velocidad de enfriamiento para la cual la criopreservación es efectiva depende del tipo celular empleado. Figura 10. Velocidad de enfriamiento frente a porcentaje de supervivencia Fuente: Grupo Cryobiotech. Son tres los parámetros biológicos que tiene especial influencia en la posición y forma de las curvas de supervivencia: la energía de activación, la permeabilidad del agua y el tamaño de la célula, o más concretamente la relación volumen/área [Mazur et al, 1996]. Un incremento en la permeabilidad del agua tiene un efecto comparable a un decremento de la velocidad de enfriamiento. El efecto que produce el tamaño de la célula es contrario, es decir un incremento en el ratio volumen-área, reduce la velocidad de enfriamiento requerida para producir hielo intracelular con la misma probabilidad. Las gráficas siguientes muestran la tasa de supervivencia de diferentes organismos a distintas velocidades de enfriamiento, observándose Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 24

25 en ellos un comportamiento en forma de U invertida, característico en este tipo de representaciones: Figura 11. Tasa de supervivencia frente a la velocidad de enfriamiento, para óvulos, linfocitos y glóbulos rojos, a - 196ºC, en 0.7 a 1 M de Dimetilsulfóxido. [Leibo et al, 1981]. Figura 12. Supervivencia en función de la velocidad de enfriamiento para glóbulos rojos humanos suspendidos en una solución salina que contiene las concentraciones indicadas de glicerol, enfriadas hasta -196ºC y recalentadas rápidamente. Datos de Morris y Farrant (1972), Mazur y Miller (1976). Figura modificada de Souzu y Mazur (1978). Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 25

26 Los mejores resultados se han obtenido mediante el uso de técnicas de vitrificación; no obstante los mecanismos clásicos de vitrificación requieren del uso de altas concentraciones de crioprotector, resultando a menudo tóxicas para el organismo a vitrificar. Existen tipos celulares que no pueden ser criopreservados con facilidad mediante las técnicas convencionales, como por ejemplo los oocitos humanos, ciertas líneas tumorales, etc. En estos casos los mejores resultados se han obtenido mediante el uso de técnicas de vitrificación; no obstante la alta concentración de crioprotector necesaria para vitrificar resulta frecuentemente tóxica. Con el presente proyecto se pretende alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo; esta velocidad de enfriamiento es muy superior a la convencional alcanzada por la inmersión directa de la muestra en nitrógeno líquido (varios miles de grados por segundo), y suficiente para vitrificar incluso agua pura. El método aquí expuesto consistiría en la aplicación de una radiación láser infrarroja sobre una célula o conjunto de células mediante el objetivo del microscopio de tal forma que se mantenga la temperatura de la muestra permanentemente a 37ºC, aún cuando todo el medio extracelular se va enfriando hasta alcanzar -150ºC. Llegados a este punto, se desconecta súbitamente el láser y la célula vitrifica. La muestra se sitúa en un capilar de policarbonato (técnica novedosa diseñada por D. Ramón Risco) que mejoran la transmisión de calor, la velocidad de enfriamiento y reducen la cantidad de crioprotector necesaria para una vitrificación óptima. El control de la acción del láser requiere de la medición de la temperatura de la muestra en cada momento mediante algún procedimiento no invasivo, barajándose el uso de Rodamina B, el aprovechamiento del efecto Raman y el uso de un termopar. DAÑOS ASOCIADOS A LA VITRIFICACIÓN Durante la vitrificación se alcanzan velocidades de enfriamiento muy elevadas. La célula pierde agua más lentamente, solventándose de esta forma el problema de la alta concentración de soluto en el interior celular. No obstante, al producirse la congelación del medio extracelular, se forma una capa de cristales que rodean la célula. Los Aquaporins son canales proteínicos que permiten la circulación de moléculas de agua. Estos cristales formados en el exterior de la célula entran a través de los aquaporins generándose hielo intracelular que puede resultar letal para la muestra. La estructura dendrítica de los mismos rasga y araña los orgánulos internos e incluso podría llegar a romper la membrana celular. El problema del hielo Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 26

27 intracelular ha sido analizado en numerosos estudios en el campo de la alimentación, ya que dichos cristales reducen la calidad de los alimentos, suponiendo importantes pérdidas. En el caso de óvulos o células madre, estos cristales pueden suponer la muerte celular. Por otra parte la vitrificación permite mayor flexibilización en su aplicación que el slow freezing, se efectúa rápidamente, en pocos minutos y elimina la necesidad de mantenimiento de equipos caros [Liebermann et al, 2004]. Su éxito depende básicamente del tiempo de exposición al crioprotector, y de la obtención de una técnica depurada y estandarizada, por lo que se hace imprescindible un personal entrenado adecuadamente. TIPOS DE CONTENEDORES EMPLEADOS EN LA INMERSIÓN EN NITRÓGENO LÍQUIDO Para conseguir las velocidades de enfriamiento requeridas para la vitrificación, la técnica más utilizada es la inmersión de las muestras en nitrógeno líquido. Se han desarrollado diversos sistemas, la mayoría de ellos busca el diseño de un contendor que consiga una transferencia de calor óptima. - Rejilla de cobre de microscopía electrónica: sobre las que se disponen las gotas de la suspensión de células. Posteriormente son sumergidas en nitrógeno líquido [Martino et al, 1996b]. - Open Pulled Straws (OPS) [Vatja et al, 1997] y Closed Pulled Straws. Este contenedor es el más utilizado. Son pajuelas de 0.25 ml de PVC abiertas y cerradas, respectivamente. Se cargan con la suspensión de material biológico y se sumergen en nitrógeno líquido. Este método elimina los problemas de contaminación por contacto directo con el nitrógeno líquido pero reduce la tasa de enfriamiento, dado el gran volumen de la pajuela. Asimismo las altas concentraciones necesarias para cubrir dicho volumen pueden resultar tóxicas para el organismo a vitrificar. [Kuwayama et al, 2007]. - Crioloops, este contenedor se caracteriza por su forma, basada en espirales de nylon que se impregnan de la solución de vitrificación donde se encuentra la muestra a criopreservar, en suspensión. Una vez cargado, el anillo se sumerge en nitrógeno líquido [Lane et al, 1997]. - Solid-Surface Vitrification (SSV), consiste en lanzar las microgotas de la suspensión de células sobre una superficie metálica enfriada con nitrógeno líquido. [Dinnyes et al, 2000]. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 27

28 - Cryotop [Hochi et al, 2004; Kuwayama et al, 2005]. Las muestras son cargadas en un capilar de plástico con un volumen inferior a 0,1 µl y de paredes muy finas. Después se sumerge en nitrógeno líquido. Con este método se consigue minimizar el volumen de la muestra y maximizar la velocidad de enfriamiento, permitiendo disminuir la concentración de crioprotectores. - Cryotip [Kuwayama et al, 2005 y 2005b], es una modificación del Cryotop. El capilar se encentra sellado por ambos extremos para evitar la contaminación por contacto directo con el nitrógeno líquido. Se ha visto que la probabilidad de contaminación es baja, por lo que la eficiencia obtenida en ambos casos (Cryotop y Cryotip) es la misma. - Cryostage, sistema en el que se coloca la muestra que se desea criopreservar. Dispone de una ventana transparente a la radiación infrarroja pues como método de calentamiento de la muestra se utilizaría un láser con longitud de onda de 1440 nm, con el fin de aprovechar el máximo relativo que la curva de absorción del agua presenta en esta longitud de onda. El sistema dispone de una serie de entradas y salidas que se conectarán al sistema de enfriamiento y que internamente se prolonga a una serie de conductos por los que circulará el refrigerante y proporcionará el entorno frío que precisa el mecanismo de vitrificación. Esta fue la primera opción que se barajó como contenedor criogénico y que se propuso en la memoria de solicitud del proyecto de investigación al instituto de salud Carlos III (concedido en 2005). - Los capilares de policarbonato (PC), tiene un diámetro exterior de mm y un espesor de mm. En la figura siguiente observamos la diferencia de volumen entre el capilar y un OPS con un diámetro de mm y espesor de pared de mm. En el caso del Cryotop, el diámetro es mm y mm de espesor. La reducción de volumen que supone el capilar respecto a los otros contenedores, se traduce en una eficiente transferencia de calor, unas 20 veces [Risco et al, 2007]. Para albergar la muestra se optó por el uso de este tipo de capilares. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 28

29 Figura 13. Comparación entre el capilar de policarbonato y otros contenedores utilizados para criopreservar. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 29

30 CAPÍTULO II MODELADO MATEMÁTICO DEL SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 30

31 1. INTRODUCCIÓN Existen tipos celulares que no pueden ser criopreservados con facilidad mediante las técnicas convencionales tales como el slow freezing. En estos casos los mejores resultados se han obtenido mediante el uso de técnicas de vitrificación; no obstante la alta concentración de crioprotector necesaria para vitrificar resulta frecuentemente tóxica. En el presente apartado se expondrán diversos modelos matemáticos del fenómeno físico de vitrificación mediante una técnica basada en el uso de radiación láser. Con esta técnica se pretende alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo, muy superior a la convencional obtenida por la inmersión directa de la muestra en nitrógeno líquido (varios miles de grados por segundo), y suficiente para vitrificar incluso agua pura. Como se ha indicado anteriormente el método aquí expuesto consistiría en la aplicación de una radiación láser infrarroja sobre una célula o conjunto de células aprovechando el objetivo del microscopio de tal forma que se mantenga la temperatura de la muestra permanentemente a 37ºC, aún cuando todo el medio extracelular se va enfriando hasta alcanzar -150ºC. Llegados a este punto, se desconecta súbitamente el láser y la célula vitrifica. Es la evolución de la temperatura en diferentes puntos de la muestra a lo largo del tiempo lo que se modelará a continuación, extrayendo de tales resultados una confirmación numérica de la alta velocidad de enfriamiento que se alcanza con este procedimiento. Como hipótesis de partida supondremos que el medio criogénico en que se situará la muestra se encuentra en estado de reposo de tal forma que el único mecanismo de transferencia de calor que se contemplará será el de conducción. Así mismo se considerarán diferentes modelos matemáticos para el perfil de calentamiento de la luz emitida por el láser en toda su zona de influencia, desde un modelo uniforme hasta un modelo de perfil gaussiano más cercano a la realidad. Debido que la célula es básicamente una disolución de agua y sales encerrada por una membrana semipermeable, y teniendo en cuenta que el primer paso de los experimentos con esta técnica se desarrollan con agua pura, modelaremos las muestras como si fueran de agua, al objeto de obtener una estimación de las velocidades de transferencia de datos con la técnica antes expuesta. A estos efectos la consideraremos como un disco plano. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 31

32 2. ECUACIÓN DE TRANSFERENCIA DEL CALOR Modelado matemático e La transferencia de calor es aquella ciencia que busca predecir la transferencia de energía que puede ocurrir entre cuerpos materiales, como resultado de una diferencia de temperatura. La termodinámica por su parte proporciona un nombre a esta transferencia de energía: calor. La experiencia ha demostrado que cuando existe un gradiente (una variación) de temperatura en un cuerpo tiene lugar una transferencia de energía desde la región de mayor a la de menor temperatura. En esta situación la energía es transferida por conducción y la rapidez de transferencia de energía por unidad de área resulta proporcional al gradiente normal de dicha temperatura: q A T x Una vez introducida la constante de proporcionalidad correspondiente, la expresión se transforma en: $ %&' ( ( Donde q es la rapidez de transferencia de calor y T ) x es el gradiente de temperatura en la dirección del flujo de calor. A la constante de proporcionalidad positiva k se denomina como conductividad térmica del material, y el signo menos de la expresión se inserta con objeto de que se satisfaga el segundo principio de la termodinámica, es decir, el calor deberá fluir hacia abajo en la escala de temperatura (de temperaturas altas a temperaturas bajas). A la expresión anteriormente referida se la denomina habitualmente como ley de conducción de Fourier en honor al físico matemático Joseph Fourier, quien realizó importantes contribuciones en el tratamiento analítico de la transferencia de calor por conducción. A partir de la expresión que recoge la ley de Fourier de la transferencia de calor nos planteamos el problema de determinar la ecuación básica que gobierna la transferencia de calor en un sólido. Considérese el sistema unidimensional que aparece reflejado en la figura 1. Si el sistema se encuentra en un estado estacionario, es decir la temperatura no cambia con el tiempo, la resolución del problema tan solo exige integrar la ecuación de conducción de Fourier y sustituir los valores adecuados para resolverla para la cantidad deseada. No obstante si la temperatura cambia con el tiempo, o si hay fuentes de calor o sumideros dentro del sólido, la situación se Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 32

33 torna algo más compleja. Consideremos el caso general en el que la temperatura puede estar cambiando con el tiempo y dentro del cuerpo puede haber fuentes de calor. Para el elemento de espesor dx se puede realizar el siguiente balance de energía, valorando la cantidad de energía que entra, la que sale y a que se genera: Energía conducida en la cara izquierda + calor generado dentro del elemento = cambio en la energía interna + energía conducida fuera de la cara derecha Estas cantidades de energía están dadas de la siguiente manera: Donde: Energía en la cara izquierda: $ * %&' +, +* Energía generada dentro del elemento: $-'. Cambio en la energía interna: /' +, +0. Energía hacia fuera de la cara derecha: $ *12* %&' ( ( *12* %'4& ( ( 5 ( ( 6&( ( 7.8 $-: refleja la energía generada por unidad de volumen. c: calor específico del material /: densidad Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 33

34 Figura 14. Volumen elemental para el análisis de la conducción de calor unidimensional La combinación de los elementos expresados antes nos da: %&' ( 5 $'. /'( ( (: % ' 4&( - ( 5 ( ( 6&( ( 7.8 Simplificando la expresión anterior obtenemos: ( ( 6&( 75 $- /( ( (: Esta es la ecuación de conducción de calor unidimensional (tengamos en cuenta que solo se contempla la variación en la dirección x). Con objeto de generalizar dicha expresión a las tres dimensiones (x, y, z) realizaremos el balance de energía considerando el calor conducido hacia adentro y hacia afuera de un volumen unitario, en las tres direcciones coordenadas, tal y como se muestra a continuación: $ * 5 $ ; 5 $ < 5 $ =>? $ *12* 5 $ ;12; 5 $ <12< 5.@.: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 34

35 Figura 15. Volumen elemental para el análisis de la conducción en coordenadas cartesianas Y las cantidades de energía están expresadas por $ * %&.A.B ( ( $ *12* %4& ( ( 5 ( ( 6&( ( 7.8.A.B $ ; %&..A ( (A $ ;12; %4& ( (A 5 ( (A 6&( ( 7.A8..B $ < %&..A ( (B $ <12< %4& ( (B 5 ( (B 6&( (B 7.B8..A $ =>? $-..A.B Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 35

36 /..A.B( (: De manera que la ecuación general de conducción de calor tridimensional es: ( ( 6&( ( 75 ( (A 6&( (A 75 ( (B 6&( 75 $- /( (B (: Suponiendo la conductividad térmica constante, la ecuación anterior se escribe como: ( ( 5 ( (A 5 ( (B 5 $- & 1 C Donde la cantidad C & )/ se denomina difusividad térmica del material. Cuanto mayor sea el valor del citado parámetro, tanto más rápida será la difusión de calor a través del material. Esto puede observarse examinando los parámetros que conforman C. ( (: Un elevado valor de C puede ser el resultado de un alto valor de conductividad térmica, que indicará una elevada rapidez de transferencia de energía o de un valor bajo de la capacidad calorífica /. Un valor bajo de la capacidad calorífica significará que se absorberá dentro del material una menor cantidad de la energía en movimiento y será utilizada para aumentar la temperatura del material; por tanto, habrá más energía disponible de transferencias ulteriores. En las expresiones anteriores, la expresión para la derivada en x + dx se ha descrito en la forma de una expansión en serie de Taylor empleando para el desarrollo tan solo los dos primeros términos de la serie. Si bien la expresión de la ecuación de transferencia de calor se ha expresado por defecto en coordenadas cartesianas, es posible adecuar la expresión de la ecuación a las coordenadas que mejor se adapten a la geometría del problema a resolver, tal y como podremos comprobar más adelante, siendo las más habituales la expresión en coordenadas cilíndricas y esféricas. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 36

37 En coordenadas cilíndricas: Tras aplicar la transformación de coordenadas cartesianas a coordenadas cilíndricas, mediante la aplicación de las expresiones de equivalencia: Obtenemos como resultado: D E AD EF BB ( ( 5 1 ( ( 5 1 ( (E 5 ( (B 5 $- & 1 ( C (: Figura 16. Volumen elemental para el análisis de la conducción en coordenadas cilíndricas Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 37

38 En coordenadas esféricas: Tras aplicar la transformación de coordenadas cartesianas a coordenadas cilíndricas, mediante la aplicación de las expresiones de equivalencia: Obtenemos como resultado: D G D E AD G D EF BB D E ( ( 5 1 ( ( 5 1 ( (G 5 ( (B 5 $- & 1 ( C (: Figura 17. Volumen elemental para el análisis de la conducción en coordenadas esféricas Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 38

39 3. MODELOS SISTEMA VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDA 3.1. MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER UNIFORME Como primer modelo de la situación física que nos ocupa vamos a considerar una situación bidimensional en la que tendremos un disco circular de radio R c, que modelará la célula, que se halla irradiada por un láser, (al que supondremos un radio de influencia R 0 algo superior al tamaño de la muestra para disponer de un margen de seguridad entre la muestra y el entorno) de forma que supondremos que ha alcanzado una temperatura estacionaria igual a T int en todos los puntos de su superficie. El soporte de la muestra es enfriada (supondremos situada en el interior de una cryostage o dentro de los capilares de policarbonato) con alguna de las técnicas disponibles, a una temperatura T ext. Podemos depreciar efectos de borde y considerar la situación tal y como se muestra en la ecuación siguiente. O? D P Q THr,θ,tM N >* D R Q De esta forma mantenemos a una temperatura habitable tanto la muestra como una zona del entorno de la misma, dado que el laser no se puede ajustar con tanta precisión al borde exacto de la muestra. La ecuación de transferencia del calor será, tal y como se indicó anteriormente: S T Hr,θ,tM 1 THr,θ,tM t Dada la geometría cilíndrica del problema se representará la dicha ecuación en coordenadas cilíndricas: ( H,G,TM ( 5 1 (H,G,TM 5 1 ( H,G,TM 1 ( (G C (H,G,TM (T Donde α es una propiedad física conocida como difusividad térmica, que en el caso del agua (H 2 O) tiene un valor de 1, m 2 /s. Con objeto de simplificar el cálculo y evitar que los resultados dependan de valores y unidades concretas de las variables físicas vamos a proceder a adimensionalizar previamente las mismas, de la siguiente forma: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 39

40 Variable Original Rango Variable adimensional Rango r U0, W R = X Y Z U0,1W G U0,2\W Ω G 2\ t U0, W : = Y Z^ U0,1W U0, W T U0, W _ % >* O? % >* U0,1W Tabla 1. Variables adimensionalizadas para resolver el problema Así pues realizando los cambios de variable propuestos en la tabla anterior obtenemos que: H`a, % bc, M 1 ( _ Q ( 5 1 Q H`a,% bc, M (_ Q ( 5 1 Q H`a,% ( _ bc, M H2\M (Ω 1 C H`a,% (_ bc, M Q (: Simplificando la expresión anterior obtenemos la expresión adimensionalizada de la ecuación diferencial de transferencia de calor en coordenadas cilíndricas: ( _H,Ω,:M ( 5 1 (_H,Ω,:M 5 1 ( _H,Ω,:M (_H,Ω,:M ( (G (: Donde las variables H,Ω,:M son adimensionales, e independientes del sistema de unidades elegido. Dada la simetría cilíndrica del problema, al haber modelado la muestra a irradiar como un círculo plano, la temperatura adimensional _ resulta independiente de la variable Ω, por lo que la ecuación diferencial en derivadas parciales se reduce a: ( _H,:M 5 1 (_H,:M (_H,:M ( ( (: Dadas las características de la ecuación diferencial se aplicará el método de la separación de variables, por lo que la función de temperatura se descompondrá como: _H,:M ΓHMeH:M Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 40

41 Sustituyendo esta expresión en la ecuación diferencial anterior: ( ΓHMeH:M 5 1 (ΓHMeH:M (ΓHMeH:M ( ( (: Sacando factor común y agrupando adecuadamente los términos: Obtenemos: eh:mf ( ΓHM ( ΓHM f( ΓHM 5 1 ( (ΓHM ( g ΓHM(eH:M (: (ΓHM ( g 1 (eh:m eh:m (: Como puede comprobarse el término de la izquierda de la igualdad anterior depende exclusivamente de la variable radial (R), mientras que el miembro de la derecha depende únicamente de la variable temporal (:M, lo cual únicamente puede ser cierto para todo valor de R y : si ambos miembros son constantes, e iguales a h. Dado que el segundo miembro de la ecuación depende únicamente de la variable temporal, la ecuación diferencial en derivadas parciales se transforma en una ecuación diferencial lineal ordinaria: 1.eH:M %h eh:m.: La solución de la ecuación anterior presenta un comportamiento exponencial cuya expresión es la que se indica a continuación: eh:m ' j0 Una vez resuelto el comportamiento del término temporal pasemos a resolver el término radial. Al igual que ocurría con el otro miembro de la igualdad, tan solo depende de una variable por lo que la ecuación diferencial en derivadas parciales se reduce a una ecuación diferencial ordinaria. ( ΓHM 5 1 (ΓHM ( ( %hγhm Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 41

42 Desplazando todos los términos al primer miembro de la igualdad obtenemos: ( ΓHM ( 5 1 (ΓHM ( 5hΓHM0 Multiplicando por R 2 ambos miembros de la igualdad obtenemos: ( ΓHM ( 5 (ΓHM ( 5h ΓHM0 Esta ecuación diferencial corresponde con la denominada como ecuación diferencial de Bessel, cuya resolución se abordará empleando el método de Frobenius; este método consiste en considerar que la solución de la ecuación anterior se puede expresar como una serie de potencias, reduciendo el problema a determinar los coeficientes o términos de dicha serie. La expresión general de una solución en serie de potencias del tipo Frobenius será: 1m ΓHM k l?? Con objeto de sustituir en la ecuación diferencial anterior calculemos previamente la derivada primera y segunda de la serie de potencias anterior:?nq 1m dγhm dr &kq l?? 1m d ΓHM &H&%1M k l dr?? 1m?nQ?nQ 5 k lh%1m???nq 1m 5 k l??q 1m?nQ 5 & kq l??q 5 & kq l??q Sustituyendo las expresiones anteriores en la ecuación diferencial de Bessel, obtenemos:?nq 1m?nQ Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 42

43 1m r&h&%1m k l???nq 1m 1m Modelado matemático e 5 & kq l??q 5 & kq l??q?nq 5 k lh%1m???nq 1m 5 h k1 l?? 0?nQ Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 43 1m 1m?nQ s5 r& kq l?? 5? l??q s?nq Desarrollando los productos de la expresión anterior obtenemos: 1m &H&%1M k l???nq 1m 5 & k1q l??q 5 & k1q l??q 1m?nQ 5 k1 lh%1m???nq 1m 5 h k1 l?? 0?nQ A continuación agrupamos los términos: 1m &H&%1Ml??1k?nQ 1m 1m?nQ 1m 5 & k l???nq 1m?nQ 1m 5 k1q l??q?nq 5 2&l??1k 5 lh%1m??1k 5 lh5&m??1k 1m?nQ 5 hl??1k1?nq 0 1m?nQ En el último término de la expresión anterior, realizamos un cambio de variable m=n-2, con objeto de que las potencias de la variable R queden todas con el mismo exponente. 1m &H&%1Ml??1k?nQ 1m 1m?nQ 5 2&l??1k 5 lh%1m??1k 5 lh5&m??1k 1m?nQ 5 h l t t1k 0 tn 1m?nQ Descompongamos la expresión anterior valorando los sumatorios para n=0 y n= 1; asimismo en el índice del último miembro de la expresión anterior realizamos el cambio n=m. así obtenemos: 1m?nQ

44 &H&%1MU Q k 5 q k1q W5 2&U q k1q W5 U& Q k 5 H&51M q k1q W 1m 5 &H&%1Ml??1k 1m?n 5 lh5&m??1k?n 1m 5 2&l??1k 5 lh%1m??1k?n 1m 5 hl??1k 0?n Desarrollando los productos y agrupando en las diferentes potencias de R, obtenemos: U Q & H&%1M5 & Q W k 5 U q &H&%1M5 2& q 5 q H&51MW k1q 1m 5 luh&h&%1m5 2&5 5 &M? 5 h? W?1k 0?n Simplificando se llega a que la ecuación anterior se reduce a: 1m?n & Q k 5 q H& 5 2&51M 5 lh& 5 5 2&M? 5 h? 1m?n 0 Para que la igualdad anterior se cumpla los tres sumandos de la ecuación deben ser nulos, por lo que se plantean las siguientes igualdades: H1M & Q 0;de donde &0 Q H2M H& 5 2&51M q 0;de donde q 0 H3MH& 5 2&51M? 5 h? 0;? 5 h? 0 Desarrollemos la ecuación en diferencias finitas, dando valores a n, con objeto de obtener una expresión cerrada para los coeficientes a n.?1 2; 4 5 h Q 0; % h 4 Q; %h 1 2 } H051M! 3; 9 5 h q 0; % h 9 q; 0 4; 16 5 h 0; % h 16 ; Q1 1 h 4ƒ16 Q h 2 } 2!H052M! Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 44

45 5; 25 5 h 0; % h 25 ; 0 6; 36 5 h 0; % h 36 ; Modelado matemático e %h 36ƒ4ƒ16 Q %h 1 2 } Q1 3!H053M! Del desarrollo anterior se puede concluir que los coeficientes del desarrollo en serie de Frobenius de la ecuación de transferencia del calor se ajustan a la expresión siguiente:? Š ˆ ˆ H%hM? 1 2 } Q1? D 2 }! 2 }!,D 0,D D Por lo que la solución de la componente radial de la ecuación diferencial de transferencia del calor se expresará en series de Frobenius como se indica a continuación: 1m 1m H%hM Ž 1 Ž 1m 1m ΓHM k l?? k l?? 5 k l?? l 2 } 2? 2 }! 2 2 }!?nq? Œ X Simplificando obtenemos como solución:? OtŒ X ŽnQ ΓHM l 1mH H%1MŽ Ž1Q M!H05 M! 612 h7 ŽnQ Expresión que puede identificarse con el desarrollo en serie de la función de Bessel de primera especie y orden 0, por lo que la expresión puede reducirse como sigue: ΓHM Q h Así pues la evolución espacio temporal de la temperatura adimensional de la muestra desde el instante en que desaparece la acción de la luz láser y queda sometida a temperaturas extremas viene dada por: _H,:M ' Q h j0 Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 45

46 Una vez obtenida la solución básica de la ecuación diferencial en derivadas parciales, válida para todos los valores del parámetro λ, aplicaremos la condición de contorno espacial consistente en imponer que más allá de los límites de la zona de influencia del láser (R=1), la temperatura adimensional es nula mientras que en el interior de dicha zona (y por tanto en el interior de la muestra) se mantiene a valor 1, es decir que se cumple la expresión del perfil de temperatura adimensionalizada un instante antes de apagar el laser,: 1 D P1 _H,:M N 0 D R1 Las condiciones de contorno a aplicar quedan como se indica: _H,0M Ynq ' Q h jq Ynq 0 de donde Q h Ynq 0 Para que la función de Bessel de orden cero sea nula es preciso que: h Ynq Q,?, Donde j 0,n representa la raíz n-ésima de la función de Bessel de orden 0. Así pues el parámetro λ queda acotado como se muestra a continuación: h Q,?, De aquí se puede concluir que la solución de la ecuación de transferencia de calor se puede expresar como combinación lineal de diferentes términos (tantos como raíces presenta la función de Bessel. Así pues quedaría: 1m _H,:M l'? Q?,Q Ž Z, ^ 0?nq Una vez obtenida la solución básica de la ecuación diferencial en derivadas parciales, válida para todo los valores del parámetro λ aplicaremos la condición de contorno restante y que consiste en imponer que en el instante τ=0, cuando la luz laser que se apaga la temperatura de la zona de influencia del láser (y con ella la muestra a criopreservar) se encuentra a T INT, o lo que es equivalente a que la temperatura adimensional sea igual a 1 para dicha zona: 1m _H,:M 0nQ 1; l'? Q Q,? Ž Z, ^ Q1?nq Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 46

47 Por lo que se reducirá el problema a calcular los coeficientes A n tales que satisfagan la expresión: 1m l'? Q Q,? 1?nq Para resolver esta presión acudimos al apéndice I, en el que se muestran las propiedades principales de las funciones de Bessel, entre las que encontramos la que sigue: 1m Œ 2' Œ l?nq 1 Œ,? Œ1q Œ,? Œ6 Q,? ' 7 Tomando en la expresión anterior p = 0 y A=1, obtenemos: 1m 12l 1?nq Q,? q Q,? Q Q,? De donde identificando términos con la expresión de nuestro desarrollo nos permite obtener el valor de los coeficientes A n : '? 2 Q,? q Q,? Por lo que finalmente la expresión de la evolución espacio-temporal de la temperatura adimensional de la muestra queda como se indica a continuación: 1m _H,:M l 2?nq Q,? q Q,? Q?,Q Ž Z, Con objeto de visualizar la evolución de la temperatura de los diferentes puntos del disco, una vez que se procede al apagado del láser, y consecuentemente la muestra queda expuesta a las bajas temperaturas del entorno que lo rodea necesitamos crear utilizando el software Matlab diferentes funciones auxiliares que nos serán de utilidad. Dado que la expresión final de la evolución espacio-temporal de la temperatura requiere evaluar la función de Bessel de primera especie y orden cero en puntos proporcionales a las raíces de la propia función, el primer paso consiste en la determinación de tales puntos. Para ello se programa la función raizbesselj0(n, h). Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 47 ^ 0

48 function R = raizbesselj0(n, h) %Función que calcula los N primeros ceros de la función J 0 (x) tomando como paso de iteración el parámetro h. Devolverá como resultado un vector con los ceros buscados de la función de Bessel de primera especie y orden 0. El valor típico para h será 0.01 a = 0; b = 0; for i=1:1:n while sign(bessel(0,a)) * sign(bessel(0,b)) > -1 b = b + h; end x = a:h:b; R(i) = fzero(inline( BesselJ(0,x) ), [a,b]); A = b; end En la expresión anterior indicar que: Bessel(0,a) es una función propia de Matlab, proporciona el valor de la función de Bessel de primera especie y orden cero en el punto x = a; esto es J 0 (a). raizbesselj0(n,h) proporciona las N primeras raíces de la función de Bessel de primera especie y orden cero. Se tomará como valor típico para el parámetro h el valor 0,01. En la siguiente gráfica se muestra el comportamiento matemático de la función de Bessel de orden cero en el intervalo [0, 20], observando su comportamiento oscilatorio amortiguado característico, así como los cortes de la función con el eje de ordenadas. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 48

49 Figura 18. Representación de la función de Bessel de primera especie y orden cero en el intervalo [0,20] A modo de ejemplo, la ejecución de la función raizbesselj0(6, 0.01) proporciona los valores: Orden 1º 2º 3º 4º 5º 6º Raíz Tabla 2. Primeras raíces de la función de Bessel de primera especie y orden cero Una vez disponemos de esta función auxiliar que nos permite calcular las raíces j n0 ya es posible implementar un código Matlab en el que se simule la función que modela la evolución de la temperatura en los diferentes puntos del disco que conforma la muestra sometida a la acción del láser, una vez desaparece el efecto de éste. Para ello se implementa la función [R,T] = discorconst(n, h, tfin). Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 49

50 function [R,T] = discorconst(n, h, tfin) %function [R,T] = discorconst(n, h, tfin) nos va a permitir representar información del campo de temperaturas resultante de resolver la ecuación de calor para el modelo uniforme de calentamiento de la muestra por parte del láser. Para simplificar el resultado e independizarlas del sistema de unidades las variables se van a adimensionalizar. % N: Numero de sumandos para el desarrollo en serie % h: Precisión e la variable radial % tfin: Instante de tiempo hasta el que se desea estudiar la evolución temporal %Obtengamos en primer lugar las N raices de la funcion Jo[x] que nos interesan j0 = raizbesselj(n,0.01); %inicializamos las variables en primer lugar B=0;i=1;k=1;r=1; 'Calculando...' for R=0:h:1 for tau=0:0.01:tfin for n=1:1:n end T(r,i) = B; i=i+1; B=0; end B = B + (2/(j0(n)*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R)*exp(-1*tau*j0(n)^2); end r=r+1; i=1; R = 0:h:1; 'Modelo generado...' Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 50

51 El programa anterior genera una matriz en la que se recoge para cada punto R i de la zona de influencia del láser (incluyendo la zona ocupada por la muestra) el valor de la temperatura _H O,: O M, es decir un campo de temperaturas que evoluciona en el tiempo una vez ha cesado la influencia del láser como consecuencia de la transferencia de calor hasta zonas más frías del medio. La precisión del modelo vendrá controlado por los parámetros N (número de sumandos incluidos en la expresión) y del parámetro h (determina lo densa que será la nube de puntos de la muestra en que se calcula la temperatura). A modo de ejemplo determinemos la evolución temporal en cuatro puntos diferentes de la región; concretamente en R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75. Como puede verse en las gráficas siguientes, las curvas denotan una rápida evolución desde la temperatura interior (_ = 1) hasta la temperatura exterior (_ = 0), observándose que la rapidez con que se alcanza esta temperatura aumenta a medida que nos acercamos al extremo de la zona. Esto puede comprobarse con mayor facilidad superponiendo las diferentes curvas sobre unos ejes comunes. Figura 19. Evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75 Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 51

52 Figura 20. Superposición de las curvas de evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75 Una vez que disponemos del campo de temperaturas de la muestra almacenado para distintos instantes de tiempo, y hemos observado la tendencia de la misma a alcanzar la temperatura del medio que la rodea, el siguiente paso es llevar a cabo una estimación de cuán rápido se alcanza dicha temperatura; este parámetro se conoce como velocidad de enfriamiento. Hay muchos tipos de células para los que aún no se han desarrollado protocolos aceptables de criopreservación dado que la concentración de crioprotector requerido para evitar la formación de hielo intracelular es demasiado alta para que muchas células los toleren. Entre los principales tipos de célula para los que aún no se han desarrollado protocolos realizables de congelación se encuentran los hepatocitos, los óvulos humanos, granulocitos, etc. Así pues en el presente proyecto tratamos de profundizar en un método alternativo de criopreservación al uso de crioprotectores que permita evitar la formación de cristales de hielo; la opción que se plantea es mantener una muestra celular a una temperatura habitable en un entorno que alcanza una temperatura muy baja (utilizando por ejemplo nitrógeno líquido), mediante la aplicación de un láser de potencia adecuada (controlada a través de mediciones de la temperatura de la muestra, tal y como se verá más adelante). En un determinado instante se procede al apagado del láser y la muestra queda sometida a unas temperaturas muy bajas, de Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 52

53 tal forma que por transferencia de calor se irá enfriando hasta alcanzar la temperatura del entorno. Como se va a poner de manifiesto en el presente documento esto tiene lugar a una velocidad tan elevada que no se llega a producir el fenómeno de cristalización. Como su propio nombre indica denominamos velocidad o tasa de enfriamiento a la rapidez con que la temperatura de la muestra varía en el tiempo. Si ésta es suficientemente rápida logramos evitar la formación de cristales que dañan el material a preservar, supuesta la temperatura interior de la muestra constante en todos sus puntos como consecuencia del efecto del láser. Dada la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura una vez el efecto de calentamiento del láser ha desaparecido y la temperatura de la muestra tiende a equilibrarse con el entorno que la rodea: 1m _H,:M l 2?nq ^ 0 Q,? q Q,? Q?,Q Ž Z, La velocidad de enfriamiento se obtendrá derivando la expresión anterior respecto a la variable temporal: H,:M (_H,:M (: 1m ^ 0 %2l Q,? q Q,? Q?,Q Ž Z,?nq Expresión que obviamente depende tanto del tiempo como del punto de la muestra que consideremos. Dado el comportamiento asintótico de las curvas un procedimiento adecuado para lograr una estimación promedio de la velocidad de enfriamiento consiste en calcular la pendiente de la línea recta en la parte central de la curva, en una banda del 60%, concretamente en la zona de la curva comprendida entre el 20% y el 80% del valor máximo de la temperatura adimensionalizada. Para obtener la evolución de este parámetro en toda la zona de influencia del láser (dada su simetría circular nos centraremos tan solo en una sección radial de la muestra), en primer lugar implementaremos una función que nos permita calcular el valor más aproximado posible a un valor dado dentro de la curva de evolución de temporal de temperaturas. Esta función será x = buscatemperatura(a, T, t) implementada en Matlab a través del siguiente código: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 53

54 function x = buscatemperatura(a,t,tiempo) %function x = buscatemperatura(a,t,tau,tol) buscar el valor A en el vector T, o al menos el que más se acerque y devolverá el valor del instante de tiempo correspondiente d=1; while T(d)>A d = d + 1; end x = tiempo(d); Utilizando esta función auxiliar e incorporándola a la función de cálculo del modelo de temperatura, es posible determinar para diferentes puntos a lo largo de la coordenada radial la velocidad de enfriamiento adimensional como la pendiente de una recta que linealiza el modelo en una banda del 60% del valor máximo, esto es: H,:M 0.8 _H O,0M% 0.2 _H O,0M : % : q 0.6 _H O,0M : % : q Con objeto de sistematizar la determinación de la velocidad de enfriamiento implementamos en Matlab el código de la función [R, tasa] = tasarconst(n, h, tfin). function [R, tasa] = tasarconst(n,h, tfin) %function [R,tasa] = tasarconst(n, h, tfin) nos va a permitir representar información de la tasa de enfriamiento adimensionalizada de la muestra a lo largo de un eje radial, empleando un modelo uniforme de perfil del láser % R: Puntos de la coordenada radial en los que se evalúa la tasa de enfriamiento % tasa: Tasa de enfriamiento para cada uno de los puntos del disco % N: Numero de sumandos para el desarrollo en serie % h: Precisión en la variable temporal % tfin: tiempo adimensional en el que se estudiará la evolución de la temperatura %Obtengamos en primer lugar las N raíces de la función Jo[x] que nos interesan j0 = raizbesselj(n,0.01); Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 54

55 %Calculemos entonces en el punto R=1, por simplicidad B=0;i=1;k=1;r=1; t = [0:0.01:tfin]; 'Calculando...' for R=0:h:1 for tau=0:0.01:tfin for n=1:1:n B = B + (2/(j0(n)*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R)*exp(-1*tau*j0(n)^2); end T(r,i) = B; i=i+1; B=0; end tau1 = buscatemperatura(0.8*t(r,1),t(r,:),t); tau2 = buscatemperatura(0.2*t(r,1),t(r,:),t); tasa(k) = 0.6*T(r,1)/(tau2-tau1); k=k+1; r=r+1; i=1; end R = 0:h:1; 'Modelo generado...' A partir de lo anterior obtenemos las curvas que se muestran a continuación, pudiendo observar las siguientes peculiaridades: Permanece prácticamente constante a lo largo de toda la coordenada radial, dado que todos los puntos de la muestra, con el modelo elegido, se encuentran inicialmente a la misma temperatura. En el entorno de R=1 se observa que la velocidad de enfriamiento tiende a infinito. Esto es debido a la naturaleza del modelo, dado que en R=1 la función no es continua ni derivable, existiendo una discontinuidad de salto. Debido a esta discontinuidad el modelo no funciona adecuadamente en su contorno. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 55

56 Debido a que la serie se ha truncado a un valor limitado de N el comportamiento entorno a cero del presente modelo no se ajusta correctamente a menos que el número de puntos que tomemos sea muy alto. Figura 21. Evolución de la tasa de enfriamiento en función de la coordenada radial Como es posible ver en la primera de las dos curvas que se muestran a continuación, existen una serie de oscilaciones entorno a R=0, debido a que se ha utilizado un número limitado de puntos N. Podemos observar en la segunda de las curvas que con un número suficiente de puntos se obtiene una curva mucho más suave: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 56

57 Figura 22. Evolución de la tasa de enfriamiento en torno a R = 0. Oscilaciones ocasionadas por el uso de un número finito de puntos Figura 23. Evolución de la tasa de enfriamiento en función de la coordenada radial para N=500 puntos Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 57

58 Con objeto de comprobar la influencia del número de puntos de cálculo elegido para obtener el modelo matricial del campo de temperaturas de la muestra se observa en la figura siguiente la aproximación al comportamiento de la temperatura en t=0 (justo tras apagar el laser) a lo largo de la coordenada radial para N=1, 5, 20 y 100 puntos de cálculo. Podemos observar como a medida que el parámetro N crece la curva se va aproximando cada vez más a un valor uniforme, a excepción del entorno cercano de R=1 donde la discontinuidad de salto origina que el modelo no funcione del todo correctamente. Figura 24. Temperatura adimensional en función de la coordenada radial para diferente número de puntos de cálculo (N=1, N=5, N=20 y N=300) Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 58

59 3.2. MODELO MATEMÁTICO PERFIL LÁSER CUADRÁTICO El objeto del presente apartado es alcanzar un modelo más cercano a la realidad, contemplando para ello que haz laser no calienta por igual a todos los puntos de la muestra, considerando una distribución de temperaturas en forma de parábola, de forma que el máximo se produzca en el centro de la muestra (supuesto coincidente con el centro del haz láser), descendiendo cuadráticamente hasta el borde de la misma, donde se obtiene un valor nulo, compatible con la temperatura del entorno. Al igual que sucedía en el modelo lineal, la variable radial se normalizará respecto a la zona de influencia del láser (R 0 ) de forma que la muestra queda dentro de la misma (R c ) y se define un cierto margen de seguridad entre la muestra y el entorno. Para ello, la evolución radial de la temperatura se modelará como se indica en la expresión siguiente: Š 1% 6 7 D P1 ΓHM ' 0, D T Figura 25. Perfil cuadrático de la radiación láser que incide sobre la muestra Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 59

60 La resolución de la ecuación de transferencia de calor en coordenadas polares, modelando la zona de influencia del láser dentro de la cual se encuentra la muestra a criopreservar como un círculo de radio R=1 e imponiendo una temperatura adimensional nula en el extremo radial R = 1 de tal forma que en el intervalo R < 1 la muestra se encuentra a una temperatura adecuada, lejos del frío del entorno, conduce a la siguiente expresión: 1m _H,:M l'? Q?,Q Ž Z, ^ 0?nq Teniendo en cuenta el perfil cuadrático del laser, reducimos el problema a calcular los coeficientes A n tales que en el instante inicial, permitan que se cumpla: 1m _H,0M l'? Q?,Q?nq 1% La resolución de esta expresión requiere del desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la expresión cuadrática. Con objeto de entender el desarrollo realizaremos a continuación una introducción al significado de las series de Fourier-Bessel. Definición: Dada una función f(x) se conoce como desarrollo en serie de Fourier-Bessel a un desarrollo matemático de la forma siguiente: HM l' X? HC X M Donde α r son las raíces de la función de Bessel de orden n, esto es: 1m Xnq C X? HC X M0š,C q P C P Para realizar el desarrollo de Fourier-Bessel de una función f(x), todo se reduce a elegir n (en nuestro caso tomaremos n=0) y a realizar el cálculo de los distintos coeficientes A r, para lo que nos basaremos en dos propiedades de las funciones de Bessel: q H1Mœ? HC X M? HC M.0, žd Q q H2Mœ? HC X M. 1 2?1qHC M Q Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 60

61 Obtengamos a continuación, basándonos en las propiedades anteriores, el valor de los coeficientes A r que constituyen la base del desarrollo de Fourier-Bessel. Partimos de la expresión genérica de la expresión del desarrollo en serie de una función f(x): 1m HM l' X? HC X M Multipliquemos ambos miembros de la igualdad por el término xj n (α s ), obteniendo: Xnq 1m HM? HC M l' X? HC X M? HC M Procedamos a integrar ambos miembros de la igualdad en el intervalo [0,1]: q œ HM? HC M. Q Xnq q 1m œ l' X? HC X M? HC M. Q Aplicando la propiedad de linealidad de la integral definida podemos intercambiar los operadores integral y suma, de tal forma que la expresión queda como: q œ HM? HC M. Q 1m Xnq q l' X œ? HC X M? HC M. Aprovechando las propiedades (1) y (2), anteriormente mostradas, obtenemos que: q œ HM? HC M. Q Xnq Q q ' œ? HC M.' 1 2?1qHC M Q De donde despejando, obtenemos la expresión que permite calcular los coeficientes del desarrollo en serie de Fourier-Bessel de una función dada f(x): ' 2?1q HC M œ HM?HC M. Q q Así pues para el caso que nos ocupa deberemos hallar los coeficientes A s tales que permiten calcular el desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la función cuadrática. En definitiva podemos reducir el problema a calcular los coeficientes A s tales que satisfagan: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 61

62 1m 1% l' Q?,Q nq Donde los coeficientes se calcular a través de: ' q 2 q HC M œ H1% M Q HC M. Q La expresión integral anterior puede descomponerse en dos integrales diferentes: ' q 2 q HC M œ QHC M.% Q q 2 q HC M œ Q HC M. Q Calculemos ambas integrales por separado: Ÿ.1M q 2 q HC M œ QHC M. Q Realicemos el cambio de variable α s x = z, que permiten transformar la integral anterior (I.1) en la siguiente: 2 q HC M œ B C QHBM.B C Aplicando la propiedad integral de la función de Bessel recogida en el anexo B: Q œ Œ1q Œ HM. Œ1q Œ1q HM Obtenemos que la integral I.1 quedaría como: 2 1 q HC MC œ B QHBM.B Q 2 C q HC M B qhbm Q A continuación resolvamos la segunda integral de la expresión (I.2): 2 C q HC M Ÿ.2M q 2 q HC M œ Q HC M. Q Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 62

63 Para resolver esta expresión en primer lugar realizamos el cambio de variable α s x = z, que permiten transformar la integral anterior (I.2) en la siguiente: 2 q HC M œ 6B C 7 Q Q HBM.B C 2 C q HC M œ B Q HBM.B Q Integral, esta última, que por su estructura resolveremos mediante la técnica de integración por partes, para lo que definimos las variables u y v, según la expresión: œ. % œ. B ;.2B.B. B Q HBM.B; œb Q HBM.B Por lo que la expresión quedará como: ^H M B Q HBM.B Q 2B HBM Q ^H M B q HBM Q % 2 B q HBM.B Q ^H M UC q HC M% 2C HC MW ^H M C q HC M% La relación de recurrencia entre funciones de Bessel de diferentes órdenes establece que:?q HM 2?HM%?1q HM Aplicándolo para el caso en que n=1, obtenemos: Q HM 2 qhm% HM De donde despejando la expresión de la función de Bessel de orden 2, se tiene que: HM 2 qhm% Q HM Sustituyendo esta igualdad en la expresión de la integral anterior, y teniendo en cuenta que α s son las raíces de la función de Bessel de orden cero, esto es J 0 (α s ) = 0, obtenemos que: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 63

64 2 C q HC M œ B Q HBM.B Q Modelado matemático e 2 C q HC M UC q HC M% 4C q HC MW Por lo que sumando las expresiones obtenidas para I.1 e I.2 obtenemos que: ' q 2 q HC M œ H1% M Q HC M. Q 8 C q HC M De esta forma se obtiene la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura adimensional en el caso de que modelemos el perfil de temperaturas del láser de forma cuadrática dentro de la zona de influencia del mismo: 1m _H,:M l 8 q Q,? Q?,Q Ž Z,?nq Q,? Obtenida la expresión matemática del modelo de evolución espacio-temporal de la temperatura adimensional desarrollamos un algoritmo en Matlab que permita generarlo, function [R,T] = discorcuad(n, h, tfin) %function [R,T] = discorcuad(n, h, tfin) nos va a permitir representar información del campo de temperaturas resultante de resolver la ecuación de calor para el modelo cuadrático de calentamiento de la muestra por parte del láser. Para simplificar el resultado e independizarlas del sistema de unidades las variables se van a adimensionalizar % N: Numero de sumandos para el desarrollo en serie % h: Precisión de la variable radial % tfin: Instante de tiempo hasta el que se desea estudiar la evolución temporal %Obtengamos en primer lugar las N raices de la funcion Jo[x] que nos interesan j0 = raizbesselj(n,0.01); %inicializamos las variables en primer lugar B=0;i=1;k=1;r=1; 'Calculando...' for R=0:h:1 for tau=0:0.01:tfin for n=1:1:n ^ 0 Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 64

65 end T(r,i) = B; i=i+1; B=0; end B = B + (8/(j0(n)^3*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R/A)*exp(-1*tau*j0(n)^2); end r=r+1; i=1; R = 0:h:1; 'Modelo generado...' El programa anterior genera una matriz en la que se recoge para cada punto R i de la muestra el valor de la temperatura _H O,: O M, es decir un campo de temperaturas que evoluciona en el tiempo una vez ha cesado la influencia del láser como consecuencia de la transferencia de calor hasta zonas más frías del medio. La precisión del modelo vendrá controlado por los parámetros N (número de sumandos incluidos en la expresión) y h (determina lo densa que será la nube de puntos de la muestra en que se calcula la temperatura). A modo de ejemplo determinemos la evolución temporal en cuatro puntos diferentes de la muestra; concretamente en R=0, R=0.25, R=0.5, R = La relación entre del tamaño de la muestra y la zona calentada por el láser variará dependiendo del tipo de célula que se someta a la acción de la radiación láser; obviamente se contempla una zona de transición entre la muestra y su entorno, con objeto de no someter a la membrana de la célula a temperaturas muy bajas. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 65

66 Figura 26. Evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75 Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 66

67 Figura 27. Superposición de las curvas de evolución temporal de la temperatura para R=0, R=0.25, R=0.5 y R=0.75 Una vez que disponemos del campo de temperaturas de la muestra almacenado para distintos instantes de tiempo, y hemos observado la tendencia de la misma a alcanzar la temperatura del medio que la rodea, el siguiente paso es llevar a cabo una estimación de la velocidad de enfriamiento. Dada la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura una vez el efecto de calentamiento del láser ha desaparecido y la temperatura de la muestra tiende a equilibrarse con el entorno que la rodea: 1m _H,:M l 8 q Q,? Q?,Q Ž Z,?nq Q,? La velocidad de enfriamiento se obtendrá derivando la expresión anterior respecto a la variable temporal: ^ 0 Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 67

68 H,:M (_H,:M (: Modelado matemático e 1m %l 8?nq ^ 0 Q,? q Q,? Q?,Q Ž Z, Expresión que obviamente depende tanto del tiempo como del punto de la muestra que consideremos. Dado el comportamiento asintótico de las curvas un procedimiento adecuado para lograr una estimación promedio de la velocidad de enfriamiento consiste en calcular la pendiente de la línea recta en la parte central de la curva, en una banda del 60%, concretamente en la zona de la curva comprendida entre el 20% y el 80% del valor máximo de la temperatura adimensionalizada. Utilizando esta función auxiliar e incorporándola a la función de cálculo del modelo de temperatura, es posible determinar para diferentes puntos a lo largo de la coordenada radial la velocidad de enfriamiento adimensional como la pendiente de una recta que linealiza el modelo en una banda del 60% del valor máximo, esto es: H,:M 0.8 _H O,0M% 0.2 _H O,0M : % : q 0.6 _H O,0M : % : q Con objeto de sistematizar la determinación de la velocidad de enfriamiento implementamos en Matlab el código de la función [R, tasa] = tasarcuad(n, h, tfin). function [R, tasa] = tasarcuad(n,h, tfin) %function [R,tasa] = tasarcuad(n, h, tfin) nos va a permitir representar información de la tasa de enfriamiento adimensionalizada de la muestra a lo largo de un eje radial, empleando un modelo cuadrático para el perfil del láser % R: Puntos de la coordenada radial en los que se evalúa la tasa de enfriamiento % tasa: Tasa de enfriamiento para cada uno de los puntos del disco % N: Numero de sumandos para el desarrollo en serie % h: Precisión en la variable temporal % tfin: tiempo adimensional en el que se estudiará la evolución de la temperatura %Obtengamos en primer lugar las N raices de la funcion Jo[x] que nos interesan j0 = raizbesselj(n,0.01); %Calculemos entonces en el punto R=1, por simplicidad Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 68

69 B=0;i=1;k=1;r=1; t = [0:0.01:tfin]; 'Calculando...' for R=0:h:1 for tau=0:0.01:tfin for n=1:1:n B = B + (8/(j0(n)^3*BesselJ(1,j0(n))))*BesselJ(0,j0(n)*R)*exp(-1*tau*j0(n)^2); end T(r,i) = B; i=i+1; B=0; end tau1 = buscatemperatura(0.8*t(r,1),t(r,:),t); tau2 = buscatemperatura(0.2*t(r,1),t(r,:),t); tasa(k) = 0.6*T(r,1)/(tau2-tau1); k=k+1; r=r+1; i=1; end R = 0:h:1; 'Modelo generado...' A partir de lo anterior obtenemos las curvas que se muestran a continuación, pudiendo observar las siguientes peculiaridades: La distribución de temperaturas no es constante en toda la zona de influencia del láser ya desde el instante t=0, dado que el perfil del láser decrece suavemente. A la luz de las curvas que muestran la evolución temporal de la temperatura con el tiempo para diferentes puntos de la zona muestran como la pendiente de las mismas se va haciendo cada vez menor hasta alcanzar el punto extremo de la zona de influencia del láser, R=1. Evidentemente la velocidad de enfriamiento no será constante en toda la zona sino que irá decreciendo. Con objeto de evitar que los puntos de la muestra vitrifiquen a velocidades excesivas resultará conveniente ajustar la zona de influencia del láser de forma que la influencia del mismo en la zona ocupada por la muestra sea lo más uniforme posible. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 69

70 Entorno a R = 0 la tasa de enfriamiento adquiere valores próximos a los obtenidos para el modelo uniforme antes estudiado Figura 28. Evolución de la tasa de enfriamiento en función de la coordenada radial Con objeto de analizar el efecto del parámetro N (número de términos de la serie) y comprobar lo bien que se adapta el desarrollo en serie de Fourier Bessel realizado para la función cuadrática respecto de la función original, en la siguiente gráfica se muestra el resultado para diferentes valores de N. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 70

71 Figura 29. Influencia del número de términos N en la aproximación al perfil cuadrático de temperaturas en el instante t=0 en función de la coordenada radial. Se comprueba para N= 1,2,3,4,5 y 200 puntos. En esta gráfica puede observarse como incluso truncando la solución en un número reducido de puntos la curva de distribución radial de la temperatura para cada instante se aproxima notablemente a la curva real, especialmente a medida que nos alejamos de la coordenada R=0. A continuación se muestra igualmente la evolución temporal de la temperatura de la muestra en un punto concreto de la misma en función del parámetro N, observando como el efecto es exactamente el mismo. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 71

72 Figura 30. Influencia del número de términos N en la evolución temporal de la temperatura de la muestra a partir del instante t=0 para el punto central de la muestra R = 0. Se comprueba para N= 1,2,3,4,5 y 200 puntos. Como puede observarse en las curvas precedentes la principal diferencia aportada por el restante número de parámetros de la suma que constituye la solución se encuentra en el entorno del centro de la muestra y en los instantes iniciales del enfriamiento de la misma, mientras que en las proximidades al borde de la zona de influencia del láser y a medida que nos acercamos al régimen permanente el error que se comete tiende a cero. En la figura siguiente se observa el comportamiento de la temperatura de la muestra en R=0 en los primeros instantes que transcurren tras el apagado del láser Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 72

73 Figura 31. Influencia del número de términos N en la evolución temporal de la temperatura de la muestra a partir del instante t=0 para el punto central de la muestra R = 0. Detalle del entorno t=0, donde se observa la principal diferencia y como a medida que aumenta el número de puntos se produce una convergencia. Se comprueba para N= 1,2,3,4,5 y 200 puntos. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 73

74 3.3. MODELO MATEMÁTICO PERFIL LASER GAUSSIANO El objeto del presente apartado es alcanzar un modelo más cercano a la realidad, contemplando para ello que haz laser no calienta por igual a todos los puntos de la muestra, considerando una distribución de temperaturas en forma de campana gaussiana, de forma que la mayor parte del calor se concentra en el entorno del centro y se va reduciendo a medida que nos alejamos del centro de la muestra. Para ello, la evolución radial de la temperatura se modelará como se indica en la expresión siguiente: Y^ ΓHM N D P1 0, D T Donde el parámetro β permite modelar la anchura del haz del láser y consecuentemente de la curva gaussiana. Figura 32. Perfil gaussiano de la radiación láser que incide sobre la muestra para diferentes valores de beta. Cuanto mayor es el parámetro más uniforme será el calentamiento de la muestra y por tanto más constante será la velocidad de enfriamiento en la muestra. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 74

75 La resolución de la ecuación de transferencia de calor en coordenadas polares (modelando la muestra a criopreservar como un círculo de radio R=1, imponiendo una temperatura adimensional nula en el extremo radial de la muestra, esto es en R= 1 conduce a la siguiente expresión: 1m _H,:M l'? Q?,Q Ž Z, ^ 0?nq Teniendo en cuenta el perfil gaussiano del laser, reducimos el problema a calcular los coeficientes A n tales que en el instante inicial, permitan que se cumpla: 1m _H,0M l'? Q?,Q?nq Y^ La resolución de esta expresión requiere del desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la expresión gaussiana por lo que los coeficientes anteriores se resolverán a través de: ' q 2?1q HC M œ HM?HC M. Q Así pues para el caso que nos ocupa deberemos hallar los coeficientes A s tales que permiten calcular el desarrollo en serie de Fourier-Bessel de la función gaussiana. En definitiva podemos plantear el problema como calcular los coeficientes A s tales que satisfagan: 1m *^ l' Q?,Q Donde los coeficientes se calcularán a través de la expresión integral siguiente: nq ' q *^ 2 q HC M œ Q HC M. Q Para resolver esta expresión en primer lugar realizamos el cambio de variable α s x = z, que permite transformar la integral anterior en la siguiente: ' <^ 2 C q HC M œ ª B ª^ Q HBM.B Q Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 75

76 Dada la complejidad de la integral anterior, que involucra tanto funciones de Bessel como la función campana de Gauss, procedemos al desarrollo en serie de la función J o (z). La expresión general de dicho desarrollo responde a la fórmula siguiente: m t HM l H%1M??1t!ΓH5 51M 2 }?nq ΓH5 51MHn5mM! Adaptándola al caso que nos interesa, esto es m = 0, obtenemos m Q HBM l H%1Mk &!&! knq B 2 } k Con lo que la integral a resolver quedaría en la siguiente forma: ' m 2 C q HC M œ ª <^ B ª^l H%1Mk &!&! Q knq B k 2 }.B Aplicando la propiedad de linealidad de la integral obtenemos que: ' m 2 C q HC M lh%1mk &!&! knq ª œ B < Q ^ B k 2 k.b Procedamos a realizar el siguiente cambio de variable: B C e 2B.B ;. C e,...b C e. 2B Por lo que la integral anterior quedará como se muestra a continuación: ' m 1 q HC M lh%1mk &!&! knq œ *HC em k 2 k e. Q q m k e q HC M lh%1mk &!&! C e 4 œ * k. knq Q q Para resolver el término integral recurrimos a la solución recogida en el libro Table of Integrals, series and Products, de I.S. Gradshteyn and I.M. Ryzhik, donde se establece la siguiente relación de recurrencia: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 76

77 œ t * t * % œtq * Si expandimos la relación de recurrencia anterior, de manera sucesiva obtenemos: œ t * t * % t % tq 5 H %1M Por lo que la integral quedará como: œ t * * t t % H %1MH %2M t 5 ± l H%1MŽ! Ž H % M! tž ŽnQ Aplicando esta expresión a la fórmula que nos permitirá calcular los coeficientes A s obtenemos: ' m m k e q HC M lh%1mk &!&! C e 4 œ * k. knq %e q HC M lh%1mk &!&! C e 4 knq k k l * ŽnQ Q q q H%1M Ž &! H%1M Ž H&% M! kž Q Simplificando obtenemos: ' m k e q HC M lh%1mk &!&! C e 4 ²&!%l q kž &! H&% M! 61 e 7 ³ knq k ŽnQ Sacando factor común k! y simplificando obtenemos: ' m e q HC M lh%1mk &! knq C e 4 q k% e m q HC M lh%1mk &! knq C 4 k k l ež ŽnQ H&% M! Expresión que puede descomponerse en dos sumandos, que resolveremos por separado. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 77

78 Donde se ha seleccionado: m e q HC M lh%1mk &! knq Desarrollando la serie obtenemos: Modelado matemático e C k e 4 ' C e 4 m e q HC M lh%1mk &! knq ' k m e q HC M lh%1mk &! knq ' k e q HC M 1%'5 ' 2! % ' 3! 5 Observamos que puede identificarse con el desarrollo en serie de una exponencial, por lo que podrá simplificarse como se indica a continuación (para A pequeño): m e q HC M lh%1mk &! knq C k e 4 e q HC M 6 ^ 7 A continuación centrémonos en el segundo miembro de la expresión: Donde se denominará: e q m q HC M lh%1mk &! knq C 4 k k l ež ŽnQ H&% M! C 4 A µ k l ež H&% M! Por lo que la expresión anterior quedará como: k ŽnQ e q m q HC M lh%1mk kµ &! k knq Por lo que la expresión más cerrada a la que se llega de los coeficientes corresponde con: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 78

79 ' ^ e q HC M 6 7 % e q HC M lh%1mk kµ &! k q m knq Sacando factor común llegamos a la expresión: ' e % q q HC M l H%1Mk kµ &! k m knq De esta forma se obtiene la expresión de la evolución espacio temporal de la temperatura adimensional en el caso de que modelemos el perfil de temperaturas del láser de forma cuadrática dentro de la zona de influencia del mismo: 1m _H,:M l e % q q HC? M l H%1Mk kµ &! k Q?,Q Ž Z, ^ 0?nq Expresión analítica que resulta poco práctica por su complejidad a la hora de implementarla en un algoritmo. En nuestro intento de determinar la evolución de la temperatura de la muestra de forma analítica sin necesidad de recurrir a la resolución de métodos numéricos de resolución tales como la técnica de los elementos finitos hemos obtenido expresiones manejables para el caso de los modelo lineal y cuadrático, no así para el caso del modelo gaussiano. Obtenida la expresión matemática del modelo de evolución espacio-temporal de la temperatura adimensional para el caso de un perfil gaussiano desarrollamos un algoritmo en Matlab que permita generarlo; para ello se obtiene una serie de funciones auxiliares que permiten determinar los diferentes coeficientes del modelo: function C = coeficiente(j,a) %function C = coeficiente(j,a) es una función que permitirá calcular los coeficientes del desarrollo de forma que resulte convergente para valores grandes de N, evitando calcular factoriales muy grandes o potencias elevadas. C=1; for i=0:1:j-1 C = C*A/(i+1); end m knq Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 79

80 A partir de los coeficientes anteriormente mostrados y que implementan los factoriales calculamos los coeficientes D k del modelo anteriormente calculados function Dk = coefdk(n,c,d) %function Dk = coefdk(n,c,d) calculara los coeficientes Dk del desarrollo Fourier Bessel del perfil gaussiano D=0;Dk=0; for k=0:1:n H = ((-1)^k)*coeficiente(k,D); Cl=0; for l=0:1:k Cl = Cl + coeficiente(l,c); end Dk = Dk + H*Cl; end A partir de los coeficientes D k determinamos los coeficientes A s. function [As,alphas] = coefas(n,beta,a) %function As = coefas(n,beta,a) con esta funcion trataremos de calcular los coeficientes del desarrollo de Fourier-Bessel del perfil gaussiano con el que estamos trabajando para un determinado numero de puntos, para una beta determinada y en un intervalo [0,a] que nosotros elijamos arbitrariamente grande. alphas = raizbesselj(n,0.1); alphas = alphas/a; i=1; C = (a^2)/beta; for i=1:1:n A = (alphas(i)/2)^2; D = A*beta; B = beta/(a*besselj(1,a*alphas(i)))^2; As(i) = B*(exp(-D) - exp(-c)*coefdk(n,c,d)); end Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 80

81 Una vez definidas las funciones auxiliares definimos la función discorgauss que nos permitirá determinar la evolución temporal de la temperatura en los diferentes puntos de la muestra. Hemos de tener en cuenta que el modelo obtenido es realmente una simplificación, basada en la adopción del criterio de que el término desarrollo en serie de Maclaurin. ¹ sea menor que la unidad y así poder aplicar el function [R,T] = discorgauss(n, h, beta, tfin) %function [R,T] = discorgauss(n, h, tfin,a) nos va a permitir representar información del campo de temperaturas resultante de resolver la ecuación de calor para el modelo gaussiano de calentamiento de la muestra por parte del láser. Para simplificar el resultado e independizarlo del sistema de unidades las variables se van a adimensionalizar % N: Numero de sumandos para el desarrollo en serie % h: Precisión de la variable radial % beta: Parámetro beta que da forma a la gaussiana % tfin: Instante de tiempo hasta el que se desea estudiar la evolución temporal [As,alphas] = coefas(n,beta,a); B=0;i=1;r=1; for R=0:0.1:1.0 for tau=0:0.01:t for n=1:1:n B = B + As(n)*besselJ(0,alphas(n)*R)*exp(-1*tau*alphas(n)^2); end f(r,i) = B; i=i+1; B=0; end r=r+1; i=1; end tau=0:0.01:t; El programa anterior genera una matriz en la que se recoge para cada punto R i de la muestra el valor de la temperatura _H O,: O M, es decir un campo de temperaturas que evoluciona en el tiempo una vez ha cesado la influencia del láser como consecuencia de la transferencia de calor hasta zonas más frías del medio. La precisión del modelo vendrá controlado por los parámetros N (número de sumandos incluidos en la expresión), h Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 81

82 (determina lo densa que será la nube de puntos de la muestra en que se calcula la temperatura) y β (modelará la curva gaussiana). Como ya se ha indicado anteriormente la expresión obtenida no es general dado que se requiere que se cumplan unas condiciones concretas que validen una de las simplificaciones realizadas. Es por eso que este modelo analítico no es viable con objeto de disponer de una herramienta precisa y no basada en cálculos numéricos con los que tomar decisiones. Para este fin resultan más recomendables los modelos líneal y cuadrático antes mencionados. En cualquier caso en la figura siguiente se muestra la evolución temporal para distintos puntos de la muestra, haciendo uso de las funciones anteriores, para los parámetros N=30, β=1 y tfin=0.8 Figura 33. Evolución temporal para diferentes puntos de la muestra de la temperatura supuesto un perfil gaussiano para el laser. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 82

83 3.4. RESULTADOS NUMÉRICOS Una vez desarrollados algunos modelos matemáticos para el sistema de vitrificación ultrarrápido propuesto, siguiendo como objetivo el obtener resultados analíticos (con objeto de poder realizar suposiciones e hipótesis que no podrían tomarse en el caso de resolver las ecuaciones diferenciales haciendo uso de cálculo numérico) hemos obtenido que los modelos lineal y cuadrático se aproximan bastante bien al comportamiento dela evolución de la temperatura en la muestra irradiada por un dispositivo láser, a partir del instante en que se apaga y se deja a la muestra biológico a merced de las bajísimas temperaturas del entorno. También hemos observado como el modelo gaussiano no resulta sencillo de utilizar por cuanto que no es posible simplificar todo lo deseable su expresión. Todos los modelos matemáticos antes desarrollados se han calculado haciendo uso de variables adimensionales que evitan la dependencia de los resultados obtenidos del sistema de unidades elegido. Hemos comprobado asimismo que era posible evalúa la velocidad de enfriamiento de la muestra de forma adimensional; especialmente adecuado para esta estimación resulta el modelo lineal, donde al modelar la temperatura de la muestra como uniforme se obtiene una velocidad de enfriamiento también constante en prácticamente toda la muestra. Como se obtuvo anteriormente la curva de la velocidad de enfriamiento adimensional se muestra a continuación: Figura 34. Velocidad de enfriamiento adimensional en función de la coordenada radial. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 83

84 Con objeto de obtener una estimación numérica de la velocidad de enfriamiento en condiciones reales de temperatura interior y exterior, así como para muestras biológicas de diferentes tamaños, vamos a aplicar las expresiones de normalización a la inversa, considerando los siguientes valores numéricos: C 1,47ƒ 10» D Hµ D.. Té.½ ¾M & CƒH O? % >* M/ Q Teniendo en cuenta que la velocidad de enfriamiento adimensionalizada se ha calculado contemplado como la pendiente de una recta que linealiza el modelo de temperatura en una banda del 60% del valor máximo, esto es: H,:M _ : 0.8 _H O,0M% 0.2 _H O,0M : % : q 0.6 _H O,0M : % : q Deshaciendo la normalización de las variables _ y :, obtenemos: % _ >* : O? % } >* 6 CT 7 Q Q C H O? % >* M T Hº /DM De donde despejamos la expresión de la velocidad o tasa de enfriamiento medida en grados centígrados por segundo como: T Hº /DMC H O?% >* M Q Con objeto de comprobar los resultados de la velocidad de enfriamiento consideraremos dos tipos diferentes de muestras: _ : Muestras de tamaño reducido (R = 1µm): las muestras celulares del ser humano más pequeñas que resulta interesante vitrificar son los espermatozoides, lo cual resulta especialmente interesante en el campo de la reproducción asistida. En la tabla siguiente se muestran los resultados para diferentes valores de condiciones internas y externas. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 84

85 Muestras de gran tamaño (R = 200µm): las muestras celulares del ser humano de mayor tamaño y cuya criopreservación realmente motiva la búsqueda de diferentes técnicas de vitrificación son los óvulos. En la tabla siguiente se muestran los resultados para diferentes valores de condiciones internas y externas. Temperatura interior 100ºC 90ºC 37ºC 0ºC -60ºC Temperatura exterior -100ºC ºC ºC Tabla 3. Velocidad de enfriamiento expresada en ºC/s para muestras con un tamaño aproximado de 1 µm. Temperatura interior 100ºC 90ºC 37ºC 0ºC -60ºC Temperatura exterior -100ºC ºC ºC Tabla 4. Velocidad de enfriamiento expresada en ºC/s para muestras con un tamaño aproximado de 200 µm. Podemos observar que desde un punto de vista teórico que para el caso de muestras d gran tamaño (más difíciles de vitrificar) en condiciones próximas a las que se establecerán en la configuración experimental se alcanzan velocidades de enfriamiento del orden de ºC/s, es decir ºC/min (aprox ºC/s). Estos valores de tasa de enfriamiento se encuentran dentro de las observaciones realizadas experimentalmente. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 85

86 CAPÍTULO III IMPLEMENTACIÓN DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN ULTRA-RÁPIDO MEDIANTE RADIACIÓN LÁSER Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 86

87 1. INTRODUCCIÓN Como ya se ha referido anteriormente existen principalmente dos grupos de técnicas utilizadas tradicionalmente en la criopreservación de material biológico: el enfriamiento lento o slow freezing y la vitrificación. Las técnicas tradicionales en ambos sistemas presentan dificultades. En el caso del enfriamiento lento se evita la formación de hielo intracelular pero a costa de la formación de la formación del extracelular lo que origina una deshidratación de la célula que trae como consecuencia la deformación de la estructura celular. Como solución a esta dificultad se introducen sustancias crioprotectoras que presentan el enorme inconveniente de ser tóxicos para muchos tipos de células. El segundo grupo de técnicas, fundamentadas en la consecución dela vitrificación, se basan precisamente en someter a la célula a velocidades elevadas de forma que no se genere hielo ni intracelular ni extracelular. Esta técnica, si bien ha proporcionado muy buenos resultados, adolece de una importante dificultad dado que al vitrificar sale gran cantidad de agua a través de la membrana provocando por un lado un aumento tóxico de sales en la célula y una rápida salida de agua lo que supone una deformación en la estructura de la misma. Para evitar estos efectos, al igual que en los términos anteriores se requiere del uso de crioprotectores que reduzcan este flujo de agua, con la evidente problemática anterior: su toxicidad. Para lograr vitrificación con una reducida cantidad de crioprotector de tal forma que no sea tóxico para las muestras biológicas se requieren velocidades de enfriamiento muy rápidas, del orden de decenas de miles de grado por minuto que no se alcanza con el método tradicional de inmersión directa en nitrógeno líquido (varios miles de grados por segundo). Teniendo en cuenta el perfil gaussiano del laser, reducimos el problema a calcular los coeficientes A n tales que en el instante inicial, permitan que se cumpla 2. MÉTODO PROPUESTO DE VITRIFICACIÓN ULTRARRÁPIDA Con el presente proyecto, tal y como se ha desarrollado matemáticamente en los modelos anteriores se pretende plantear una técnica de vitrificación con la que se pretende alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo. El método de vitrificación ultra-rápida que se propone consta básicamente de dos etapas. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 87

88 En la primera etapa del proceso la radiación procedente de una fuente láser de potencia regulable, se focaliza sobre la muestra biológica (utilizando para ello uno de los canales de un microscopio) con objeto de mantener permanentemente la temperatura de la misma en unos márgenes tolerables (37ºC), cuando todo el medio situado en el exterior es enfriado hasta los -150ºC, haciendo uso de una mezcla de nitrógeno gaseoso a diferentes temperaturas cuya proporción es controlada actuando electrónicamente sobre sendas válvulas. Esta muestra biológica se puede instalar en un recipiente adecuado para ello. Se barajó en un estadio temprano el uso de un recipiente tipo cryostage dotado de ventanas transparentes a la radiación empleada y de una serie de conductos de entrada y salida por donde discurriría fluido refrigerante que permite generar el entorno frío que se pretende crear para la muestra; no obstante finalmente se optó para una primera configuración el uso de capilares de policarbonato anteriormente descritos y que presentan unas adecuadas propiedades de transferencia del calor. Lograr que la muestra biológica se mantenga a una temperatura constante de 37ºC requiere de la implementación de un lazo cerrado de realimentación de tal forma que a partir de medidas de la temperatura de la muestra se actúe sobre la potencia de emisión del láser aumentándola o disminuyéndola de acuerdo a una determinada ley de control. Con objeto de mantener el entorno de la muestra a una temperatura de - 150ºC en el permanente e implementar un perfil descendente lineal durante las fases iniciales del proceso también se requiere de la determinación de la temperatura de dicho entorno. En una segunda etapa del procedimiento de vitrificación considerado la fuente de radiación láser se desconecta súbitamente, accionado por una señal de control (en los modelos matemáticos anteriormente presentados este hecho se ha considerado en t = 0), de tal forma que la muestra queda totalmente expuesta a las temperaturas extremas del entorno de la misma de tal forma que como se recoge en los modelos matemáticos anteriores y se constata en los experimentos realizados se alcanzan velocidades de enfriamiento del orden de 10 6 ºC/s, lográndose por tanto una adecuada vitrificación. Con objeto de minimizar los efectos de la deshidratación y alteración de la estructura celular ocasionados por los fenómenos crioscópico y osmótico se deben incorporar pequeñas cantidades de crioprotector aunque sin alcanzar niveles tóxicos. El método de dos etapas antes descrito requiere no obstante para su aplicación de la resolución de dos importantes problemas: medir in situ la temperatura de la muestra sin que se Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 88

89 produzcan alteraciones en la célula a cusa del propio proceso de medida y calentar la muestra, en su mayor parte agua, haciendo uso de luz láser a la que es prácticamente transparente. 3. MEDICIÓN DE LA TEMPERATURA El sistema de control del láser que calienta la muestra manteniéndola a 37ºC aún cuando el entorno en que se encuentra inmerso se halla a -150ºC requiere para su correcto funcionamiento de la determinación constante de datos acerca de la temperatura de la muestra con objeto de precisar de acuerdo a una determinada ley de control si hay que actuar sobre el láser aumentando o disminuyendo su potencia. Evidentemente la técnica de estimación de la temperatura que se implemente debe minimizar los efectos sobre la propia muestra durante el proceso de medida. A este respecto se han contemplado tres posibles técnicas de medición de temperatura: - Utilización de Rodamina B - Empleo de termopares - Espectroscopía Raman De las técnicas propuestas se han implementado experimentalmente las dos primeras, quedando la tercera opción como una propuesta novedosa que conduciría a la implementación del termómetro Raman, herramienta que podría proporcionar información muy relevante acerca de la calorimetría de la célula UTILIZACIÓN DE RODAMINA B La Rodamina B es un compuesto químico empleado como colorante y que pertenece al grupo de las rodaminas. Se utiliza habitualmente como colorante de seguimiento en un líquido para rastrear la tasa y dirección de su flujo y transporte. La rodamina posee fluorescencia y puede detectarse fácilmente a un coste bajo mediante unos instrumentos conocidos como fluorómetros. Se utilizan especialmente en aplicaciones de biotecnología tales como microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, espectroscopía de correlación de fluorescencia, etc. La Rodamina B presenta además una propiedad especialmente interesante de cara a su utilización como sensor de temperatura dad o que la intensidad de la fluorescencia que emite es sensible a la temperatura. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 89

90 Figura 35. Fórmula química de la rodamina B Empleando un segundo láser a nm se lleva a cabo la excitación de la fluorescencia de la rodamina emitiendo a 590 nm con una intensidad tanto mayor cuanto más fría (menor temperatura) se encuentra la muestra. Este sistema de adquisición de la temperatura se ha utilizado en el proyecto realizado en la Harvard Medical School and Massachussets (Center for Engineering in Medicine, Boston, USA) por D. Ramón Risco y otros investigadores alcanzando un precisión superior al 1º C de temperatura. El sistema que se implementó en aquella ocasión consistía en utilizar un fotodetector que se encargaba de medir la intensidad de la fluorescencia. La señal obtenida es digitalizada y procesada por un software de control, estableciendo a partir de ella una medida de la temperatura de la muestra, lo que permite en función de un determinado esquema de control actuar sobre el dispositivo láser de forma que se mantenga constante la temperatura. Este sistema de medición de temperatura presenta, no obstante, como principal problema el propio proceso de formación de hielo extracelular, una vez se apaga el láser dado que la zona que no contiene hielo concentrará todo el soluto, entre el que se encuentra la rodamina empleada para medir la temperatura. Dado que se produce un incremento de la concentración de la rodamina se producirá un aumento en la intensidad de la fluorescencia de la muestra de tal forma que no es posible diferenciar entre la que porcentaje de la intensidad de la fluorescencia es debida a la disminución de la temperatura y cual la ocasionada al aumento de la concentración de la rodamina; a causa de esto se pierde la referencia de intensidad y por tanto su validez, a partir de ese instante, como sensor de temperatura. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 90

91 Figura 36. Agua pura con Rodamina (0.025g/l) a la que se ha aplicado el protocolo de enfriamiento ultrarrápido. Se muestra una imagen ampliada a 400X de la zona superior izquierda del lugar tratado. En ella se puede observar la presencia de hielo en la zona no tratada y una estructura opaca que bien pudiera ser agua vitrificada o cristales de hielo de tamaño muy inferior al presente en la otra región 3.2. EMPLEO DE TERMOPARES El método más sencillo y económico para determinar la temperatura de una muestra es en principio el uso de termopares como dispositivos sensores. Un termopar en definitiva consiste en el aprovechamiento del efecto Seebeck al realizar la conexión entre dos metales de características diferentes; se produce una caída de tensión que es función de la diferencia de temperatura entre el extremo común en que se unen ambos metales (conocido como punto caliente) y el otro extremo conocido como punto frío. La diferencia de tensión que aparece entre ambos metales cambia directamente con la temperatura, es decir, al aumentar la temperatura de la muestra aumenta también el voltaje en una forma proporcional. Dependiendo del tipo de metales que se empleen en la construcción del termopar pueden medirse diferentes intervalos de temperatura, en particular cuando se utilizan cobre y constatán (aleación de cobre y niquel), se pueden medir temperaturas entre -190ºC y 300ºC. En la tabla siguiente se muestra una clasificación de los principales tipos de termopares que se pueden emplear en la práctica: Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 91

92 Tipo Alcance Tª (ºC) Material y aleación (+) vs. (-) Metal - Base E -270 a 1000 Níquel Cromo vs. Cobre - Níquel J -210 a 1200 Hierro vs. Cobre - Níquel T -270 a 400 Cobre vs. Cobre Níquel K -270 a 1372 Níquel Cromo vs. Níquel Aluminio M -270 a 1300 Níquel Cromo Silicio vs. Níquel Silicio - Magnesio Tabla 5. Clasificación de los diferentes tipos de termopares constituidos por metal -Base. Tipo Alcance Tª (ºC) Material y aleación (+) vs. (-) Metal - Noble R -50 a 1768 Platino 13% rodio vs. platino S -50 a 1768 Platino 10% rodio vs. platino B 0 a 1820 Platino 30% rodio vs. Platino 6% rodio Tabla 6. Clasificación de los diferentes tipos de termopares constituidos por metal Noble. Por el rango de temperaturas en la que pretendemos trabajar (-150 a 37ºC) y por su economía el tipo de termopar más apropiado para emplear en este sistema es el tipo T, es decir el uso de cobre en uno de sus terminales y constatán en el otro. En la l sistema de vitrificación ultrarrápida, aparte del uso fallido de la rodamina, se han empleado con éxito termopares de tamaño adecuado (acorde con el tamaño de los capilares de policarbonato empleados; concretamente en el sistema se han utilizado dos termopares: Uno de los termopares se instalará lo más próximo posible a la muestra con objeto de sensar la temperatura a la que se encuentra la misma. La diferencia de tensión surgida entre los terminales del sensor son captados por una tarjeta de adquisición de datos a través de la cual se obtienen en el sistema de control datos en tiempo real de la Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 92

93 temperatura de la célula generando la señal de control oportuna de actuación sobre el dispositivo láser, permitiendo en todo momento seguir la referencia de 37ºC. Un segundo termopar se colocará en contacto con el medio criogénico con objeto de tener monitorizado en todo momento, pero especialmente en el arranque del sistema, la temperatura del entorno. Con objeto de permitir que desde el primer instante la temperatura de la muestra se encuentre dentro de parámetros donde las células puedan sobrevivir se aplica una señal de referencia a seguir por la temperatura descendente hasta alcanzar los -150ºC para después mantener constante este valor. La actuación sobre el fluido criogénico se realiza actuando sobre sendas electroválvulas que mezclan nitrógeno gaseoso caliente con nitrógeno gaseoso enfriado al pasar a través de un serpentín por nitrógeno líquido, en una proporción tal que se logre alcanzar la temperatura de referencia. Las características más destacadas de estos sensores de temperatura son principalmente: - Resultan económicos, frente a otras alternativas. - Intercambiables. - Disponen de conectores estándar. - Capaces de medir un amplio rango de temperaturas. - Pueden fabricarse termopares suficientemente pequeños como para medir temperaturas de muestras celulares. - Presentan no obstante unas limitaciones en la exactitud; no obstante, para el caso que nos ocupa en el que se pretenden medir velocidades de enfriamiento del orden de 10 6 ºC/s, pueden resultar irrelevantes. Si bien esta técnica se ha utilizado en la implementación de la configuración del sistema d vitrificación, se presenta a continuación una técnica novedosa que permitirá determinar con exactitud la temperatura aprovechando el análisis espectral de la radiación electromagnética dispersada (scattering) por la muestra al ser sometida a la acción de una fuente monocromática (láser): efecto Raman ESPECTROSCOPÍA RAMAN Como técnica alternativa a las anteriormente mencionadas para la determinación de la temperatura de la muestra a criopreservar (sin interaccionar de ninguna forma sobre la muestra de forma que no se alteren el comportamiento de las células por el solo hecho de realizar la medida), se plantea el uso de las características propias del espectro Raman del agua. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 93

94 ESPECTRO RAMAN El análisis mediante espectroscopía Raman se basa en hacer incidir un haz de luz monocromática de frecuencia Á Q sobre una muestra cuyas características moleculares se desean determinar, y examinar la luz dispersada por dicha muestra. La mayor parte de la luz dispersada presenta la misma frecuencia que la luz incidente pero una porción muy pequeña presenta un cambio de frecuencia como resultado de la interacción de la luz con la materia. La luz que mantiene la misma frecuencia Á Q que la luz incidente se conoce como dispersión Rayleigh y no aporta información alguna sobre la composición de la muestra analizada. La luz dispersada que por su parte presenta frecuencias distintas a la de la radiación incidente, es la que proporciona información sobre la composición molecular de la muestra y es la que se conoce como dispersión Raman. Las nuevas frecuencias 5Á X y %Á X son las frecuencias Raman, características de la naturaleza química y el estado físico de la muestra e independientes de la radiación incidente. Figura 37. Emisión de luz dispersa (scattered light) tras incidir luz incidente (incident light) sobre la muestra. Algunas de las componentes de luz dispersada constituirán el espectro Raman, presentando componentes de frecuencia diferentes a las de la radiación incidente. Fuente: Immunome Research 2010 Las variaciones de frecuencia observadas en el fenómeno de dispersión Raman, son equivalentes a variaciones de energía. Los iones y átomos enlazados químicamente para formar moléculas y redes cristalinas están sometidos a constantes movimientos vibracionales y rotacionales; estas oscilaciones se realizan a frecuencias bien determinadas en función de la masa de las partículas que intervienen y del comportamiento dinámico de los enlaces Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 94

95 existentes. A cada uno de los movimientos vibracionales y rotacionales de la molécula le corresponderá un valor determinado de la energía molecular. Cuando los fotones del haz de luz incidente, con energía há Q (donde h es la constante de Planck) es mucho mayor que la diferencia de energía entre dos niveles vibracionales (o rotacionales) de la molécula, chocan con ella de tal forma que la mayor parte la atraviesan pero una pequeña fracción es dispersada (del orden de un foton por cada incidentes) pudiéndose interpretar de la siguiente forma: el fotón incidente lleva a la molécula transitoriamente a un nivel de energía vibracional (o rotacional) superior no permitido, el cual abandona rápidamente para pasar a uno de los niveles de energía permitidos emitiendo un fotón; la frecuencia a la cual resulta liberado este fotón dependerá del salto energético realizado por la molécula, pudiendo distinguirse dos casos: Si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón dispersado a la misma frecuencia que el fotón incidente, se dice que el choque es elástico ya que no el fotón ni la molécula sufren variaciones en su estado energético; la molécula vuelve al mismo nivel de energía que tenía antes del choque y el fotón dispersado tiene la misma frecuencia Á Q que el incidente, dando así lugar a la dispersión Rayleigh. Si el resultado de la interacción fotón-molécula es un fotón dispersado a una frecuencia diferente de la incidente, se dice que el choque es inelástico (existe transferencia de energía entre la molécula y el fotón); en este caso pueden darse dos fenómenos: o o Si el fotón dispersado tiene una frecuencia menor a la del incidente, se produce una transferencia de energía del fotón a la molécula que, después de saltar al estado de energía no permitido, vuelve a uno permitido mayor al que tenía inicialmente; el fotón es dispersado con frecuencia Á Q % Á X y se produce la conocida como dispersión Raman Stokes. Si el fotón tiene una frecuencia superior a la del incidente se produce una transferencia de energía de la molécula al fotón; esto implica que la molécula, inicialmente antes del choque no se encontraba en su estado vibracional fundamental sino en uno de mayor energía y después del choque pasa a este estado. El fotón es dispersado con frecuencia Á Q 5 Á X y se produce la conocida como dispersión Raman anti-stokes. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 95

96 Figura 38. Clasificación de los diferentes tipos de termopares constituidos por metal -Base. Cada material tendrá un conjunto de valores Á X característicos de su estructura poliatómica y de la naturaleza de los enlaces químicos que la forman. El espectro Raman recoge estos fenómenos representando la intensidad óptica dispersada en función del número de onda normalizado Á al que se produce. APLICACIÓN DEL ESPECTRO RAMAN COMO SENSOR DE TEMPERATURA La técnica de la espectroscopía Raman está bien definida como un método para medir concentraciones en gases o líquidos con el fin de investigar la estructura molecular de sustancias puras y medir temperaturas en llamas o en flujos de gases a alta temperatura. Hay dos efectos diferentes que se pueden emplear para medir temperaturas de cuerpos empleando la técnica de la espectroscopía Raman. El primer efecto se basa en la ratio entre las moléculas de gas que están en un estado vibracional excitado y las moléculas de dicho gas que por el contrario se encuentran en un estado de reposo. Esta relación depende de la temperatura a la que se encuentra el gas de acuerdo con la ley de Boltzman. El efecto requiere que las temperaturas del gas se encuentren por encima de los 1000 K, dado que en otro caso el número de moléculas en un estado excitado no será significativo. La aplicación más habitual de la Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 96

97 espectroscopía Raman es en este sentido el medir la temperatura en una llama. En este caso la temperatura de las llamas se puede calcular como una relación entre los picos stokes y antistokes de un cierto componente como el nitrógeno por ejemplo o a través de la forma de la línea vibracional del nitrógeno por ejemplo (Schrader, 1995). Un efecto completamente diferente permite medir la temperatura del agua líquida mediante el uso de la espectroscopía Raman. La forma del espectro Raman del agua líquida es bastante diferente de la forma de dicho espectro en el caso del agua en estado de vapor debido a que los enlaces de hidrógenos afectan a la vibración de los enlaces OH. El número de enlaces de hidrógeno depende de la temperatura y la forma del espectro Raman del agua líquida cambia por lo tanto también con la temperatura. Walrafen describió la influencia de los enlaces de hidrógeno en la línea vibracional cercana a los 3652 cm -1 ya en Él ya sugirió una dependencia de la temperatura de la forma del pico Raman en la región entre 3000 y 3800 cm -1. Walfaren y Fujita e Ikawa (1989), más tarde, utilizaron este efecto para determinar la estructura molecular del agua líquida y determinar la energía de enlace de los enlaces de hidrógeno mediante el uso de espectroscopía Raman y espectroscopía infrarroja. Leonard y alumnos (1979) llevaron a cabo un primer intento de usar este efecto para la medición de la temperatura del agua en los inicios de la década de los 70. Desarrolló el esqueleto de un sistema LIDAR para medir la temperatura del gua del océano sobre grandes áreas del mismo. Midió las temperaturas a 100 metros por debajo del nivel de la superficie del agua. Dentro de una profundidad de 3 metros consiguió un promedio de ±1 K. Schwaiger (1992) empleó por su parte el mismo efecto para medir temperaturas de gotas de agua. J. Karl, M. Ottman y D. Mein en sus trabajos aplicaron la espectroscopía Raman para medir la distribución de temperatura del agua a lo largo de un haz láser. ESPECTRO RAMAN DEL AGUA LÍQUIDA La dispersión Raman es un proceso inelástico de dispersión de la luz. Una molécula puede dispersar luz de cualquier longitud de onda bien elásticamente (sin desplazamiento de longitud de onda) o inelásticamente, en cuyo caso la luz dispersada es desplazada a una longitud de onda diferente. El primer caso se denomina como dispersión Rayleigh y el segundo es conocido como dispersión Raman. Las dispersiones inelásticas de la luz incidente implican que una cierta cantidad de energía queda en la molécula. La pérdida de energía de los cuantos de luz dispersada corresponde con la energía de una cierta vibración de la molécula ocasionada por el proceso de dispersión. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 97

98 Aquellas vibraciones de la molécula como por ejemplo las vibraciones de estiramiento o rotacionales, son propias y características de la molécula. Esto permite utilizar la espectroscopía Raman en análisis químico cuantitativo o investigar la estructura de la molécula. El desplazamiento Raman de una cierta molécula depende de la energía de la vibración de una molécula, de su estructura, de la distancia atómica y de los correspondientes pesos atómicos. Figura 39. Modos vibracionales de las moléculas de agua. (a) vibración de curvatura (b) vibración por estrechamiento asimétrica (c) vibración por estrechamiento simétrico Este efecto reduce la energía de vibración asociada a los estrechamientos de los enlaces de los O-H y reduce el desplazamiento Raman. El pico del agua líquida es mucho más amplio que el pico del vapor a causa de que el ángulo entre los enlaces OH y el enlace de hidrógeno puede ser muy diferente. La influencia de los enlaces de hidrógeno en la vibración de estrechamiento de los enlaces O-H depende del ángulo entre el enlace de hidrógeno y los enlaces OH. Figura 40. Espectro Raman de una muestra de vapor de agua Fuente: M. Goldbrunner, J. Karl, D. Hein Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 98

99 Figura 41. Espectro Raman de una muestra de agua líquida Fuente: M. Goldbrunner, J. Karl, D. Hein 42. La forma de los picos agua líquida cambia con la temperatura como se muestra en la figura Warafen explicó este efecto con una reacción de equilibrio dependiente de la temperatura entre los hidrógenos enlazados y los hidrógenos no enlazados de los osciladores OH en estrechamiento y expansión en agua líquida. El número de enlaces de hidrógeno establecidos decrece a medida que se produce un aumento de la temperatura. Este efecto puede ser utilizado para medir temperaturas del agua con un error de ±2ºK utilizando un algoritmo descrito en Karl and Weiss, en La figura siguiente muestra la forma del espectro Raman medido para el agua líquida a temperaturas entre 30 y 100 ºC. Después de la extracción de la línea base se observa que los picos de la curva del espectro del agua normalizados se cruzan todos en el mismo punto (punto isosbéstico) tal y como es documentado por Walfaren. La estructura molecular real del agua líquida es bastante complicada pero en términos sencillos se puede decir que el pico del agua consta realmente de dos picos con máximos en 577,6 nm y 589,4 nm que representan los hidrógenos enlazados de los enlaces OH y los hidrógenos no enlazados de los enlaces OH no enlazados. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 99

100 Figura 42. Espectro Raman del agua para temperaturas entre 30 y 100ºC Fuente: M. Goldbrunner, J. Karl, D. Hein La forma de las diferencias en el espectro entre los dos picos relevantes (577,6 y 589,4 nm) resultan útiles para obtener la relación entre los picos de intensidad de los hidrógenos enlazados y los hidrógenos no enlazados de las moléculas. Asumiendo un equilibrio dependiente de la temperatura entre los osciladores por estrechamiento de los hidrógenos enlazados y de los hidrógenos no enlazados, este equilibrio puede ser interpretado además como un equilibrio entre hidrógenos enlazados (polímero) y los hidrógenos no enlazados (monómeros) de las moléculas de agua. La relación de concentración de los enlaces establecidos representa la constante de equilibrio de este equilibrio. Esta constante de equilibrio se puede expresar a través de la entalpia de los enlaces de hidrógeno H 0 y la entropía (Atkins, 1986) ½6 UÂW UÃW 7½6UÄ%W?Å >?Æ < 2Å 7 Q 5 ÇQ UÄ%W >?Æ < 2Å Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 100

101 Asumiendo que los hidrógenos enlazados y lo no enlazados de los enlaces O-H del agua causan picos en el espectro Raman con una sección cruzada diferencial S M y S P la ecuación anterior se puede escribir como: ½6 Ç ÈŸ É 7 Q 5 ÇQ Ç É Ÿ È O bien, estableciendo la relación entre la ratio de las intensidades y la temperatura: ½6 Ÿ É Ÿ È 7 q 1 5 Aplicando aproximación lineal por el método de los mínimos cuadrados a los valores experimentales midiendo las intensidades para diferentes temperaturas se determina el valor de los coeficientes c 1 y c 2. Utilizando el principio de Vant Hoffs para calcular la entalpía de los enlaces de hidrógeno H 0 obtenemos para c 1 un valor de KJ/kmol que resulta ser una buena aproximación a las entalpías publicadas. Si la relación entre las intensidades de los picos del espectro `Ê se determina a partir de los datos medidos, la temperatura del agua puede ser calculada a través de: `Ë q ½ Ÿ É ŸÈ }% 1259,66 Ì ½ Ÿ É ŸÈ }%3.92 Así pues si empleando algún procedimiento de evaluación de la temperatura determinamos el valor de los niveles de sendos picos, en nuestro sistema de control será fácil calcular el valor de la temperatura estimada para emplearlo como medio para actuar sobre el láser y conseguir que siga la señal de referencia. PROCEDIMIENTOS PARA EVALUAR LA TEMPERATURA MEDIANTE ESPECTRO RAMAN Hay dos métodos principales para obtener la relación de intensidad entre los picos del espectro Raman. El primer método requiere del uso de un monocromador o un espectrógrafo tal y como se ha mencionado anteriormente y utiliza toda la información espectral para la evaluación de la temperatura. El espectrógrafo o monocromador proporciona un espectro Raman completo permitiendo calcular la relación `Ê con bastante precisión, y por tanto estimar la temperatura. `Ë Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 101

102 La principal ventaja de este método es que cualquier señal Rayleigh, Mie o fluorescencia puede ser separada y eliminada fácilmente. La extracción de la línea base se puede hacer automáticamente utilizando un procedimiento de ajuste lineal que separe las señales del espectro. El procedimiento de procesamiento de imagen presentado por Karl y Weiss en 1997 proporcionan temperaturas con un error de menos de ± 2ºK dentro del rango de temperaturas de 20ºC y. El segundo método para obtener las temperaturas del agua utiliza filtros de interferencia tipo paso banda estrecha. La idea es utilizar dos filtros paso de banda estrecha que transmitan principalmente las señales Raman de los hidrógenos enlazados y los no enlazados de los enlaces O-H. El haz láser puede ser expandido mediante a una lámina de luz. Una cámara CCD muestrea la luz dispersada con o sin un espectrógrafo. Las dos imágenes de la lámina de agua tomadas con diferentes filtros de interferencia son necesarias para evaluar la distribución de la temperatura del agua. Utilizando dos filtros de interferencia con una longitud de onda central en la longitud de onda Raman de los hidrógenos enlazados y los no enlazados se hace posible obtener la relación entre intensidades a partir de dos mediciones separadas con sendos filtros. Utilizando la línea azul de un laser de argón ion a 488 nm se requiere el uso de dos filtros paso de banda cercana a 577 nm y 589 nm. Es evidente que la relación de las intensidades transmitidas a través de filtros depende de la temperatura del agua. La integración de los espectros proporciona la intensidad total transmitida a través de los filtros. Este método, denominado, de dos colores tiene que tratar con tres importantes problemas: Los filtros de interferencia paso banda de banda estrecha son habitualmente filtros del tipo Fabry-Perot que operan con el mismo principio que los interferómetros Fabry- Perot. La longitud de onda central real del filtro depende del ángulo de incidencia. Es obvio que este efecto causará errores severos y sólo es válido para calcular valores de temperatura del agua a partir de la relación de intensidades si el ángulo de incidencia es muy pequeño. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 102

103 El segundo problema del método de los dos colores es causado por la fluorescencia. Altas tasas de fluorescencia incrementan las intensidades de los picos de 578 nm y 590 nm y por tanto distorsionan la relación entre las intensidades de los picos. Con agua pura la mayor parte de la señal de fluorescencia se origina de la superficie del agua. La reflexión y la dispersión de la luz laser sobre la superficie sólida del agua generan fluorescencia adicional con lo que mejora la tasa de fluorescencia total. Para cualquier aplicación de la técnica de los dos colores el tercer efecto será el más importante. Cualquier disolvente o partícula causan fluorescencias adicionales que podrían ser incluso más intensas que la señal Rayleigh. La suciedad de la ventana del láser y espejos mejorará la fluorescencia también. La mejor forma para eliminar el error causado por la fluorescencia es medirla utilizando un espectrógrafo. 4. CALENTAMIENTO DE LA MUESTRA MEDIANTE LÁSER Uno de los problemas a resolver en el sistema de vitrificación por laser que se está proponiendo es precisamente el núcleo del sistema: cómo conseguir que la muestra, en su mayor parte agua, se caliente por acción del láser? En la figura siguiente se muestra la absorción del agua para diferentes longitudes de onda de una radiación electromagnética con objeto de decidir que mecanismo podemos emplear para lograr un adecuado calentamiento de la muestra empleando radiación láser. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 103

104 Figura 43. Curva de absorción de radiación electromagnética del agua Evidentemente la solución más económica es emplear radiación láser que opere en el rango del visible, es decir la región del espectro electromagnético que el ojo humano es capaz de percibir, siendo el rango típico en el que respondería un ojo humano el que se extiende entre 400 y 700 nm. Con objeto de comprobar si es posible utilizar directamente una fuente láser en esta banda como medio de calentamiento se muestra a continuación la curva de absorción para el agua en el espectro visible: Figura 44. Descomposición del espectro visible. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 104

105 Figura 45. Absorción de la radiación electromagnética por parte del agua en espectro visible. Como puede comprobarse en las curvas anteriores el agua es prácticamente transparente a la radiación electromagnética en el rango del visible, por lo que para su uso directo se requeriría de un láser muy potente de tal forma que la mayor parte de su radiación se estaría desperdiciando. No es por tanto una solución técnicamente eficiente. Se plantean por lo tanto las siguientes alternativas. Utilización de laser infrarrojo: a la luz de la forma de la curva de absorción de radiación electromagnética por parte del agua en el espectro de luz visible se comprueba que es poco eficiente emplear este tipo de láser para calentar la muestra; no obstante la curva de absorción electromagnética, en el espectro infrarrojo (situadas inmediatamente a continuación de la luz roja extendiéndose entre longitudes de oda de 780 nm a 1mm) presenta sendos máximos interesantes a 1455 nm y nm respectivamente tal y como se muestra a continuación: Como puede observarse, el máximo relativo de la curva se alcanza a la longitud de onda de nm donde la absorción es mínima; no obstante debido a lo elevado de la pendiente en el entorno de dicha longitud de onda se tiene un pico muy estrecho, de tal forma que es difícil y muy costoso desde el punto de vista del control mantener esta frecuencia Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 105

106 Figura 46. Absorción de la radiación electromagnética por parte del agua en espectro infrarrojo. Es por ello que se opta como posible solución para calentar la muestra el uso de dispositivo láser a frecuencia infrarroja de 1455 nm. Utilización de laser en el espectro visible: evidentemente si bien el uso de un laser de radiación infrarroja es una solución plausible el uso de dispositivos láser que operan en el espectro visible resulta una opción notablemente más simple y económica. Si bien su uso directo sobre la muestra no es factible debido a lo reducido del coeficiente de absorción de agua en esta banda es posible lograrlo principalmente de dos formas: o Utilizaremos un dispositivo láser que emita en el espectro de la luz visible. Por ejemplo se ha utilizado para los diferentes experimentos un laser de luz verde. Con objeto de aumentar la absorción de la radiación electromagnética de la muestra utilizaremos un colorante no tóxico y que no altere el comportamiento de las células a criopreservar; si utilizamos un laser verde lo ideal será utilizar un colorante rojo que permita absorber gran parte de dicha radiación y lograr un calentamiento de la muestra mucho más rápido y eficiente. Este sistema es compatible con cualquiera de las técnicas de determinación de la temperatura: uso de rodamina (puede emplearse esta misma rodamina como colorante y Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 106

107 seleccionar un laser de luz visible que emita en una frecuencia adecuada en el espectro visible), empleo de termopar y espectroscopía Raman. o Si optamos por emplear como sensor de temperatura para el sistema de vitrificación un elemento termopar, que no es más que un elemento metálico (punto caliente) al que se conectan dos metales de propiedades distintas y que generan una diferencia de tensión relacionada con la temperatura, es posible utilizar este mismo elemento para lograr calentar la muestra; apuntaremos el laser de luz verde (utilizado durante las experiencias) directamente sobre el termopar, logrando un doble objetivo: por un lado al calentarse el termopar, por conducción se transferirá el calor a la muestra circundante, y por otro permitirá conocer en cada instante la temperatura a la que se encuentra la muestra tanto durante la fase de acción del láser como cuando este se apaga y tiene lugar el proceso de vitrificación. Este sistema es el que se ha utilizado en el set-up montado con objeto de logar la vitrificación; se utiliza para calentar la muestra un laser verde y como medio indirecto para lograr el calentamiento de la muestra, el propio termopar que se utiliza para sensar la temperatura y decidir, en virtud de una determinada ley de control, la acción a ejercer sobre el propio laser. 5. ESQUEMA DE SISTEMA DE VITRIFICACIÓN REALIZADO Una vez planteadas las opciones para resolver los principales problemas a que debe enfrentarse la técnica de vitrificación ultrarrápida de muestras biológicas (modeladas como agua pura desde el punto de vista matemático) mediante el uso de luz láser pasamos a describir el sistema (set-up) montado inicialmente: - Con objeto de lograr un medio externo de muy baja temperatura (-150ºC) se utilizó un recipiente de nitrógeno gaseoso a cuya salida se le acopla una unión tipo T d forma que se generan dos caminos para el gas: uno de ellos directo y otro se hace pasar mediante un serpentín a través de un recipiente conteniendo nitrógeno líquido de forma que por conducción se consigue que el nitrógeno gaseoso alcance temperaturas muy reducidas. La clave de este sistema para conseguir de forma controlada un medio de baja temperatura se encuentra en mezclar el nitrógeno gaseosos que discurre por estos dos caminos y que se encuentran a diferentes temperaturas. Para ello en el extremo final de estos trayectos se acoplan sendas electroválvulas cuya apertura y cierre controlado por ordenador permitirá realizar la mezcla de la forma más adecuada posible. Las Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 107

108 salidas de sendas electroválvulas se interconectan entre si mediante otra unión tipo T, alcanzando así la mezcla el capilar de policarbonato en el que se situará la muestra. Con objeto de sensar en todo momento la temperatura del entorno frío se utilizará un dispositivo termopar en contacto con el nitrógeno gaseoso y conecta a una tarjeta de adquisición de datos. La diferencia de tensión que se genera con las diferentes temperaturas permitirá al sistema de control no solo conocer dicha temperatura sino actuar sobre las electroválvulas (también conectadas a la tarjeta de adquisición de datos) para mantener un perfil de temperaturas adecuada; este perfil en los instantes iniciales del funcionamiento del sistema será una línea recta decreciente hasta alcanzar la temperatura deseada de -150ºC. - La muestra biológica a criopreservar se instala en un capilar de policarbonato (presenta una adecuada transferencia de calor) y será sometida exteriormente a la acción por conducción del nitrógeno gaseoso. La transferencia se realizará por conducción y no por convección ya que si bien esta última es mucho más eficiente, resulta más difícil de controlar. - El elemento fundamental de la técnica de vitrificación ultrarrápida propuesta es sin duda el elemento láser. Se utiliza, por su mayor economía y facilidad de control un láser de luz visible de color verde. Este láser se apuntará directamente a un segundo termopar instalado en el interior del capilar en contacto con la muestra a criopreservar de forma que será este sensor quien directamente reciba la acción del láser y por conducción se la traslade al resto de la muestra; de esta forma evitamos la necesidad de utilizar ningún tipo de colorante y logramos calentar la muestra de forma muy eficiente. El guiado de la luz láser desde el dispositivo hasta la muestra se realizará empleando uno de los canales de un microscopio permitiendo gracias a su objetivo focalizar la radiación sobre las células. El termopar utilizado indirectamente para calentar la muestra se encuentra conectado a una tarjeta de adquisición de datos que permitirá al sistema de control conocer en todo momento la temperatura de la muestra de tal forma que de acuerdo a una determinada ley de control se pueda actuar sobre el láser y lograr que se siga una determinada referencia (temperatura de 37ºC). Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 108

109 6. CONCLUSIONES El objeto principal de este proyecto ha sido desarrollar tanto desde el punto de vista matemático como de su implementación práctica, un sistema que permita la vitrificación de pequeñas muestras celulares con una velocidad suficientemente elevada como para evitar la formación de hielo intracelular y extracelular sin necesidad de emplear cantidades relevantes de sustancias crioprotectoras que pudieran resultar tóxicas. El sistema que se ha propuesta se basa en el uso de radiación láser para calentar la muestra en combinación con la acción de nitrógeno gaseoso sobre un capilar de policarbonato que proporciona un entorno con una temperatura muy baja (entorno a -150ºC) de tal forma que anulando en un momento determinado el efecto del láser la muestra quede sometida a un fenómeno de conducción que transporte el calor hacia zonas más frías, con una velocidad de enfriamiento notablemente elevada. Se ha comprobado tanto teórica como experimentalmente que pueden alcanzarse tasas de enfriamiento en torno a 10 6 ºC/s, en función del tamaño de la muestra. El interés por desarrollar este sistema radicaba, en su origen en explorar un posible camino que permitiese la criopreservación de óvulos humanos, algo que hasta hace pocos años era tarea harto imposible. Si bien esta técnica que aquí se propone resulta viable, el devenir del tiempo ha permitido el desarrollo de técnicas basadas en el uso de combinaciones apropiadas de sustancias crioprotectoras, que sin ser tóxicas para dichas células (especialmente sensibles a la presencia de tales sustancias), evitan la formación de hielo durante el proceso de inmersión directa en nitrógeno líquido, de tal forma que se logra el objetivo deseado con rapidez y de modo económico, sin necesidad de someter a las células a radiación electromagnética. Es por tanto que esta técnica aquí propuesta no será viable comercialmente, aunque pudiera tener aplicación en algún campo. El sistema implementado utiliza, tal y como se ha comentado anteriormente, termopares para llevar a cabo las mediciones de temperatura y a partir de ellas decidir la acción a realizar sobre el dispositivo láser. Como posible mejora a dicho sistema se propone sustituir tales sensores por un espectrógrafo Raman, que permita medir los picos característicos del espectro (con ayuda de una cámara CCD) y de esta forma estimar la temperatura. Esta técnica propuesta permitirá implementar el sistema de vitrificación sin necesidad de utilizar termopares, de una forma fiable pero también permitirá, sin alterar la muestra durante el proceso de medida obtener una calorimetría de la célula que puede proporcionar mucha información acerca de los procesos que tienen lugar en la misma. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 109

110 Modelado matemático e Figura 47. Imagen de un óvulo humano. Lograr su criopreservación fue un reto durante varios años. El presente trabajo explora uno d los posibles caminos para lograrlo aunque no la más implementable actualmente, gracias al desarrollo de técnicas más sencillas basadas en la utilización de adecuadas combinaciones de crioprotectores. En los apéndices II y III se adjunta la memoria de propuesta de proyecto de investigación que se elaboró con objeto de solicitar fondos para el desarrollo del sistema aquí mencionado. En dicha memoria se recogen las experiencias realizadas en este sentido, los modelos matemáticos de comportamiento de la célula, (tanto bidimensionales como tridimensionales) así como las ventajas que supone el aprovechamiento de la forma del espectro Raman del agua para la obtención de la temperatura de la muestra. La investigación que se proponía así como los resultados y modelos matemáticos aportados fue considerada por la dirección del Instituto de Salud Carlos III suficientemente interesante y prometedora como para que fueran concedidos los fondos correspondientes, en el ámbito de la investigación biomédica. Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 110

111 CAPÍTULO IV BIBLIOGRAFÍA Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 111

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113 13. Maurizio Becucci, Stefano Cavalieri, Roberto Eramo, Lorenzo Fini and Marzia Materazzi. Accuracy of remote sensing of water temperature by Raman spectroscopy. APPLIED OPTICS, vol. 38 Nº 6, 20 Febrero, M. Necati Özisik. Heat Conduction. Editorial John Wiley & Sons, Paul M. Danehy and David W. Alderfer. Survey of Temperature Measurement Techniques for studying underwater shock waves. Advanced Sensing and Optical Measurement Branch. NASA Langley Research Center. Hampton Virginia, US P. Mazur, The freezing of biological systems. Science, vol. 168, , P. Mazur, Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physol., vol R.E. Pitt, S.P. Myers, D.V. Lynch, P.L. Steponkus, Quantitative analysis of the probability of ice intracellular formation during freezing of isolated protoplasts. Cryobiology, vol. 26, Richard W. Hill, Gordon A. Wyse, Fisiología animal. Editorial Médica Panamericana, Risco R, Elmoazzen H, Doughty M, He X and Toner M, Thermal peformance of quartz capillaries for vitrification. Cryobiology (2007). 21. R.L. Sutton, Critical cooling rates to avoid ice crystallization in aqueous cryoprotectant solutions containing polymers. J. Chem. Soc. Faraday Trans., vol 87, Robert J. Milewski, Yuaro Kumagai, Katsumasa Fujita, Daron M. Standley y Nicholas I. Smith. Automated processing of label-free Raman microscope images of macrophage cells with standarzad regression for high-throughput analysis. Inmunome Research 2010, 6: Yaochun Shen, Zuhong Lu, Stephen Spiers, Hugh A. MacKenzie, Helen S. Ashton, John Hannigan, Scott S. Freeborn and John Lindberg, Measurement of the optical absorption coefficient of a liquid by use of a time-resolved photoacustic technique. Applied optics, Vol. 39, Nº Agosto Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 113

114 APÉNDICES Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 114

115 APÉNDICE I. CONSTANTES FÍSICAS Constante Símbolo Valor Unidades Velocidad de la luz en el vacío c m / s Permeabilidad del vacío (mu) N A -2 Permitividad del vacío (épsilon) F / m Impedancia del vacío Z Ohm Constante de la gravitación G m 3 /(kg s 2 ) Constante de Plank h J s Carga elemental e C Magnetón de Bohr (mu) B J / T Constante de la estructura fina (alfa) Constante de Rydberg R oo m -1 Radio de Bohr a m Masa del electrón m e kg Longitud de onda Compton (lambda) C m Radio clásico del electrón r e m Momento magnético del electrón (mu) e J / T Masa del protón m p kg Momento magnético del protón (mu) p J / T Masa del neutrón m n kg Momento magnético del neutón (mu) n J / T Masa de la partícula alfa m (alfa) kg Constante de Avogadro N A mol -1 Constante de los gases R J m / mol Constante de Boltzmann k J / K Constante de Stefan-Boltzmann (sigma) W /(m 2 K 4 ) Ley de desplazamiento de Wien b m K Difusividad térmica del agua α m 2 /s Departamento Física Aplicada III Escuela Superior de Ingenieros de Sevilla 115

116 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº PI TITULO: Sistema de enfriamiento ultrarrápido basado en la aplicación de radiación láser y espectrofotometría Raman del agua para criopreservación celular mediante vitrificación. Investigador principal: Ramón Risco Delgado DURACIÓN: 1 año 2 años 3 años RESUMEN (Objetivos y metodología del proyecto): (Máximo 250 palabras) Objetivo: Existen tipos celulares que no pueden ser criopreservados con facilidad mediante las técnicas convencionales, como por ejemplo los oocitos humanos, ciertas líneas tumorales, etc. La vitrificación (muy altas velocidades de enfriamiento) parece ser la única alternativa. Sin embargo, la alta concentración de crioprotector necesaria para vitrificar resulta frecuentemente tóxica. Con el presente proyecto se pretende alcanzar velocidades de enfriamiento del orden del millón de grados por segundo. Esta velocidad de enfriamiento es muy superior a la convencional mediante inmersión en nitrógeno líquido (varios miles de grados por segundo), y suficiente para vitrificar incluso agua pura. Metodología: En una primera etapa, la radiación láser infrarroja focalizada sobre una célula o un conjunto de células mediante el objetivo del microscopio consigue mantener la temperatura de esta permanentemente a 37º C, aun cuando todo medio extracelular se va enfriando hasta alcanzar -150º C. Llegados a este punto, en la segunda etapa el láser se desconecta súbitamente y la célula vitrifica. El control permanente de la temperatura de la célula durante la primera etapa se realiza utilizando la forma del espectro Raman del agua. La relación de intensidades entre sus dos picos depende de la temperatura de esta, de modo que la potencia del láser infrarrojo viene controlada por la forma de la señal Raman. Intentos previos del control mediante la fluorescencia de la rodamina B (pigmento fluorescente dependiente de la temperatura) no son viables debido a la eyección del soluto cuando aparece hielo, perdiéndose el control por la pérdida de la calibración de la intensidad de la fluorescencia con la temperatura. La espectrofotometría Raman evita este handicap. TITLE: Ultra-fast laser cooling technique based on laser radiation and Raman spectrophotomentry of water for cell criopreservation by vitrification. SUMMARY (Objectives and methodology): Objectives: Many cellular types that cannot be criopreserved by means of conventional techniques: human oocytes and certain tumoral lines are two examples. Vitrification (very high cooling rates) seems to be the only possibility for them. However, the high concentration of cryoprotectant needed to vitrify is frequently toxic. With the present project we will reach cooling rates of the order of the million of degrees per second. This cooling rate is very superior to the conventional one by plunging into liquid nitrogen (several thousands of grades per second), and enough to vitrify even pure water. Methodology: In a first step, the infrared laser radiation in focalized on a single cell or a group of cells by means of the objective of the microscope. This allows to keep its temperature permanently at 37º C, even when all extracellular media goes cooling down until reaching -150º C. When this situation is reached, in the second step the laser is suddenly disconnected and the cell vitrifies. The control of the temperature of the cell during the first step is carried out using the form of the Raman spectrum of the water. The relationship of intensities of its two picks depends on the temperature of the water; so the power of the infrared laser is controlled by the form of the Raman signal. Previous attempts to the control this temperature by means of the fluorescence of the rhodamine B (fluorescent dye temperature-dependent) has shown not viable due to the ejection of the solute when ice appears, getting lost the calibration of the intensity of the fluorescence with the temperature and therefore the control of the temperature. The Raman spectrophotometry will overcome theis trouble. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Título y resumen Página 1 de 24

117 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº PI Investigador principal: Ramón Risco Delgado Antecedentes y estado actual del tema (Citar las referencias incluidas en el apartado siguiente) (Máximo 3 páginas) La criopreservación de material biológico en general y de células aisladas en particular es una imperiosa necesidad de la biotecnología moderna. Existen dos procedimientos para tal fin: I) Low cooling rate, con bajas concentraciones de crioprotector y control-optimización de la (baja) velocidad de enfriamiento, y II) Vitrification, con altas concentraciones de crioprotector y muy altas velocidades de enfriamiento. En la técnica Low cooling rate, la célula sufre una importante deshidratación, consecuencia de la cual, entre otras causas, hace que este procedimiento no sea siempre aplicable. En estos casos, la vitrificación se impone como la única alternativa. La superioridad de la vitrificación reside básicamente en la ausencia (o importante reducción) de la necesidad de deshidratación, conservando por lo tanto al máximo la estructura celular o del tejido. Sin embargo, la vitrificación tampoco esta ausente de problemas, todos ellos provenientes de las altas concentraciones de crioprotector (que juega el papel de agente vitrificante) necesarias. Estas concentraciones de crioprotector pueden ser reducidas sensiblemente, o incluso la necesidad misma de crioprotector puede ser eliminada por completo, si la velocidad de enfriamiento de la muestra fuese varios órdenes de magnitud por encima de los empleados convencionalmente, y que básicamente son los alcanzados mediante una rápida inmersión en nitrógeno liquido (-196 C). En Harvard Medical School & Massachusetts General Hospital (Center for Engineering in Medicine, Boston, USA) empezamos a implementar una novedosa técnica que contiene a la vez las ventajas de la vitrificación y las ventajas de usar bajas (no tóxicas) concentraciones de crioprotector. La técnica esta basada en la posibilidad teórica de un enfriamiento ultrarrápido de las células mediante la aplicación de radiación láser. Las ventajas que tal sistema tendría serían numerosas, y sus potenciales aplicaciones en el campo de la medicina irían desde la criopreservacion de óvulos u otras células muy sensibles, hasta el posible escalamiento para su uso con grandes muestras de tejidos [1]. El proyecto se encuentra en una fase muy avanzada, tanto por el intenso trabajo teórico que otros investigadores han realizado desde 1999 en el proyecto [2], como por el trabajo experimental que el solicitante (Ramón Risco), ha realizado durante un año en dicho centro, cofinanciado por el Ministerio de Educación y por Center for Engineering in Medicine (Harvard Medical School). La idea central del proyecto consiste en alcanzar una situación estacionaria en la que la célula se encuentre a 37ºC mientras que todo el medio extracelular se encuentre a 150ºC. Para conseguir dicha situación, la célula se deposita sobre la plataforma de un criomicroscopio y se procede al enfriamiento controlado de dicha plataforma. Sin embargo, al tiempo, la célula es calentada mediante un haz de luz láser muy focalizado por el objetivo del microscopio. Cuando la situación es la descrita anteriormente (célula a 37ºC y plataforma del criomicroscopio a -150ºC), el láser se desconecta, consiguiéndose una velocidad de enfriamiento de millones de grados por segundo (dado lo pequeño de la muestra caliente en relación al baño frío exterior). La principal dificultad reside en realizar un correcto control, o sea en depositar la cantidad justa de radiación sobre la célula, de modo que no sea ni tan baja como para no mantener la celula permanentemente a 37ºC, ni tan alta como para producir daño por hipertermia. Como sistema sensor de la temperatura de la célula se usó rhodamina B, un pigmento fluorescente cuya intensidad de emisión es sensible a la temperatura. Un segundo haz laser a nm se encarga de excitar la fluorescencia de la rhodamina, reemitiendo a 590 nm con una intensidad tanto mayor cuanto mas fría se encuentre la muestra. Mediante este procediento, el solicitante ha implementado un sistema sensor de temperatura de la célula con una precisión superior a 1ºC. En la figura 3b (anexo) se puede apreciar la sensibilidad que hemos obtenido. Un fotodetector se encarga de sensar la intensidad de la fluorescencia; la señal es digitalizada y procesada por la computadora, que envía una señal de control al láser de calentamiento con la cantidad de energía que este debe depositar para manterner la temperatura de la célula siempre a 37ºC. El problema principal de esta forma de realizar el control basado en la dependencia de la fluorescencia de la rhodamina con la temperatura se presenta cuando aparece hielo extracelular (figura 4c). En ese momento, la zona que no contiene cristales de hielo concentra (por eyección de la fase sólida) el soluto, en este caso la rhodamina, de forma que se pierde la referencia de la intensidad de la fluorescencia y por tanto la calibración fluorescencia/temperatura de la célula. En el presente proyecto deseamos implementar UN NUEVO SISTEMA SENSOR DE TEMPERATURA mediante espectroscopía Raman. En los apartados de esta memoria: Hipótesis, Objetivos y Metodología se explica en detalle esta variante. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Antecedentes y estado actual del tema Página 2 de 24

118 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº Partes del proyecto desarrolladas hasta ahora:1.construcción de un criomicroscopio especial que evitase el uso de materiales fotosensibles. 2.Calibración de la fluorescencia de rhodamina con la temperatura mediante lector de placas. 3.Calibración de la fluorescencia de rhodamina mediante criomicroscopio. 4.Vitrificacion de agua mediante enfriamiento ultrarapido con láser. 5.Vitrificacion de solucion con agente vitrificante mediante enfriamiento ultrarrápido con láser. 6.Vitrificación de fibroblastos (3T3-S4). 1. El criomicroscopio se diseñó y se construyó con el estricto requisito de no-absorción de la luz láser. Los criomicroscopios comerciales controlan la temperatura mediante un portaobjetos recubierto con Tin Oxide conductor de la corriente eléctrica (700 ohms/cm aprox.), y produciendo calentamiento por efecto Joule. En nuestro caso, el portaobjetos está constituido por un capilar, en el que se deposita la muestra y en el que se introduce un microsensor de temperatura basado en un termopar tipo T cuya señal es acondicionada mediante el amplificador operacional OP741. Dicho capilar es de borosilicato transparente de seccion rectangular, lo que permite el análisis de la muestra bajo el microscopio. Este capilar va inmerso dentro de una cámara por la que circula nitrógeno gaseoso en régimen turbulento a la temperatura deseada, entre 40 C y 150 C. Mediante el sensor de temperatura se cierra el bucle de control, siguiendo el enfriamiento de la muestra en el criomicroscopio el protocolo establecido en la computadora que realiza el control sobre las válvulas que regulan el flujo del nitrogeno frío y caliente. 2. La calibración inicial de la fluorescencia de la rhodamina con la temperatura se realizó con un lector de microplacas modificado. En uno de los pocillos fue introducido un termopar y así se pudo establecer la dependencia de la fluorescencia de la rhodamina con la temperatura y la concentración de la misma. La curva de calibración se muestra en la figura 3a. 3. Seguidamente se realizó la calibración de la rhodamina con el criomicroscopio, cuyo detalle se ha resumido en le punto 1. Para ello el microscopio fue dotado de un sensible fotodetector capaz de recoger las variaciones en la intensidad de la fluorescencia de la rhodamina cuando la temperatura varía un grado centígrado. La sensibilidad del sistema se muestra en la figura 3b. 4. Con este sistema de control se abordó la vitrificacion de agua pura con rhodamina. El papel de la rhodamina es doble: por una lado sirve de sensor de la temperatura de la muestra. Por otro, permite el calentamiento de la muestra, ya que solamente se usa un láser a nm y esta longitud de onda es poco absorbida por el agua. En el agua pura es difícil mediante procedimientos exclusivamente ópticos distinguir el estado de sólido amorfo del estado cristalino. Las imágenes que se obtuvieron (figuras 4ba y 4c) en cualquier caso apuntan a que, si no se alcanzó el estado amorfo, con seguridad si que al menos se llego a una estructura muy distinta y posiblemente consistente en microcristales (con frecuencia inocuos en la criopreservación de muestras biológicas). 5. La adición de 10% de glicerol permitió asegurar la obtencion del estado vítreo tras el protocolo de enfriamiento ultrarrapido. Para ello una vez que se desconectó el laser, se observó una zona transparente (estado vítreo) rodeada de una zona opaca (zona cristalina). La transparencia es una garantía, casi indiscutible, de la existencia del estado amorfo. Para mayor garantia, sin embargo, se observó el comportamiento de la muestra tras el recalentamiento. Así, la muestra se tornó súbitamente opaca toda ella, evidencia del preceso se desvitrificación (ver figuras 5a-c). 6. Por último se aplicó la técnica a la vitrificación de fibroblastos (3T3-S4). En la figura se puede observar la morfología de los fibroblastos que han seguido el protocolo de enfriamiento ultrarrápido (figura 6a), comparada con la morfología de los fibroblastos que han seguido el protocolo de enfriamiento impuesto por el criomicroscopio (figura 6b). En desarrollos posteriores de este proyecto se harán determinaciones (no sólo morfológicas) de la viabilidad de estos fibroblastos, posiblemente con Calcein-AM Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Antecedentes y estado actual del tema Página 3 de 24

119 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Bibliografía más relevante Expediente Nº PI (Máximo 1 página) Bibliografia: [1] Ramon Risco and Jorge Aguilar. Microwaves and vascular perfusion: getting very fast organ cooling rates. CRYO2004-Beijing, July 15-19, th Meeting of the Society for Cryobiology. [2] Alex Fowler and Mehmet Toner. Cryopreservation of cells using ultra-rapid freezing, HTD-Vol355/Bed Vol 37, Advances in Heat and Mass Transfer in Biotechnololgy, ASME [3] Alex Fowler and Mehmet Toner. Prevention of Hemolysis in rapid frozen erythrocytes by using a laser pulse Annals of the New York Academy of Sciences 858: (1998). New York Academy of Sciences. [4] Dubravko Risovic and Kresimir Furic, "Comparison of Raman spectroscopic methods for the determination of supercooleed and liquid water temperature", J. Raman Spectrosc (2005) [5] Elkin Lucena, Diana Patricia Bernal, Carolina Lucena, Alejandro Rojas, Sandra Mojica, Ángela María Sao, Zulma Suárez, Abby Morán, "Primera gestación lograda a partir de óvulos vitrificados", Revista Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol 55 No. 3 (2004) Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Bibliografía más relevante Página 4 de 24

120 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Expediente Nº PI Hipótesis Las hipótesis de partida que justifican el proyecto a realizar serían las que se consideran a continuación: - El espectro Raman de la luz dispersada (scattering) por una muestra que ha sido irradiada con luz láser (radiación monocromática y coherente) tiene unas caracteristicas que dependen de la temperatura de la muestra. En particular, en el caso del agua se distinguen dos picos de emisión en longitudes de onda de nm y nm. Midiendo la relación de intensidad entre estos dos picos espectrales (relacionados con la concentración de moléculas de agua enlazadas con puente de hidrógeno, y no enlazadas) encontramos una sencilla relación con la temperatura (ln(sm Ip/Sp Im)=(Ho/RT)+RSo). Mediante un espectrofotómetro digital focalizado mediante el objetivo del criomicroscopio obtendremos el espectro Raman de células y desarrollaremos un método no invasivo para determinar su temperatura, tanto en un instante concreto como su evolución en el tiempo. - Si mantenemos una célula o conjunto de células, mediante un sistema de control que combine el uso de un laser para calentarlas y una criostage enfriarlas, mantendremos la temperatura de la célula entre 4ºC y 20 ºC: el medio extracelular alcanzará, sin embargo, -196ºC. Si seguidamente desconectamos súbitamente el laser de calentamiento, la celula se verá sometida casi instanténeamente a una temperatura muy baja, de forma que no dará tiempo a la formación del hielo intracelular sino que se producirá la vitrificación de esta, evitando así un problema especilamente grave a la hora de llevar a cabo la criopreservación de cualquier tejido, órgano o célula. Objetivos El objetivo principal que persique este proyecto es doble: - En primer lugar se pretende poner a punto un procedimiento, basándonse en las propiedades del efecto Raman, que permita determinar, sin necesidad de utilizar sustancias externas como la Rodamina, la temperatura de una célula, con cierta precisión, de forma fiable, rápida y no agresiva. Esto permitiría obtener, entre otras posibles aplicaciones, con cierta facilidad la calorimetría y termometría de una célula (algo que no se ha realizado hasta la fecha en ningún laboratorio), y de esta forma conocer el comportamiento y la reacción de la misma ante diferentes situaciones. Así pues el primer objetivo que podría alcanzarse con este desarrollo podría ser lograr un "termómetro Raman para células aisladas". - En segundo lugar, y utilizando la información obtenida por el termómetro Raman, se lograría desarrollar una técnica de enfriamiento ultrarrápida de células evitando la formación de cristales de hielo intracelular, que es uno de los problemas principales a tener en cuenta en el campo de la criopreservación, así como eliminar la necesidad de utilizar soluciones crioprotectoras que resultan altamente tóxicas, en especial para determinados tipos de células de enorme interés en criopreservación como puede ser el oocito humano, entre otras. Ajustarse al espacio disponible Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Hipótesis y objetivos Página 5 de 24

121 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Expediente Nº PI Metodología (Diseño, sujetos de estudio, variables, recogida y análisis de datos y limitaciones del estudio) (Máximo 3 páginas) Metodología: 1. Desarrollo de sistema de medición de temperatura de una única célula: existen diferentes métodos y técnicas para llevar a cabo la operación de medición de la temperatura en diversos campos; no ocurre lo mismo a la hora de determinar la temperatura en el ámbito celular. Esto es debido a que no debemos alterar la célula mientras realizamos la medición. En este proyecto se propone una novedosa técnica de medición de temperatura basada en las características y propiedades del espectro Raman en relación con la temperatura. Este procedimiento permitiría realizar mediciones no invasivas de la temperatura celular, información que podría emplearse en la realización de una calorimetría de la célula a estudiar. Así podríamos conocer con más detalle las reacciones térmicas de la célula en relación a diferentes situaciones. Para ello llevaremos a cabo las siguientes etapas. A. Montaje de los sistemas requeridos: Aquí se llevaría a cabo el montaje del sistema láser en la mesa óptica, calibrando adecuadamente su potencia, posición y orientación. Mediante un sistema colimador se puede corregir el patrón de radiación del láser para adaptarlo a nuestros intereses. El láser utilizado para realizar la espectroscopía Raman puede trabajar en el visible o en el ultravioleta, donde la absorción óptica es más reducida, de forma que la interferencia con la célula será prácticamente inexistente. Dado que el objetivo principal de la aplicación es la criopreservación de células aisladas nos vemos obligados a trabajar a escalas micrométricas de forma que hemos de emplear un microscopio, con un objetivo de A.N para poder focalizar correctamente la luz láser sobre la muestra a estudiar. La muestra absorberá energía electromagnética que reemitirá. En su mayor parte la luz reemitida presenta la misma longitud de onda de la radiación incidente (scattering Rayleigh), pero existe una pequeña fracción de radiación reemitida a diversas longitudes de onda diferentes de la incidente y que constituirán el espectro Raman que a nosotros nos interesa. El objetivo del microscopio nos servirá también para recoger esta radiación y guiarla hacia el fotoespectrómetro, utilizando diversos filtros ópticos para eliminar componentes espectrales no deseadas (como pude ser la componente Rayleigh). La dirección de propagación de esta radiación se llevará a cabo empleando diversos sistemas ópticos (dicroicos, beam-splitters y lentes) para lograr una adecuada focalización de la luz a la entrada del fotoespectrómetro. El fotoespectrómetro se encargará de descomponer la radiación luminosa en diversas componentes epectrales, mediante el uso de redes de difracción. Estas componentes espectrales incidirán sobre diferentes puntos de una cámara CCD. Con esta cámara CCD dispondremos de una información adecuada de la intensidad luminosa de cada una de las componentes espectrales, en cada uno de sus puntos. Gracias a esta información resolveremos el espectro Raman de la radiación considerada. El espectro Raman recogido por la cámara CCD será enviada al puerto USB del ordenador. Se desarrollará pues un software que se comunique con el puerto USB del ordenador con el fin de leer la información suministrada por la cámara CCD acerca de las intensidades del espectro Raman. Mediante este software se determinarán las intensidades de los picos de interés (577.6 nm y nm) y se estimará la temperatura de la muestra con cieta precisión. Una vez que el sistema de medición Raman de temperatura se haya puesto a punto tendremos a nuestra disposición un sensor no invasivo que nos permitiría continuar con la realización de la segunda parte del proyecto considerado. No obstante antes de esta etapa se podrán realizar diversos experimentos de comprobación del funcionamiento del sistema: - Calorimetría y termometría de diversos tipos celulares en distintas condiciones. - Montaje en el mismo criomicroscopio de sistema para de determinación de viabilidad celular, mediante 'dyes' fluorescentes Calceim-AM/Ethidium. 2. Desarrollo del sistema de enfriamiento ultrarápido: Realizaremos la conexión de la cryostage al sistema de enfriamiento, que previamente habremos dispuesto a través de sus diversas entradas y salidas al sistema Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Metodología Página 6 de 24

122 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº de enfriamiento (conductos por los que circulará nitrogeno líquido de refrigeración, válvulas controladas eléctricamente, vaso Dewar conteniendo nitrógeno líquido, etc). La ventana dispone de una ventana transparente a la radiación infrarroja puesto que como método de calentamiento de la muestra se utilizará un láser con longitud de onda de 1440 nm, con el fin de aprovechar el máximo relativo que la curva de absorción del agua presenta en esta longitud de onda. Una vez dispuesta la cryostage y conectada al sistema de enfriamiento y al láser a través del microcopio anteriormente citado (que se encargará de focalizar el rayo sobre la muestra contenida en la cryostage) empleando para ello diversos elementos ópticos, utilizaremos el termómetro Raman descrito más arriba como elemento de medición de temperatura, información esencial en el establecimiento del bucle de control del sistema. La información acerca del espectro Raman recogida por la cámara CCD será enviada al ordenador, bien a través del puerto USB del ordenador, que será empleado para realizar diversas tareas, como controlador del sistema completo, tanto en la determinación de la temperatura a partir de la información de la cámara CCD, como en la actuación sobre la potencia del láser de calentamiento o las válvulas del sistema de enfriamiento. Mediante el software desarrollado se determinarán las intensidades de los picos de interés (desplazamientos Raman de nm y nm respectivamente) a partir de la información procedente de la cámara CCD y se estimará la temperatura de la muestra. Comparando esta temperatura con la referencia que le hayamos especificado al sistema de control se encargará de general las señales de control apropiadas. El sistema de control escribirá los valores apropiados en los canales de salida correspondientes de la tarjeta de adquisición de datos, conectada al ordenador. De esta manera controlaremos la potencia que aplica el láser a la muestra calentando más o menos su objetivo, así como las válvulas que permiten el paso del nitrógeno gaseoso, enfriando más o menos la muestra, y logrando de esta forma estabilizar la temperatura de la muestra en unos límites tolerables para la vida celular (entre 4ºC y 20ºC), gracias a este mecanismo de realimentación. Mediante una cámara acoplada al microsopio podremos observar adecuadamente el comportamiento de la célula en tiempo real, al mismo tiempo que se realiza su criopreservación, pudiendo comprobar si se forma o no hielo durante el proceso, si se daña la membrana celular, etc. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Metodología Página 7 de 24

123 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Expediente Nº PI Plan de trabajo (Etapas de desarrollo y distribución de tareas de todo el equipo investigador, incluyendo los proyectos en los que participe cada uno de sus integrantes y las asignaciones previstas para los becarios. Indicar también el lugar de realización del proyecto) (Máximo 1 página) Plan de desarrollo del proyecto: 1. Adquisición del material necesario: espectrómetro, láseres, microscopio, ordenador, etc. Duración: 1 mes Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero Gonzalez Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 2. Comprobación del correcto funcionamiento de los elementos que configurarán al sistema. Duración: 1 mes Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryobioTech (Junta Andaluc) 3. Montaje del termómetro Raman. Duración: 3 meses Asignación de tarea: Javier Rivero González Lugar: Laboratorio de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 4. Desarrollo de software de comunicación con la cámara CCD para obtención del espectro Raman y determinación de la temperatura a partir de dicha información. Duración: 2 meses Asignación de tarea: Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 5. Calibrado y puesta a punto del termómetro Raman, para maximizar su precisión. Duración: 2 meses Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 6. Realización de comprobaciones del funcionamiento del termómetro Raman con diversos experimentos. Duración: 3 meses Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 7. Conexión con los elementos restantes para implementar el sistema de criopreservación por "ultra-fast 'laser' cooling". Duración: 3 meses Asignación de tarea: Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 8. Desarrollo del software de control del sistema. Duración: 2 meses Asignación de tarea: Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 9. Ajuste y puesta a punto del sistema de criopreservación. Duración: 3 meses Asignación de tarea: Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) 10. Realización de experimentos diversos de criopreservación con el sistema anterior, empleando diferentes tipos de cultivos celulares. Duración: 4 meses Asignación de tarea: Ramón Risco Delgado y Javier Rivero González Lugar: Laboratorios de la Esc. Sup. de Ingenieros (Univ. Sevilla) y grupo CryoBioTech (Junta Andaluc) Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Plan de trabajo Página 8 de 24

124 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Experiencia del equipo investigador sobre el tema RAMON RISCO DELGADO Expediente Nº PI (Máximo 1 página) CRYOPRESERVACION: Responsable del grupo de Investigación de la Junta de Andalucia: CVI-289: CRYOPRESERVACIÓN DE TEJIDOS Y ORGANOS PARA TRASPLANTES. Desde 2001 Diirección de multriples proyectos en Ingenieria Superior sobre criopreservación que han dado lugar a los trabajos: AUTORES: Jaime Saenz, Khaid El-Moussaoui, José Antonio Calvillo, Ricardo Campa, Ramon Risco TITULO: Non-linear cooling rates and the kinetics of water loss REVISTA: Cryobiology 32, 316 (2001) AUTORES: Roberto Baena y Ramon Risco TITULO: Results of the application of an ultrasound field on the statistical properties of water freezing REVISTA: Cryobiology 47, 256 (2003). AUTORES: Jaime Saenz y Ramon Risco TITULO: Linear and non linear cryopreservation protocols for spermatozoa: comparison of ideal and nonideal solution models REVISTA: Cryobiology 47, 268 (2003) AUTORES: Jorge Aguilar, Servando Alvarez, Jose Manuel Salmeron y Ramon Risco TITULO: Real transient temperature and mass fields of perfused tissues and organs: a digital image and finite differences method. REVISTA: Cryobiology 47, 286 (2003). AUTORES: Jorge Aguilar y Ramon Risco TITULO: Microwaves and vascular perfusion: getting very high organ cooling rates. REVISTA: Cryobiology 49, (2004). AUTORES: Ramon Risco TITULO: Organ Cryopreservation LIBRO (capitulo): Extending Lifespan, LIT Verlag Ed. (Hamburg, Germany), ISBN: LASERES: Responsable, durante cuatro años del grupo de investigación Fundamentos de Mecánica Cuántica, de la Junta de Andalucía, (FQM-239). En el mismo ha realizado trabajos tanto teóricos como experimentales publicados en Physical Review, Eurpopean Physical Journal, Ziftschriftfurnaturforschung y otras revistas internacionales de reconocido prestigio (ver curriculo) sobre APLICACIONES IMPORTANTES DE LA RADIACION LASER (ver Curriculo). LASERES Y CRIOPRESERVACIÓN: Officer: Harvard Medical Shool. Harvard Univesity (Boston, USA). Desarrolla trabajo de colaboración con "Center for Engineering in Medicine and Surgical Services", Massachusetts General Hospital. Aquí colabora en la implementación del sistema de enfriamiento ultrarrapido con laser de celulas y tejidos, donde explora la via del uso de rhodamina B como sistema sensor de la temperatura para el control durante el proceso de enfriaminto. El proyecto solicitado es muy similar, la única diferencia radica en el uso de la espectroscopia Raman en vez de la Rhodamina JAVIER RIVERO GONZALEZ (Becario) INGENIERO SUPERIOR (Escuela Superior de Ingenieros, Univ Sevilla): Proyecto de Fin de Carrera titulado: "Criopreservación celular mediante láser y espectroscopia Raman: modelo matemático y propuesta experim" Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Experiencia del equipo investigador sobre el tema Página 9 de 24

125 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Expediente Nº PI Resumen del historial científico del grupo en el seno del nodo de la red temática de investigación cooperativa, incluyendo publicaciones y proyectos derivados de la pertenencia a la red (cumplimentar SOLO los proyectos coordinados en el marco de las redes temáticas de investigación cooperativa) (Máximo 1 página) Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Resumen del historial científico Página 10 de 24

126 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº Investigador principal: Ramón Risco Delgado Actividades de integración y relaciones científicas cooperativas con otro nodo de la red (cumplimentar SOLO los proyectos coordinados en el marco de las redes temáticas de investigación cooperativa) (Máximo 1 página) Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Actividades de integración Página 11 de 24

127 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Investigador principal: Ramón Risco Delgado Expediente Nº PI Utilidad práctica de los resultados en relación con la salud. Posibilidad de patentes u otros resultados explotables comercialmente Aplicaciones prácticas: - En primera instancia este proyecto permitiría desarrollar una técnica no invasiva de determinación de la temperatura de una única célula, dado que al basarse en el uso de la información suministrada por el espectro Raman tan sólo es necesario iluminar la muestra con una luz láser de una frecuencia en la que prácticamente no hay absorción de energía por parte de la célula. Este procedimiento permite por lo tanto, sin alterar el estado de la célula, conocer el comportamiento calorimétrico de una célula al ser sometida a diversas condiciones. - En segundo lugar proporciona una técnica de criopreservación que solventa muchos de los posibles problemas con los que se encuentra actualmente la biomedicina a la hora de conservar diversos tipos de células como oocitos humanos, algunas lineas tumorales,etc. 1. Se elimina la necesidad de emplear sustancias anticongelantes como glicerol, DMSO, etc. para evitar la formación de hielo intracelular, sustancias que para muhas células de interés práctico resultan tóxicas. Esto ocurre,por ejemplo en el caso del oocito humano. Al no poder emplear criopreservantes nos vemos obligados a utilizar temperaturas más altas y consecuentemente disminuye el timepo de conservación. 2. Por otra parte el proceso de descongelación o recuperación de las células resulta tremendamente simple, dado que bastaría con recalentar la mustra con el láser hasta alcanzar una temperatura óptima, sin necesidad de extraer las substancias criopreservadoras dado que no son necesarias. Medios disponibles para la realización del proyecto Medios disponibles: - Laboratorios de la Escuela Superior de Ingenieros de la Universidad de Sevilla. - Material del grupo de investigación CrioBioTech (Campana de extracción, microscopio, estufa, fungible para cultivos celulares, calceim AM/Ethidium) - Colaboración con centros diversos: 1.-Departamento de Fisiología Médica y Biofísica (Univ. Sevilla) 2.-CSIC (Bioquimica Vegetal, Sevilla): Citómetro de Flujo y Microscopio confocal 3.-Harvard Medical School (Harvard University; Center for Engineering in Medicine), con quien se esta colaborando en un proyecto similar, basando el control de la temperatura en la dependencia de la fluorescencia de la rodamina B con la temperatura, en vez del uso de la fotoespectrometria Raman (que se propone aquí). Ajustarse al espacio disponible Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Utilidad práctica de los resultados / Medios disponibles Página 12 de 24

128 Investigador principal: MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº PI Justificación detallada de la ayuda solicitada (Máximo 1 página) La cuantía de la ayuda solicitada se repartiría entre las siguientes partidas que se mencionan: Equipamiento - Cryostage (FTIR600 de Linkam): sistema en el que se coloca la muestra que se desea criopreservar. Dispone de una ventana transparente que permitirá al láser calentar la muestra, así como enfriarla de forma ultrarápida utilizando un circuito de refrigeración. - Láseres: Se requieren dos láseres, uno de ellos para lograr el calentamiento de la muestra, y otro para implementar el sistema de medición de temperatura por efecto Raman. Laser de Argon-ión: 488nm Laser infrarrojo para calentamiento: 1440nm - Espectrofotómetro (U21830 de B3 Scientific): con el fin de obtener el espectro Raman de la muestra y a partir de ella obtener una medida fiable acerca de la temperatura. Es necesario capturar la luz irradiada por la muestra y separarla en sus componentes espectrales constitutivas. Este equipo se encarga de tales funciones, generando información vital para establecer el control del sistema. - Microscopio y objetivos especiales para IR (Olympus): Aquí el microscopio tendrá una triple función: - Por una parte permitirá observar que ocurre con la muestra durante toda el proceso. - En segundo lugar permitirá focalizar la radiación de los láseres hacia la muestra. - En tercer lugar servirá como mecanismo de captación de la luz irradiada por la muestra, que será guiada hacia el espectrómetro anteriormente referido. - Cámara CCD (2) -Tarjeta de adquisición de señales I/O, que se conectará al ordenador y permitirá que éste se comunique con su entorno cerrando así el bucle de control. -Ordenador: será el centro de control del sistema, encargado de procesar la señal procedente de la cámara CCD y del fotoreceptor, con el fin de calcular la temperatura de la muestra y modificar las actuaciones sobre el láser de calentamiento y el sistema de enfriamiento y así poder establecer el control. -Software necesario: - Control de cryostage (Lynksys32) - Mesa óptica - Dispositivos ópticos diversos: - Dicroicos - Filtros ópticos - Colimadores para la luz láser - Beamsplitters. Personal - Un becario que se encargaría de realizar el montaje del sistema, así como de la calibración de los diferentes elementos Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Justificación detallada de la ayuda solicitada Página 13 de 24

129 MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Expediente Nº PI Investigador principal: Ramón Risco Delgado PRESUPUESTO SOLICITADO 1. Gastos de personal Euros 1 Becario (a tiempo completo) 1200/mes 2. Gastos de ejecución a) Adquisición de bienes y contratación de servicios (Inventariable, fungible y otros gastos) Cryostage (Linkam) Láser (infrarrojo) de 1440nm. Láser de semiconductor para espectroscopia Raman de 488nm Mesa Óptica Espectrofotómetro (modelo U21830 de B3 Scientific) Objetivos específicos transparentes a luz infrarroja (Olympus) Ordenador (incluyendo software y tarjeta de adquisición de datos apropiada) Software(Lynsys32) SUBTOTAL b) Viajes y dietas SUBTOTAL Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Anexos Página 14 de 24 SUBTOTAL SUBTOTAL GASTOS EJECUCIÓN TOTAL AYUDA SOLICITADA 47772

130 Investigador principal: Ramón de Jesús Risco Delgado MEMORIA DE SOLICITUD DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN ANEXOS Expediente Nº PI Modelos matemáticos Con anterioridad a la propuesta de este proyecto y con el objeto de disponer de un modelo adecuado que simulara el comportamiento de la evolución temporal de la temperatura en una célula sometida a un rápido enfriamiento de la misma se desarrollaron una serie de modelos de transferencia de calor. Partimos para ello de la hipótesis de que mediante un determinado sistema de control se puede lograr la estabilización la temperatura en la célula en un entorno apropiado para su desarrollo vital; para ello utilizamos la combinación de un sistema de refrigeración (cryostage) y de un sistema de calentamiento por láser. Este láser, con el fin de considerar un efecto más realista, suponemos que no calienta uniformemente toda la célula sino que induce una distribución inicial determinada en la misma, de forma que una vez apagado el láser, la temperatura en el interior de la muestra caerá con una determinada velocidad de enfriamiento. Gracias a estos modelos podemos comprobar como será la evolución de la temperatura a partir de este instante en cada punto de la muestra. La obtención de tales modelos procede del planteamiento y posterior resolución de la ecuación de transferencia del calor, en diversas situaciones, tanto de geometría como de distribución inicial de la temperatura inducida por el láser. En nuestro caso, dada la forma del haz laser, lo más simple resulta emplear una geometría circular (bidimensional) o cilíndrica (tridimensional). Así pues la ecuación a resolver será la que se muestra a continuación: 2 T ( r, θ, t) 2 r 1 T ( r, θ, t) + r r r 2 T ( r, θ, t) 2 θ + 2 T ( r, θ, t) 2 z 1 T ( r, θ, t) = α t Tomemos en cuenta una serie de aspectos: La geometría de nuestro problema permite suponer la existencia de simetría cilíndrica luego la dependencia de la temperatura con respecto al ángulo desaparece. El término α se conoce como difusividad térmica y tiene relación con la velocidad con que el calor se difunde hacia zonas más frías durante el proceso de transferencia térmica. Para nuestro modelo supondremos que este término es una constante que no depende de la temperatura. En el caso del agua, el valor que tomaremos será: ms -2. Así pues la ecuación diferencial en derivadas parciales a resolver, queda reducida a: 2 2 T ( r, θ, t) 1 T ( r, θ, t) T ( r, θ, t) 1 T ( r, θ, t + + = ) 2 2 r r r z α t Como en toda ecuación en derivadas parciales será necesario imponer una serie de condiciones, que ayuden a delimitar la solución de la expresión anterior. Distinguiremos entre condiciones de contorno, relacionadas especialmente con la geometría del problema, y condiciones iniciales, relacionadas con el comportamiento temporal. En relación con las primeras, trabajaremos especialmente con dos tipos diferentes: Conducción: podemos especificar la temperatura que tendrán los puntos de una curva o superficie a través de las condiciones de contorno conductivas. En nuestro caso serán de la forma: Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Anexos Página 15 de 24

131 T ( r, θ, z, t) T ( r, θ, z, t) r = R1 z = z1 = T = T 0 1 Convección: estas condiciones de contorno se utilizan cuando la transferencia de calor no se produce por el simple contacto de dos cuerpos con temperaturas diferentes, sino cuando el elemento encargado de extraer calor del sistema es un fluido, a una temperatura diferente, en movimiento. En nuestro caso serán de la forma: T ( r, θ, z, t) k z = z + ht ( r, θ, z, t) = 0 1 z donde las constantes que aparecen son: k: conductividad térmica del medio. h: coeficiente de convección. A continuación se muestran los resultados obtenidos para esta ecuación diferencial en diversas condciones de contorno. Modelo bidimensional En una primera aproximación a nuestro problema se modeló la muestra contenida en la cryostage como un disco plano sometido a una serie de condiciones: Condiciones de contorno: supusimos que las condiciones de contorno en el borde de contacto entre la muestra y el resto del medio la transferencia de calor se realizaría mediante el mecanismo de conducción, de forma que al apagarse el láser y transcurrido un breve periodo de tiempo la muestra acabaría a la misma temperatura que el entorno. La tasa de enfriamiento alcanzada mediante este mecanismo es muy elevada. Condiciones iniciales: con el fin de modelar de forma realista la forma del haz láser, supusimos que la distribución inicial de la temperatura seguía un perfil determinado. Aunque se realizaron diversos modelos, sin duda el más realista es el gaussiano. En esta situación la ecuación diferencial a resolver resulta un tanto más simple, dado que estamos utilizando un modelo bidimensional. Esto es, se supone que la distribución de temperatura no depende la componente z. 2 T ( r, θ, t) 1 T ( r, θ, t) 1 T ( r, θ, t + = ) 2 r r r α t Así pues resolviendo la ecuación de transferencia de calor en coordenadas polares, sometidas a una condición de contorno conductiva en el borde del disco y modelando la distribución inicial de temperatura en el interior como gaussiana, la evolución de la temperatura con el tiempo una vez que se produce el apagado del láser generan las curvas que se indican a continuación. Dada la simetría angular del problema planteado basta con estudiar el comportamiento en una dirección determinada. Además se comprueba como ajustando la gaussiana podemos obtener unas variaciones más o menos rápidas en la pendiente (tasa de enfriamiento), del orden de 10 6 ºC/s Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 16 de 24

132 Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 17 de 24

133 Modelo tridimensional Una vez desarrollada una primera aproximación al problema, mediante modelos bidimensionales, optamos por modelar la muestra a estudiar mediante un cilindro finito, sometido a una serie de condiciones de contorno y una distribución inicial de temperaturas determinada. En la práctica podemos plantear dos posibles situaciones: Utilizar como soporte de la muestra a criopreservar una cryostage en la que el enfriamiento de la muestra se realice únicamente por la superficie inferior de la misma. En esta situación la parte superior de la muestra queda al aire, con lo que se puede suponer que la transferencia de calor a través de esta superficie es prácticamente despreciable; esto permite modelarla como adiabática. La resolución de la ecuación diferencial en derivadas parciales, en coordenadas cilíndricas, para el caso tridimensional y asumiendo el comportamiento adiabático de la superficie superior de la muestra, nos permite conocer cómo es la evolución de la temperatura en la muestra una vez que el láser se apaga. En la gráfica puede verse un ejemplo de distribución de temperaturas en un instante dado según un corte r-z del cilindro (dada simetría cilíndrica del problema, basta con conocer que ocurre en una dirección cualquiera), en este caso para unas condiciones conductivas en la base (En todas las gráficas siguientes: eje OX: dirección radial; eje OY: dirección del laser; curvas con temperatura adimensionalizada): Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 18 de 24

134 Utilizar como soporte para contener la muestra una cryostage en la que el enfriamiento por nitrógeno gaseoso se produzca tanto por la superficie inferior de la muestra como por la parte superior. Este tipo de cryostage, de más reciente aparición será el que se utilice en la implementación del sistema de criopreservación anteriormente propuesto. Extraer el calor contenido en la muestra por ambas caras hace que el enfriamiento sea aún más rápido, permitiendo una mayor velocidad de enfriamiento respecto al esquema anterior. Evidentemente el montaje será algo más complejo. La resolución de la ecuación de transferencia del calor, supuesto que el enfriamiento de la muestra se realice por las dos caras del cilindro, imponiendo tanto condiciones de contorno conductivas (la pérdida de calor se produce por el contacto de dos cuerpos con temperaturas distintas) como convectivas (en éste caso se tiene en cuenta la influencia del movimiento del gas en la extracción de calor de la muestra considerada) y teniendo en consideración cómo era la distribución de temperaturas en el interior de la misma justo antes de apagar el láser (suponemos generalmente distribución gaussiana), nos permiten conocer la distribución de la temperatura a partir de ese instante, pudiendo estimar la rapidez de enfriamiento de la muestra, siendo esta muy superior a los valores obtenidos por otros procedimientos. El desrrollo matemético del problema condujo a una solución de la forma: T = m 0 m m = 1 n = 1 donde A m y Q n son coeficientes conocidos. 2 2 β ( ) m τ η n τ R, Z, τ A e J ( β R) Q e sen( η Z ) En la gráfica sigiuiente puede verse un ejemplo de distribución de temperaturas en un instante dado según un corte r-z del cilindro en este caso para unas condiciones conductivas en las bases, calculado mediante la expresión anterior: n n Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 19 de 24

135 Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 20 de 24 La ecuación normalizada de evolución temporal de la temperatura en la muestra considerada en el caso de que las condiciones de contorno en las tapas del cilindro sean e tipo convectivo conducen a una expresión algo más compleja, pero con una estructura similar ( ) ( ) ( ) = = = ) )( ( cos ' ) (,, 2 2 H H H c H Z sen H Z e Q R J e A Z R T n n n n n n n m m m n m η η η η η β τ τ η τ β También se muestra a continuación el ejemplo de una muestra sometida a condiciones convectivas en ambas caras, supuesta una distribución inicial de temperaturas, en un instante determinado después de apagar el láser.

136 Gracias a estos modelos desarrollados, es posible evaluar entre otras cosas dos parámetros de especial importancia para el problema que se nos plantea: 1. Potencia necesaria que debe tener el láser. 2. Velocidad de enfriamiento de la muestra en cuestión. En la actualidad se desarrollan modelos más complejos que incorporen nuevas variables al problema, como son la presencia del cristal de soporte de la muestra, etc. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 21 de 24

137 FIGURAS: LASER, 514 nm microsco pe Hg lamp Filte rs electroni VALV ES DA C N 2 Fig. 1 Esquema del montaje experimental Figura 2 a (izquierda): Detalle de criomicroscopio. Se observa vaso Dewar para circuito refrigerante y resistencia para circuito calefactor. También se observa plataforma de criocroscopio con cámara para inserción de capilar y termopar de control. En el centro se aprecian las dos válvulas de tres vías sobre las que actúa el software. Figura 2 b (derecha). Vista parcial de sistema óptico, con telescopio (al fondo), y puerto de entrada en microscopio invertido mg/l Rhodamine B in 1xPBS Serie Figura 3a (izquierda). Curva de calibración de la fluorescencia de la rhodamina en función de la temperatura mediante lector de microplacas. En el eje vertical se representa la intensidad de la fluorescencia (pwatts) y en el eje horizontal se representa la temperatura en grados Celsius. Figura 3b (derecha). Curva de calibración de la fluorescencia de la rhodamina en función de la temperatura mediante el criomicroscopio. La primera línea horizontal es la fluorescencia a 4 C para 0.2 miliwattios de excitación. La segunda línea horizontal es a 37 C, también para 0.2 miliwattios. La tercera línea horizontal es a 37 C para 0.6 miliwattios y la cuarta es a 4 C, también para 0.6 miliwattios. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 22 de 24

138 Figura 4. (izquierda)capacidad de focalización del sistema láser-criomicroscopio implementado. Cultivo de fibroblastos en el que se ha seleccionado una célula concreta (flecha) y se ha sometido a un pulso láser de 10 miliwattios durante 5 segundos. Se observa como el fibroblasto queda destruido sin producirse daño aparente en ninguna de las células vecinas. Figura 4bª (centro). Agua pura con rhodamina (0.025g/l) a la que se ha aplicado el protocolo de enfriamiento ultrarrápido. Se muestra una imagen ampliada a 400X de la zona superior izquierda del lugar tratado. En ella se puede observar la presencia de hielo en la zona no tratada y una estructura opaca que bien pudiera ser agua vitrificada o cristales de hielo de tamaño muy inferior al presente en la otra región. Figura 4c (derecha). Tras el recalentamiento de la sección descrita en la imagen anterior lo que se obtiene es siempre un patrón como el mostrado en esta figura. Se observa cómo la transición sólido-líquido comienza siempre en la zona tratada, algo que está de acuerdo con el hecho de que esta zona sea un sólido amorfo o microcristales de hielo. Figura 5a (izquierda). Solución (10% glicerol) tratada con el procedimiento de enfriamiento ultrarrápido con láser. Cuándo la temperatura del criomicroscopio alcanzó 90 C, el láser de calentamiento fue desconectado. En la figura se observa cómo las burbujas quedan atrapadas en lo que parece un claro estado vítreo. La temperatura se siguió descendiendo hasta 130 C y la imagen permaneció idéntica. La zona oscura que rodea la zona tratada muestra denota la presencia de hielo. Figura 5b (centro). Tras el recalentamiento la imagen se torna súbitamente opaca en cierto instante. Esto denota la formación de cristales de hielo (devitrificación o recristalización). Figura 5c (derecha) Si se continua subiendo la temperatura la muestra comienza a licuarse. Dicho proceso comienza allá donde los cristales eran más pequeños, y esto ocurre en la zona que había sido vitrificada inicialmente. Por ello esta zona retoma en primer término el aspecto trasparente. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 23 de 24

139 Figura 6a (izquierda). Cultivo de fibroblastos tratados con la técnica anterior ( ºC/segundo). Los fibroblastos son, al menos morfológicamente, normales. Los fibroblastos han sido incubados previamente en 10% DMSO. Figura 6b (derecha). Mismo experimentos que en la figura 7ª, pero ahora la imagen es de la zona del capilar que no fue calentada con el láser y que siguió el perfil de enfriamiento impuesto por el criomicroscopio (10º C/minuto). La morfología es totalmente distinta al caso anterior y el aspecto denota la muerte de estas células. Memoria de solicitud del proyecto de investigación: Presupuesto solicitado Página 24 de 24